專利名稱：促胰液素受體配體在治療囊性纖維化(cf)及慢性阻塞性肺病(copd)中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用或通過激活激素促胰液素或其它促胰液素受體配體而治療囊性纖維化(CF)及慢性阻塞性肺病(COPD)。
背景技術(shù)：
囊性纖維化囊性纖維化(CF)是一種非常常見的，致命的，常染色體隱性遺傳疾病，目前僅英國(guó)就有超過7000人被診斷患有這種疾病，而美國(guó)大約有30,000人。CF的發(fā)病率主要取決于人種。北歐的白種人患這種疾病的危險(xiǎn)性最大，基于大約1/25的雜合載體率，他們患病的概率大約為1/2500。
CF是由于遍及身體的囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)劑(CFTR)氯離子通道基因的基因突變而產(chǎn)生的。CFTR中的這種突變可導(dǎo)致蛋白的錯(cuò)誤折疊和/或轉(zhuǎn)錄蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到上皮質(zhì)膜遷移的缺乏及隨后氯離子(Cl-)通道功能的損耗。這可引起細(xì)胞和腔內(nèi)的流體和電解質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及CF肺下呼吸道容積的不平衡，其分解粘液的構(gòu)造，依次損害粘液纖毛清除并引發(fā)CF患者肺部不可避免且持續(xù)的細(xì)菌感染。不同突變可引起不同嚴(yán)重程度的CF癥狀并相應(yīng)導(dǎo)致患者存活率的改變。
幾十年來，改進(jìn)的藥物和物理療法已經(jīng)顯著提高了患者的存活時(shí)間，盡管平均預(yù)期壽命仍然比較短，目前大約為30歲。因此仍然需要繼續(xù)研究治療這種疾病的更好方法。
COPDCOPD的臨床特征包括氣喘，咳嗽和喀痰，并伴有慢性氣道阻塞及肺過度膨脹，這是由慢性支氣管炎和肺氣腫(遠(yuǎn)端肺空間擴(kuò)張)引發(fā)的。在支氣管哮喘中較為顯著的慢性支氣管過度興奮也是在COPD中發(fā)現(xiàn)的。COPD中的氣道重塑可導(dǎo)致持續(xù)不可逆的氣道變窄及粘液的過度分泌。氣道變窄和高反應(yīng)性的直接原因還未可知，雖然通常認(rèn)為氣道平滑肌功能的異?？蓪?dǎo)致松弛性的降低或減小及收縮性的增加。
與緩釋口服茶堿及吸入的β2激動(dòng)劑(例如，異丙阿托品，沙丁醇胺，沙美特羅)聯(lián)合使用的支氣管擴(kuò)張藥療法，及高劑量吸入的類固醇代表了目前在COPD治療中使用的療法，這是由于即便是阻塞的適度改善對(duì)于COPD患者也是有益的。β2激動(dòng)劑可通過刺激與特異性G-蛋白Gs偶聯(lián)的特異性受體而介導(dǎo)氣道的支氣管擴(kuò)張，其依次使第二信使cAMP的細(xì)胞內(nèi)水平增加。
最近，Cl-的移動(dòng)已經(jīng)被證實(shí)與上皮依賴性氣道松弛有關(guān)(Fortner等，2001)，阻斷Cl-離子分泌可導(dǎo)致激動(dòng)劑誘導(dǎo)的松弛的顯著減少。此外，化合物如呋塞米，一種Cl-依賴性Na+/K+/2Cl-協(xié)同-轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑已經(jīng)在某些研究中被證實(shí)可減少氣喘時(shí)支氣管的高反應(yīng)性(Pendino等，1998)。此外，粘液分泌過多和氣管支氣管粘液的非-連續(xù)性清除也可導(dǎo)致持續(xù)的氣流阻塞，其可與氣道的高反應(yīng)性同時(shí)存在。粘液堵塞可導(dǎo)致小氣道(例如，三級(jí)支氣管)阻塞，從而使最大呼吸氣流減小，肺排空的推動(dòng)緩慢。
促胰液素促胰液素是一種肽激素，它是從近端小腸(特別是十二直腸和空腸)中的S細(xì)胞分泌的，并對(duì)離胃的酸性內(nèi)含物有反應(yīng)。相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間以來，豬促胰液素的結(jié)構(gòu)已經(jīng)為人們所知，并已經(jīng)將它從豬腸中分離出來，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它是由27個(gè)氨基酸殘基組成的肽構(gòu)成的(Mutt等，1970)。此外，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)牛和豬促胰液素是相同的，并與犬促胰液素相似。
雖然牛和豬促胰液素與人促胰液素的表現(xiàn)在某些方面相同，但它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上不同。這些動(dòng)物促胰液素與人促胰液素在第15和16位不同。人，豬和牛促胰液素的序列對(duì)比在

圖1中表示。
促胰液素的生理作用是刺激水(H2O)和碳酸氫鹽(HCO3-)從胰腺分泌，中和酸性食糜。它的作用是由7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的，G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，其是結(jié)構(gòu)上與GPCRs超家族有關(guān)的高血糖素-促胰液素-血管活性腸肽的一員，(IUPHAR Receptor Compendium，1998)，該肽顯示出毫微摩爾的親和性。促胰液素受體的刺激可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cAMP的增加，及蛋白激酶A(PKA)的激活。
促胰液素目前已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于診斷胃泌素瘤及評(píng)估胰腺功能。促胰液素在小兒孤獨(dú)癥中的應(yīng)用表明它可改善與孤獨(dú)癥，即一種交流，社會(huì)技能和發(fā)展嚴(yán)重受損的疾病有關(guān)的生理和行為癥狀(見，例如WO98/52593，US-A-6,020,310或US-A-6,020,314)。2000年3月，RepligenCorporation(USA)宣布他們已經(jīng)使用促胰液素對(duì)患有孤獨(dú)癥的兒童開始進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)，進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)的地點(diǎn)包括Mayo Clinic，theUniversity of Rochester Medical Center和the Southwest Autism ResearchCenter及Phoenix Children’s Hospital。這些試驗(yàn)的初步結(jié)果表明，促胰液素的輸注對(duì)于患有嚴(yán)重孤獨(dú)癥兒童的離散組是有益的。
