專利名稱：：干細(xì)胞分化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及調(diào)制干細(xì)胞分化的方法，所述方法包括將抑制性RNA(RNAi)導(dǎo)入干細(xì)胞以消除編碼與干細(xì)胞分化有關(guān)之多肽的mRNA。這些mRNA一般編碼分化的負(fù)調(diào)節(jié)物，除去這些mRNA能促使干細(xì)胞分化成特定的細(xì)胞類型。近年來(lái)，已開發(fā)出多種據(jù)稱能特異性消除基因和/或基因產(chǎn)物的技術(shù)。例如，使用反義核酸分子結(jié)合、近而阻斷或滅活靶mRNA分子不失為一種抑制基因產(chǎn)物產(chǎn)生的有效方法。在植物中，反義技術(shù)已產(chǎn)生多個(gè)顯著的表型特征，因此該方法對(duì)植物十分有效。然而，反義是可變的，因此需要篩選很多、有時(shí)為成百上千個(gè)攜帶一個(gè)或多個(gè)反義轉(zhuǎn)基因拷貝的轉(zhuǎn)基因生物體，以確保表型確實(shí)與反義轉(zhuǎn)基因表達(dá)相關(guān)聯(lián)。已將不必產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的反義技術(shù)應(yīng)用于培養(yǎng)物中的細(xì)胞，獲得了各不相同的結(jié)果。另外，經(jīng)由同源重組破壞基因的能力為生物學(xué)家限定高等生物的發(fā)育路徑提供了至關(guān)重要的工具。使用小鼠基因“剔除”品系能仔細(xì)分析基因功能以及與缺失的小鼠基因相對(duì)應(yīng)的人基因的適當(dāng)功能(JordanandZant，1998)。特異性消除基因功能的最新技術(shù)是將雙鏈RNA，也稱抑制性RNA(RNAi)導(dǎo)入細(xì)胞，從而破壞與RNAi分子中包括的序列互補(bǔ)的mRNA。RNAi分子含有兩個(gè)彼此退火以形成雙鏈RNA分子的RNA互補(bǔ)鏈(有義鏈和反義鏈)。RNAi分子一般得自待消除基因的外顯或編碼序列。最新研究表明得自編碼序列的100-1000bpRNAi分子是有效的基因表達(dá)抑制劑。令人驚奇的是阻斷基因表達(dá)只需要幾種RNAi分子，這暗示著機(jī)理是催化性的。作用位點(diǎn)似乎是細(xì)胞核，因?yàn)樵诩?xì)胞質(zhì)中好象檢測(cè)不到任何RNAi，這表明RNAi在mRNA合成或加工過(guò)程中發(fā)揮其作用。盡管有一些理論能解釋該現(xiàn)象，但仍不知道RNAi的精確作用機(jī)理。例如，所有生物已進(jìn)化產(chǎn)生保護(hù)性機(jī)理來(lái)限制外源性基因表達(dá)的作用。例如，病毒經(jīng)常對(duì)它所感染的生物體產(chǎn)生有害的作用。因此需要阻抑病毒基因表達(dá)和/或復(fù)制。另外，遺傳轉(zhuǎn)化的快速發(fā)展以及轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的供應(yīng)導(dǎo)致人們認(rèn)識(shí)到轉(zhuǎn)基因也被認(rèn)為是外源核酸，并會(huì)遇到多個(gè)被稱為消除(SingerandSelker，1995)，基因沉默(MatzkeandMatzke，1998)和共-抑制(Stametal.，2000)的現(xiàn)象。最初的使用RNAi的研究利用了線蟲Caenorhabditiselegans。將RNAi注射到蟲體，導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于含有RNAi分子的基因序列的多肽消失(Montgomeryetal.，1998；Fireetal.，1998)。最近，在多種真核生物中證實(shí)了RNAi抑制現(xiàn)象，所述生物包括例如，但不限于植物，錐蟲(Shietal.，2000)，果蠅(Drosophilaspp.)(KennerdellandCarthew，2000)。最新實(shí)驗(yàn)已證實(shí)RNAi也可在高等真核生物中起作用。例如，已證實(shí)RNAi可消除小鼠卵母細(xì)胞中的c-mos以及小鼠植入前胚胎中的E-鈣粘著蛋白(WiannyandZemicka-Goetz，2000)。這表明可以對(duì)早期胚胎細(xì)胞的發(fā)育前景施加影響。在哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中，形成胚胎的一部分直至胚泡形成的細(xì)胞據(jù)稱是全能性的(例如每個(gè)細(xì)胞都具有發(fā)育形成完整胚胎以及支持所述胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育所需的所有細(xì)胞的潛能)。在形成胚泡的過(guò)程中，含有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞據(jù)稱是多能性的(例如每個(gè)細(xì)胞具有發(fā)育形成多種組織的潛能)。原則上，胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞，具有多能性)可得自兩種胚胎來(lái)源。分離自內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞被稱為胚胎干(ES)細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)室小鼠中，類似的細(xì)胞可得自原生殖細(xì)胞培養(yǎng)物，所述原生殖細(xì)胞分離自交配后8.5-12.5天的胚胎的腸系膜或生殖嵴。這些細(xì)胞最終會(huì)分化成生殖細(xì)胞，可稱之為胚胎生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)。這些類型的多能細(xì)胞中的每一種都具有類似的、能分化成可變細(xì)胞類型的發(fā)育潛能，但行為(例如與印記有關(guān))上可能出現(xiàn)的差異導(dǎo)致這些細(xì)胞與其它細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。一般說(shuō)來(lái)，ES/EG細(xì)胞培養(yǎng)物具有定義恰當(dāng)?shù)奶卣鳌＿@些特征包括但不限于i)當(dāng)在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上維持時(shí)，可在培養(yǎng)物中維持至少20代；ii)在培養(yǎng)物中產(chǎn)生被稱為胚狀體的細(xì)胞群；iii)在單層培養(yǎng)物中能分化成多種細(xì)胞類型；iv)當(dāng)與胚胎宿主混合時(shí)，可形成胚胎嵌合體；v)表達(dá)ES/EG細(xì)胞特異性標(biāo)記。直至最近，體外培養(yǎng)人ES/EG細(xì)胞仍是不可能的。WO96/22362中首次說(shuō)明可以測(cè)定在培養(yǎng)物中建立人ES/EG細(xì)胞所需的條件。該申請(qǐng)描述了細(xì)胞系和生長(zhǎng)條件，所述條件能連續(xù)增殖靈長(zhǎng)類動(dòng)物的ES細(xì)胞，所述ES細(xì)胞表現(xiàn)出與具有多能性特征的干細(xì)胞有關(guān)的一系列特征或標(biāo)記。最近，Thomson等(1998)公開了在培養(yǎng)物中建立人ES細(xì)胞所需的條件。人ES細(xì)胞系也顯示出靈長(zhǎng)類動(dòng)物ES細(xì)胞所顯示的上述特征。另外，人細(xì)胞系還顯示出高水平的端粒酶活性，和能以未分化狀態(tài)在培養(yǎng)物中持續(xù)分裂的細(xì)胞特征。另一研究小組(Reubinoff等，2000)也報(bào)道了從人胚泡中獲得人ES細(xì)胞。第三個(gè)小組(Shamblott等，1998)描述了EG細(xì)胞的獲得。在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的存在下，ES/EG細(xì)胞的特征是它們能將以未分化狀態(tài)分裂的能力保持幾代。如果除去飼養(yǎng)層，細(xì)胞就會(huì)分化。經(jīng)常分化至神經(jīng)元或肌肉細(xì)胞，但仍不清楚其精確的發(fā)生機(jī)理及其控制方式。除了ES/EG細(xì)胞外，多種成年組織含有具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞。通常，盡管這些細(xì)胞保留了分化成不同細(xì)胞類型的能力，但它們不具有ES/EG細(xì)胞的多能性特征。例如，造血干細(xì)胞具有形成所有造血系統(tǒng)細(xì)胞(紅血細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜堿細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞等)的潛能。