專利名稱：用作丙型肝炎病毒ns3－絲氨酸蛋白酶抑制劑的新型肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的丙型肝炎病毒(“HCV”)蛋白酶抑制劑、包含一種或多種所述抑制劑的藥用組合物、制備所述抑制劑的方法和使用所述抑制劑治療丙型肝炎和相關疾病的方法。本發(fā)明特別公開用作HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶抑制劑的新的肽化合物。
背景技術：
丙型肝炎病毒(HCV)為一種(+)-有義單鏈RNA病毒，它為非甲非乙型肝炎(NANBH)的主要病原體，尤其是血液相關性NANBH(BB-NANBH)(參見國際專利申請公布號WO 89/04669和歐洲專利申請公布號EP 381 216)。NANBH區(qū)別于其它類型的病毒誘導性肝疾病，例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丁型(δ)肝炎病毒(HDV)、巨細胞病毒(CMV)和埃-巴二氏病毒(EBV)肝炎、以及區(qū)別于其它形式的肝疾病，例如酒精中毒性肝疾病和原發(fā)性膽汁性肝硬化。
最近，已經(jīng)鑒定、克隆和表達出了多肽加工和病毒復制所必需的HCV蛋白酶(參見例如美國專利號5,712,145)。這種約3000個氨基酸的多蛋白自氨基末端至羧基末端包含核殼蛋白(C)、包膜蛋白(E1和E2)以及幾種非結構蛋白(NS1、2、3、4a、5a和5b)。NS3為約68kda的蛋白，由HCV基因組的約1893個核苷酸編碼，并且具有2個不同的結構域(a)由約200個N-末端氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶結構域；和(b)蛋白C-末端RNA依賴性ATP酶結構域。由于蛋白質序列、整體三維結構和催化機制的相似性，認為NS3蛋白酶是胰凝乳蛋白酶家族的一個成員。其它胰凝乳蛋白酶樣酶有彈性蛋白酶、Xa因子、凝血酶、胰蛋白酶、纖溶酶、尿激酶、tPA和PSA。HCV NS3絲氨酸蛋白酶與所述多肽(多蛋白)于NS3/NS4a、NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接點水解有關，因此在病毒復制期間負責生成四種病毒蛋白。這使HCV NS3絲氨酸蛋白酶成為抗病毒化學治療的令人關注的目標。
已經(jīng)確定約6kda多肽的NS4a蛋白是NS3絲氨酸蛋白酶活性的輔因子。NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶對NS3/NS4a接點的自動裂解在分子內(即順式)進行，而其它的裂解位點在分子間(即反式)進行。
對HCV蛋白酶的天然裂解位點的分析揭示，P1存在半胱氨酸和P1’存在絲氨酸，并且這些殘基在NS4a/NS4b、NS4b/NS5a和NS5a/NS5b接點中是嚴格保守的。NS3/NS4a接點包含P1的蘇氨酸和P1’的絲氨酸。推定NS3/NS4a上的Cys→Thr取代解釋該接點需要順式而不是反式加工。參見例如Pizzi等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)91888-892，F(xiàn)ailla等(1996)Folding & Design 135-42。NS3/NS4a裂解位點也比其它位點更耐受誘變。參見例如Kollykhalov等(1994)J.Virol.687525-7533。還發(fā)現(xiàn)，裂解位點上游區(qū)的酸性殘基是有效裂解所需要的。參見例如Komoda等(1994)J.Virol.687351-7357。
已報道的HCV蛋白酶抑制劑包括抗氧化劑(參見國際專利申請公布號WO 98/14181)、某些肽類和肽類似物(參見國際專利申請公布號WO 98/17679，Landro等(1997)Biochem.369340-9348，Ingallinella等(1998)Biochem.378906-8914，Llinàs-Brunet等(1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.81713-1718)、基于70-氨基酸多肽水蛭蛋白酶抑制劑c的抑制劑(Martin等(1998)Biochem.3711459-11468，選自人胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑(hPSTI-C3)和小體所有組成成分(MBip)的抑制劑親和性(Dimasi等(1997)J.Virol，717461-7469)、cVHE2(“camelized”可變結構域抗體片段)(Martin等(1997)Protein Eng.10607-614)和α1-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)(Elzouki等)(1997)J.Hepat.2742-28)。最近公開了設計用來選擇性破壞丙型肝炎病毒RNA的核酶(參見BioWorldToday9(217)4(1998年11月10日))。
另外參見1998年4月30日公開的PCT公布號WO 98/17679(Vertex Pharmaceuyticals Incorporated)、1998年5月28日公開的WO98/22496(F.Hoffmann-La Roche AG)和1999年2月18日公開的WO99/07734(Boehringer Ingelheim Canada Ltd)。
HCV與肝硬化有關，而且誘發(fā)肝細胞癌。目前HCV感染患者的預后很差。由于缺乏免疫性或者與HCV感染有關的豁免性(remission)，HCV感染比起其它形式的肝炎更難以治療。目前的資料表明，肝硬化診斷后四年的存活率小于50％。診斷為患有局灶性可切除性肝細胞癌的患者的五年存活率為10-30％，而局灶性不可切除性肝細胞癌的患者的五年存活率小于1％。
參見A.Marchett等Synlett，S1，1000-1002(1999)，它介紹了HCVNS3蛋白酶抑制劑的二環(huán)類似物的合成，其中所公開的化合物的結構式如下 另參見W.Han等Bioorganic & medicinal Chem.Lett，(2000)10，711-713，它介紹了某些包含烯丙基和乙基官能團的α-酮酰胺類、α-酮酯類以及α-二酮類的制備。
另參見WO 00/09558(受讓人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公開)，它公開了下式的肽衍生物
其中各單元在其文中作了定義。該系列的示例性化合物為 另參見WO 00/09543(受讓人Boehringer Ingelheim Limited；2000年2月24日公開)，它公開了下式的肽衍生物 其中各種單元在其文中作了定義。該系列的示例性化合物為 丙型肝炎的當前療法包括干擾素-α(INFα)以及使用利巴韋林和干擾素的聯(lián)合療法。參見例如Beremguer等(1998)Proc.Assoc.Am.Physicians110(2)98-112。這些療法存在低持續(xù)應答率并時常發(fā)生副作用的缺陷。參見例如Hoofnagle等(1997)N.Engl.J.Med.336347。目前，沒有疫苗可用于HCV感染。
等待批準以及共同等待批準的美國專利申請序列號09/--------，------------申請、序列號09/------，-------申請、序列號09/--------，-------申請、序列號09/--------，------------申請、序列號09/--------，------------申請和序列號09/--------、------------申請，它們公開了用作丙型肝炎病毒NS-3絲氨酸蛋白酶抑制劑的各種類型肽類。
HCV感染需要新的治療藥物及治療方法。因此，本發(fā)明一個目的是提供有效治療、預防或改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供治療、預防或改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的方法。
本發(fā)明再一目的是提供使用本發(fā)明提供的化合物調節(jié)絲氨酸蛋白酶活性、特別是HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶活性的方法。
本發(fā)明又一目的是提供使用本發(fā)明提供的化合物調節(jié)HCV多肽加工的方法。
發(fā)明概述在許多實施方案中，本發(fā)明提供HCV蛋白酶的新型抑制劑、包含一種或多種化合物的藥用組合物、包含一種或多種所述化合物的藥物制劑的制備方法以及治療、預防或者改善丙型肝炎的一種或多種癥狀的方法。還提供調節(jié)HCV多肽與HCV蛋白酶相互作用的方法。在本發(fā)明提供的化合物中，優(yōu)選抑制HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶活性的化合物。本申請公開包含從P3直至P2’排列的氨基酸的肽化合物。
在第一實施方案中，本發(fā)明提供式I化合物 式I其中G、J和Y獨立選自以下部分H、烷基、烷基-芳基、雜烷基、雜芳基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、雜芳基氨基、環(huán)烷基氨基或雜環(huán)烷基氨基，前提是Y可以任選被X11或X12取代；X11為烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、環(huán)烷基-烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜芳基、烷基雜芳基或雜芳基烷基，前提是X11還可以任選被X12取代；X12為羥基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、烷基亞磺酰氨基、芳基亞磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、羧酰胺基(carboxamido)、烷氧基羰基氨基、烷氧基羰氧基、烷基脲基、芳基脲基、鹵素、氰基或硝基，前提是烷基、烷氧基和芳基可以另外任選被選自X12的部分取代；R1為COR5或B(OR)2，其中R5為H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6或COR7，其中R7為H、OH、OR8、CHR9R10或NR9R10，其中R6、R8、R9和R10獨立選自H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、CH(R1’)COOR11CH(R1’)CONR12R13CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11
CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’獨立選自H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基和雜芳烷基；Z選自O、N或CH；W可以存在或者不存在，當W存在時，W選自C＝O、C＝S或SO2；R、R2、R3和R4獨立選自H；C1-C10烷基；C2-C10鏈烯基；C3-C8環(huán)烷基；C3-C8雜環(huán)烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；氧、氮、硫或磷原子(所述氧、氮、硫或磷原子的數(shù)目為0-6個)；(環(huán)烷基)烷基和(雜環(huán)烷基)烷基，其中所述環(huán)烷基組成為3-8個碳原子，0-6個氧、氮、硫或磷原子，并且所述烷基具有1-6個碳原子；芳基；雜芳基；烷基-芳基；烷基-雜芳基；其中所述烷基、雜烷基、鏈烯基、雜鏈烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基部分可被任選取代，所述術語“取代”指任選并且化學上適當?shù)谋?個或多個選自以下的基團取代烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、鹵素、羥基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、氨磺酰、亞砜、砜、磺酰脲、酰肼和異羥肟酸酯。
在式I不同部分的上述定義中，不同部分的優(yōu)選基團如下