有人已經(jīng)提出促胰液素還可預(yù)防吸入性肺炎綜合征(例如，EP0150760；AU3806485)。
已經(jīng)報(bào)道過許多合成和/或天然存在的促胰液素肽類似物及片段(此處被稱作“促胰液素受體配體”)，它們對(duì)促胰液素受體顯示出廣泛的效能，功效和選擇性。這些包括，但不限制于單/多取代的促胰液素類似物，促胰液素片段，取代的促胰液素片段，還原肽鍵的類似物(Gardner等，1976；Gardner等，1979；Waelbroeck等，1981；Konig等，1984；Staun-Olsen等，1986；Robbertecht等，1988；Haffer等，1991)，和VIP/促胰液素家族天然存在及合成的類似物，片段和嵌合肽(包括VIP(血管活性腸肽)，腸抑胃肽(GIP)，PACAP(可激活垂體腺苷酸環(huán)化酶的多肽)，adrenomedullin，降鈣素，CGRP(α，β和皮膚降鈣素基因相關(guān)肽)，胰高血糖素，胰高血糖素樣多肽(GLP)，生長(zhǎng)激素釋放因子，甲狀旁腺激素(PTH)及其相關(guān)蛋白(PTHrP)，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)和糊精。這些肽中的大多數(shù)(包括胰高血糖素，GLP，PACAP和VIP)與促胰液素共同具有有效的氨基酸同源物，特別是在氨基末端。所有這些肽可接受相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征，包括兩親α-螺旋狀二級(jí)結(jié)構(gòu)的一個(gè)或兩個(gè)區(qū)，且可以較保守的方式與它們的受體相互作用(Sexton，1999)。
促胰液素-相關(guān)受體肽，及其類似物和片段也是已知的，它們對(duì)促胰液素受體顯示出親和性。
本發(fā)明的公開我們已經(jīng)研究了促胰液素受體在CF和COPD患者組織中的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)，無論是在正常個(gè)體還是患有這些疾病的患者中，促胰液素受體均是在肺遠(yuǎn)端區(qū)，特別是在三級(jí)支氣管和實(shí)質(zhì)中表達(dá)的，在肺近端區(qū)中只有很少的或沒有可測(cè)量的mRNA表達(dá)。先前沒有報(bào)道過促胰液素受體在這些組織中的表達(dá)。
此外，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)在CF患者三級(jí)支氣管中，促胰液素受體mRNA的水平顯著升高。這種升高對(duì)CF是特異性的，且不與患有其它肺病的患者共有。這種升高對(duì)于三級(jí)支氣管組織是特異性的。
我們不希望受任何一種特定理論的束縛，我們相信促胰液素對(duì)細(xì)胞中離子移動(dòng)的作用(見下面)可抵消與CF有關(guān)的CTFR缺乏的作用。此外，雖然本發(fā)明的實(shí)踐不依賴于任何一種特定的理論，但對(duì)三級(jí)支氣管組織中促胰液素受體mRNA水平升高的解釋是，這是對(duì)這些細(xì)胞中離子不平衡的反應(yīng)。
此外，人們逐漸認(rèn)識(shí)到，對(duì)于COPD患者而言，患者肺中離子流出的作用可能是治療干預(yù)的一個(gè)重要目標(biāo)。所述促胰液素受體與G-蛋白Gs偶聯(lián)，并因此推測(cè)功能性促胰液素受體的激活可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP的積聚，及隨后的支氣管擴(kuò)張，其中所述功能性促胰液素受體是在排列于人遠(yuǎn)端支氣管的上皮細(xì)胞上鑒定的(還可見Ng等，1999)。此外，在其它粘液分泌過多的肺病，如囊性纖維化和COPD中，Cl-流出的顯著減少可改變水及離子的組成和隨后粘液的粘度及粘液的分泌，產(chǎn)生稠而無味的粘液，其可損害肺的粘液纖毛清除。因此在這種患者中，刺激離子移動(dòng)對(duì)于其疾病的治療是有益的。
因此，本發(fā)明提供一種治療CF患者囊性纖維化的方法，該方法包括給予所述患者有效量的藥劑，該藥劑可通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子的流出。
本發(fā)明還提供一種治療COPD患者COPD的方法，該方法包括給予所述患者有效量的藥劑，該藥劑可通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子的流出。
就其中一方面而言，本發(fā)明是以發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的，即CF患者三級(jí)支氣管中促胰液素受體的mRNA水平升高，且本發(fā)明涉及促胰液素在囊性纖維化治療中的新用途。本發(fā)明的優(yōu)選方面涉及通過給予患者促胰液素受體配體來治療CF。然而，本發(fā)明人已經(jīng)預(yù)期除了直接給予促胰液素受體配體外，還可通過其它方式給予患者有效量的促胰液素。給予促胰液素的其中一個(gè)選擇性方法是使用可刺激肺細(xì)胞中內(nèi)源性促胰液素，或促胰液素相關(guān)肽產(chǎn)生或釋放的正向調(diào)節(jié)的藥劑。
本發(fā)明還提供了可通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子流出的藥劑在制備治療囊性纖維化的藥物中的用途。
此外，本發(fā)明還提供了可通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子流出的藥劑在制備治療COPD的藥物中的用途。
優(yōu)選所述藥劑是一種促胰液素受體配體，更特別是促胰液素，特別是人促胰液素。
附圖簡(jiǎn)述圖1表示人，豬和犬促胰液素的序列對(duì)比。
圖2表示對(duì)照組和CF肺區(qū)中促胰液素受體mRNA的不同表達(dá)。
圖3表示對(duì)照組和CF肺區(qū)中GAPDH的mRNA表達(dá)。
圖4表示在來源于16個(gè)對(duì)照組供體和25個(gè)CF組織供體的對(duì)照組和CF肺區(qū)中，促胰液素受體mRNA的不同表達(dá)。
圖5表示在非-CF三級(jí)支氣管中，促胰液素刺激離子移動(dòng)。
圖6表示在來源于非-CF供體的原始人三級(jí)支氣管上皮細(xì)胞的融合單層中，促胰液素刺激非-CTFR依賴性的離子移動(dòng)。
圖7表示促胰液素刺激人CF三級(jí)支氣管中離子的移動(dòng)。
圖8表示促胰液素對(duì)來源于非CF供體的原始人三級(jí)支氣管上皮細(xì)胞中氯離子流出的作用。
圖9表示CF患者的三級(jí)支氣管和肺實(shí)質(zhì)中，NeuroD mRNA的水平。