所有神經(jīng)組織，皮膚和肌肉保留了具有干細(xì)胞潛能的細(xì)胞庫(kù)。因此，除了在發(fā)育生物學(xué)中能使用胚胎干細(xì)胞外，也有一些成年干細(xì)胞能用于測(cè)定控制細(xì)胞分化的因子。最新研究表明一些以前被認(rèn)為只會(huì)定向分化成單個(gè)組織(例如神經(jīng)元)的干細(xì)胞在某些情況下實(shí)際上具有相當(dāng)大的多能性。最近已證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞能與小鼠胚胎嵌合并形成寬范圍的非-神經(jīng)組織(Clark等，2000)。另一組與發(fā)育生物學(xué)相關(guān)的細(xì)胞是畸胎瘤細(xì)胞(EC細(xì)胞)。這些細(xì)胞形成被稱為畸胎瘤的腫瘤，并具有很多與ES/EG細(xì)胞共同的特征。其中最重要的特征是多能性特征。畸胎瘤含有寬范圍的分化組織，數(shù)百年前，就已知人的畸胎瘤。它一般作為男性和女性的性腺腫瘤出現(xiàn)。一般相信這些腫瘤的性腺形式源自生殖細(xì)胞，據(jù)認(rèn)為通常具有相同組織范圍的多余性腺形式是由胚胎發(fā)生過(guò)程中錯(cuò)誤遷移的生殖細(xì)胞引起的。因此，一般將畸胎瘤歸類為包含多種不同類型癌癥的生殖細(xì)胞腫瘤。這些癌癥包括精原細(xì)胞瘤，胚胎瘤，卵黃囊瘤和絨毛膜瘤。已將EC細(xì)胞與ES/EG細(xì)胞類似的生物學(xué)用于研究細(xì)胞的發(fā)育方向以及鑒定EC細(xì)胞和ES/EG細(xì)胞共同表達(dá)的細(xì)胞標(biāo)記。例如但不限于特異性細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA-3(+)，SSEA-4(+)，TRA-1-60(+)，TRA-1-81(+)(Shevinsky等1982；Kannagi等1983；Andrews等1984a；Thomson等，1995)；堿性磷酸酶(+)(Andrews等，1996)和Oct4(Scholer等，1989；Kraft等，1996；Reubinoff等，2000；Yeom等，1996)的表達(dá)。我們積累了表達(dá)研究，所述研究已鑒定出多個(gè)據(jù)認(rèn)為參與決定干細(xì)胞、特別是胚胎干細(xì)胞的發(fā)育方向的基因。通過(guò)Northern印跡，我們鑒定出兩個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的人同系物的表達(dá)，據(jù)信所述途徑對(duì)于決定細(xì)胞命運(yùn)而言是至關(guān)重要的。已闡明Notch和Wingless信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的配體，受體和下游組分的表達(dá)。我們使用模型系統(tǒng)NTERA2/D1胚胎瘤細(xì)胞，記錄細(xì)胞分化時(shí)一些組分表達(dá)的變化。記住這些級(jí)聯(lián)系統(tǒng)在動(dòng)物界胚胎發(fā)育過(guò)程中所起的作用，這些變化表明Wingless和Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)干細(xì)胞分化起著顯著作用。另外，一些基因的活性是沿特定途徑發(fā)生分化所必需的，例如肌源基因MyoD1。其它基因具有抑制沿特定途徑的細(xì)胞分化的活性。我們?cè)O(shè)想通過(guò)下列方法調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化以產(chǎn)生特定的細(xì)胞類型(i)抑制某些通常能促進(jìn)沿特定途徑分化的基因；因此促進(jìn)分化以改變細(xì)胞表型；(ii)抑制防止分化成特定細(xì)胞類型的基因活性；和(iii)(i)和(ii)的組合，見(jiàn)圖1胚胎發(fā)生，成年組織更新和創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的干細(xì)胞分化受到很嚴(yán)格的調(diào)節(jié)該調(diào)節(jié)過(guò)程的畸變會(huì)導(dǎo)致形成發(fā)育過(guò)程中的新生缺陷，并被認(rèn)為可以導(dǎo)致成年人形成癌癥。一般說(shuō)來(lái)，人們?cè)O(shè)想使這種干細(xì)胞處于正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)之下，從而使對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化過(guò)程的控制達(dá)到精細(xì)的水平在損害細(xì)胞分化的情況下過(guò)度增殖可導(dǎo)致形成組織腫塊-癌癥-而在損害增殖的情況下過(guò)度分化可導(dǎo)致?lián)p失干細(xì)胞并長(zhǎng)期產(chǎn)生極小的分化組織，尤其會(huì)喪失再生潛能。已鑒定出某些基因?qū)Ψ乐垢杉?xì)胞分化具有負(fù)作用。所述基因與Notch家族中的基因一樣，當(dāng)經(jīng)突變獲得活性時(shí)，可以抑制分化；所述突變基因作為癌基因起作用。相反，這種基因抑制功能的喪失會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞分化。我們建議使用EC細(xì)胞作為我們的模型細(xì)胞系統(tǒng)以跟蹤RNAi對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的作用。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了調(diào)制干細(xì)胞分化狀態(tài)的方法，所述方法包括(i)使干細(xì)胞與至少一種抑制性RNA(RNAi)分子接觸，所述分子含有能介導(dǎo)所述細(xì)胞分化的至少一個(gè)步驟的基因序列或其有效部分；(ii)提供有助于上述(i)中處理的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的條件；和任選地(iii)維持和/或儲(chǔ)存分化狀態(tài)的細(xì)胞。上述(i)中的干細(xì)胞可以是畸胎瘤細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述條件是體外細(xì)胞培養(yǎng)條件。在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述干細(xì)胞選自多能性干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞；和譜系受限的干細(xì)胞，例如但不限于造血干細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，皮膚真皮鞘干細(xì)胞。顯然，該方法可提供中間定型的干細(xì)胞。例如，胚胎干細(xì)胞可按程序分化成具有有限定型的造血干細(xì)胞?；蛘撸虚g定型的分化細(xì)胞或干細(xì)胞能重新按程序進(jìn)入更加多能的狀態(tài)，由此可獲得其它分化的細(xì)胞譜系。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因編碼干細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面受體。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述細(xì)胞表面受體選自人Notch1(hNotch1)；hNotch2；hNotch3；hNotch4；TLE-1；TLE-2；TLE-3；TLE-4；TCF7；TCF7L1；TCFFL2；TCF3；TCF19；TCFl；mFringe；lFringe；rFringe；sel1；Numb；Numblike；LNX；FZD1；FZD2；FZD3；FZD4；FZD5；FZD6；FZD7；FZD8；FZD9；FZD10；FRZB。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因編碼配體。通常，配體是與相關(guān)受體結(jié)合以誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間反應(yīng)的多肽。配體可以是可溶性的或與膜結(jié)合的。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述配體選自D11-1；D113；D114；Dlk-1；Jagged1；Jagged2；Wnt1；Wnt2；Wnt2b；Wnt3；Wnt3a；Wnt5a；Wnt6；Wnt7a；Wnt7b；Wnt8a；Wnt8b；Wnt10b；Wnt11；Wnt14；Wnt15?