R1的優(yōu)選定義為COR5，其中R5為H、OH、COOR8或CONR9R10，其中R8、R9和R10的定義同上。R1的優(yōu)選部分為COCONR9R10，其中R9為H，R10為H、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)。其中，R10優(yōu)選部分為CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’為H或烷基、雜烷基，R2’為苯基、取代的苯基、雜原子-取代的苯基、苯硫基、環(huán)烷基、雜原子-取代的環(huán)烷基、哌啶基或吡啶基。更優(yōu)選部分為R1’為H，R11為H或叔丁基；R’為羥甲基；R2’選自以下基團 其中U1和U2可以相同或不同，并且選自以下基團H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、疊氮基、氨基、羥基、取代的氨基、取代的羥基；U3和U4可以相同或不同，并且為O或S；U5選自以下部分烷基磺?；?、芳基磺酰基、雜烷基磺酰基、雜芳基磺?；?、烷基羰基、芳基羰基、雜烷基羰基、雜芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、雜芳基氨基羰基或其組合；NR12R13選自以下基團NH2，NHMe，N(Me)OMe，NMe2， 其中U6為H、OH或CH2OH。R2的優(yōu)選部分為 R3的優(yōu)選部分為 其中R31＝OH或O-烷基。此外，R3還可以為 其中Y19選自以下部分 此外，R3還可以為 其中Y20選自以下部分 最優(yōu)選的R3為 此外，式I的Z-C-R3部分不含R4時可為以下結構 和 一些其它優(yōu)選部分為Z為N，R4為H，W為C＝O或SO2。Y的優(yōu)選部分為 其中Y11選自H、COOH、COOEt、OMe、Ph、OPh、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12選自H、COOH、COOMe、OMe、F、Cl或Br。Y還可以為 其中Y13選自以下部分 Y14選自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc。Y的另外的優(yōu)選結構為 其中Y15和Y16可以相同或不同，并且獨立選自烷基、芳基或雜烷基或雜芳基。Y的另外的優(yōu)選結構為 其中Y17為CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18為COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。J的優(yōu)選部分為 G的優(yōu)選部分為 除非另有定義，否則本文使用的所有科技術語具有本發(fā)明所屬領域的技術人員通常理解的含義。因此，例如術語烷基(包括烷氧基的烷基部分)指由具有1-8個、優(yōu)選1-6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴除去一個原子后獲得的單價基團；芳基-表示具有6-14個碳原子且具有至少1個苯型環(huán)的碳環(huán)基團，碳環(huán)基團的所有可取代的芳香族碳原子可能作為連接點。優(yōu)選芳基包括苯基、1-萘基、2-萘基和茚滿基，尤其是苯基和取代的苯基；芳烷基-表示含有芳基并通過低級烷基連接的部分；烷基芳基-表示含有低級烷基并通過芳基連接的部分；環(huán)烷基-表示具有3-8個、優(yōu)選5個或6個碳原子的飽和碳環(huán)，其任選被取代；雜環(huán)-表示(除以下定義的雜芳基以外)具有至少1個插入碳環(huán)結構(由1個環(huán)或者2個稠環(huán)組成，其中每個環(huán)為5元、6元或7元環(huán)且可具有或者不具有不含離域pi電子的雙鍵)的O、S和/或N原子的飽和及不飽和環(huán)狀有機基團，其環(huán)結構具有2-8個、優(yōu)選3-6個碳原子，例如2-或3-哌啶基、2-或3-哌嗪基、2-或3-嗎啉基，或者2-或3-硫代嗎啉基；鹵素-表示氟、氯、溴和碘；雜芳基-表示具有至少1個插入碳環(huán)結構的O、S和/或N原子且具有足夠數(shù)量的離域pi電子以提供芳族性質的環(huán)狀有機基團，芳族雜環(huán)具有2-14個、優(yōu)選4或5個碳原子，例如2-、3-或4-吡啶基，2-或3-呋喃基、2-或3-噻吩基、2-、4-或5-噻唑基、2-或4-咪唑基、2-、4-或5-嘧啶基、2-吡嗪基，或者3-或4-噠嗪基等。優(yōu)選雜芳基為2-、3-和4-吡啶基；所述雜芳基也可任選被取代。此外，除非另有特別定義，術語“取代或未取代”或“任選取代”是指相關部分任選并且化學上適當?shù)谋粚儆赗12或R13的部分取代。
本發(fā)明還包括式I化合物的互變異構體、旋轉異構體、對映異構體和其它的旋光異構體及其藥學上可接受的鹽、溶劑化物和衍生物。
本發(fā)明又一特征是包含作為活性成分的式I化合物(或其鹽、溶劑化物或異構體)和藥學上可接受的載體或賦形劑的藥用組合物。
本發(fā)明還提供制備式I化合物的方法以及治療疾病例如HCV及相關疾病的方法。治療方法包括給予患有一種或多種所述疾病的患者治療有效量的式I化合物或者包含式I化合物的藥用組合物。
還公開了式I化合物在制備治療HCV和相關疾病的藥物中的用途。
優(yōu)選實施方案的詳細描述在一個實施方案中，本發(fā)明公開了作為HCV蛋白酶抑制劑、尤其是HCV NS3/NS4a絲氨酸蛋白酶抑制劑的式I化合物或其藥學上可接受的衍生物，其各種定義見上文。
具有優(yōu)良的HCV蛋白酶抑制活性的本發(fā)明代表性化合物與它們的活性一并列于表1中(Ki*值范圍以納摩爾表示，nM)。
表1化合物與HCV蛋白酶連續(xù)檢測結果
HCV連續(xù)檢測的Ki*范圍類別A＝1-100；B＝101-1000；C＝＞1000nM。
部分類型的本發(fā)明化合物以及合成不同類型的本發(fā)明式I化合物的方法列舉如下，接著用示意圖說明，再后是示例性實施例。
R＝MeR＝芐基 X＝OtBuX＝OHX＝NH2X＝NMeOMeX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH X＝H，Y＝tBu；X＝tBu，Y＝H R＝炔丙基R＝烯丙基 X＝Ot-丁基X＝OH X＝Ot丁基X＝OH X＝Ot丁基X＝OHX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH R＝tBuR＝HR＝Me X＝H，Y＝COOHX＝COOH，Y＝H 根據(jù)它們的結構，本發(fā)明化合物可與有機酸或無機酸、或者有機堿或無機堿形成藥學上可接受的鹽。形成所述鹽的合適的酸的實例為鹽酸、硫酸、磷酸、乙酸、檸檬酸、丙二酸、水楊酸、蘋果酸、富馬酸、琥珀酸、抗壞血酸、馬來酸、甲磺酸和本領域技術人員熟知的其它的無機酸以及羧酸類。對于與堿形成鹽的合適堿為例如NaOH、KOH、NH4OH、氫氧化四烷基銨等。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供包含作為活性成分的本發(fā)明肽的藥用組合物。藥用組合物通常還包含藥學上可接受的載體稀釋劑、賦形劑或載體(本文統(tǒng)稱為載體材料)。由于它們的HCV抑制活性，所述藥用組合物具有治療丙型肝炎和相關疾病的用途。
在另一實施方案中，本發(fā)明公開了制備包含作為活性成分的本發(fā)明化合物的藥用組合物的方法。在本發(fā)明的藥用組合物和方法中，活性成分一般與適合的載體材料混合給藥，載體材料根據(jù)預定給藥形式適當選擇，即口服片劑、膠囊劑(固體填充、半固體填充或液體填充)、使用時配制用粉劑、口服凝膠劑、酏劑、可分散顆粒劑、糖漿劑、混懸劑等，并且符合常規(guī)制藥實踐。舉例來說，對于以片劑或膠囊劑形式口服給藥，活性藥物成分可與任何口服非毒性藥學上可接受的惰性載體組合，例如乳糖、淀粉、蔗糖、纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、滑石粉、甘露糖醇、乙醇(液體形式)等。此外，當要求或者需要時，也可在混合物中摻入合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑。粉劑和片劑可包含約5-95％的本發(fā)明化合物組分。合適的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖類、玉米甜味劑、天然及合成樹膠如阿拉伯樹膠、藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇和蠟。用于上述劑型的潤滑劑的實例有硼酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括淀粉、甲基纖維素、瓜爾膠等。
適當?shù)那闆r下也可包含甜味劑、增香劑和防腐劑。下面更詳細地討論以上提及的一些術語，即崩解劑、稀釋劑、潤滑劑、粘合劑等。
另外，本發(fā)明組合物可配制成持續(xù)釋放形式，以控制任何一種或者多種成分或活性成分的釋放速率，達到最佳治療效果，即最佳HCV抑制活性等。持續(xù)釋放的合適劑型包括多層片劑，它包含多個不同崩解速率層，或者為活性成分浸漬在其中的控釋聚合物基質，將其加工成片劑形式或者包含所述浸漬或包囊性孔型聚合物基質的膠囊劑。
液態(tài)制劑包括溶液劑、混懸劑和乳劑。實例可列舉腸胃外注射用水溶液劑或者水-丙二醇溶液劑，或者加入甜味劑和遮光劑(Pacifiers)的口服溶液劑、混懸劑和乳劑。液態(tài)制劑也可包括鼻內給藥的溶液劑。
適于吸入的氣霧制劑可包括溶液劑和粉末形式的固體，它們可以與藥學上可接受的載體例如惰性壓縮氣體(如氮氣)混合應用。
制備栓劑時，首先熔融低熔點的蠟，例如脂肪酸甘油酯(如可可脂)的混合物，通過攪拌或者類似的混合使活性成分均勻分散于其中。然后將熔融的均勻混合物傾入到適當大小的模具中，使之冷卻并由此固化。
還包括這樣的固態(tài)制劑可在臨用前配制成口服或腸胃外給藥的液態(tài)制劑。所述液態(tài)制劑包括溶液劑、混懸劑和乳劑。
本發(fā)明化合物也可經(jīng)皮給藥。透皮組合物可采用乳膏、洗劑、氣霧劑和/或乳劑的形式，所述組合物可包含在基質型或者貯庫型透皮貼劑中，這是本領域的常規(guī)技術。
本發(fā)明化合物優(yōu)選口服、靜脈內或皮下給藥。
藥用制劑優(yōu)選為單位劑型。單位劑型時，制劑細分為包含適量活性成分的適當大小的單位劑量，例如包含達到所需目的的有效量。
根據(jù)具體應用，制劑的單位劑量中，本發(fā)明的活性成分劑量通?？梢圆煌蛘{整，從約1.0毫克到約1,000毫克，優(yōu)選約1.0到約950毫克，更優(yōu)選約1.0到約500毫克，一般為約1到約250毫克。實際使用劑量可根據(jù)患者的年齡、性別、體重以及所治療病癥的嚴重程度而變化。所述技術對本領域的熟練技術人員是眾所周知的。
通常，包含活性成分的人類口服劑型可以每天給藥1次或2次。給藥量和給藥頻率需要根據(jù)主治醫(yī)師的判斷調整?？诜o藥的一般推薦日劑量范圍從約1.0毫克/天到1,000毫克/天，可以一次或分次給藥。
部分有用的術語說明如下膠囊劑-指特殊容器或者包封物，它們由甲基纖維素、聚乙烯醇或變性明膠或淀粉制成，其裝有或包含含活性成分的組合物。硬殼膠囊一般由較高凝膠強度骨架和豬皮明膠的摻合物制成。膠囊本身可包含少量染料、不透明劑、增塑劑和防腐劑。
片劑-指包含活性成分及合適稀釋劑的壓縮或模壓固體劑型。通過壓縮混合物或濕法制粒、干法制?；驂嚎s獲得的顆粒制備片劑。
口服凝膠劑-指活性成分分散于或溶于親水性半固體基質中。
使用時配制用粉劑(powerder for constitution)指包含活性成分和合適稀釋劑的粉末摻合物，它可用水或果汁混懸。
稀釋劑-指通常構成組合物或者劑型主要部分的物質。合適的稀釋劑包括糖類，如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨醇；從小麥、玉米、大米和馬鈴薯獲得的淀粉；以及纖維素，例如微晶纖維素。組合物中稀釋劑數(shù)量占總組合物的重量百分比從約10％到約90％，優(yōu)選約25％到約75％，更優(yōu)選從約30％到約60％，更優(yōu)選從約12％到約60％。
崩解劑-指加入到組合物中促使其崩解并釋放出藥物的物質。合適的崩解劑包括淀粉；“冷水可溶的”改性淀粉，例如羧甲基淀粉鈉；天然和合成樹膠類，例如槐樹豆膠、卡拉牙膠、瓜爾膠、黃蓍膠和瓊脂；纖維素衍生物，例如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；微晶纖維素和交聯(lián)微晶纖維素，例如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉；藻酸鹽，例如藻酸和藻酸鈉；粘土如膨潤土；以及泡騰混合物。組合物中的崩解劑含量范圍占組合物的重量百分比從約2％到約15％，更優(yōu)選從約4％到約10％。
粘合劑-指使粉末粘合或者“膠著”在一起并使它們粘聚形成顆粒，因此在配制中用作“膠粘劑”的物質。粘合劑增加稀釋劑或增量劑已有的粘結強度。合適的粘合劑包括糖類如蔗糖；從小麥、玉米、大米和馬鈴薯獲得的淀粉；天然樹膠類如阿拉伯樹膠、明膠和黃蓍膠；海藻衍生物如藻酸、藻酸鈉和藻酸鈣銨；纖維素材料如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉及羥丙基甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮；以及無機物，例如硅酸鎂鋁。組合物中的粘合劑含量可占組合物的重量百分比從約2％到約20％，更優(yōu)選從約3％到約10％，更優(yōu)選約3％到約6％。
潤滑劑-指加入到劑型中以便在其被壓制后通過減少摩擦或磨損使片劑、顆粒等自模具或者沖模中脫出的物質。合適的潤滑劑包括金屬硬脂酸鹽，例如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鉀；硬脂酸；高熔點蠟；以及水溶性潤滑劑，例如氯化鈉、苯甲酸鈉、乙酸鈉、油酸鈉、聚乙二醇和d’l-亮氨酸。潤滑劑通常在壓制前的最后步驟加入，因為它們必須存在于顆粒的表面、顆粒與壓片機配件之間。組合物中潤滑劑含量可占組合物重量百分比從約0.2％到約5％，優(yōu)選約0.5％到約2％，更優(yōu)選從約0.3％到約1.5％。
助流劑(glident)-防止結塊并改善顆粒流動性的物質，使得制備物流動平滑均勻。合適的助流劑包括二氧化硅和滑石粉。組合物中助流劑含量可占組合物總量的重量百分比從約0.1％到約5％，優(yōu)選從約0.5％到約2％。
著色劑-使組合物或者劑型著色的賦形劑。這類賦形劑可包括食品級顏料和吸附到合適吸附劑(例如粘土或氧化鋁)上的食品級顏料。著色劑含量可占組合物的重量百分比從約0.1％到約5％，優(yōu)選從約0.1％到約1％。