發(fā)明詳述通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子流出的藥劑促胰液素受體可通過很多機(jī)理而被激活。例如，已經(jīng)廣泛報(bào)道過促胰液素的表達(dá)被限制在小腸和結(jié)腸內(nèi)分泌細(xì)胞中的S-型腸內(nèi)分泌細(xì)胞及產(chǎn)生發(fā)育胰腺的β細(xì)胞的胰島素中。腸內(nèi)分泌細(xì)胞和胰島均來自原始的胚胎腸內(nèi)胚層。此外，一級(jí)氣道是通過被稱作分支形態(tài)發(fā)生的過程形成的，由此，2個(gè)腹側(cè)的肺芽從排列在胚胎前腸內(nèi)胚層底部的上皮抽芽。氣道的形成是由兩個(gè)肺芽的生長(zhǎng)和反復(fù)分枝而進(jìn)行的。肺神經(jīng)內(nèi)分泌(PNE)細(xì)胞位于第一細(xì)胞之中，從而與原始肺上皮區(qū)別，且通常，其在胎兒和新生兒肺中的含量最豐富。已知這些細(xì)胞可表達(dá)許多肽，包括降鈣素，降鈣素基因相關(guān)肽，血清素和內(nèi)皮縮血管肽，且可通過它們對(duì)這些肽或一般的內(nèi)分泌物標(biāo)記物如突觸小泡蛋白，嗜鉻粒蛋白及蛋白基因產(chǎn)物9.5的免疫反應(yīng)性而被目測(cè)檢驗(yàn)。在CF支氣管中，已經(jīng)證實(shí)了內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)降鈣素免疫反應(yīng)性的增加(Wolf等，1986)。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與非-CF肺相比，在CF三級(jí)支氣管部分中，嗜鉻粒蛋白A的免疫反應(yīng)性增加，表明CF肺中的孤立內(nèi)分泌細(xì)胞數(shù)增加。人們預(yù)期CF肺三級(jí)支氣管內(nèi)，內(nèi)分泌細(xì)胞表達(dá)的增加與所存在的內(nèi)分泌肽，包括促胰液素的增加有關(guān)。同樣，直接或間接刺激內(nèi)分泌細(xì)胞從而在肺內(nèi)局部釋放促胰液素(和/或促胰液素釋放肽或?qū)Υ僖纫核厥荏w顯示出親和性的肽)代表了一種選擇性的，用外源性促胰液素刺激促胰液素受體，或類似的并為CF提供治療有益之處的方法。
此外，促胰液素基因還可通過提供藥劑而正向調(diào)節(jié)，所述藥劑可通過啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)而提高基因轉(zhuǎn)錄的水平。促胰液素基因的增強(qiáng)子區(qū)含有被稱為E框的順式作用DNA共有序列(CAGCTG)，其結(jié)合屬于轉(zhuǎn)錄因子的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)家族的蛋白。已經(jīng)證實(shí)了被稱為BETA2/NeuroD的bHLH蛋白可導(dǎo)致促胰液素基因轉(zhuǎn)錄的組織-特異性調(diào)節(jié)(Mutoh等，1997)。在剔除小鼠中，BETA2/NeuroD缺陷小鼠不能發(fā)育腸內(nèi)分泌細(xì)胞或胰β細(xì)胞，從而證實(shí)了這種轉(zhuǎn)錄因子在源于腸內(nèi)胚層的多種特異性細(xì)胞類型的正常發(fā)育中起著重要的作用。β2/NeuroD的表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)僅僅位于轉(zhuǎn)基因小鼠的內(nèi)分泌細(xì)胞中(Rhindi等，1999)。
此外，內(nèi)源性促胰液素產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)還可通過本領(lǐng)域已知的各種其它方法獲得(例如，見Jiang等，2001；Yang等，1998；Morse等，2001；Lewis等，1997；West & Rodman，2001；Alton & Kitson，2000)，這些方法包括但不限制于基因療法(在病毒或非病毒載體中遞送DNA或RNA，其中所述載體編碼能夠直接或間接刺激促胰液素受體或其細(xì)胞信號(hào)途徑的肽)，基因?qū)ぐ?遞送藥劑，其中該藥劑針對(duì)編碼促胰液素或相關(guān)肽的基因啟動(dòng)子區(qū)上的調(diào)節(jié)序列或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，由此產(chǎn)生能夠直接或間接刺激促胰液素受體的促胰液素或相關(guān)肽)。
已知的可刺激促胰液素釋放的多種機(jī)理，包括下列
藥劑如二丁酰環(huán)狀-3’，5’-腺苷一磷酸，福斯高林，4β-12-O-十四酰佛波醇-13-醋酸鹽，合成的絲氨酸蛋白酶抑制劑，卡莫司他，和鈣離子載體，A2318，其刺激Ca2+和環(huán)狀-3’，5’-腺苷一磷酸-依賴性促胰液素的釋放(Xue等，1993)；胰磷脂酶A2(PLA2)，其已經(jīng)被證實(shí)本質(zhì)上具有釋放促胰液素的活性，而不依賴于它的消化酶活性(Chang等，1999)；神經(jīng)肽鈴蟾肽，胃泌素釋放肽，VIP和神經(jīng)節(jié)肽已經(jīng)顯示出可調(diào)節(jié)產(chǎn)生促胰液素的細(xì)胞中促胰液素的釋放(Chang等，1998)；和長(zhǎng)鏈脂肪酸，如油酸鈉是從內(nèi)分泌細(xì)胞釋放促胰液素的有效刺激劑。它們的刺激作用是由內(nèi)源性蛋白激酶A加強(qiáng)的，并由通過L-型通道流入的Ca2+和蛋白激酶C及Ca2+/鈣調(diào)蛋白-依賴性蛋白激酶II的激活而介導(dǎo)(Chang等，2000)。
此外，受體活性修飾蛋白，或RAMP是新的單一跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白，其可調(diào)節(jié)促胰液素受體GPCR家族中至少兩個(gè)成員的表達(dá)和/或活性。迄今為止，存在3個(gè)RAMP同種型，1-3，它們的相互作用很可能導(dǎo)致受體到細(xì)胞表面的運(yùn)輸，改變受體糖基化的程度，和/或提供與細(xì)胞表面受體有關(guān)的配體結(jié)合位點(diǎn)(Sexton，1999)。
RAMPS可間接改變肽對(duì)促胰液素GPCR家族特異性受體的選擇性。例如，有關(guān)PTH1受體的單點(diǎn)突變對(duì)此受體產(chǎn)生促胰液素反應(yīng)性，而回復(fù)突變對(duì)促胰液素受體產(chǎn)生PTH反應(yīng)性的研究(Turner等，1996)已經(jīng)暗示了，這可能是由于與受體相互作用的特異性RAMP的改變(Sexton；1999)。
同樣，促胰液素受體的激動(dòng)(agonism)可通過促胰液素受體家族的肽類似物或片段及特異性RAMP的同時(shí)或順序應(yīng)用而介導(dǎo)。
其中的促胰液素受體被激活的呼吸組織特別包括選自三級(jí)支氣管和肺實(shí)質(zhì)的肺遠(yuǎn)端區(qū)內(nèi)的組織。
促胰液素受體配體如上所述，優(yōu)選的促胰液素受體配體是人促胰液素(hSN)。然而，也可使用其它哺乳動(dòng)物的促胰液素，如緊密相關(guān)的牛，豬的促胰液素，或犬，嚙齒動(dòng)物，小雞和兔子的促胰液素(其顯示出與人促胰液素不同程度的同源性)，及其它天然存在或合成的促胰液素片段或類似物，如此處鑒定的那些。