；蛘撸龌蜻x自SFRP1；SFRP2；SFRP4；SFRP5；SK；DKK3；CER1；WIF-1；DVL1；DVL2；DVL3；DVL1L1；mFringe；lFringe；rFringe；selll；Numb；LNXOct4；NeuroD1；NeuroD2；NeuroD3；Brachyury；MDFI。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述序列含有至少一個(gè)列入本文作為參考的表4中鑒定的序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因選自DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因是DLK1。優(yōu)選DLK1RNAi分子得自含有圖2a所示序列的核酸序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因是Oct4。優(yōu)選Oct4RNAi分子得自含有圖2b所示序列的核酸序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因是hNotch1。優(yōu)選所述hNotch1RNAi分子得自含有圖2c所示序列的核酸序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因是hNotch2。優(yōu)選所述hNotch2RNAi分子得自含有圖2d所示序列的核酸序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因是RBPJk。優(yōu)選所述RBPJkRNAi分子得自含有圖2e所示序列的核酸序列。RBPJk也被稱為CBF-1。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的方法中，所述基因是CIR。優(yōu)選所述CIRRNAi分子得自含有圖2f所示序列的核酸序列。最近30年來(lái)，已開發(fā)出很多種便于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法，所述方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并可用于RNAi。將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的方法一般包括使用化學(xué)試劑，陽(yáng)離子脂質(zhì)或物理方法。便于細(xì)胞攝入DNA的化學(xué)方法包括使用DEAE-Dextran(VaheriandPaganoScience175p434)。DEAE-dextran是帶負(fù)電的陽(yáng)離子，它與核酸結(jié)合并將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。磷酸鈣也是常用的化學(xué)試劑，當(dāng)與核酸共沉淀時(shí)，可將核酸導(dǎo)入細(xì)胞(Graham等，Virology(1973)52p456)。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如脂質(zhì)體(Felgner(1987)Proc.Natl.Acad.SciUSA，84p7413))已成為一種普通的方法。脂質(zhì)的陽(yáng)離子頭與待導(dǎo)入的帶負(fù)電的核酸骨架結(jié)合。脂質(zhì)/核酸復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合并與細(xì)胞融合以將結(jié)合的核酸導(dǎo)入細(xì)胞。與現(xiàn)有的方法相比，脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，使用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移能更加容易地轉(zhuǎn)染對(duì)傳統(tǒng)的化學(xué)方法不適應(yīng)的細(xì)胞。最近，導(dǎo)入核酸的物理方法已成為可再現(xiàn)地轉(zhuǎn)染細(xì)胞的有效方法。直接進(jìn)行微量注射就是這樣一種方法，它可以將核酸直接傳遞至細(xì)胞核(Capecchi(1980)Cell，22p479)。該方法允許分析單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染子。所謂的“biolistic”法使用顆粒槍將核酸物理射入細(xì)胞和/或細(xì)胞器(Neumann(1982)EMBOJ，1p841)。電穿孔是可論證的、最常用于轉(zhuǎn)染核酸的方法。該方法包括使用高壓電荷瞬間穿透細(xì)胞膜，使它們能透過(guò)大分子復(fù)合物。最近，一種被稱為免疫穿孔的方法已成為公認(rèn)的、用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)，參見(jiàn)Bildirici等，Nature(2000)405，p298。該技術(shù)包括使用被針對(duì)特異性受體的抗體包被的珠。轉(zhuǎn)染混合物包括核酸，抗體包被的珠和表達(dá)特異性細(xì)胞表面受體的細(xì)胞。包被的珠結(jié)合細(xì)胞表面受體，當(dāng)將剪切力應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)，珠會(huì)從細(xì)胞表面剝離。在除去珠的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生瞬時(shí)的小洞，籍此核酸和/或其它生物分子能進(jìn)入細(xì)胞。根據(jù)所用核酸的不同，可獲得40-50％的轉(zhuǎn)染效率。另外，通過(guò)使RNAi與特異性抗體，配體或受體結(jié)合或連接，可以增強(qiáng)RNAi的細(xì)胞傳遞特異性。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了RNAi分子，其特征在于它含有至少一種基因的編碼序列，所述基因介導(dǎo)干細(xì)胞分化中的至少一個(gè)步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述編碼序列是外顯子?；蛘?，所述RNAi分子得自內(nèi)含子序列或5’和/或3’-非編碼序列，所述序列側(cè)翼于介導(dǎo)干細(xì)胞分化的基因的編碼/外顯子序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNAi分子的長(zhǎng)度為100bp-1000bp之間。更優(yōu)選RNAi的長(zhǎng)度選自100bp；200bp；300bp；400bp；500bp；600bp；700bp；800bp；900bp；或1000bp。更優(yōu)選所述RNAi至少為1000bp。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，RNAi分子的長(zhǎng)度為15bp和25bp之間，優(yōu)選所述分子為21bp。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNAi分子含有列入本文作為參考的表4中鑒定的序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述RNAi分子得自選自下列的基因DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。優(yōu)選所述RNAi分子含有選自圖2a-2f所示核酸序列的核酸序列。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述RNAi分子含有經(jīng)修飾的核糖核苷酸堿基。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道包含經(jīng)修飾的堿基，以及天然堿基胞嘧啶，尿嘧啶，腺苷和鳥苷可賦予含有所述經(jīng)修飾堿基的RNAi分子以有利特性。例如，經(jīng)修飾的堿基可增加RNAi分子的穩(wěn)定性，從而減少產(chǎn)生所需效果所需的量。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離的DNA分子，其含有如表4中鑒定的DNA登記號(hào)所示的基因序列，所述基因介導(dǎo)干細(xì)胞分化中的至少一個(gè)步驟，其特征在于所述DNA與至少一種能促進(jìn)與其連接的所述DNA轉(zhuǎn)錄的其它DNA分子(“啟動(dòng)子”)可操作連接。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因選自DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。