生物利用度-指與標準物或者對照物相比，給藥劑型的活性藥物成分或者治療部分吸收進入體循環(huán)的速率和程度。
制備片劑的常規(guī)方法是人們已知的。所述方法包括干法，例如直接壓縮和壓制壓縮生產(chǎn)的顆粒，或者濕法或其它的特殊方法。制備其它給藥形式例如膠囊劑、栓劑等的常規(guī)方法也是人們熟知的。
本發(fā)明的另一個實施方案公開了上文公開的藥用組合物在治療疾病例如丙型肝炎等中的用途。該方法包括給予患有一種或多種所述疾病并需要這種治療的患者治療有效量的本發(fā)明藥用組合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明化合物可以用于治療人類HCV，其治療模式可以是單藥療法或聯(lián)合療法，例如聯(lián)合應用抗病毒藥物(如利巴韋林)和/或干擾素(如α-干擾素)等。
如上所述，本發(fā)明還包括所述化合物的互變異構體、旋轉異構體、對映異構體和其它立體異構體。因此，本領域技術人員知道，本發(fā)明的一些化合物可存在適當?shù)漠悩嬻w形式。這類不同形式化合物已考慮在本發(fā)明范圍內。
本發(fā)明另一個實施方案公開了本發(fā)明公開的化合物的制備方法。所述化合物可通過本領域已知的幾種技術制備。代表性示例方法在以下反應流程中概述。應當理解，雖然以下示例性流程介紹了幾個本發(fā)明代表性化合物的制備，但是適當?shù)奶娲魏翁烊患胺翘烊话被釋纬苫谒鎏娲乃杌衔?。這類變化已考慮在本發(fā)明范圍內。
在以下流程、制備和實施例的說明中所使用的縮寫為THF四氫呋喃DMFN，N-二甲基甲酰胺EtOAc乙酸乙酯AcOH乙酸HOOBt3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮EDCl1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽DEC1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽NMMN-甲基嗎啉ADDP1，1’-(偶氮二羰基)二哌啶DEAD二乙基偶氮二羧酸酯MeOH甲醇EtOH乙醇Et2O乙醚DMSO二甲基亞砜HOBtN-羥基苯并三唑PyBrOP溴-三-(吡咯烷基)磷鎓六氟磷酸鹽Bn芐基Bzl芐基Et乙基Ph苯基iBoc異丁氧基羰基iPr異丙基
tBu或But叔丁基Boc叔丁氧基羰基Cbz芐氧基羰基Cp環(huán)戊二烯基Ts對-甲苯磺?；鵐e甲基THP四氫吡喃基iBoc異丁氧基羰基Chg環(huán)己基甘氨酸一般制備流程以下的流程介紹中間體結構單元的合成方法流程1
流程2 流程3
流程4 制備中間體制備實施例1步驟A化合物(1.1)
將化合物(1.08)(3.00g，12.0mmol；Harbeson，S.L；Abelleira，S.M.；Akiyama，A.；Barrett，R.；Carroll，R.M.等；J. Med.Chem.；37(18)1994；2918-2929；)的DMF(15mL)和CH2Cl2(15mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOOBt(1.97g，12.0mmol)、N-甲基嗎啉(4.0mL，36.0mmol)和EDCl(2.79g，14.5mmol)，攪拌10分鐘，然后加入HCl·H2N-Gly-OBn(2.56g，13.0mmol)。將所得溶液在-20℃攪拌2小時，冷凍保存過夜，然后濃縮至干，接著用EtOAc(150mL)稀釋。將EtOAc溶液用飽和NaHCO3、H2O、5％H3PO4、鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(1.09)(4.5g，94％)。LRMSm/z MH+＝395.1。步驟B化合物(1.1) 將化合物(1.09)(7.00g，17.8mmol)的無水乙醇(300mL)溶液在室溫于氫氣氛下，在存在Pd-C(300mg，10％)下攪拌。反應進度通過tlc.監(jiān)測。在2小時后，將混合物通過硅藻土墊過濾，真空濃縮所得溶液獲得化合物(1.1)(5.40g，定量)。LRMS m/z MH+＝305.1。制備實施例2步驟A化合物(1.3) 將制備實施例1步驟B的化合物(1.1)(1eq.)、化合物(1.2)(Novabiochem，第04-12-5147號)(1.03eq.)、HOOBt(1.03eq.)、N-甲基嗎啉(2.2eq.)和二甲基甲酰胺(70mL/g)的混合物在-20℃攪拌。加入EDCl(1.04eq.)，反應物攪拌48小時。將反應混合物傾入5％KH2PO4水溶液，用乙酸乙酯(2×)萃取。合并的有機物依次用5％K2CO3冷水溶液、5％KH2PO4水溶液、鹽水洗滌，有機層用無水MgSO4干燥。過濾混合物，然后蒸發(fā)，真空干燥濾液，殘余物用Et2O-己烷研磨，過濾獲得標題化合物(1.3)(86％收率)，C25H39N3O7(493.60)，質譜(FAB)M+1＝494.3。步驟B化合物(1.4) 將制備實施例2步驟A的化合物(1.3)(3.0g)用4N HCl/二氧六環(huán)(36mL)處理，在室溫下攪拌7分鐘。將混合物傾入1.5L冷(5℃)己烷中并攪拌，然后在0℃保持0.5小時?；旌衔镌诟稍锟諝庵谐闉V，將收集的固體進一步干燥獲得標題化合物(1.4)(2.3g，88％收率)，C20H31N3O5·HCl，H1NMR(DMSO-d6/NaOD)δ7.38(m，5H)，5.25(m，1H)，4.3-4.1(m，1H)，3.8(m，2H)，3.4-3.3(m，被HDO屏蔽)，1.7-1.1(m，4H)，1.35(s，9H)，0.83(m，3H)。制備實施例3化合物(1.5) 制備實施例2步驟A的化合物(1.3)按照以下的制備實施例7步驟A基本相同的方法處理，獲得化合物(1.5)。制備實施例4化合物(1.6) 制備實施例3的化合物(1.5)按照制備實施例2步驟B基本相同的方法處理獲得化合物(1.6)。制備實施例5步驟A化合物(2.09) 二甲胺鹽酸鹽(1.61g，19.7mmol)、N-Boc-苯基甘氨酸、化合物2.08(4.50g，17.9mmol，Bachem Co.# A-2225)、HOOBt(3.07g，18.8mmol)和EDCl(4.12g，21.5mmol)的無水DMF(200mL)和CH2Cl2(150mL)溶液在-20℃加入NMM(5.90mL，53.7mmol)。在上述溫度攪拌30分鐘后，反應混合物保存在冰箱中過夜(18h)。然后加溫至室溫，加入EtOAc(450mL)、鹽水(100mL)和5％H3PO4(100mL)。分出各層后，有機層用5％H3PO4(100mL)、飽和碳酸氫鈉溶液(2×150mL)、水(150mL)和鹽水(150mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，然后真空濃縮獲得白色固體化合物(2.09)(4.86g)，使用時無需再提純。步驟B化合物(2.1) 將制備實施例5步驟A的化合物(2.09)(4.70g，粗制品)溶于4NHCl(60mL，240mmol)，所得溶液在室溫下攪拌。反應進度用TLC監(jiān)測。4小時后，真空濃縮上述溶液獲得白色固體化合物(2.1)，它在下一步反應中使用時無需再提純。LRMS m/z MH+＝179.0。制備實施例6步驟A化合物(2.2) 按照制備實施例2步驟A基本相同的方法，用苯基甘氨酸N，N-二甲基酰胺鹽酸鹽代替苯基甘氨酸叔丁酯鹽酸鹽制備化合物(2.2)。質譜(FAB)M+1＝465.3。步驟B化合物(2.3) 使步驟A的化合物(2.2)(1.85g)與4N HCl/二氧六環(huán)(50mL)在室溫下反應1小時。混合物在20℃水浴中真空蒸發(fā)，用異丙醚研磨，過濾，干燥獲得化合物(2.3)(1.57g，98％收率)，C18H28N4O4·HCl，質譜(FAB)M+1＝365.3制備實施例7步驟A化合物(2.4) 將制備實施例5步驟A的化合物(2.2)(2.0g)的二氯甲烷(60mL)溶液用二甲基亞砜(3.0mL)和2，2-二氯乙酸(0.70mL)處理?；旌衔镌跀嚢柘吕鋮s至5℃，然后加入1M二環(huán)己基碳二亞胺/二氯甲烷溶液(8.5mL)。除去冷水浴，攪拌混合物22小時。然后加入2-丙醇(0.5mL)，再攪拌1小時。過濾混合物，依次用冰冷的0.1N NaOH(50mL)、冰冷的0.1N HCl(50mL)、5％KH2PO4水溶液、飽和鹽水洗滌。有機溶液用無水硫酸鎂干燥，然后過濾。蒸發(fā)濾液，然后在硅膠上用色譜法分離，用乙酸乙酯洗脫獲得化合物(2.3)(1.87g，94％收率)，C23H34N4O6，質譜(FAB)M+1＝463.3。步驟B化合物(2.5) 按照制備實施例2步驟B基本相同的方法制備化合物(2.5)。制備實施例8步驟A化合物(3.1)步驟A-1.化合物3.02 將化合物3.01(4.6g，用N-Boc-S-甲基半胱氨酸(BachemBiosciences Inc.)按照Boger，J.Org.Chem.，1988，53，487的方法制備)的DMF(150mL)溶液用CS2CO3(6.1g)處理，然后用溴化芐(2.3mL)處理，上述混合物在室溫下攪拌4小時。真空濃縮混合物，然后將殘余物懸浮于EtOAc(200mL)?；旌衔镆来斡?％KH2PO4水溶液、鹽水洗滌，有機萃取液用無水MgSO4干燥。過濾混合物，蒸去濾液，獲得產(chǎn)物3.02(6.2g)；[α]D-33.7(c1.3，CHCl3)。步驟A-2.化合物3.03 按照U.Larsson等，Acta Chem.Scan.，1994，48(6)，517-525中的方法，將過硫酸氫鉀制劑(R)(16.4g，Aldrich Chemical Co.)的水(90mL)溶液緩慢地加入0℃化合物3.02(6.1g)的MeOH(150mL)溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時，然后用旋轉蒸發(fā)器濃縮至1/2體積，加入冷水(100mL)，混合物用EtOAc萃取。萃取液用鹽水洗滌，用無水MgSO4干燥。過濾混合物，蒸去濾液獲得產(chǎn)物3.03(5.9g)；[α]D-26.3(c0.9，CHCl3)。步驟A-3.化合物3.2 將前一步驟產(chǎn)物3.03用4N HCl/二氧六環(huán)處理0.5小時，獲得產(chǎn)物3.2，C12H17NO4S·HCl(307.79)；質譜(FAB)M+1＝272.0。制備化合物3.3 使化合物(3.2)(S-甲基半胱氨酸砜芐酯鹽酸鹽)和化合物(3.1)(N-Boc-環(huán)己基甘氨酸)按照制備實施例2步驟A的基本相同的方法反應獲得化合物(3.3)C25H38N2O7S(510.64)。步驟B化合物(3.4) 上述步驟A的化合物(3.3)(0.7g)、10％Pd/C(0.05g)和EtOH-二氧六環(huán)(100mL)的混合物在3atm H2氣氛下攪拌5小時。過濾混合物，真空蒸發(fā)至干獲得化合物(3.4)(0.56g，97％收率)，C18H32N2O7S(420.52)質譜(FAB)M+1＝421.2。步驟C化合物(3.5) 上述步驟B的化合物(3.4)與制備實施例2步驟B的化合物(1.4)按照制備實施例2步驟A的基本相同的方法反應獲得化合物(3.5)，C38H61N5O11S(795.98)，質譜(FAB)M+1＝796.3。制備實施例9化合物4.1 制備實施例8步驟C的化合物(3.5)按照制備實施例2步驟B的基本相同的方法反應獲得化合物(4.1)C33H53N5O9S.HCl(732.33)。制備實施例10化合物(4.2) 將制備實施例9的化合物(4.1)(0.7g)、二甲基甲酰胺(15mL)和二異丙基乙胺(0.38mL)的溶液在5℃用氯甲酸異丁酯(0.15mL)處理。除去冷水浴，攪拌6小時。將反應混合物傾入5％KH2PO4水溶液(100mL)，用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并的有機層依次用冷5％K2CO3水溶液、5％KH2PO4水溶液、鹽水洗滌，有機層用無水MgSO4干燥。過濾混合物，真空蒸去濾液，殘余物用Et2O-己烷研磨，過濾剩下化合物(4.2)。制備實施例11化合物(4.3) 化合物(4.2)按照以下的制備實施例14步驟H基本相同的方法反應獲得化合物(4.3)。制備實施例12化合物(4.4) 將制備實施例11的化合物(4.3)(約0.10g)用無水三氟乙酸-二氯甲烷(1∶1，約10mL)溶液處理約2小時。溶液用二甲苯(約50mL)稀釋，蒸空蒸發(fā)。殘余物用Et2O研磨，過濾獲得化合物(4.4)。制備實施例13化合物(4.5) 使制備實施例12的化合物(4.4)與二甲胺按照制備實施例2步驟A基本相同的方法反應獲得化合物(4.5)。制備實施例14步驟A化合物(5.2) 在0℃攪拌冷卻下，向化合物(5.01)(1.11g，7.0mmol)的無水DMF(10mL)和無水CH2Cl2(10mL)溶液中加入HOBT(1.19g，7.25mmol)，N-甲基嗎啉(2.3mL，21.0mmol)和DEC(1.6g，8.4mmol)。所得溶液在0℃攪拌15分鐘，接著加入H-Val-O-tBu(1.54g，7.35mmol)。將溶液置于冰箱過夜。觀察到大量的沉淀，將溶液濃縮至干，然后用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并的有機層用5％H3PO4溶液、H2O、鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾獲得粗產(chǎn)物5.1(2.4g，98％收率)。