各種其它的促胰液素受體配體在本領(lǐng)域中也是熟知的。這種配體多數(shù)是以天然促胰液素(例如，人或豬促胰液素)序列為基礎(chǔ)的，但包含1-7(通常為1-5，常常是1，2或3)個(gè)氨基酸取代或缺失，特別但不僅僅在N-末端區(qū)。
例如，Gespach等(1986)描述了4種合成的促胰液素類似物，包括與豬促胰液素相似，但N-末端被血管活性腸肽(VIP)的序列部分取代的，即Ala4-Val5-pSN，和Tyr1-Ala2-Glu3-pSN，Gln3-pSN，Phe1-Phe2-Trp3-Lys4-pSN。Konig等(1977)描述了Ala4-pSN。Gardener等(1976)描述了促胰液素片段SN5-27及其3個(gè)變體，(9Gln-SN5-27，15Asn-SN5-27和9Gln-15Asn-SN5-27)。15-Lys-SN也已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述(Gardener等，1979)。Haffer等(1991)描述了八種促胰液素變體，而八個(gè)N-末端肽鍵中有一個(gè)具有還原肽鍵(用-CH2-HN-替換-CONH-鍵)。Robberecht等(1988)描述了促胰液素片段2-27，3-27，5-27和7-27及所觀察到的促胰液素受體的活性。Konig等(1986)把促胰液素N-末端的5個(gè)氨基酸換成人生長(zhǎng)激素釋放因子N-末端的五肽序列，從而產(chǎn)生1-Tyr-2，4-二Ala-5-Ile-SN，其顯示出促胰液素活性。構(gòu)造的其它活性變體是3-L-半胱氨酸-SN，6-D-Phe-SN，5-Allo-Thr-SN，和1-Cys-6-Cys-SN。
對(duì)促胰液素受體顯示親和性的促胰液素類似物的其它例子包括，[Ala4，Val5]和[D-Ala4，Val5]促胰液素，(D-Ala4)促胰液素；(D-Phe6)促胰液素；促胰液素5-27，促胰液素14-27[Val5]促胰液素，[D-Ala4，Val5]促胰液素(Waelbroeck等，1981)；取代片段如[Gln9，Asnl5]促胰液素(5-27)(Staun-Olsen等，1986)；含酚基的豬促胰液素類似物，包括Nalpha-酪氨酰促胰液素，[Tyrl]促胰液素，和Nalpha-β-(4-羥苯基)丙酰促胰液素(Yanaihara等，1977)；促胰液素的羧基-末端二十三肽類似物(S5-27)(9-Gln-S5-27，15-Asn-S5-27)，和9-Gln-15-Asn-S5-27)(Gardner等，1976)。
血管活性腸肽(VIP)，PACAP，胰高血糖素，胰高血糖素樣多肽及其天然存在和合成的類似物及其片段，可顯示出與促胰液素顯著的同源性。這些的例子包括但不限制于，(D-Ala4)VIP；(D-Phe4)VIP；(D-Phe2)VIP，VIP的脂肪酰基衍生物，包括十四烷基，十六烷基，和十八?；?[Nle17]VIP(Gourlet等，1998)，VIP2-28；VIP1-14；VIP2-14；VIP14-28；VIP15-28；VIP20-28；VIP21-28，N-末端的VIP1-6或VIP1-9已經(jīng)與C-末端的VIP20-28或VIP21-28共價(jià)連接的兩個(gè)序列(Couvineau等，1984)；VIP7-27，VIP11-28，VIP1-22-NH2，VIP16-28(Staun-Olsen等，1986)，VIP[10-28]和VIP[16-28]。促胰液素和VIP的類似物，其被稱作vasectrins，已經(jīng)由Beyerman等于1981年描述。PACAP(1-27；1-38)及類似物的例子包括PACAP(1-23，VIP-24-28)，PACAP(1-24，Cys-25)，PACAP(1-23)，PACAP(3-27)，PACAP(1-19)，PACAP(3-19)，PACAP(1-12)，和PACAP(18-38)(Schmidt等，1993)，胰高血糖素，和GLP-1，它們相關(guān)的類似物及片段包括GLP-1(7-37)GLP-1-(1-37)酰胺，-(6-37)酰胺，-(8-37)酰胺，-(7-36)酰胺(Suzuki等，1989)，N-末端1位發(fā)生改變的那些，包括N-甲基化-(N-me-GLP-1)，α-甲基化(α-me-GLP-1)，脫酰胺化的-(脫氨-GLP-1)和咪唑-乳-酸取代的GLP-1(imi-GLP-1)。(Gallwitz等，2000)。
在引入此處作為參考的上述文獻(xiàn)中描述的促胰液素受體配體可全部用于本發(fā)明中，然而本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到上述引證的參考文獻(xiàn)不是窮舉的，也可使用其它促胰液素受體配體。
候選配體的適合性可通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定。例如，Charlton等(1983)報(bào)道了腦室內(nèi)(intracerebroventricularly)注射的促胰液素可顯著增加大鼠的澄清，減少新的目標(biāo)近似值，但對(duì)定型行為沒有顯著的作用。這種試驗(yàn)可使用促胰液素受體配體在大鼠中進(jìn)行，從而測(cè)定它對(duì)本發(fā)明的適合性(即，可選擇通過促胰液素受體的激動(dòng)顯示相似作用的那些配體)。
促胰液素可從市場(chǎng)上購得(例如，Peninsula Laboratories Inc，USA)，或它及上述配體可參很考容易得到的公開文獻(xiàn)獲得。
本發(fā)明的組合物此處所報(bào)道的新發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了新的組合物，它含有促胰液素受體配體和至少一種具有抗CF或COPD活性的其它化合物。
就CF而言，這種化合物包括粘液溶解劑，如乙酰半胱氨酸，脫氧核糖核酸酶I(dornase)或厄多司坦，及其它抗CF劑，如萘多羅米或布洛芬。
就COPD而言，這種化合物包括支氣管擴(kuò)張藥如茶堿，異丙阿托品，β2激動(dòng)劑，如沙丁胺醇或沙美特羅，或抗炎劑如類固醇。
促胰液素受體配體在這種組合物中的量為，例如，占活性成分總重量(即，不包括載體或稀釋劑)的1％-99％，例如10％-90％。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供促胰液素受體配體與第二種具有抗CF或COPD活性的化合物的組合，它們可同時(shí)或順序使用，分別用于治療CF或COPD?！巴瑫r(shí)”是指同時(shí)給予兩種化合物，雖然這在同一組合物中不是必須地?！绊樞颉笔侵冈谝欢螘r(shí)期內(nèi)給予兩種化合物，這樣當(dāng)給予兩種化合物中的第二種時(shí)，兩種化合物中的第一種在患者體中仍然是活性的。優(yōu)選“順序”是指在同一24小時(shí)內(nèi)，優(yōu)選在同一12小時(shí)內(nèi)，如在同一6，3，1，半小時(shí)或一刻鐘內(nèi)。