優(yōu)選所述DNA含有選自圖2a-2f所示序列的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因與至少兩種啟動(dòng)子一起被提供，其特征在于所述啟動(dòng)子的定向使得含有所述DNA分子的兩條DNA鏈被轉(zhuǎn)錄成RNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道通過(guò)提供包括與啟動(dòng)子序列可操作連接的靶基因或靶基因片段的載體，可以合成形成RNAi的RNA分子。通常，啟動(dòng)子序列是噬菌體RNA聚合酶啟動(dòng)子(例如T7，T3，SP6)。提供具有多克隆位點(diǎn)的載體是有利的，因?yàn)榭蓪⒒蚧蚧蚱蝸喛寺≈了鑫稽c(diǎn)。通常需改造載體，使得噬菌體啟動(dòng)子側(cè)翼于含有所需基因的多克隆位點(diǎn)。噬菌體啟動(dòng)子的定向使得一個(gè)啟動(dòng)子合成有義RNA，另一個(gè)噬菌體啟動(dòng)子合成反義RNA。因此，能方便地合成RNAi?；蛘?，可通過(guò)經(jīng)由寡-合成技術(shù)產(chǎn)生嵌合啟動(dòng)子/基因融合物，而將靶基因或靶基因片段直接與噬菌體啟動(dòng)子融合。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)能容易地?cái)U(kuò)增所產(chǎn)生的構(gòu)建體，從而為制備含有RNAi的RNA分子提供模板。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含本發(fā)明的DNA分子的載體。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了制備RNAi分子的方法，所述方法包括(i)提供根據(jù)本發(fā)明的DNA分子或載體；(ii)提供能合成含有所述RNAi分子的每條RNA鏈的試劑和條件；和(iii)提供使每條RNA鏈至少在部分長(zhǎng)度上，或者至少在對(duì)應(yīng)于編碼所述干細(xì)胞基因的核酸序列的部分能夠結(jié)合的條件，所述基因介導(dǎo)干細(xì)胞分化。優(yōu)選所述基因或基因片段選自表4所示的基因。RNA的體外轉(zhuǎn)錄是已建立的方法學(xué)。試劑盒可以商購(gòu)，其中提供了便于產(chǎn)生RNA的載體，核糖核苷三磷酸，緩沖液，RNase抑制劑，RNA聚合酶(如噬菌體T7，T3，SP6)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了促進(jìn)干細(xì)胞分化的體內(nèi)法，所述方法包括給動(dòng)物施用有效量的、足以影響靶干細(xì)胞分化的根據(jù)本發(fā)明的RNAi。優(yōu)選所述方法促進(jìn)內(nèi)源性干細(xì)胞的體內(nèi)分化以原位修復(fù)組織損害。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道RNAi依靠靶基因RNA和RNAi分子之間的同源性。這會(huì)在靶向干細(xì)胞時(shí)賦予RNAi分子顯著水平的特異性。例如，在骨髓中發(fā)現(xiàn)造血干細(xì)胞，可通過(guò)直接注射至骨髓組織而將RNAi分子施用給動(dòng)物?？蓪NAi分子裹入脂質(zhì)體膠囊中，以提供免受動(dòng)物免疫系統(tǒng)和/或動(dòng)物血清中存在的核酸酶破壞的保護(hù)作用。脂質(zhì)體是脂質(zhì)基載體，它將選定的治療劑裹入膠囊中，然后導(dǎo)入患者。通常，可由純的磷脂或磷脂和磷酸甘油酯的混合物制備脂質(zhì)體。一般情況下，所制備的脂質(zhì)體的直徑小于200nm，這樣可以使其被注射至靜脈內(nèi)，并能穿過(guò)肺毛細(xì)血管床。另外，脂質(zhì)體的生物化學(xué)特性賦予其穿透血管膜的穿透性，從而能進(jìn)入選定組織。脂質(zhì)體還具有相對(duì)較短的半壽期。已開發(fā)出所謂的STEALTH脂質(zhì)體，它含有包被在聚乙二醇(PEG)中的脂質(zhì)體。當(dāng)靜脈內(nèi)給藥于患者時(shí)，經(jīng)PEG處理的脂質(zhì)體具有顯著增加的半壽期。另外，STEALTH脂質(zhì)體顯示出減少的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝入和增強(qiáng)的選定組織積累。另外，已開發(fā)出所謂的免疫-脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體將脂質(zhì)基載體與一種或多種抗體混合，用于增加RNAi分子傳遞至選定細(xì)胞/組織的特異性。US5580575和US5542935中描述了脂質(zhì)體作為傳遞工具的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道可以以口或鼻噴霧劑，氣霧劑，懸浮劑，乳劑和/或滴眼液的方式提供RNAi分子。或者也可以以片劑的形式提供RNAi分子?；蛘?，傳遞方式包括吸入或噴霧。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療組合物，其含有至少一種本發(fā)明的RNAi分子。優(yōu)選所述RNAi分子用于制備藥劑，所述藥劑可用于促進(jìn)干細(xì)胞分化以提供分化的細(xì)胞/組織用以治療疾病，其中細(xì)胞/組織被所述疾病破壞。所述疾病一般包括惡性貧血；中風(fēng)，神經(jīng)變性疾病，如帕金森病，早老性癡呆；冠狀心臟病；肝硬化；糖尿病。顯然，可以使用分化的干細(xì)胞替換因?yàn)槔缣鎿Q脊髓組織而損害的神經(jīng)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述治療性組合物還含有稀釋劑，載體或賦形劑。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了治療性的細(xì)胞組合物，其含有通過(guò)導(dǎo)入本發(fā)明的RNAi分子或組合物而產(chǎn)生的分化細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞；間充質(zhì)細(xì)胞；肌肉細(xì)胞(心肌細(xì)胞)；肝細(xì)胞；腎細(xì)胞；血液細(xì)胞(如紅細(xì)胞，CD4+淋巴細(xì)胞，CD8+淋巴細(xì)胞)；胰腺β細(xì)胞；上皮細(xì)胞(如肺，胃)；和內(nèi)皮細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了至少一種含有至少一種本發(fā)明的細(xì)胞的器官。以下將參照下列附圖和表，僅通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明的實(shí)施方案。表1描述了用于監(jiān)測(cè)干細(xì)胞分化的抗體的選擇；表2描述了用于評(píng)價(jià)干細(xì)胞分化的mRNA標(biāo)記的核酸探針；表3描述了干細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)標(biāo)記；表4描述了用于產(chǎn)生基因特異性抑制所用的RNAi的特異性引物和具有DNA數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)的基因序列；表5簡(jiǎn)要描述了圖3所示的FACS數(shù)據(jù)；圖1闡明干細(xì)胞分化受正和負(fù)調(diào)節(jié)物的控制(A)。所獲得的特定細(xì)胞表型是激活或抑制特定分化事件的正和負(fù)調(diào)節(jié)物的直接結(jié)果?？梢允褂肦NAi控制干細(xì)胞最初的分化(A)，并通過(guò)阻抑一般會(huì)促進(jìn)特定細(xì)胞命運(yùn)的正激活物來(lái)控制分化細(xì)胞D1和D2最終的命運(yùn)；圖2a描述了用于擴(kuò)增δ-樣1(DLK1)的正向和反向引物以及擴(kuò)增的序列；圖2b描述了用于擴(kuò)增Oct4的正向和反向引物以及擴(kuò)增的序列；圖2c描述了用于擴(kuò)增Notch1的正向和反向引物以及擴(kuò)增的序列；圖2d描述了用于擴(kuò)增Notch2的正向和反向引物以及擴(kuò)增的序列；圖2e描述了用于擴(kuò)增RBPJK的正向和反向引物以及擴(kuò)增的序列；和圖2f描述了用于擴(kuò)增CIR的正向和反向引物以及擴(kuò)增的序列；圖3描述了用針對(duì)Notch(A)，RBPJk(B)，Oct4(C)的RNAi和對(duì)照RNAi(D)轉(zhuǎn)染之后，監(jiān)測(cè)NTERA2c1D1人EC細(xì)胞的SSEA3表達(dá)的FACS掃描圖。