將粗產(chǎn)物(如上獲得)的4N HCl/二氧六環(huán)溶液在室溫下攪拌7小時，濃縮至干獲得化合物(5.2)。步驟B化合物(5.4) 將化合物(5.3)(F.L.Bach，Jr.等J.Amer.Chem.Soc.，(1955)77，6049)(17.5g，0.086mmol)的50％MeOH/50％H2O(300mL)溶液在攪拌下加入Boc酸酐(47.0g，0.215mol)。然后在溶液中滴加50％的濃NaOH溶液調節(jié)至pH＝9.5。所得溶液在室溫下攪拌過夜，然后用濃HCl中和至pH＝8，用檸檬酸酸化至pH＝2.94，接著用CH2Cl2萃取。合并的有機層用MgSO4干燥獲得化合物(5.4)(27.16g，95％收率)步驟C化合物(5.5) 0℃的亞硫酰氯(3.37mL，0.046mmol)的DMF(3.59mL，0.046mol)溶液加溫至室溫，攪拌35分鐘。然后將溶液冷卻至0℃，接著加入以上步驟B的化合物(5.4)(15.0g，0.045mol)的CH3CN(150mL)和吡啶(3.73mL，0.046mol)溶液。所得溶液加溫至室溫，攪拌過夜。將溶液傾入冰水(700mL)中，用EtOAc(150mL)萃取三次。合并的有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(5.5)(10.8g)。步驟D化合物(1.08) 以下的制備實施例14步驟D的化合物(6.6)(6.5g，0.044mol)的CH2Cl2(130mL)溶液在攪拌下加入Boc酸酐(9.65g，0.044mol)和DMF(50mL)。所得溶液在室溫下攪拌一個周末，濃縮至干，然后加入H2O(120mL)和50％NaOH調節(jié)至pH＝10-11。將溶液攪拌2小時，再加入Boc酸酐(1.93g，8.8mmol)，在室溫下攪拌過夜。將溶液用CH2Cl2萃取，水層在0℃用1N HCl酸化至pH＝4，然后用CH2Cl2萃取3次。然后合并的有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(1.08)(4.50g，41％收率，M-叔丁基+2＝192)。步驟E化合物(5.7) 向以上獲得的化合物(1.08)(4.5g，0.018mol)的DMF(22mL)和CH2Cl2(22mL)溶液在攪拌下加入HOBT(2.7g，0.02mol)、N-甲基嗎啉(6mL，0.054mol)、DEC(4.17g，0.022mol)和烯丙基甘氨酸.TsOH(6.1g，0.02mol)。所得溶液在室溫下攪拌一個周末，然后濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并的有機層用10％H3PO4、鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾獲得粗產(chǎn)物(5.7g)。將粗產(chǎn)物的4N HCl/二氧六環(huán)(50mL)溶液在室溫下攪拌50分鐘，濃縮至干獲得化合物(5.7)(4.79g，94％收率，MH+＝245.1)。步驟F化合物(5.8) 以上步驟E的化合物(5.7)(3.1g，0.011mol)的無水CH2Cl2(55mL)溶液在攪拌下于13分鐘內滴加TEA(1.69mL，0.012mol)，然后滴加步驟C的化合物(5.5)(2.83g，0.011mol)的無水CH2Cl2(55mL)溶液。所得溶液在室溫下攪拌1.5小時。然后將有機層用飽和NaHCO3、鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾獲得化合物(5.8)(4.67g，MH+＝457.2)步驟G化合物(59) 步驟A的化合物(5.2)(0.34g，1.31mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在0℃加入HOBT(0.214g，1.31mmol)、N-甲基嗎啉(0.43mL，3.9mmol)和DEC(0.5g，1.09mmol)。將混合物在室溫下攪拌15分鐘，然后加入步驟F的化合物(5.8)(0.5g，1.09mmol)。所得溶液在冰箱中保存過夜，然后濃縮至干，再用EtOAc-H2O萃取。合并的有機層用飽和NaHCO3、5％H3PO4和鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，然后過濾，濃縮至干獲得化合物(5.9)(0.65g，MH+＝697.4)步驟H化合物(5.10) 步驟G的化合物(5.9)(0.6g，0.8mmol)的無水CH2Cl2(8mL)溶液中加入Dess-Martin試劑(0.732g，1.72mmol)，在室溫下攪拌1小時，然后滴加H2O(0.031mL)和Dess-Martin試劑(0.373g，0.86mmol)的CH2Cl2(12mL)溶液。所得溶液在室溫下攪拌2.5小時，然后加入50％飽和NaHCO3/50％飽和Na2S2O3(20mL)溶液，然后在室溫快速攪拌1.5小時。將溶液用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，濃縮至干獲得化合物(5.10)(0.588g，100％收率，MH+＝695.2)。制備實施例15步驟A化合物(6.2) 化合物(6.1)(5.0g，19.89mmol)的CH2Cl2(20mL)和DMF(10mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(3.25g，19.89mmol)、EDCl(4.58g，23.87mmol)和N-甲基嗎啉(6.56mL，59.69mmol)。所得溶液在室溫下攪拌10分鐘，然后加入NH4Cl(1.38g)，保持在0℃過夜。將溶液濃縮，用EtOAc-H2O萃取。合并的有機層用NaHCO3、H3PO4、和鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干。粗產(chǎn)物用柱色譜法提純，用2.5％MeOH/97.5％CH2Cl2洗脫獲得化合物(6.2)(1.95g，MH+＝251.1)。步驟B化合物(6.3) 步驟A的化合物(6.2)(12.32g，49.28mmol)的4N HCl/二氧六環(huán)(270mL，43.08mmol)溶液在室溫下攪拌2小時，然后濃縮至干獲得化合物(6.3)(8.40g，100％收率)。步驟C化合物(1.08)(別種合成法) 1-硝基丁烷(16.5g，0.16mol)和乙醛酸.H2O(28.1g，0.305mol)的MeOH(122mL)溶液在0℃-5℃攪拌下，在2小時內滴加三乙胺(93mL，0.667mol)。將溶液加溫至室溫，攪拌過夜，然后濃縮至干獲得油狀物。將油狀物與水混合，用10％HCl酸化至pH-1，然后用EtOAc萃取。合并的有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(6.5)(28.1g，99％收率)。步驟D化合物(6.6) 步驟C的化合物(6.5)(240g，1.35mmol)的乙酸(1.25L)溶液在攪拌下加入10％Pd/C(37g)。所得溶液在59psi氫化3小時，然后在60psi氫化過夜。蒸去乙酸，殘余物與甲苯共沸三次，然后用MeOH以及乙醚研磨。然后過濾溶液，再與甲苯共沸兩次獲得化合物(6.6)(131g，66％收率)。步驟E化合物(1.08) 步驟D的化合物(6.6)(2.0g，0.0136mol)的二氧六環(huán)(10mL)和H2O(5mL)溶液在0℃攪拌下加入1N NaOH水溶液(4.3mL，0.014mol)。將所得溶液攪拌10分鐘，然后加入Boc酸酐(0.11g，0.014mol)，再在0℃攪拌15分鐘。將溶液加溫至室溫，攪拌45分鐘，在冰箱保存過夜，然后濃縮至干獲得粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物的EtOAc及冰溶液中加入KHSO4(3.36g)和H2O(32mL)，攪拌4-6分鐘。分出有機層，水層用EtOAc萃取兩次。合并的有機層用H2O、鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(1.08)(3.0g，89.2％收率)。步驟F化合物(1.09) 步驟E的化合物(1.08)(3.0g，0.012mol)的DMF(15mL)和CH2Cl2(15mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(1.97g，0.012mol)、N-甲基嗎啉(4.0mL，0.036mol)和EDCl(2.79g，0.0145mol)。將反應物攪拌10分鐘，然后加入H-Gly-OBZ.HCl(2.56g，0.013mol)。所得溶液在-20℃攪拌2小時，在冰箱保存過夜，然后濃縮至干，接著用EtOAc稀釋。所得EtOAc溶液用飽和NaHCO3、H2O、5％H3PO4、鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(1.09)(4.5g，94％收率，MH+＝395.1)。步驟G化合物(6.9) 步驟F的化合物(1.09)(4.5g，0.0114mol)的4N HCl/二氧六環(huán)(45mL)溶液在室溫下攪拌45分鐘，然后濃縮至干獲得化合物(6.9)(4.5g，MH+＝295.1)。步驟H化合物(6.11) Boc-苯基-Gly化合物(6.1)(0.398g，1.58mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)的溶液置于100mL圓底燒瓶中，在-20℃攪拌下加入HOBT(0.258g，1.58mmol)、EDCl(0.364g，1.903mmol)和N-甲基嗎啉(0.523mL，4.759mmol)。將混合物攪拌5分鐘，然后加入步驟G的化合物(6.9)(0.5g，1.51mmol)和CH2Cl2(5mL)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，然后保存在冰箱中過夜。將反應物濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并的有機層用5％H3PO4和鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(6.11)(0.75g，94％收率，MH+＝528.1)。步驟J化合物(6.12) 步驟H的化合物(6.11)(0.75g，1.423mmol)的4N HCl/二氧六環(huán)(21mL)溶液在室溫下攪拌3小時，然后濃縮至干獲得化合物(6.12)(0.68g，100％收率)。步驟K化合物(6.14)
化合物(6.13)(0.44g，1.725mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-20℃攪拌下加入EDCl(0.39g，2.07mmol)、HOBT(0.18g，1.725mmol)和N-甲基嗎啉(0.523mL，4.76mmol)。將反應物攪拌5分鐘，然后加入步驟J的化合物(6.12)(0.68g，1.64mmol)的CH2Cl2(7mL)溶液。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，保存于冰箱過夜，然后濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并的有機層依次用5％H3PO4、鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(6.14)(0.59g，54％收率，MH+＝667.3)。步驟L化合物(6.15) 步驟K的化合物(6.14)(0.593g，0.89mmol)的CH2Cl2(20mL)溶液在攪拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.76g，1.784mmol)。所得溶液在室溫下攪拌2小時，然后加入混合物H2O/CH2Cl2。將混合物攪拌45分鐘，然后加入50％飽和NaHCO3/50％Na2S2O3(10mL)，再攪拌1.5小時。在溶液中再加入CH2Cl2，有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干，用柱色譜提純，用2.5％MeOH/97.5％CH2Cl2洗脫獲得化合物(6.15)(0.48g，82％收率)。步驟M化合物(6.16) 步驟L的化合物(6.15)(0.16g，0.24mmol)的無水EtOH(10mL)溶液在攪拌下加入Pd/C(40.8mg)。將所得溶液劇烈攪拌，然后加入1滴AcOH。然后將溶液在H2氣氛下攪拌2小時，再通過硅藻土過濾獲得化合物(6.16)(0.133g，95％收率，MH+＝575.3)。步驟N化合物(6.18) 化合物(6.17)(0.5g，1.59mmol))的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(0.259g，1.59mmol)、NMM(0.48g，4.77mmol)和EDCl(0.366g，1.91mmol)。將混合物攪拌5分鐘，然后加入步驟G的化合物(6.9)(0.5g，1.51mmol)和CH2Cl2(5mL)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，在冰箱保存過夜，然后濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并有機層后用5％H3PO4和鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(6.18)(0.95g，MH+＝592.1)。步驟O化合物(6.19) 將步驟N的化合物(6.18)(0.93g，1.58mmol)的4N HCl/二氧六環(huán)(26mL)溶液在室溫下攪拌2小時。