配制和給藥根據(jù)本發(fā)明對(duì)患者進(jìn)行的治療可通過給予患者藥物組合物形式的促胰液素受體配體而進(jìn)行，其中所述藥物組合物可具有或沒有其它活性成分存在(下面提到的組合物被理解為包括兩種類型，雖然僅專門提到促胰液素受體配體)。該組合物還可與非-毒性的，藥學(xué)上可接受的載體組合。就此而論，本發(fā)明還包括一種治療CF的方法，包括給予所要治療的患者治療有效量的本發(fā)明促胰液素受體配體，或本發(fā)明的組合物。
在臨床實(shí)踐中，由于激素作為一種肽對(duì)生物活性環(huán)境較敏感，因此本發(fā)明的組合物可非腸道給藥。然而也可口服或直腸給藥，例如使用緩釋類型的組合物可使活性成分達(dá)到最初的目標(biāo)位點(diǎn)，即三級(jí)支氣管。
促胰液素受體配體還可被配制成適于吸入(例如，通過氣溶膠)，吹入(通過口腔或鼻)，或非腸道(通過除腸之外的途徑引入)給藥的形式。
通過吸入遞送蛋白或肽可使用促胰液素受體配體的液體或固體制劑而完成。因此，本發(fā)明預(yù)期含有促胰液素受體配體的制劑可用于各種裝置中，該裝置被設(shè)計(jì)用于遞送藥物組合物及治療制劑到呼吸道。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面中，促胰液素受體的配體是以氣溶膠或吸入形式給藥的。與分散劑聯(lián)合使用的促胰液素受體配體可作為干燥粉末以氣溶膠制劑的形式給藥，或以具有稀釋劑的溶液或混懸液形式給藥。
適宜的分散劑在本領(lǐng)域中是熟知的，其包括但不限制于表面活性劑等。本領(lǐng)域通常所用的表面活性劑可用于減少表面產(chǎn)生的蛋白聚集，而表面產(chǎn)生的蛋白聚集是由形成液體氣溶膠的溶液的霧化引起的。這種表面活性劑的例子包括聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，及聚氧化乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯。所用表面活性劑的量通常大約占制劑重量的0.001％-4％。在特定的方面，所述表面活性劑是聚氧化乙烯脫水山梨糖醇一油酸酯或脫水山梨糖醇三油酸酯。
所述液體氣溶膠制劑在生理可接受的稀釋劑中含有促胰液素受體配體和分散劑。本發(fā)明干燥粉末狀的氣溶膠制劑包括微細(xì)分裂固體形式的促胰液素受體配體和分散劑，及選擇性的膨脹劑，如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇等，從而促進(jìn)粉末分散。無論是液體還是干燥粉末狀的氣溶膠制劑，所述制劑必須被霧化。也就是說，必須將它破碎成液體或固體顆粒，從而確保霧化劑量能夠按照所希望的，確實(shí)到達(dá)支氣管和/或肺泡。通常，質(zhì)量中值動(dòng)態(tài)直徑為5微米(μm)或更小，從而確保藥物顆粒到達(dá)肺支氣管或肺泡(Wearley等，1991)。
關(guān)于遞送裝置的結(jié)構(gòu)，本領(lǐng)域已知的任何形式的霧化作用，包括，但不限制于液體制劑的噴霧，霧化或泵送霧化，及干燥粉末制劑的霧化，均可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。人們預(yù)期了一種獨(dú)特設(shè)計(jì)的，用于給予固體制劑的遞送裝置。通常，液體或干燥粉末制劑的霧化作用需要推進(jìn)劑。所述推進(jìn)劑可以是本領(lǐng)域通常所用的任何一種推進(jìn)劑。有效推進(jìn)劑的例子包括氯氟烴，氫氟烴，氫氯氟烴和烴，包括三氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷及其組合。
在本發(fā)明的優(yōu)選方面，用于霧化的裝置是一種計(jì)量給藥吸入器。給藥時(shí)，計(jì)量給藥吸入器可提供具體劑量，并可根據(jù)給藥提供可變劑量。這種計(jì)量給藥吸入器可使用液體或干燥粉末形式的氣溶膠制劑。
氣溶膠遞送系統(tǒng)，如加壓的計(jì)量給藥吸入器和干燥粉末吸入器在Newman，Aerosols and the Lung，Clarke，S.W.和Davia，D.編輯，第197-22頁中公開，并可與本發(fā)明結(jié)合使用。
還可使用其它制藥方法控制本發(fā)明拮抗劑作用的持續(xù)時(shí)間。所述拮抗劑還可利用界面聚合凝聚技術(shù)而被包裹在所制備的微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊和聚(甲基異丁烯酸鹽)微膠囊)中，包裹在膠態(tài)藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體，白蛋白，微球體，微乳，毫微顆粒和毫微膠囊)中，或包裹在粗乳狀液中。這種技術(shù)在Remington’sPharmaceutical Sciences，16thedition，Osol，A.，ed(1980)中公開。
對(duì)于鼻內(nèi)給藥而言，所述促胰液素受體配體還可被配制成通過適宜的計(jì)量或單位裝置給藥的溶液，或選擇性地被配制成使用適當(dāng)遞送裝置，與適宜載體混合的粉末。選擇性地，促胰液素受體配體還可以類似方式透鼻遞送。例如，用于透鼻給藥的促胰液素制劑已經(jīng)在JP60123426中描述。
用于非腸道給藥的制劑包括無菌的含水或非水溶液，混懸液或乳液。非水溶劑或懸浮介質(zhì)的例子是丙二醇，植物油，如橄欖油，及可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯。這些組合物還可含有助劑，如防腐劑，濕潤(rùn)劑，乳化劑和分散劑。它們可以是滅菌的，例如，通過留存細(xì)菌的過濾器過濾滅菌，通過在組合物中摻入滅菌劑滅菌，通過加熱輻照滅菌。它們還可被制備成無菌固體組合物的形式，其可在使用前被立即溶解在無菌的可注射介質(zhì)中。且作為更慣常使用的靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)途徑，所述組合物還可通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射而給藥。
本發(fā)明組合物中活性成分的百分比可發(fā)生改變，只要它們組成一定的比例，從而獲得所期望的，適宜劑量對(duì)胰腺的刺激作用。很明顯，各種單位劑量形式大約可同時(shí)給藥。通常，所述組合物應(yīng)當(dāng)含有大約0.1％-80％重量的活性成分。
所用劑量取決于所期望的刺激效果，給藥途徑和治療持續(xù)時(shí)間。對(duì)于人類患者而言，典型劑量為10-8-10-3mg/天，優(yōu)選10-6-10-4mg/天。所述促胰液素受體配體可每天給藥或，根據(jù)醫(yī)師的要求減少，例如，每周給藥，或直到獲得所期望的治療效果。