用針對(duì)a)Notch1和Notch2；b)RBPJk；c)Oct4的RNAi；和d)對(duì)照RNAi轉(zhuǎn)染4天之后，通過(guò)流式細(xì)胞熒光測(cè)定分析NTERA2c1D1人EC細(xì)胞的SSEA3表達(dá)。每組顯示出兩個(gè)在用單克隆抗體MC631(抗SSEA3)，接著用經(jīng)FITC標(biāo)記的山羊抗-小鼠IgM染色細(xì)胞之后，細(xì)胞數(shù)目對(duì)log熒光強(qiáng)度(任意單位)的直方圖。在每組中，一個(gè)直方圖得自用除RNAi以外的所有相關(guān)試劑處理的“模擬”轉(zhuǎn)染細(xì)胞；每組中的第二個(gè)直方圖得自用針對(duì)上述基因套的RNAi處理過(guò)的細(xì)胞。注意在描述SSEA3+和SSEA3-群體(分別被標(biāo)記為M1和M2的區(qū)域)的所有情況下，細(xì)胞表現(xiàn)出兩種形式的直方圖。注意在用針對(duì)Notch1和Notch2(A組)和Oct4(C組)的RNAi處理之后，SSEA3+群體的熒光強(qiáng)度明顯下移，這顯示出干細(xì)胞分化的證據(jù)。在用RBPJk處理的細(xì)胞(B組)中，也能明顯看到向下的較小變化。如果這些基因產(chǎn)物在維持未分化的EC細(xì)胞表型中起作用，并且如果用針對(duì)導(dǎo)致這些關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)蛋白下調(diào)的相應(yīng)mRNA的RNAi處理的話，這種結(jié)果就是預(yù)期的結(jié)果。相反，用對(duì)照RNAi(D組)處理不會(huì)導(dǎo)致SSEA3的任何下調(diào)。SSEA3的表達(dá)似乎是未分化的EC干細(xì)胞表型的非常敏感的標(biāo)記，并且是通過(guò)分化而消失的最快速的標(biāo)記之一(Fenderson等，1987；Andrews等，1996)。類似地，人ES細(xì)胞也表達(dá)SSEA3(Thomson等，1998)，通過(guò)其分化也可快速消失(PWAndrews和JSDraper，結(jié)果未公開)；圖4描述了(A)闡明Notch和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的圖。圖中顯示了Notch和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑。δ/Serrate/Lag(DSL)家族的配體結(jié)合Notch受體，導(dǎo)致激活Hairless(Su-H)/CBF1/RBPJk的抑制基因，并使靶基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。(B)通過(guò)Northern印跡分析NTERA2EC細(xì)胞中DLS配體Dlk和Notch靶基因TLE1的表達(dá)。將TLE1鑒定為NTERA2EC細(xì)胞中Notch途徑的靶基因。在視黃酸誘導(dǎo)的分化過(guò)程中，TLE1顯示出與DSL配體Dlk1高度類似的表達(dá)模式。用RA處理3天(RA3)后，兩個(gè)基因顯著下調(diào)。在隨后的時(shí)間點(diǎn)，可觀察到表達(dá)在漸進(jìn)恢復(fù)，一直到RA處理21天(RA21)后。TLE1下調(diào)表明細(xì)胞已進(jìn)入分化途徑。(C)對(duì)經(jīng)RNAi處理的ES細(xì)胞中的TLE1和HASH1進(jìn)行RTPCR分析。用dsRNA處理3天后，對(duì)TLE1和HASH1進(jìn)行RT-PCR。泳道1水；泳道2未經(jīng)處理的ES細(xì)胞；泳道3模擬轉(zhuǎn)染；泳道4Notch1&2dsRNA；泳道5Dlk1dsRNA；泳道6RBPJkdsRNA；泳道7CIRdsRNA；泳道8Oct4dsRNA；泳道9對(duì)照dsRNA。注意泳道5和6中的TLE1表達(dá)特異性降低，在所述泳道對(duì)應(yīng)的樣品中，Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑的組分已被dsRNA靶向。還注意到泳道5中出現(xiàn)HASH1。這些數(shù)據(jù)表明細(xì)胞開始運(yùn)行神經(jīng)分化程序(delaPompa等，ConservationoftheNotchsignallingpathwayinmammalianneurogenesis，Development124，1139-1148(1997))。Notch1&2dsRNA無(wú)法導(dǎo)致類似效果的原因是受體系統(tǒng)的功能過(guò)多，或與其它途徑組分相關(guān)的受體過(guò)度豐富。圖5描述了人ES細(xì)胞的RNAi，其中使用了得自不同的、與干細(xì)胞分化有關(guān)的基因的RNAi分子，并使用RTPCR監(jiān)測(cè)mRNA的穩(wěn)態(tài)水平。用dsRNA處理3天后，通過(guò)RTPCR分析人胚胎干細(xì)胞中靶轉(zhuǎn)錄物的豐度。泳道1水；泳道2未經(jīng)處理的ES細(xì)胞；泳道3模擬轉(zhuǎn)染；泳道4Notch1&2dsRNA；泳道5Dlk1dsRNA；泳道6RBPJk(CBF1)dsRNA；泳道7CIRdsRNA；泳道8Oct4dsRNA；泳道9對(duì)照dsRNA。注意用dsRNA處理之后，靶轉(zhuǎn)錄物豐度的特異性降低至少持續(xù)3天。在用Notch1&2，RBPJk(CBF1)和Oct4dsRNA處理的細(xì)胞中，這種效果尤其明顯。將β肌動(dòng)蛋白PCR用作PCR的模板上樣對(duì)照。圖6描述了NTERA2/D1的RNAi，其中使用了得自不同的、與干細(xì)胞分化有關(guān)的基因的RNAi分子，并使用RTPCR監(jiān)測(cè)mRNA的穩(wěn)態(tài)水平。用dsRNA處理17小時(shí)后，通過(guò)RTPCR分析人胚胎瘤細(xì)胞系NTERA2中靶轉(zhuǎn)錄物的豐度。泳道1水；泳道2未經(jīng)處理的EC細(xì)胞；泳道3Oct4dsRNA；泳道4對(duì)照dsRNA；泳道5RBPJkdsRNA；泳道6Notch1&2dsRNA；泳道7模擬轉(zhuǎn)染。注意靶轉(zhuǎn)錄物豐度的特異性降低至少持續(xù)3天。在用Notch1&2，RBPJk(CBF1)和Oct4dsRNA處理的細(xì)胞中，這種效果尤其明顯。將β肌動(dòng)蛋白PCR用作PCR的模板上樣對(duì)照。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)在含10％CO2的潮濕氣氛中，在添加有10％v/v胎牛血清(GIBCOBRL)的DMEM(高葡萄糖配方)(DMEM)(GIBCOBRL)內(nèi)，按文獻(xiàn)(Andrews等，1982，1984b)所述，以高細(xì)胞密度維持NTERA2和2102Ep人EC細(xì)胞系。合成雙鏈RNA針對(duì)所需mRNA序列設(shè)計(jì)PCR引物以使產(chǎn)物大小為500bp左右。在每個(gè)引物的5’末端添加T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，其含有下列序列之一TAATACGACTCACTATAGGG；AATTATAATACGACTCACTATA。使用這些引物對(duì)適當(dāng)?shù)腸DNA來(lái)源(例如得自欲靶向的細(xì)胞類型)進(jìn)行PCR，克隆產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)其同一性。使用經(jīng)測(cè)序的克隆為模板，按需要再次進(jìn)行PCR以產(chǎn)生RNA合成所用的模板DNA。在每種情況下，通過(guò)瓊脂糖電泳少量PCR產(chǎn)物以證實(shí)產(chǎn)物大小和豐度，而通過(guò)堿性苯酚/氯仿提取純化其余PCR產(chǎn)物。根據(jù)廠商提供的方法，使用Megascript試劑盒(Ambion公司)合成RNA，并用酸性苯酚/氯仿提取所述RNA。在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)合成RNA互補(bǔ)鏈?zhǔn)沟脤?duì)退火步驟的需求不復(fù)存在。然而，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步證實(shí)合成RNA的品質(zhì)和雙鏈化，所需產(chǎn)物的遷移方式與所預(yù)期的相同長(zhǎng)度的雙鏈DNA的遷移方式相同。用dsRNA處理人細(xì)胞以產(chǎn)生RNAi下列方法描述了6孔培養(yǎng)板中所培養(yǎng)細(xì)胞的RNAi。針對(duì)較大或較小的培養(yǎng)容器，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)體積和細(xì)胞數(shù)目的規(guī)模。