然后濃縮至干獲得化合物(6.19)(0.96g，100％收率，MH+＝492.1)。步驟P化合物(6.20) 化合物(6.13)(0.51g，2.02mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(0.33g，2.02mmol)、N-甲基嗎啉(0.61g，6.06mmol)和EDCl(0.46g，2.42mmol)。將反應物攪拌5分鐘，接著加入步驟O的化合物(6.19)(0.94g，1.92mmol)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，然后冷藏過夜，濃縮至干，然后用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并有機層后用5％H3PO4和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(6.20)(1.29g，87％收率)。步驟O化合物(6.21) 步驟P的化合物(6.20)(1.27g，1.74mmol)的無水EtOH(50mL)溶液在攪拌下加入Pd/C(100mg)。將所得溶液劇烈攪拌，然后加入2滴AcOH。接著將溶液氫化2小時，通過硅藻土過濾獲得化合物(6.21)(1.07g，96％收率，MH+＝641.1)。步驟R化合物(6.22) 步驟Q的化合物(6.21)(0.25g，0.39mmol)的CH2Cl2(5mL)和DMF(5mL)溶液在-25℃攪拌下加入HOBT(0.06g，0.39mmol)、N-甲基嗎啉(0.12g，1.17mmol)、EDCl(0.089g，0.469mmol)，攪拌10分鐘，接著加入步驟B的化合物(6.3)(0.069g，0.37mmol)。將所得溶液在-25℃攪拌15分鐘，冷藏過夜，然后濃縮至干，用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取，合并有機層后依次用5％H3PO4、鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(6.22)。步驟S化合物(6.23) 步驟R的化合物(6.22)(0.23g，0.302mmol)的CH2Cl2(10mL)溶液在攪拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.256g，0.60mmol)。所得溶液在室溫下攪拌2小時，然后加入混合物H2O/CH2Cl2，再攪拌45分鐘。在反應物中加入50％飽和NaHCO3/50％Na2S2O3(10mL)，將其攪拌1.5小時。溶液中再加入CH2Cl2，然后將有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干，在硅膠上用柱色譜法提純，用1％-3％MeOH/99-97％CH2Cl2洗脫獲得化合物(6.23)(0.08g，34％收率，MH+＝771.2)。制備實施例16步驟A化合物(7.2) 化合物(7.1)(0.476g，1.51mmol)的CH2Cl2(60mL)和DMF(60mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(0.246g，1.51mmol)、N-甲基嗎啉(0.458g，4.53mmol)和EDCl(0.351g，1.81mmol)。將反應物攪拌5分鐘，接著加入制備實施例15步驟F的化合物(6.8)(0.5g，1.51mmol)。所得溶液在-20℃攪拌3小時，然后在冰箱保存過夜，濃縮至干，用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并有機層后依次用5％H3PO4、H2O、鹽水洗滌兩次，用Na2SO4干燥，濃縮至干獲得化合物(7.2)(0.82g，94％收率，MH+＝592.1)步驟B化合物(7.3) 步驟A的化合物(7.2)(0.82g，1.39mmol)的4N HCl/二氧六環(huán)(20mL)溶液在室溫下攪拌2小時，然后濃縮至干獲得化合物(7.3)(0.84g，100％收率，MH+＝492.3)步驟C化合物(7.4) 化合物(6.13)(0.36g，1.40mmol)的CH2Cl2(60mL)和DMF(60mL)的溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(0.228g，1.40mmol)、NMM(0.425g，4.20mmol)和EDCl(0.322g，1.68mmol)。將反應物攪拌5分鐘，接著加入步驟B的化合物(7.3)(0.84g，1.40mmol)。所得溶液在-20℃攪拌3小時，然后在冰箱保存過夜，濃縮至干，然后用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取，合并有機層后用5％H3PO4、H2O、鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(7.4)(0.57g，57％收率，MH+＝731.3)。步驟D化合物(7.5) 步驟C的化合物(7.4)(0.55g，0.75mmol)的CH2Cl2(5mL)溶液在攪拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.64g，1.50mmol)。所得溶液在室溫下攪拌2小時，然后加入混合物H2O/CH2Cl2。將混合物攪拌45分鐘后加入50％飽和NaHCO3/50％Na2S2O3，再攪拌1.5小時。溶液中再加入CH2Cl2，然后將有機層用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，濃縮至干獲得化合物(7.5)(0.24g，44％收率，MH+＝729.5)。步驟E化合物(7.6) 步驟D的化合物(7.5)(0.10g，0.14mmol)的無水EtOH(20mL)溶液在攪拌下加入Pd/C(20mg)。將所得溶液置于100ml圓底燒瓶中劇烈地攪拌，通入H2，并在H2氣氛下攪拌過夜。溶液再通過硅藻土過濾，用EtOH洗滌，濃縮至干獲得化合物(7.6)(93mg，100％收率，MH+＝639.1)。制備實施例17 按照制備實施例16步驟A-E的基本相同的方法，在步驟A中用化合物(8.1)代替化合物(7.1)制備化合物(8.2)和(8.3)。制備實施例18步驟A化合物(9.2) (S)(+)-2-苯基甘氨酸(9.1)(15.0g，0.099mol)的苯(350mL)溶液在攪拌下加入對甲苯磺酸.H2O(20.76g，0.116mol)和芐醇(30mL，0.29mol)。所得溶液加熱回流過夜，溶液變成漿狀。然后將溶液冷卻到室溫，然后加入乙醚。固體通過多孔(scintered)漏斗過濾，用Et2O洗滌兩次，然后在氮氣氛下干燥獲得固體(35.4g)。然后將固體溶于CH2Cl2，用飽和NaHCO3洗滌。合并有機層后用Na2SO4干燥，濃縮至干獲得游離胺(18.1g，75.7％收率)。然后將游離胺溶于乙醚，鼓泡通入1N HCl形成白色沉淀。將沉淀過濾，用乙醚洗滌、真空干燥獲得化合物(9.2)(15.2g)。步驟B化合物(9.4) Boc-Gly-OH(9.3)(11.35g，0.0648mol)的無水DMF(100mL)和無水CH2Cl2(100mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(10.5g，0.065mol)、EDCl(13.6g，0.0712mol)和N-甲基嗎啉(21.3mL，0.194mol)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，然后加入步驟A的化合物(9.2)(18.0g，0.065mol)。將反應物在-20℃攪拌45分鐘，然后將其保存于冰箱過夜。將溶液濃縮至干，然后用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取，合并有機層后用H2O、鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，濃縮至干獲得化合物(9.4)(26.48g，100％收率，MH+＝399.2)。步驟C化合物(9.5) 步驟B的化合物(9.4)(26.4g，0.065mol)的4N HCl/二氧六環(huán)(100mL)溶液在室溫下攪拌1小時，然后濃縮至干獲得化合物(9.5)(22.69g，100％收率，MH+＝299.1)。步驟D化合物(9.6) 制備實施例15步驟E的化合物(1.08)(15.5g，0.0627mol)的DMF(150mL)和CH2Cl2(150mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(10.22g，0.0626mol)、EDCl(13.2g，0.069mol)和NMM(20.67g，0.188mol)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，然后加入步驟C的化合物(9.5)(21.0g，0.063mol)。將反應物在-20℃攪拌1小時，然后在冰箱保存過夜。再將溶液濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取，合并有機層后用H2O、5％H3PO4和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(9.6)(30.3g，92％收率，MH+＝528.1)。步驟E化合物(9.7) 按照以上的制備實施例18步驟C基本相同的方法制備化合物(9.7)(30.0g，100％收率，MH+＝428.1)。步驟F化合物(9.9) Boc-His(Z)-OH(9.8)(0.5g，1.28mmol)的DMF(5mL)和CH2Cl2(5mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(0.209g，1.28mmol)、EDCl(0.27g，1.41mmol)和NMM(0.42mL，3.85mmol)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，然后加入步驟E的化合物(9.7)(0.673g，1.28mmol)，在-20℃攪拌2小時，然后保存于冰箱過夜。再將溶液濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取，合并有機層后用H2O、5％H3PO4和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮獲得化合物(9.9)(0.858g，84％收率，MH+＝799)。步驟G化合物(9.11) 按照制備實施例18步驟C的基本相同的方法制備化合物(9.11)(0.76g，100％收率，MH+＝699.2)。步驟H化合物(9.12) N-Boc-環(huán)己基甘氨酸(0.263g，1.026mmol)的DMF(5mL)和CH2Cl2(5mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(0.167g，1.026mmol)、EDCl(0.216g，1.13mmol)和NMM(0.338g，3.078mmol)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，然后加入步驟G的化合物(9.11)(0.754g，1.03mmol)。將反應物在-20℃攪拌1小時，然后將其保存于冰箱過夜。再將溶液濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取。合并有機層后用H2O、5％H3PO4和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(9.12)(0.735g，MH+＝938.4)。步驟I化合物(9.13) 步驟H的化合物(9.12)(0.367g，0.377mmol)的無水CH2Cl2(10mL)溶液在攪拌下加入Dess-Martin全碘烷(0.32g，0.75mmol)。所得溶液在室溫下攪拌2小時。將CH2Cl2、飽和Na2S2O4和飽和NaHCO3加入溶液中，溶液在室溫下攪拌1小時。分出有機層，用H2O和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得粗產(chǎn)物(340mg)。粗產(chǎn)物在硅膠上用柱色譜提純，依次用CH2Cl2和4％MeOH/CH2Cl2洗脫獲得化合物(9.13)(150mg，MH+＝936.3)。步驟J化合物(9.14) 步驟I的化合物(9.13)(0.15g，1.6mmol)的無水EtOH(40mL)溶液在攪拌下加入10％Pd/C的50％H2O(w/w)溶液。溶液中通入N2，然后在H2氣球中攪拌45分鐘。用硅藻土濾出催化劑，用EtOH/CH2Cl2洗滌，然后濃縮至干獲得化合物(9.14)(0.116g，MH+＝712.2)。制備實施例19步驟A化合物(10.2) L-3-(1-萘基)丙氨酸(2.0g，9.34mmol)的無水EtOH(200mL)懸浮液裝入500mL燒瓶中。然后向溶液中鼓泡通入無水濃HCl(2mL)，溶解所有的固體。在45分鐘內將溶液冷卻至室溫，然后濃縮至干，然后加入EtOH(50mL)、10％Pd/C(300mg)和5％Rh/C(300mg)。所得溶液放入parr震蕩器并在60psi壓力下氫化。反應物通過硅藻土過濾，用EtOH洗滌，濃縮至干獲得粗產(chǎn)物(2.4g，MH+＝254.2)。將粗產(chǎn)物溶于CH2Cl2中，然后用飽和NaHCO3洗滌。合并有機層后濃縮至干，在硅膠上用柱色譜法提純，用5％-20％EtOAc/CH2Cl2洗脫獲得化合物(10.2)(0.65g)。