下列實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1RNA的表達(dá)輪廓檢測(cè)促胰液素受體信使RNA的表達(dá)輪廓(蛋白登記號(hào)P47872；核苷酸登記號(hào)U28281)?？俁NA是使用TriZolTM，一種市售的酚和胍異硫氰酸鹽溶液，按照制造商(Life Technologies)所述的方法，從5個(gè)對(duì)照組供體和5個(gè)CF供體的三級(jí)/四級(jí)支氣管和肺實(shí)質(zhì)中分離出來的。只要利用凝膠電泳檢測(cè)完整的18s和28s核糖體RNA，且如果所形成的基因組DNA少于總核酸樣品的10％，那么就可使用RNA樣品。總RNA樣品被退火成引物探針序列和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH；登記號(hào)P04406)引物，且其是使用MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄的。定量序列檢測(cè)是在所得的cDNA上進(jìn)行的。
申請(qǐng)人已經(jīng)研究過使用ABI棱柱狀7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(PerkinElmer)定量分析mRNA表達(dá)的方案。所述系統(tǒng)的詳細(xì)描述在WO00/05409中提出。簡(jiǎn)言之，在PCR過程中，所述系統(tǒng)使用熒光探針產(chǎn)生序列特異性熒光信號(hào)。所述探針是具有熒光報(bào)道分子和猝滅劑染料的寡核苷酸。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)道因子熒光的強(qiáng)度可被猝滅劑抑制。在PCR過程中，當(dāng)探針形成復(fù)制復(fù)合體的一部分時(shí)，所述猝滅劑是從導(dǎo)致熒光增強(qiáng)的報(bào)道分子染料中分離出來的，然后通過ABI7700序列檢測(cè)器檢測(cè)。ABI7700的熱循環(huán)儀中具有一個(gè)構(gòu)件(built)，和一個(gè)經(jīng)由雙向纖維光纜對(duì)準(zhǔn)96樣品孔中各孔的激光器。每隔幾秒鐘即收集一次介于520nm-660nm間的，通過光纜發(fā)射到檢測(cè)器的熒光。系統(tǒng)軟件可分析各組分染料對(duì)實(shí)驗(yàn)光譜的影響，并將信號(hào)校準(zhǔn)成內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)染料。然后繪制這些校準(zhǔn)過的‘報(bào)道分子’的峰值(Rn)對(duì)熱循環(huán)數(shù)的圖，從而得到放大圖-使PCR產(chǎn)品產(chǎn)生的程度形象化。
靶序列(Cn)的起始拷貝數(shù)是通過測(cè)定分段PCR循環(huán)數(shù)(Ct)而確定的，其中首先檢測(cè)PCR產(chǎn)品-該點(diǎn)的熒光信號(hào)超過臨界基準(zhǔn)。因此，Ct值越低，Cn越大。各樣品靶mRNA量的量化是通過將實(shí)驗(yàn)Ct值與靶序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較而確定的，其中所述靶序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線是在各實(shí)驗(yàn)的過程中繪制的。
引物探針組是為檢測(cè)促胰液素受體的mRNA而特別設(shè)計(jì)的。脫機(jī)同源性檢索顯示出與在基因銀行登記的基因序列不明顯匹配。促胰液素受體的正向和反向引物及探針序列如下正向 GACCAGCATCATCTGAGAGGCT (SEQ ID NO1)反向 CCTTCGCAGGACCTCTCTTG (SEQ ID NO2)探針 TCTCTGTCCGTGGGTGACCCTGCT (SEQ ID NO3)GAPDH引物探針組如下正向 GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC (SEQ ID NO4)反向 CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT (SEQ ID NO5)探針 TTTGGTCGTATTGGGCGCCT (SEQ ID NO6)反應(yīng)條件是使用基因組DNA作為模板，然后通過探針濃度梯度實(shí)驗(yàn)得到引物探針濃度表格而優(yōu)化的。選擇能夠產(chǎn)生最有效的基因產(chǎn)物擴(kuò)增的引物濃度，即，產(chǎn)生較低的臨界循環(huán)和相對(duì)較高的熒光積聚的那些。然后利用這些最佳引物濃度選擇最佳的探針濃度。
促胰液素受體與呼吸疾病的關(guān)聯(lián)是通過在三級(jí)支氣管和實(shí)質(zhì)中繪制促胰液素受體mRNA表達(dá)的輪廓而加以證實(shí)的，其中所述三級(jí)支氣管和實(shí)質(zhì)來源于5個(gè)完全同意的供體，所述供體在病理學(xué)和組織學(xué)上被診斷為具有下列呼吸疾病不吸煙者對(duì)照組，吸煙者，氣喘，囊性纖維化，肺炎，肺氣腫，慢性阻塞性肺病(COPD)。CF肺組織是在經(jīng)受心臟和肺移植的5名患者完全同意的情況下獲得的。
圖2表示對(duì)照組和CF肺區(qū)中，促胰液素受體的不同mRNA表達(dá)，其表明CF三級(jí)支氣管中促胰液素受體的表達(dá)增加。數(shù)據(jù)是由5個(gè)對(duì)照組和5個(gè)囊性纖維組織供體的各肺區(qū)中，QRT-PCR臨界循環(huán)的平均值±s.e.m.表示的。*p＝0.0246表示源于不成對(duì)T-試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。作為對(duì)照，圖3表示對(duì)照組和CF肺區(qū)中GAPDH的mRNA表達(dá)。數(shù)據(jù)是由5個(gè)對(duì)照組和5個(gè)囊性纖維組織供體的各肺區(qū)中，QRT-PCR臨界循環(huán)的平均值±s.e.m.表示的。在兩組之中和之間，沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
促胰液素受體表達(dá)的減少是通過將5名COPD供體的肺實(shí)質(zhì)與5名對(duì)照組供體進(jìn)行比較而加以證實(shí)的(p＝0.0465)。然而沒有其他供體組顯示出促胰液素受體mRNA表達(dá)的差異。
然而在所有情況下，促胰液素受體在肺遠(yuǎn)端區(qū)組織中的任何水平的表達(dá)均是新奇的，且為本發(fā)明提供了基礎(chǔ)。
圖4表示利用源于25名CF供體和16名不吸煙對(duì)照供體的組織隨后進(jìn)行的表達(dá)研究的結(jié)果。數(shù)據(jù)是由25名CF供體和16名不吸煙供體的各肺區(qū)中，QRT-PCR臨界循環(huán)的平均值±s.e.m.表示的。**p＝0.009表示得自方差雙向分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所得結(jié)果與圖2所得的那些相似，即，與對(duì)照組相比，CF三級(jí)支氣管中促胰液素受體的表達(dá)顯著增加，兩組在實(shí)質(zhì)中的表達(dá)水平相似。