在處理前一天，以每孔500,000個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞，并在其普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。針對(duì)待處理的每個(gè)孔，用300μl150mMNaCl稀釋9.5μg所需雙鏈RNA。在稀釋的RNA溶液中加入21μlExGen500(MBIFermentas)，渦旋混合。室溫下保溫dsRNA/ExGen500混合物10分鐘。然后加入3ml新鮮的細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，產(chǎn)生RNAi處理培養(yǎng)基。從培養(yǎng)容器中吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每孔替代以3mlRNAi處理培養(yǎng)基。然后以280g離心培養(yǎng)容器5分鐘，再將培養(yǎng)容器放回溫箱中。12-18小時(shí)之后，用普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換RNAi處理培養(yǎng)基，按需維持細(xì)胞。產(chǎn)生Oct4RNAi針對(duì)所需的Oct4mRNA序列設(shè)計(jì)PCR引物以使產(chǎn)物大小為500bp左右。在每個(gè)引物的5’末端添加T7RNA聚合酶啟動(dòng)子，其含有下列序列taatacgactcactataggg。使用這些引物對(duì)適當(dāng)?shù)腸DNA來(lái)源(例如得自欲靶向的細(xì)胞類型)進(jìn)行PCR，克隆產(chǎn)物，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)其同一性。使用經(jīng)測(cè)序的克隆為模板，按需要再次進(jìn)行PCR以產(chǎn)生RNA合成所用的模板Oct4DNA。在每種情況下，通過(guò)瓊脂糖電泳少量PCR產(chǎn)物以證實(shí)產(chǎn)物大小和豐度，而通過(guò)堿性苯酚/氯仿提取純化其余PCR產(chǎn)物。根據(jù)廠商提供的方法，使用Megascript試劑盒(Ambion公司)合成RNA，并用酸性苯酚/氯仿提取所述RNA。在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)合成RNA互補(bǔ)鏈?zhǔn)沟脤?duì)退火步驟的需求不復(fù)存在。然而，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步證實(shí)合成RNA的品質(zhì)和雙鏈化，所需產(chǎn)物的遷移方式與所預(yù)期的相同長(zhǎng)度的雙鏈DNA的遷移方式相同。用Oct4dsRNA處理人EC細(xì)胞以產(chǎn)生RNAi下列方法描述了6孔培養(yǎng)板中所培養(yǎng)細(xì)胞的Oct4RNAi。針對(duì)較大或較小的培養(yǎng)容器，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)體積和細(xì)胞數(shù)目的規(guī)模。在處理前一天，以每孔500,000個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞，并在其普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在處理的當(dāng)天，在待處理的每個(gè)孔中的100μlOptimem(GibcoBRL)內(nèi)加入每份為15μl的Lipofectin(GibcoBRL)等分試樣。同時(shí)，在待處理的每個(gè)孔中的300μlOptimem內(nèi)加入6μgOct4dsRNA。室溫下保溫Lipofectin-Optimem和dsRNA-Optimem溶液40分鐘，然后混合產(chǎn)生每孔總體積約為415μl的RNAi處理培養(yǎng)基。使用前在室溫下將處理培養(yǎng)基保溫10分鐘。屆時(shí)，從細(xì)胞中吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并用3mlPBS沖洗每個(gè)孔。然后用RNAi處理培養(yǎng)基代替PBS進(jìn)行沖洗，每孔再添加0.5mlOptimem。將培養(yǎng)容器放回溫箱中達(dá)6.5小時(shí)，然后吸出處理培養(yǎng)基，替代以普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基。處理3天后，通過(guò)PCR檢測(cè)靶mRNA抑制作用。將RNAi導(dǎo)入細(xì)胞系在6孔培養(yǎng)板中的3cm3Dulbecco改進(jìn)的Eagles培養(yǎng)基內(nèi)，以2×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種人EC干細(xì)胞，放置3小時(shí)。在培養(yǎng)基中加入6μgRNAi，室溫下振蕩細(xì)胞30分鐘。在培養(yǎng)基中加入胎牛血清(GIBCOBRL)至濃度為10％，培養(yǎng)細(xì)胞。產(chǎn)生總RNA抽吸生長(zhǎng)中的細(xì)胞培養(yǎng)物以除去DME和胎牛血清。通過(guò)用磷酸緩沖鹽水沖洗除去極少量的胎牛血清。在細(xì)胞中加入新鮮的PBS，使用酸洗玻璃珠從培養(yǎng)容器中取出細(xì)胞。以300xg離心所得細(xì)胞懸浮液。從沉淀物中吸出PBS。以1ml/107個(gè)細(xì)胞的量加入Tri試劑(Sigma，USA)，室溫下放置10分鐘。于4℃，以12000xg將該反應(yīng)的裂解物離心15分鐘。將所得水相轉(zhuǎn)移至新容器中，加入0.5ml異丙醇/mltrizol以沉淀RNA。于4℃，以12000xg離心10分鐘以沉淀RNA。除去上清液，用70％乙醇洗滌沉淀物。將經(jīng)洗滌的RNA溶解于經(jīng)DEPC處理的雙蒸水中。分析因暴露于RNAi而導(dǎo)致的EC干細(xì)胞分化暴露于對(duì)應(yīng)于特定的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)基因的RNAi之后，用多種方法監(jiān)測(cè)EC細(xì)胞隨后的分化。一種方法是監(jiān)測(cè)干細(xì)胞表型典型標(biāo)記的消失；另一種方法是監(jiān)測(cè)與所導(dǎo)致的特定譜系有關(guān)的標(biāo)記的出現(xiàn)。相關(guān)標(biāo)記包括表面抗原，mRNA類和特定的蛋白質(zhì)。通過(guò)抗體染色和FACS分析轉(zhuǎn)染子用胰蛋白酶(0.25％v/v)將細(xì)胞處理5分鐘以分散細(xì)胞；洗滌并重新懸浮細(xì)胞至2×105個(gè)細(xì)胞/ml。于4℃，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上，在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，將該細(xì)胞懸浮液與50μl第一抗體保溫1小時(shí)。將骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8的上清液用作陰性對(duì)照。以100rpm離心96孔培養(yǎng)板3分鐘。用含有5％胎牛血清的PBS將培養(yǎng)板洗滌3次以除去未結(jié)合的抗體。然后于4℃，將細(xì)胞與50μl適當(dāng)?shù)腇ITC-綴合的第二抗體保溫1小時(shí)。用PBS+5％胎牛血清將細(xì)胞洗滌3次，并使用EPICSeliteESP流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Coultereletronics，U.K.)進(jìn)行分析(Andrews等，1982)。對(duì)RNA進(jìn)行Northern印跡分析RNA分離所依賴的原理一般與標(biāo)準(zhǔn)DNA相同，但不同的是RNA傾向于與其自身或其它RNA分子雜交。在凝膠基質(zhì)中使用甲醛以與RNA的胺基反應(yīng)并形成Schiff堿。對(duì)純化的RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳。對(duì)大多數(shù)RNA而言，1％瓊脂糖凝膠就足夠了。在1XMOPS緩沖液中制備瓊脂糖，并加入0.66M甲醛。重建干燥的RNA樣品，在RNA上樣緩沖液中變性，并上樣于凝膠中。電泳凝膠約3小時(shí)(直至染料到達(dá)凝膠的3/4處)。獲得RNA的清晰印跡的主要問(wèn)題是存在甲醛。將電泳過(guò)的凝膠浸泡在蒸餾水中20分鐘，并且換4次水，以從基質(zhì)中除去甲醛。轉(zhuǎn)移部件的裝配方式與DNA(Southern)印跡的完全相同。