步驟B化合物(10.3) N-Boc-環(huán)己基甘氨酸(0.643g，2.5mmol)的DMF(5mL)和CH2Cl2(5mL)溶液在-20℃攪拌下加入HOBT(0.407g，2.5mmol)，EDCl(0.527g，2.75mmol)和NMM(0.825mL，7.5mmol)。將所得溶液在20℃攪拌10分鐘，然后加入步驟A的化合物(10.2)和CH2Cl2(3mL)，保存于冰箱過夜。再將溶液濃縮至干，接著用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取，合并有機層后用H2O、5％H3PO4和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(10.3)(1.12g，92％收率)。步驟C(10.4) 步驟B的化合物(10.3)(1.1g，2.25mmol)的MeOH(30mL)和H2O(7.5mL)溶液在攪拌下加入LiOH(0.283g，6.75mmol)。所得溶液在室溫下攪拌過夜，然后加入5％H3PO4。形成沉淀，蒸發(fā)溶液除去大部分的MeOH。再加入CH2Cl2，分出CH2Cl2層，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(10.4)(1.068g，100％收率，MH+＝459.1)。步驟D化合物(10.5) 步驟C的化合物(10.4)(1.0g，2.17mmol)的DMF(10mL)和CH2Cl2(10ML)溶液在攪拌下加入HOBT(0.353g，2.17mmol)、EDCl(0.457g，2.38mmol)和NMM(0.715mL，6.51mmol)。所得溶液在-20℃攪拌10分鐘，然后加入制備實施例18步驟E的化合物(9.7)(1.13g，2.17mmol)。將反應物在-20℃攪拌0.5小時，然后保存于冰箱過夜。再將溶液濃縮至干，然后用NaHCO3的飽和EtOAc溶液萃取，合并有機層后用H2O、5％H3PO4和鹽水洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮至干獲得化合物(10.5)(1.8g，M+Na＝890.4)。步驟E化合物(10.6) 步驟D的化合物(10.5)(1.8g，2.07mmol)的無水CH2Cl2(40mL)溶液在攪拌下加入Dess-Martin全碘烷(1.76g，4.15mmol)。所得溶液在室溫下攪拌1小時，接著在1.5小時內滴加無水CH2Cl2(40mL)和H2O(0.074mL)，再攪拌2小時。在上述溶液中加入40mL 50％飽和NaHCO3/50％飽和Na2S2O4，將所得溶液劇烈攪拌半小時。然后分出有機層，用H2O洗滌。合并有機層后濃縮至干，在硅膠上用柱色譜法提純，用2％-3％MeOH/CH2Cl2洗脫獲得化合物(10.6)(0.95g，MH+＝866.2)。步驟F化合物(10.7) 按照制備實施例18步驟K的基本相同的方法制備化合物(10.7)。實施例用制備實施例1步驟A和制備實施例2步驟F的方法偶聯(lián)；用制備實施例1步驟B、制備實施例1步驟F、制備實施例2步驟D和制備實施例4步驟J的方法進行酯去保護；用制備實施例2步驟E和制備實施例4步驟J的方法進行胺去保護以及用制備實施例4步驟H的方法將羥基酰胺氧化成酮酰胺，與上述實施例的α-氨基酸或市售α-氨基酸或文獻介紹的α-氨基酸一起以必要的不同組合制備附表2列出的化合物。固相合成固相偶合反應的一般方法合成是在反應容器中完成，容器由在底部裝配有聚丙烯濾板(frit)的聚丙烯注射針筒構成。Fmoc-保護的氨基酸用標準固相技術偶合。每個反應容器中裝入100mg的初始Fmoc-Sieber樹脂(大約0.035mmol)。樹脂用每份2mL的DMF(2次)洗滌。用2mL 20％v/v的哌啶DMF溶液處理20分鐘去除Fmoc保護基團。樹脂用每份2mL的DMF洗滌(4次)。偶合在DMF(2mL)中完成，使用0.12mmol Fmoc-氨基酸、0.12mmol HATU[O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸鹽]和0.24mmol DIPEA(N，N-二異丙基乙胺)。振蕩2小時后，排干反應容器，將樹脂用每份2mL的DMF(4次)洗滌。用下一個Fmoc-氨基酸或封端基團重復偶合過程。固相Dess-Martin氧化的一般方法合成是在反應容器中進行，容器由在底部裝配有聚丙烯濾板的聚丙烯注射針筒構成。結合在樹脂上的羥基化合物(大約0.035mmol)用0.14mmol Dess-Martin全碘烷和0.14mmol t-BuOH的2mL DCM溶液處理4小時。樹脂用每份2mL的20％v/v iPrOH的DCM溶液、THF、50％v/v THF的水溶液(4次)、THF(4次)和DCM(4次)洗滌。制備實施例20N-Fmoc-2’，3’-二甲氧基苯基甘氨酸化合物(901)
氰化鉀(1.465g，22.5mmol)和碳酸銨(5.045g，52.5mmol)的水(15mL)溶液中加入2，3-二甲氧基苯甲醛901A(2.5g，15mmol)的乙醇(15mL)溶液。將反應物混合物在40℃加熱24小時。減壓蒸發(fā)使溶液體積減至10mL。加入濃鹽酸(15mL)，獲得白色沉淀化合物901B。過濾分離出化合物901B(2.2g，9.3mmol)。將化合物901B溶于10％w/w氫氧化鈉水溶液(15mL)，所得溶液加熱回流24小時。加入濃鹽酸，調節(jié)pH值至中性(pH7)。將所得包含化合物901C的溶液減壓蒸發(fā)。將殘余物溶于5％w/w碳酸氫鈉水溶液(150mL)。溶液在冰浴中冷卻至0℃，并在0℃加入1，4-二氧六環(huán)(30mL)和9-芴基甲基琥珀酰亞胺基碳酸酯(2.7g，8mmol)的1，4-二氧六環(huán)(30mL)溶液。將反應混合物加溫至室溫，在室溫下攪拌24小時。減壓蒸去1，4-二氧六環(huán)。用乙醚洗滌水溶液。加入濃鹽酸調節(jié)pH值至酸性(pH1)。加入乙酸乙酯，有機層用水和鹽水洗滌。有機層用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得所需的白色泡沫狀固體化合物901(3.44g，7.9mmol)。MS(LCMS-電噴霧)434.1MH+。制備實施例21化合物(801) 將N-Fmoc-苯基丙氨酸801A(5g，12.9mmol)的無水DCM(22mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷卻至-30℃，依次加入N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)和氯甲酸甲酯(1.2mL，15.5mmol)。反應混合物在-30℃攪拌1小時，加入N，O-二甲基羥胺鹽酸鹽(1.51g，15.5mol)和N-甲基吡咯烷(1.96mL，16.1mmol)的無水DCM(8mL)溶液。將反應混合物加溫至室溫，并在室溫下攪拌過夜。加入甲苯，將有機層用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌。有機層用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得化合物801B(4g，9.29mmol)。
Red-Al(6.28mL，21.4mmol)的無水甲苯(8mL)溶液在干冰-丙酮浴中冷卻至-20℃，加入化合物801B(4g，9.29mmol)的無水甲苯(12mL)溶液。將反應混合物在-20℃攪拌1.5小時。有機層用稀鹽酸、碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌。有機層用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑，粗產(chǎn)物801C在下一步反應使用時無需再提純。
化合物801C(大約9.29mmol)的己烷(15mL)溶液中依次加入氰化鉀(24mg，0.37mmol)和碘化叔丁基銨(34mg，0.092mmol)的水(4mL)溶液以及丙酮合氰化氫(1.27mL，13.9mmol)。將反應混合物在室溫下攪拌24小時。加入乙酸乙酯，有機層用水和鹽水洗滌。有機層用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得化合物801D(2.4g，6.03mmol)。
化合物801D(2.4g，6.03mmol)的1，4-二氧六環(huán)(11mL)溶液中加入濃鹽酸(11mL)。將反應混合物在80℃加熱3小時。加入乙酸乙酯(25mL)和水(25mL)。有機層用鹽水洗滌，用無水硫酸鈉干燥。減壓蒸去溶劑獲得所需白色泡沫狀固體化合物801(2g，4.8mmol)。MS(LCMS-電噴霧)418.1 MH+。實施例101J化合物(101J) 流程5(見下一頁)
結合在樹脂上的化合物101B、101C、101D、101E、101F和101G從100mg Fmoc-Sieber樹脂(0.035mmol)開始，按照固相偶合反應的一般方法制備。按照固相Dess-Martin氧化的一般方法，將結合在樹脂上的化合物101G氧化成結合在樹脂上的化合物101H。將結合在樹脂上的化合物101H用4mL 2％v/v TFA的DCM溶液處理5分鐘。濾液加入到1mL AcOH中，將溶液真空離心濃縮獲得化合物101J(0.011g，45％收率)。MS(LCMS-電噴霧)703.2 MH+。
利用上文定義的固相合成技術，按照以下結構式制備及使用下列部分 -P1a和P1b其中之一為H，另一個選自
利用上文介紹的方法制備附表3的化合物，所述化合物及其活性數(shù)據(jù)列于表中。
此外制備附表4中列出的化合物及其活性數(shù)據(jù)。它們的制備介紹如下。在固相載體上制備表4化合物的一般方法固相合成可用于小量生產(chǎn)本發(fā)明的某些化合物。與常規(guī)固相合成肽一樣，用于固相合成肽基酮酰胺的反應釜包括一個反應容器，反應容器至少有一面可滲透溶劑以及溶解的試劑，但不能滲透所選粒徑的合成樹脂。這樣的反應釜包括帶有多孔玻璃濾板的玻璃固體反應容器、帶濾板的聚丙烯管或柱或者由Irori Inc.，San Diego CA生產(chǎn)的KansTM反應器。反應釜類型的選擇根據(jù)所需要的固相樹脂體積而定，不同類型的反應釜可在合成的不同階段使用。下面的方法將在接下來的實施例中引用方法A偶合反應在樹脂的N-甲基吡咯烷(NMP)(10-15mL/克樹脂)懸浮液中加入N-Fmoc或N-Boc-氨基酸(2eq)、HOAt(2eq)、HATU(2eq)和二異丙基乙胺(4eq)。讓混合物反應4-48小時。將反應物排出，樹脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(用10-15mL溶劑/克樹脂)洗滌。然后真空干燥樹脂。
方法B去除Fmoc保護Fmoc-保護的樹脂用20％哌啶的二甲基甲酰胺(10mL試劑/g樹脂)處理30分鐘。將反應物排出，樹脂依次用二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷和乙醚(10mL溶劑/克樹脂)洗滌。
方法C去除Boc保護Boc-保護的樹脂用1∶1的二氯甲烷和三氟乙酸混合物處理20-60分鐘(10mL溶劑/克樹脂)。將反應物排出，樹脂依次用二氯甲烷、二甲基甲酰胺、5％二異丙基乙胺的二甲基甲酰胺溶液、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和二甲基甲酰胺(10mL溶劑/克樹脂)洗滌。
方法D縮氨基脲水解將樹脂懸浮于由三氟乙酸∶丙酮酸∶二氯甲烷∶水9∶2∶2∶1組成的裂解混合物(10mL/g樹脂)處理2小時。將反應物排出。將此步驟再重復3次。樹脂依次用二氯甲烷、水和二氯甲烷洗滌，真空干燥。
方法EHF裂解將干燥的肽-nVal(CO)-G-O-PAM樹脂(50mg)置于包含一根小型攪拌棒的HF容器。加入清除劑苯甲醚(總體積的10％)。在存在谷氨酸和半胱氨酸氨基酸下，加入苯硫基甲烷(10％)和1，2-乙二硫醇(0.2％)。然后將HF容器安裝在HF儀器(ImmunoDynamics)，系統(tǒng)充溢氮氣5分鐘。將其用干冰/異丙醇浴冷卻至-78℃。20分鐘后，蒸餾HF至所需體積(10mL HF/g樹脂)。讓反應物在0℃繼續(xù)反應1.5小時。用氮氣逐步移出所有HF。然后將二氯甲烷加入樹脂中，攪拌此混合物5分鐘。接著加入20％的乙酸水(4mL)溶液。攪拌20分鐘后，樹脂用多孔漏斗過濾，減壓除去二氯甲烷。剩余的溶液用己烷(3×)洗滌除去清除劑。同時，將樹脂在1mL甲醇中浸濕。將水層(20％HOAc)返回樹脂中，將混合物攪拌5分鐘后過濾。減壓除去甲醇，凍干水層，然后將肽溶于10-25％甲醇(包含0.1％三氟乙酸)，用反相HPLC提純。II)合成中間體實施例I.合成Boc-3-烷基亞硫酰基丙氨酸 氫化鈉(20mmol，800mg 60％油溶液，用己烷洗滌)在四氫呋喃(30mL)中的混合物在0℃下于10分鐘內加入烷基硫醇(20mmol，R＝Ph，R＝1-萘基，R＝2-萘基，R＝PhCH2CH2或R＝Et)。除去冷卻浴，繼續(xù)攪拌10分鐘，在此期間加入Boc-2S-氨基丙酰基內酯(參閱SyntheticCommunications，(1995)25(16)，2475-2482)(3.74g，20mmol)。用冰浴使其溫度保持不超過30℃。將反應混合物在室溫下攪拌16小時，濃縮后溶于1M硫酸氫鉀水溶液(200mL)和1M HCl(40mL)。混合物用二氯甲烷(2×200mL)萃取。合并有機層后干燥(硫酸鈉)，過濾，濃縮。殘余物溶于水(200mL)、甲醇(30mL)和碳酸鉀(40mmol，5.5g)。冷卻并保持在室溫的情況下，分批加入過硫酸氫鉀制劑(21mmol，13.0g)。將混合物攪拌18小時后真空濃縮除去甲醇。溶液用2M硫酸氫鉀酸化(pH＝1)，然后用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。合并有機層后干燥(硫酸鈉)，過濾，濃縮。用反相HPLC提純。純化后的產(chǎn)物用酸堿萃取除去去boc化物質而進一步提純，然后以二異丙基乙銨鹽形式保存移防止進一步分解(失去Boc基團)。實施例II.合成2-(1-甲基乙基)-7-甲基-辛-4-烯酸 上述中間體按照公開的方法制備(Wuts，P.G.M.；Ritter，A.R.；Pruitt，L.E.J.Org.Chem.(1992)57，6696-6700)。實施例III.合成Fmoc-nV-(dpsc)-Gly-OH(以下步驟1-7) 步驟1.合成異氰基乙酸烯丙酯(以下步驟a-b)a)合成異氰基乙酸鉀鹽 將異氰基乙酸乙酯(96.6ml，0.88mol)滴加入乙醇(1.5L)和氫氧化鉀(59.52g，1.0mol)的冷凍溶液。將反應物緩慢地加溫至室溫。2小時后，過濾收集沉淀產(chǎn)物，分幾次用冷凍乙醇洗滌。如此獲得的異氰基乙酸的鉀鹽經(jīng)過真空干燥獲得金褐色固體(99.92g，91.8％)。