實(shí)施例1所提供的數(shù)據(jù)為本發(fā)明提供了基礎(chǔ)。即，Cl-從呼吸道細(xì)胞到氣道腔流出的減少代表了CF的病因?qū)W問題。然而，離子移動(dòng)和Cl-通道的這種損耗還可減少碳酸氫鹽(HCO3-)自細(xì)胞的分泌，并提高鈉離子(Na+)通過上皮，阿米洛利-敏感性Na+通道，到細(xì)胞中的重吸收。
健康肺的洗滌物主要由H2O(大約95％)，和維持分泌蛋白，如可溶且惰性的粘液和消化酶的苯巴比妥HCO3-組成。然而，由于細(xì)胞內(nèi)較高的Na+和Cl-濃度，CF氣道的上皮顯示出異常高的表面液體吸收速率，因此患者氣道內(nèi)的水分含量非常低。這些可導(dǎo)致粘液顯著增稠，及隨后由CF肺的粘液纖毛清除的損害。
HCO3-穿過肺上皮細(xì)胞頂膜的移動(dòng)主要是通過生電Cl-/HCO3-交換器進(jìn)行的，水通過簡(jiǎn)單的滲透擴(kuò)散或通過促進(jìn)性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理而穿過親水質(zhì)膜，其中所述促進(jìn)性轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理是由水通道蛋白(AQP)水通道蛋白家族的成員介導(dǎo)的。目前認(rèn)為HCO3-和Cl-主要涉及H2O的滲透性移動(dòng)。
基于促胰液素及其受體對(duì)十二指腸和胰腺中的離子調(diào)節(jié)的生理作用，申請(qǐng)人在本發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上提出促胰液素受體mRNA及功能性表達(dá)的增加可代表人體發(fā)展的，病理學(xué)應(yīng)答，從而補(bǔ)償CFTR的缺損。由于促胰液素肽的合成是在十二指腸中進(jìn)行的，因此肺內(nèi)的促胰液素受體不與促胰液素肽接觸。不受任何一種特定理論的束縛，我們提出通過藥理學(xué)干預(yù)促胰液素受體激動(dòng)可治療與CF有關(guān)的生物化學(xué)呼吸問題的全部或一部分(a)通過Cl-通道的cAMP-依賴性激活而刺激Cl-從三級(jí)支氣管呼吸細(xì)胞的流出。促胰液素受體的刺激或毛喉素-介導(dǎo)的cAMP的增加已經(jīng)顯示出可通過大鼠胰腺導(dǎo)管細(xì)胞的頂膜，刺激大約4pS較小的，單路Cl-選擇性電導(dǎo)(Gray等，1988)。雖然促胰液素已經(jīng)被證實(shí)可刺激CFTR和Cl-穿過非CF人上皮細(xì)胞(例如，膽囊)頂膜的流出，所報(bào)道的此Cl-電導(dǎo)為6-12pS。因此，Cl-代表了一種選擇性的cAMP-依賴性Cl-電導(dǎo)。
(b)刺激cAMP增加，激活蛋白激酶，引發(fā)磷酸化作用，及隨后呼吸細(xì)胞中上皮Na+通道或Na+-K+-ATP酶的調(diào)節(jié)，由此減少Na+重吸收并刺激肺液移動(dòng)。這種機(jī)理已經(jīng)在伴有cAMP偶聯(lián)的β-腎上腺素能受體刺激的大鼠肺泡上皮細(xì)胞中被證實(shí)(Minakata等，1998)。
(c)隨后腔內(nèi)Cl-水平的增加可起促胰液素激活的Cl-/HCO3-交換器底物的作用，從而使HCO3-生電移動(dòng)到氣道腔中。促胰液素已經(jīng)被廣泛證實(shí)可刺激Cl-/HCO3-交換器的活性，所述Cl-/HCO3-交換器與頂端上皮(例如，膽管上皮細(xì)胞，Alvaro等，1993；1997)上的cAMP-依賴性Cl-通道(CFTR)功能性連接。這種由促胰液素介導(dǎo)的離子移動(dòng)已經(jīng)被證實(shí)可刺激生電Na+/HCO3-的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)，從而校正細(xì)胞內(nèi)的pH(Ishiguro等，1993)。
(d)此外，已知HCO3-水平的增加可維持粘液中，可溶且惰性的分泌蛋白(Lee等，1999)。
(e)誘導(dǎo)AQPs到質(zhì)膜中的易位和插入，使水移動(dòng)到氣道腔中。在大鼠cholangiocytes中，促胰液素已經(jīng)被證實(shí)可通過誘導(dǎo)AQP-1水通道的易位而引起滲透H2O滲透性方面，60％的濃度依賴性增加(Marinelli等，1997)。由于通過先前所述機(jī)理校正了支氣管細(xì)胞和氣道腔中的Na+，Cl-，HCO3-和pH，因此該過程還可在H2O穿過質(zhì)膜的滲透擴(kuò)散的幫助下進(jìn)行。
為支持這些方案，我們研究了促胰液素對(duì)三級(jí)支氣管組織樣品的作用。
實(shí)例例2促胰液素受體在三級(jí)支氣管中的功能活性促胰液素受體的功能活性是在三級(jí)支氣管和源于正常組織三級(jí)支氣管的上皮細(xì)胞中檢測(cè)的。
簡(jiǎn)言之，解剖源于非CF供體的人三級(jí)支氣管的非分支區(qū)，縱向切，并將其固定在改進(jìn)過的烏辛小室的兩個(gè)隔室之間，從而測(cè)量穿過支氣管壁的短路電流。在氧化的克雷布斯胞外溶液中浸泡腔(氣道)和基底膜，將組織電壓調(diào)至O，從而使短路電流的改變應(yīng)答所要測(cè)量的促胰液素。開始先將10μM濃度的阿米洛利加入到腔膜中(圖5，點(diǎn)a)(如現(xiàn)有技術(shù)中的那些所述)，從而部分阻斷主要的鈉離子流并露出基本離子流。達(dá)到穩(wěn)定基線時(shí)，將3μM人促胰液素(由Sima，目錄號(hào)S714)加入到腔膜中(圖5，點(diǎn)b)。
人們發(fā)現(xiàn)促胰液素可按照與陰離子(Cl-和/或HCO3-)移動(dòng)相同的方式刺激離子移動(dòng)(圖5)。像促胰液素，將10μM ATP或UTP加入到肺上皮的頂膜中被證實(shí)可刺激相似值的類似離子移動(dòng)。這些ATP和UTP介導(dǎo)的作用在文獻(xiàn)中被廣泛報(bào)道，其通過P2Y2 purinoceptor刺激Ca2+激活的Cl-流。所有所述的激動(dòng)劑，均以高濃度產(chǎn)生相似值的應(yīng)答。
促胰液素受體的功能性作用是在人三級(jí)支氣管的上皮細(xì)胞中探測(cè)的。簡(jiǎn)言之，三級(jí)支氣管上皮是通過整夜的蛋白酶消化分離的，然后進(jìn)行培養(yǎng)直到在Snapwell(costar)可滲透載體上融合。將所述載體固定在改進(jìn)過的烏辛小室中，并在氧化的克雷布斯胞外溶液中浸泡腔和基底膜。將細(xì)胞電壓調(diào)至0，從而使短路電流的改變應(yīng)答所要測(cè)量的促胰液素。如前所述，先將10μM阿米洛利加入到腔膜中(圖6，點(diǎn)a)，然后將100nM促胰液素加入到腔膜中(圖6，點(diǎn)b)。與在三級(jí)支氣管中觀察到的結(jié)果一致，促胰液素按照與陰離子(Cl-和/或HCO3-)相同的移動(dòng)方式刺激離子移動(dòng)。此外，加入500μM格列本脲后，CFTR的識(shí)別抑制劑不能抑制促胰液素介導(dǎo)的離子移動(dòng)，暗示在CF三級(jí)支氣管的上皮細(xì)胞中可觀察到類似的離子移動(dòng)。