但是所用轉(zhuǎn)移緩沖液是10XSSPE。將凝膠轉(zhuǎn)移過(guò)夜。將膜浸泡在2XSSPE中以從轉(zhuǎn)移部件中除去任何瓊脂糖，將RNA固定在膜上。使用短-波(254nM)UV光進(jìn)行固定。將固定的膜烘1-2小時(shí)以驅(qū)除任何殘留的甲醛。在含甲酰胺的水相中進(jìn)行雜交以降低給定探針的雜交溫度。在Northern預(yù)雜交溶液中使RNA印跡預(yù)雜交2-4小時(shí)。于95℃將經(jīng)標(biāo)記的DNA探針變性5分鐘，并加入印跡中。所有雜交步驟都在溫箱的搖瓶中進(jìn)行。在預(yù)雜交溶液中，使探針雜交過(guò)夜至少16小時(shí)。使用一套標(biāo)準(zhǔn)的洗滌溶液。通過(guò)使用含有洗滌緩沖液的較低濃度的鹽獲得洗滌嚴(yán)緊度。下列為洗滌程序2XSSPE15分鐘室溫2XSSPE15分鐘室溫2XSSPE/0.1％SDS45分鐘65℃2XSSPE/0.1％SDS45分鐘65℃0.1XSSPE15分鐘室溫制備經(jīng)放射性標(biāo)記的DNA探針使用Feinberg和Vogelstein的方法(Feinberg和Vogelstein，1983)對(duì)DNA進(jìn)行放射性標(biāo)記。簡(jiǎn)單地說(shuō)，該方法使用隨機(jī)序列六核苷酸，在變性DNA模板的多個(gè)位點(diǎn)處引發(fā)使用KlenowDNA聚合酶I片段的DNA合成。使用預(yù)先形成的試劑盒將有助于結(jié)果的一致性。在水中制備5-100ngDNA片段(得自PCR或限制性消化的凝膠純化產(chǎn)物)，于95℃與隨機(jī)的六聚體一起變性5分鐘。在冰上淬滅冷卻混合物，加入下列組分5μl[α-32P]dATP3000Ci/mmol1μlKlenowDNA聚合酶(4U)然后在37℃保溫反應(yīng)1小時(shí)。用自旋柱(NucleonBiosciences)除去未摻入的核苷酸。產(chǎn)生cDNA使用被寡(dT)和(dN)引物引發(fā)的、重組Moloney-鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶的3’至5’聚合酶活性，使RNA酶促轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂渃DNA。使用單鏈cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。由1μgpoly(A)+RNA合成cDNA，或者使總RNA與下列組分保溫1.0μM寡(dT)引物(針對(duì)總RNA)或隨機(jī)六聚體(針對(duì)mRNA)0.5mM10mMdNTP混合物1U/μlRNA酶抑制劑(Promega)1.0U/μl溶于廠商提供的緩沖液的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)于42℃將反應(yīng)保溫2-3小時(shí)。熒光自動(dòng)測(cè)序?yàn)榱藱z查用于產(chǎn)生RNAi生產(chǎn)所用模板的PCR引物的特異性，使用經(jīng)棱鏡熒光標(biāo)記的鏈終止測(cè)序試劑盒(Perkin-Elmer)進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序(Prober等，1987)。在8μl棱鏡預(yù)混合物中加入適當(dāng)量的模板(200ng質(zhì)粒，100ngPCR產(chǎn)物)，10μM測(cè)序引物(一般為50％G-C含量的20聚體)，使總反應(yīng)體積達(dá)到20μl。進(jìn)行24輪PCR(94℃10秒，50℃10秒，60℃4分鐘)。熱循環(huán)之后，通過(guò)加入2μl3M醋酸鈉和50μl100％乙醇沉淀產(chǎn)物。以13000rpm將DNA沉淀至Eppendorf微量離心管中，用70％乙醇洗滌1次，真空干燥。通過(guò)機(jī)構(gòu)內(nèi)部的測(cè)序服務(wù)(Krebs研究所)分析樣品。將干燥的樣品重新懸浮于4μl甲酰胺上樣緩沖液中，變性并上樣于ABI373自動(dòng)測(cè)序儀。收集粗序列，使用ABI棱鏡軟件進(jìn)行分析，所提供的結(jié)果為分析的直方圖形式。通過(guò)SDS-PAGE和Western印跡檢測(cè)特異性蛋白質(zhì)靶為了得到細(xì)胞裂解物，用添加有2mMCaCl2的冰冷的PBS將細(xì)胞單層沖洗3次。于4℃，將細(xì)胞與1ml/75cm2燒瓶裂解緩沖液(1％v/vNP40，1％v/vDOC，0.1mMPMSF，溶于PBS)保溫15分鐘。將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至eppendorf管中，并流經(jīng)21號(hào)針頭以剪切DNA。接著進(jìn)行凍融，再進(jìn)行離心(30分鐘，4℃，15000g)以除去不溶性物質(zhì)。使用商購(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)法(Biorad)測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)濃度，將濃度調(diào)節(jié)為1.3mg/ml。通過(guò)加入4倍Laemmli電泳樣品緩沖液并煮沸5分鐘來(lái)制備SDS-PAGE樣品。用16μg蛋白質(zhì)在10％聚丙烯酰胺凝膠(Laennli，1970)上電泳之后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45μm的硝酸-纖維素膜上。用PBS和0.05％吐溫(PBS-T)洗滌印跡。用含5％奶粉的PBS-T封閉印跡(60分鐘，室溫)。將印跡與適當(dāng)?shù)牡谝豢贵w保溫。使用經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體，通過(guò)ECL(Amersham，Bucks.，UK)觀察抗體結(jié)合。除非另有說(shuō)明，SDS-PAGE和Western印跡所用的材料得自Biorad(California，USA)。表1用于檢測(cè)干細(xì)胞分化的抗體表2用于評(píng)價(jià)分化的mRNA標(biāo)記的探針表3通過(guò)Western印跡和/或免疫熒光檢測(cè)的分化蛋白質(zhì)標(biāo)記通過(guò)適當(dāng)?shù)纳藤?gòu)抗體檢測(cè)下列抗體表4用于產(chǎn)生基因特異性抑制所用dsRNA的特異性引物所有序列以5’至3’方向書寫平均熒光強(qiáng)度(Log規(guī)模，任意單位)處理M1＝SSEA3(+)M2＝SSEA3(-)模擬(對(duì)照)3192.0RNAi(Notch1+Notch2)1951.7RNAi(RBPJK)2671.8RNAi(Oct4)1811.6RNAi對(duì)照3541.7表5如圖中所述，用dsRNA處理的NTERA2細(xì)胞亞群SSEA-3(+)和SSEA-3(-)(M1和M2)的平均熒光強(qiáng)度參考文獻(xiàn)AndrewsP.W.，GoodfellowP.N.，ShevinskyL.，BronsonD.L.andKnowlesB.B.1982.CellsurfaceantigensofaclonalhumanembryonalcareinomacelllineMorphologicalandantigenicdifferentiationinculture.Int.J.Cancer.29523-531.AndrewsP.W.，BantingG.S.，DamjanovI.，AmaudD.andAvnerP.1984a.Threemonoclonalantibodiesdefiningdistinetdifferentiationantigensassociatedwithdifferenthighmolecularweightpolypeptidesonthesurfaceofhumanembryonalcarcinomacells.Hybridoma.3347-361.AndrewsP.W.，DamjanovI.，SimonD.，BantingG.，CarlinC.，DracopoliN.C.andFoghJ.1984b.PluripotentembryonalcarcinomaclonesderivedfromthehumanteratocarcinomacelllineTera-2Differentiationinvivoandinvitro.Lab.Invest.50147-162.AndrewsP.W.，NudelmanE.，HakomoriS.-i.andFendersonB.A.1990.DifferentpatternsofglycolipidantigensareexpressedfollowingdifferentiationofTERA-2humanembryonalcarcinomacellsinducedbyretinoicacid，hexamethylenebisacetamide(HMBA)orbromodeoxyuridine(BUdR).Differentiation.43131-138.FendersonB.A.