b)合成異氰基乙酸烯丙酯 步驟a的產(chǎn)物(99.92g，0.81mol)溶解于乙腈(810ml)中，加入稀丙基溴(92ml，1.05mol)。加熱回流4小時后獲得深褐色溶液。將反應混合物濃縮，剩下的殘余物溶于乙醚(1.5L)，用水(3×500ml)洗滌。干燥有機層，過濾，濃縮獲得深褐色漿狀物。粗產(chǎn)物在7mm Hg(98℃)下真空蒸餾提純獲得澄清的油狀物(78.92g，78％)。NMR ppm(CDCl3)5.9(m，1H)，5.3(m，2H)，4.7(d，2H)，4.25(s，2H)。步驟2.合成9-芴基甲氧羰基-正纈氨醛(以下步驟a-c)
a)合成9-芴基甲氧羰基-L-正纈氨酸甲酯(Fmoc-nVal-OMe) 商業(yè)獲得性Fmoc-L-nVal(25g，73.75mmol)的無水甲醇(469ml)冷凍溶液在1小時內加入亞硫酰氯(53.76ml，737.5mmol)。TLC用乙酸乙酯經(jīng)過1小時后證實反應完成(Rf＝0.85)。將反應混合物濃縮，殘余物溶于乙酸乙酯。有機層依次用飽和碳酸氫鈉(3×200ml)、鹽水(200ml)洗滌。干燥有機層，過濾，濃縮獲得白色固體Fmoc-nVal-OMe(產(chǎn)量26.03g)。NMR ppm(CD3OD)7.7(m，2H)，7.6(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3(m，2H)，4.1(m，2H)，3.7(s，3H)，1.7(m，1H)，1.6(m，1H)，1.4(m，2H)，0.95(t，3H)。
b)合成9-芴基甲氧羰基-正纈氨醇(Fmoc-正纈氨醇) Fmoc-nVal-OMe(26.03g，73.75mmol)的四氫呋喃(123ml)和甲醇(246ml)溶液中加入氯化鈣(16.37g，147.49mmol)。將反應混合物冷卻至0℃，分幾批加入硼氫化鈉(11.16g，294.98mmol)。在獲得的稠糊狀物中加入500ml甲醇，反應物在室溫下攪拌90分鐘。TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷證實反應完成(Rf＝0.25)。反應通過緩慢加入0℃的100ml水猝滅。減壓除去甲醇，剩余的水相用乙酸乙酯稀釋。有機層用水(3×500ml)、飽和碳酸氫鈉(3×500ml)和鹽水(500mol)洗滌。用硫酸鈉干燥有機層，濃縮至白色固體(21.70g，90.5％)。NMR ppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.7(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，4.3-4.5(m，2H)，4.2(m，1H)，3.6(s，1H)，3.5(s，2H)，1.5(m，1H)，1.3-1.4(m，3H)，0.99(m，3H)。
c)合成9-芴基甲氧羰基-正纈氨醛(Fmoc-nVal-CHO) 在Fmoc-正纈氨醇(21.70g，66.77mmol)的二氯甲烷(668ml)溶液中加入三乙胺(37.23ml，267mmol)，將溶液冷卻至0℃。吡啶三氧化硫絡合物(42.51g，267mmol)的二甲基亞砜(96ml)懸浮液加入到上述冷凍溶液中。1小時后，TLC用2∶3乙酸乙酯∶己烷證實反應完成。減壓除去二氯甲烷，將殘余物溶于乙酸乙酯中，用水(2×50ml)、1N飽和硫酸氫鈉(2×50ml)、飽和碳酸氫鈉(2×50ml)和鹽水(50ml)洗滌。濃縮有機層獲得白色固體。獲得理論產(chǎn)量(21.57g)，反應物直接進行下一步驟而無需再提純。步驟3.合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸鹽(以下步驟a-b)a)合成Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷 羰基二咪唑(16.2g，0.10mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液在30分鐘內滴加肼基甲酸叔丁酯(13.2g，0.100mol)的二甲基甲酰胺(225ml)溶液。在接下來的30分鐘內加入二苯基甲胺(18.3g，0.10mol)。將反應物在室溫下攪拌1小時。加入水(10ml)后將混合物減壓濃縮至約150ml。將此溶液傾入水(500ml)中，用乙酸乙酯(400ml)萃取。乙酸乙酯相用1N HCl(2×75ml)、H2O(2×75ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(2×75ml)和氯化鈉(2×75ml)洗滌，用硫酸鎂干燥。將混合物過濾，濃縮溶液獲得白色泡沫狀產(chǎn)物29.5g(85％收率)。所得產(chǎn)物可以用乙酸乙酯/己烷重結晶提純，但是上述產(chǎn)物純度足以在下一步直接使用mp 142-143℃ 1H NMR(CDCl3)d 1.45(s，9H)，6.10(dd，2H)，6.42(s，1H)，6.67(bs，1H)，7.21-7.31(m，10H)。C19H23N3O3的分析值C，66.84；H，6.79；N，12.31。實測值C，66.46；H，6.75；N；12.90。
b)合成二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸鹽 Boc-氨基脲-4-基二苯基甲烷(3.43g，10mmol)的二氯甲烷(12.5ml)溶液在室溫下用三氟乙酸(12.5ml)處理，攪拌30分鐘。將溶液滴加到75ml乙醚，過濾收集所得固體(2.7g，80％)。mp 182-184℃。1H NMR(CD3OD)d 6.05(s，1H)，7.21-7.35(m，10H)。13C NMR(CD3OD)d57.6，118.3(q，CF3)，126.7，127.9，141.6，156.9，160.9(q，CF3CO2H)。步驟4.合成Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-CHO(實施例III，步驟2c)(5.47g，16.90mmol)的二氯甲烷(170ml)溶液中加入異氰基乙酸烯丙酯(實施例III，步驟1b)(2.46ml，20.28mmol)和吡啶(5.47ml，67.61mmol)。將反應混合物冷卻至0℃，滴加三氟乙酸(3.38ml，33.80mmol)。將反應物在0℃攪拌1小時，然后在室溫下攪拌48小時。TLC采用乙酸乙酯證實反應完成。將反應混合物濃縮，并用含20％-70％乙酸乙酯的己烷進行快速色譜法提純。合并包含所需產(chǎn)物部分，濃縮至白色泡沫狀(6.88g，87.3％)。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷顯示出一個斑點(Rf＝0.37)。NMRppm(CD3OD)7.8(m，2H)，7.65(m，2H)，7.4(m，2H)，7.3(m，2H)，5.9(m，1H)，5.1-5.4(m，2H)，4.55-4.65(m，2H)，4.3-4.4(m，2H)，4.15-4.25(m，1H)，4.01(s，1H)，3.9-4.0(m，3H)，1.5-1.6(m，2H)，1.35-1.45(m，3H)，0.9(m，3H)。步驟5.合成Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CHOH)-Gly-O烯丙基(步驟4)(5.01g，10.77mmol)的二甲基亞砜(100ml)和甲苯(100ml)溶液中加入EDC(20.6g，107.7mmol)。將反應混合物冷卻至0℃，滴加二氯乙酸(4.44ml，53.83mmol)。反應物在0℃下攪拌15分鐘，然后在室溫下攪拌1小時。在0℃下加入水(70ml)，減壓除去甲苯。殘余物用乙酸乙酯稀釋，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌幾次，再用1N硫酸氫鈉和鹽水洗滌。用硫酸鈉干燥有機層，過濾，濃縮。獲得理論產(chǎn)量4.99g，反應物直接進入下一步驟而無需再提純。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷顯示一個斑點(Rf＝0.73)。步驟6.合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基 Fmoc-nVal-(CO)-Gly-O烯丙基(步驟5)(4.99g，10.75mmol)的乙醇(130ml)和水(42ml)溶液中加入二苯基甲基氨基脲(dpsc)三氟乙酸鹽(實施例III，步驟3b)(7.6g，21.5mmol)和乙酸鈉·3H2O(1.76g，12.9mmol)。將反應混合物加熱回流90分鐘。用薄層色譜法以1∶1乙酸乙酯∶己烷證實反應完成。減壓除去乙醇，殘余物溶于乙酸乙酯，用1N硫酸氫鈉(2×10ml)、飽和碳酸氫鈉(2×10ml)和鹽水(2×10ml)洗滌。干燥有機層，過濾，濃縮。用快速色譜法提純所得殘余物，使用含20％到50％乙酸乙酯的己烷，獲得白色固體(5.76g，78％)。TLC用1∶1乙酸乙酯/己烷顯示出兩個斑點(順式異構體和反式異構體)，Rf＝0.42和0.50。步驟7.合成Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-O烯丙基(實施例III，步驟6)(4.53g，6.59mmol)的四氫呋喃(300ml)溶液中先加入雙甲酮(4.62g，32.97mmol)，然后加入四(三苯膦)鈀(O)催化劑(0.76g，0.66mmol)。在90分鐘后，用TLC(9∶1二氯甲烷∶甲醇)證實反應完成。將反應混合物濃縮，剩余的殘余液溶于乙酸乙酯，用0.1M磷酸氫鉀(3×50ml)洗滌。有機層用50ml亞硫酸氫鈉處理，將兩相體系攪拌15分鐘。將兩相分離，此步驟再重復兩次。干燥有機層，過濾，濃縮，用快速柱色譜法(含20％-100％乙酸乙酯的己烷，然后用9∶1二氯甲烷∶甲醇)處理獲得白色固體(3.99g，94％)。TLC用9∶1二氯甲烷∶甲醇顯示兩個斑點(順式異構體和反式異構體)。NMRδppm(CD3OD)7.75(m，2H)，7.6(m，3H)，7.2-7.4(m，14H)，6.1-6.2(m，1H)，4.25-4.4(m，2H)，4.1-4.2(m，2H)，3.85(s，2H)，1.6-1.8(m，2H)，1.3-1.5(m，2H)，0.95(t，3H)。實施例IV.合成H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂(以下步驟1-2) 步驟1.合成H-Phg-MBHA樹脂 將商業(yè)獲得性MBHA樹脂(2.6g，1.12mmol/g，2.91mmol)轉移到250ml配置了氮氣入口的燒結固相反應容器。將其用每份30ml的二氯甲烷、甲醇、二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗滌，根據(jù)方法A將其與商業(yè)獲得性Fmoc-Phg-OH(2.17g，5.82mmol)偶合18小時，反應效率為99.82％。然后按照方法B將樹脂去除Fmoc保護。對少量試樣的茚三酮定性檢測獲得深藍色樹脂和溶液，說明反應成功。步驟2.合成H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂 以上步驟1獲得的樹脂(2.6g，0.8mmol/g，2.91mmol)按照方法A與Fmoc-nVal-(dpsc)-Gly-OH(實施例III，步驟7)(5.82mmol，3.77g)反應。在18小時后，用茚三酮定量分析顯示偶合效率為99.91％。將樹脂按照方法B除去Fmoc保護。對少量試樣的定性茚三酮檢測獲得深藍色樹脂和溶液，說明反應成功。III)典型丙型肝炎靶的固相裝配實施例V.固相合成2，5-二氟-6-羥基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH2(以下步驟1-5) 步驟1.合成Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂 將化合物H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂(實施例IV，步驟2)(1.5g，1.12mmol/g，1.68mmol)轉移到濾板型聚丙烯管中，按照方法A與N-Fmoc-Leu-OH(890mg，2.52mmol)偶合。在18小時后，用茚三酮定性分析顯示無色珠狀物以及無色溶液。步驟2.