實(shí)施例3CF支氣管中離子移動(dòng)的刺激使用人CF三級(jí)支氣管，和1μM促胰液素重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。所得結(jié)果在圖7中表示。在點(diǎn)(a)，加入阿米洛利可阻斷基礎(chǔ)鈉流。在點(diǎn)(b)，加入1μM促胰液素可刺激陰離子的離子移動(dòng)，從而證實(shí)非-CF支氣管中的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果。
實(shí)施例4利用促胰液素刺激三級(jí)支氣管中氯離子的流出三級(jí)支氣管上皮細(xì)胞中的離子移動(dòng)是利用Cl-特異性熒光探針MQAE(正-(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉 溴化物；Molecular Probes)表征的。簡(jiǎn)言之，按照前面所述分離原始的人三級(jí)支氣管上皮細(xì)胞，并在96孔平板中培養(yǎng)。達(dá)到融合時(shí)，用4mM MAQE整夜裝載細(xì)胞。在通過加入Cl-游離緩沖液而使Cl-被動(dòng)流出之前，在含HEPES緩沖液的氯化物中清洗該細(xì)胞。加入毫微摩爾濃度的促胰液素可刺激Cl-流出，這一點(diǎn)是通過MQAE熒光的改變而測(cè)定的。促胰液素介導(dǎo)的熒光改變是通過加入非選擇性Cl-通道阻斷劑NPPB(5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸；100μM)而消除的。所得結(jié)果在圖8中表示，它表示兩種不同濃度促胰液素的作用(空心菱形12.5nM；實(shí)心圓圈100nM)。100nM促胰液素介導(dǎo)的Cl-流出是由非選擇性Cl-阻斷劑NPPB(空心圓圈)抑制的。未刺激過的Cl-流出是通過實(shí)心正方形加以證實(shí)的。
實(shí)施例5CF三級(jí)支氣管中嗜鉻粒蛋白A的免疫反應(yīng)性將恒冷箱切片(5-7μM)從固定的低聚甲醛上切下來，用石蠟包埋5個(gè)CF和3個(gè)非-CF第四支氣管的切片，并用小鼠單克隆嗜鉻粒蛋白A抗體(Vector Laboratories Ltd；cat.No.NCL-CHROM)染色，然后用IgG第二抗體染色。使用Vector Universal Elite ABC試劑盒檢測(cè)抗體的結(jié)合。在沒有原始陰性對(duì)照且似乎沒有非特異性結(jié)合的情況下，培養(yǎng)相鄰的切片。與較少或沒有染色的正常組織和對(duì)照組相比，在用嗜鉻粒蛋白A抗體染色的CF組織中，觀察到很多孤立的內(nèi)分泌細(xì)胞。這表明S-型腸內(nèi)分泌細(xì)胞的存在是促胰液素表達(dá)調(diào)節(jié)劑的靶。因此，刺激促胰液素在這種細(xì)胞中產(chǎn)生的藥劑可用于治療CF。
實(shí)施例6促胰液素產(chǎn)生的內(nèi)源性調(diào)節(jié)檢測(cè)了17個(gè)正常供體和25個(gè)CF肺供體的三級(jí)支氣管和肺實(shí)質(zhì)中NeuroD的mRNA表達(dá)。引物探針組是為檢測(cè)NeuroD(登記號(hào)BAA76603)而特殊設(shè)計(jì)的。脫機(jī)同源性檢索顯示與在基因銀行登記的基因序列不顯著匹配。轉(zhuǎn)錄因子BETA2/NeuroD的正向和反向引物及探針序列如下正向引物 GAACGCGCCGCTAGACA (SEQ ID NO7)反向引物 GTCTCGATTTTGGACAGCTTCTG (SEQ ID NO8)探針 AGCAAGGCACCACCTTGCGCA (SEQ ID NO9)數(shù)據(jù)(圖9)是由QRT-PCR臨界循環(huán)的平均值±s.e.m.表示的，臨界循環(huán)越高，基因拷貝數(shù)/100ng tRNA越低。
在CF實(shí)質(zhì)中可觀察到NeuroD mRNA表達(dá)的顯著減少，這與在對(duì)照組和CF供體三級(jí)支氣管中較低的存在水平相似。功能性地，CF實(shí)質(zhì)中NeuroD的這種減少可能與內(nèi)源性促胰液素合成及調(diào)節(jié)的減少有關(guān)。因此，NeuroD功能性表達(dá)的提高可導(dǎo)致肺內(nèi)促胰液素內(nèi)源性水平的提高，其因此成為利用促胰液素受體的激動(dòng)來治療囊性纖維化的間接機(jī)理。
總之，促胰液素受體的刺激可用于校正CF的離子和H2O問題，減少粘液層的厚度，并改善肺的粘液纖毛清除。
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權(quán)利要求
1.一種治療CF患者囊性纖維化的方法，該方法包括給予所述患者有效量的藥劑，該藥劑可通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子的流出。
2.一種治療COPD患者COPD的方法，該方法包括給予所述患者有效量的藥劑，該藥劑可通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子的流出。
3.一種通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子流出的藥劑在制備治療囊性纖維化或COPD的藥物中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述藥劑是一種促胰液素受體配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述藥劑是圖1所示的人促胰液素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中所述藥劑是通過吸入給藥的。
7.一種含有促胰液素受體配體和至少一種具有抗CF活性的其它化合物的組合物。
8.一種含有促胰液素受體配體和至少一種具有抗COPD活性的其它化合物的組合物。
全文摘要
本發(fā)明是以促胰液素受體在人遠(yuǎn)端肺所存在的組織中表達(dá)的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)的。在CF患者中，受體水平要比正常組織高。利用促胰液素對(duì)組織進(jìn)行治療可刺激陰離子在組織中的移動(dòng)。本發(fā)明提供了通過給予患者有效量的藥劑來治療所述患者囊性纖維化或COPD的方法，其中所述藥劑可通過激活促胰液素受體而引發(fā)呼吸組織中陰離子的流出。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1452494SQ01815130
公開日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2001年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月4日
發(fā)明者R·J·達(dá)維斯, K·J·佩奇 申請(qǐng)人:基因藥品實(shí)驗(yàn)室有限公司