，AndrewsP.W.，NudelmanE.，ClausenH.andHakomoriS.-i.1987.Glycolipidcorestructureswitchingfromglobo-tolacto-andganglio-seriesduringretinoicacid-induceddifferentiationofTERA-2-derivedhumanembryonalcarcinomacells.Dev.Biol.12221-34.Kannagi，R，Levery，S.B.，Ishigami，F(xiàn).，Hakomori，S.，Shevinsky，L.H.，Knowles，B.B.andSolter，D.(1983)Newgloboseriesglycosphingolipidsinhumanteratocarcinomareactivewiththemonoclonalantibodydirectedtoadevelopmentallyregulatedantigen，stage-specificembryonica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方法，其中所述RNAi分子得自含有圖2c所示序列的核酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述基因是hNotch2。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述RNAi分子得自含有圖2d所示序列的核酸序列。20.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述基因是RBPJk。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述RNAi分子得自含有圖2e所示序列的核酸序列。22.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述基因是CIR。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述RNAi分子得自含有圖2f所示序列的核酸序列。24.RNAi分子，其特征在于所述分子含有至少一種基因的編碼序列，所述基因介導(dǎo)干細(xì)胞分化中的至少一個(gè)步驟。25.根據(jù)權(quán)利要求24的RNAi分子，其中所述編碼序列是外顯子。26.根據(jù)權(quán)利要求24或25的RNAi分子，其中所述分子的長(zhǎng)度為100bp-1000bp。27.根據(jù)權(quán)利要求28的RNAi分子，其中所述分子的長(zhǎng)度選自100bp；200bp；300bp；400bp；500bp；600bp；700bp；800bp；900bp；或1000bp。28.根據(jù)權(quán)利要求24或25的RNAi分子，其中所述分子的長(zhǎng)度至少為1000bp。29.根據(jù)權(quán)利要求24或25的RNAi分子，其中所述分子的長(zhǎng)度為15bp到25bp。30.根據(jù)權(quán)利要求30的RNAi分子，其中所述分子的長(zhǎng)度為21bp。31.根據(jù)權(quán)利要求24-30中任一項(xiàng)的RNAi分子，其中所述分子含有由表4中的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)確定的序列。32.根據(jù)權(quán)利要求31的RNAi分子，其中所述RNAi得自選自下列的基因DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。33.根據(jù)權(quán)利要求32的RNAi分子，其中所述RNAi分子含有選自圖2a-2f所示核酸序列的核酸序列。34.根據(jù)權(quán)利要求24-33中任一項(xiàng)的RNAi分子，其中所述分子含有經(jīng)修飾的核糖核苷酸堿基。35.分離的DNA分子，其含有如表4中鑒定的DNA登記號(hào)所示的基因序列，所述基因介導(dǎo)干細(xì)胞分化中的至少一個(gè)步驟，其特征在于所述DNA與至少一種能促進(jìn)與其連接的所述DNA轉(zhuǎn)錄的其它DNA分子(“啟動(dòng)子”)可操作連接。36.根據(jù)權(quán)利要求35的分離的DNA分子，其中所述基因選自DLK1；Oct4；hNotch1；hNotch2；RBPJk和CIR。37.根據(jù)權(quán)利要求36的分離的DNA分子，其中所述分子含有選自圖2a-2f所示序列的序列。38.根據(jù)權(quán)利要求35-37中任一項(xiàng)的分離的DNA分子，其中所述基因與至少兩種啟動(dòng)子一起被提供，其特征在于所述啟動(dòng)子的定向使得含有所述DNA分子的兩條DNA鏈被轉(zhuǎn)錄成RNA。39.包含根據(jù)權(quán)利要求35-38中任一項(xiàng)的DNA分子的載體。40.制備RNAi分子的方法，所述方法包括(i)提供至少一種根據(jù)權(quán)利要求35-38中任一項(xiàng)的分離的DNA分子或根據(jù)權(quán)利要求39的載體；(ii)提供能合成含有所述RNAi分子的每條RNA鏈的試劑和條件；和(iii)提供使每條RNA鏈至少在其部分長(zhǎng)度上，或者至少在對(duì)應(yīng)于編碼所述干細(xì)胞基因的核酸序列的部分能夠結(jié)合的條件，所述基因介導(dǎo)干細(xì)胞分化。41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述基因選自由表4中的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)登記號(hào)鑒定的基因。42.促進(jìn)干細(xì)胞分化的方法，所述方法包括給動(dòng)物施用有效量的、足以影響靶干細(xì)胞分化的根據(jù)權(quán)利要求24-34中任一項(xiàng)的RNAi。43.治療性組合物，其含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求24-34中任一項(xiàng)的RNAi分子。44.根據(jù)權(quán)利要求26-36中任一項(xiàng)的至少一種RNAi分子用于制備藥劑的用途，所述藥劑可用于促進(jìn)干細(xì)胞分化以提供分化的細(xì)胞/組織用以治療疾病，其中細(xì)胞/組織被所述疾病破壞。45.根據(jù)權(quán)利要求44的用途，其中所述疾病選自惡性貧血；中風(fēng)，神經(jīng)變性疾病，如帕金森病，早老性癡呆；冠狀心臟病；肝硬化；和糖尿病。46.根據(jù)權(quán)利要求43的治療性組合物或根據(jù)權(quán)利要求44或45的用途，其進(jìn)一步含有稀釋劑，載體或賦形劑。47.治療性的細(xì)胞組合物，其含有通過(guò)導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求24-34中任一項(xiàng)的RNAi分子而產(chǎn)生的分化細(xì)胞。48.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法獲得的細(xì)胞。49.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求48的方法獲得的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自神經(jīng)細(xì)胞；肌肉細(xì)胞；肝細(xì)胞；腎細(xì)胞；血液細(xì)胞(如紅細(xì)胞，CD4+細(xì)胞，CD8+細(xì)胞)；胰腺β細(xì)胞；上皮細(xì)胞(如肺，胃，腸)。50.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物。51.含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求48或49的細(xì)胞的器官。全文摘要本發(fā)明涉及調(diào)制干細(xì)胞分化的方法，所述方法包括將抑制性RNA(RNAi)導(dǎo)入干細(xì)胞以消除編碼與干細(xì)胞分化有關(guān)的多肽的mRNA；本發(fā)明還涉及RNAi分子，編碼所述RNAi分子的DNA分子；和通過(guò)所述方法獲得的細(xì)胞。文檔編號(hào)A61P9/10GK1449448SQ01814360公開日2003年10月15日申請(qǐng)日期2001年8月17日優(yōu)先權(quán)日2000年8月19日發(fā)明者彼得·安德魯斯,詹姆斯·沃爾什,保羅·戈卡萊申請(qǐng)人:愛(ài)克斯澳迪亞有限公司