合成Fmoc-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂 將實施例V步驟1獲得的樹脂(Fmoc-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂，1.68mmol)按照方法B進行除去Fmoc保護程序。然后按照方法A與商業(yè)獲得性Fmoc-G(Chx)-OH(0.956g，0.2.52mmol)偶合。18小時后，茚三酮的定量分析顯示偶合效率為98％。步驟3.合成2，5-二氟-6-羥基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂 實施例V步驟2獲得的樹脂(Fmoc-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂)按照方法B除去Fmoc保護。對少量試樣的茚三酮檢測獲得深藍色樹脂和溶液，說明反應成功。將樹脂(150mg，0.168mmol)懸浮于1ml NMP，加入3，6-二氟鄰苯二甲酸酐(91mg，0.42mmol)，然后加入二異丙基乙胺(0.146ml，84mmol)，再將反應混合物在室溫下振蕩18小時。茚三酮定量分析顯示偶合效率為97.8％。步驟4.合成2，5-二氟-6-羥基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA樹脂 實施例V步驟3的化合物(2，5-二氟-6-羥基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂)(200mg)按照方法D進行縮氨基脲水解。步驟5.合成2，5-二氟-6-羥基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-NH2 將實施例V步驟4的樹脂(2，5-二氟-6-羥基羰基苯基羰基-G(Chx)-Leu-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA樹脂)(100mg)置于HF裂解條件(方法E)獲得所需的粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物通過HPLC提純，采用2.2×25cm反相柱，包含由300埃孔徑的10微米膠粒組成的C-18樹脂，使用20-50％乙腈水溶液梯度洗脫。分析HPLC用4.6×250mm反相柱，包含由300埃孔徑的5微米膠粒組成的C-18樹脂，用10-60％乙腈水溶液洗脫(包含0.1％三氟乙酸)，在17.2分鐘顯示一個峰。用低分辨率質譜證實的所需要的物質(MH+771.5)。實施例VI.固相合成iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal-(CO)-Gly-Phg-NH2(以下步驟1-5) 步驟1.合成Fmoc-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂 將化合物H-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂(實施例IV，步驟2)(0.17g，0.8mmol/g，0.19mmol)轉移到濾板型聚丙烯管，按照方法A與Boc-Cys((O2)Et)-OH(實施例1)(160mg，0.38mmol)偶合。在18小時后，茚三酮定量分析顯示偶合完成99.98％。步驟2.合成Fmoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂 將前一步驟獲得的樹脂(實施例VI，步驟1)(Boc-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂，0.19mmol)按照方法C除去Boc保護。然后按照方法A與Fmoc-G(Chx)-OH(0.170g，0.45mmol)偶合。在18小時后，茚三酮定量分析顯示偶合效率為99.92％。步驟3.合成iBoc-G(Chx)-Cys(O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂 將前一步驟獲得的樹脂(實施例VI，步驟2)(Fmoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂)按照方法B除去Fmoc保護。對少量試樣的茚三酮檢測獲得深藍色樹脂和溶液，說明反應成功。將上述樹脂(170mg，0.19mmol)懸浮于1ml NMP中，加入氯甲酸異丁酯(0.06ml mg，0.45mmol)，然后加入二異丙基乙胺(0.16ml，0.90mmol)，再將反應混合物在室溫下振蕩18小時。茚三酮定量分析顯示偶合效率為99.35％。步驟4.合成iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA樹脂 前一步驟的化合物(實施例VI，步驟3)iBoc-G(Chx)-Cys(O2)Et)-nVal(dpsc)-Gly-Phg-MBHA樹脂(170mg)按照方法D進行縮氨基脲水解。步驟5.合成iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-NH2 將前一步驟的樹脂(實施例VI，步驟4)(iBoc-G(Chx)-Cys((O2)Et)-nVal(CO)-Gly-Phg-MBHA樹脂)(170mg)置于HF裂解條件(方法E)，獲得所需要的粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用HPLC提純用2.2×25cm反相柱，包含由300埃孔徑的10微米膠粒組成的C-18樹脂，使用20-50％乙腈水溶液梯度洗脫。分析HPLC用4.6×250mm反相柱，包含由300埃孔徑的5微米膠粒組成的C-18樹脂，用10-60％乙腈水溶液洗脫(包含0.1％三氟乙酸)，在16.94分鐘顯示一個峰。用低分辨率質譜證實為所需要的物質(MH+737.5)。檢測HCV蛋白酶抑制活性分光光度分析按照R.Zhang等(Analytical Biochemistry，270(1999)268-275，其公開內容通過引用結合到本文中)介紹的方法對本發(fā)明化合物進行HCV絲氨酸蛋白酶的分光光度分析。基于蛋白分解顯色酯底物的分析適合連續(xù)監(jiān)測HCV NS3蛋白酶活性。底物衍生自其C末端羧基被4個不同發(fā)色醇(3-或4-硝基酚、7-羥基-4-甲基-香豆素或4-苯基偶氮酚)之一酯化的NS5A-NS5B連接序列(Ac-DTEDVVX(Nva)(其中X＝A或P)的P側。下面介紹這些新的分光光度性酯底物的合成、表征和在高通量篩選中的應用，并且詳細介紹HCV NS蛋白酶抑制劑的動力學評價。
材料和方法材料分析用有關緩沖液的化學試劑得自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Missouri)。肽合成試劑得自Aldrich Chemicals、Novabiochem(San Diego，California)、Applied Biosystems(Foster City，California)和Perseptive Biosystems(Framingham，Massachusetts)。人工合成肽，或者用自動ABI431A型合成儀(Applied Biosystems)合成肽。LAMBDA 12型UV/VIS分光計得自Perkin Elmer(Norwalk，Connecticut)，96孔UV板得自Corning(Corning，New York)。預熱均溫塊(Prewarming block)得自USA Scientific(Ocala，F(xiàn)lorida)，96孔板渦旋器得自Labline Instruments(Melrose Park，Illinois)。Spectramax Plus微量滴定板讀數(shù)儀(帶有單色計)得自Molecular Devices(Sunnyvale，California)。
酶制備使用以前公開的方法(D.L.Sali等，Biochemistry，37(1998)3392-3401)制備重組HCV NS3/NS4A異源二聚體蛋白酶(菌株1a)。蛋白濃度使用預先通過氨基酸分析定量的重組HCV蛋白酶標準品通過Biorad染料方法測定。開始分析前，采用Biorad Bio-Spin P-6預填柱使酶貯藏緩沖液(50mM磷酸鈉pH8.0，300mM氯化鈉，10％甘油，0.05％月桂基麥芽糖苷和10mM DTT)交換為檢測緩沖液(25mMMOPS pH6.5，300mM氯化鈉，10％甘油，0.05％月桂基麥芽糖苷，5μMEDTA和5μM DTT)。
底物合成與純化根據(jù)R.Zhang等(同上)報道合成底物，合成開始時用標準方法(K.Barlos等，Int.J.Pept.Protein Res.，37(1991)，513-520)使Fmoc-Nva-OH固定在2-氯三苯甲基氯樹脂上。隨后利用Fmoc化學裝配肽，或者人工進行或者采用自動ABI431型肽合成儀。N-乙?；彝耆Ｗo的肽片斷經(jīng)過10％乙酸(HOAC)和10％三氟乙醇(TFE)的二氯甲烷(DCM)溶液處理30分鐘，或者經(jīng)過2％三氟乙酸(TFA)的DCM溶液處理10分鐘后與樹脂斷開。共沸蒸發(fā)合并的濾液和DCM洗滌液(或者重復用碳酸鈉水溶液萃取)，以去裂解時使用的酸。DCM相用硫酸鈉干燥后蒸發(fā)。
所述酯底物用標準酸-醇偶合方法(K.Holmber等，Acta Chem.Scand.，B33(1979)410-412)裝配。肽片段溶解于無水吡啶(30-60mg/ml)，其中加入10摩爾當量發(fā)色團和催化量(0.1eq.)對甲苯磺酸(pTSA)。加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，3eq.)啟動偶合反應。用HPLC監(jiān)測產(chǎn)物形成，在室溫下反應12-72小時后證實反應完畢。吡啶溶劑通過真空蒸發(fā)除去，進一步與甲苯共沸除去。肽酯用95％TFA的DCM溶液去保護2小時，用無水乙醚萃取3次以去除過量發(fā)色團。去保護底物在C3或C8柱上通過反相HPLC純化，用30％-60％乙腈梯度洗脫(用6個柱體積)。HPLC純化后的總收率約20-30％。電噴霧離子化質譜證實分子量。底物以干粉干燥保藏。
底物及產(chǎn)物光譜用pH6.5檢測緩沖液獲得底物和相應的發(fā)色團產(chǎn)物的光譜。利用多個稀釋度以1-cm比色杯于優(yōu)化非高峰波長(3Np和HMC為340nm，PAP為370nm，4-Np為400nm)檢測消光系數(shù)。優(yōu)化非高峰波長的定義為底物和產(chǎn)物之間產(chǎn)生最大吸光度差異((產(chǎn)物OD-底物OD)/底物OD)的波長。
蛋白酶分析在96孔微量滴定板中用200μl反應混合物于30℃進行HCV蛋白酶分析。對NS3/NS4A異源二聚體優(yōu)化檢測緩沖條件(25mM MOPS pH6.5，300mM NaCl，10％甘油，0.05％月桂基麥芽糖苷，5μM EDTA和5μM DTT)(D.L.Sali等，同上)。通常，將150μl的緩沖劑、底物和抑制劑的混合物加入各孔中(DMSO終濃度為4％v/v)，使其于30℃預溫育約3分鐘。然后用50μl在檢測緩沖液中的蛋白酶預熱溶液(12nM，30CC)啟動反應(終體積為200μl)。用配備有單色器的Spectromax Plus微量滴定板讀數(shù)儀(采用截止濾光片型板讀數(shù)儀可獲得可接受的結果)，在合適波長(3Np和HMC為340nm，PAP為370nm，4-Np為400nm)在檢測時間(60分鐘)范圍內監(jiān)測各板的吸光度變化。相對于用作非酶水解對照的無酶空白，在合適波長監(jiān)測Nva和發(fā)色團之間的酯鍵的蛋白裂解。在30倍底物濃度范圍內(約6-200μM)評價底物動力學參數(shù)。用線性回歸確定初速度，采用非線性回歸分析(Mac Curve Fit 1.1，K.Raner)用實驗數(shù)據(jù)擬合Michaelis-Menten方程，獲得動力學常數(shù)。計算酶變率(kcat)，假定酶全部具有活性。
抑制劑和滅活劑的評價對竟爭性抑制劑Ac-D-(D-Gla)-L-I-(Cha)-C-OH(27)、Ac-DTEDVVA(Nva)-OH和Ac-DTEDVVP(Nva)-OH，實驗測定固定濃度酶和底物的抑制常數(shù)，根據(jù)用于竟爭性抑制動力學的重排Michaelis-Menten方程vo/vi＝1+[l]o/(Ki(1+[S]o/Km))，其中vo為非抑制初速度，vi為存在任何已知抑制劑濃度([l]o)抑制劑的初速度，[S]o為所使用的底物濃度；用vo/vi對抑制劑濃度([l]o)作圖。用線性回歸擬合獲得的數(shù)據(jù)，用獲得的斜率1/(Ki(1+[S]o/Km)計算Ki*值。
在以上各表中給出了獲得的本發(fā)明不同化合物的Ki*值，其中的化合物按照Ki*順序排列。根據(jù)上述試驗結果，熟練技術人員顯而易見的是，本發(fā)明化合物具有良好的NS3-絲氨酸蛋白酶抑制劑作用。
盡管結合上述具體實施方案闡明了本發(fā)明，但是本發(fā)明的許多替代、改進及其它變化方案對本領域普通技術人員是顯而易見的。所有這樣的替代、改進及變化方案均屬于本發(fā)明實質及范疇。表2 表3 表4
權利要求
1.一種化合物，包括該化合物的對映異構體、立體異構體、旋轉異構體和互變異構體，以及該化合物的藥學上可接受的鹽或溶劑化物，所述化合物具有式I所示的通式結構式I 其中G、J和Y可以相同或不同并且獨立選自以下基團H、烷基、烷基-芳基、雜烷基、雜芳基、芳基-雜芳基、烷基-雜芳基、環(huán)烷基、烷氧基、烷基-芳氧基、芳氧基、雜芳氧基、雜環(huán)烷氧基、環(huán)烷氧基、烷基氨基、芳基氨基、烷基-芳基氨基、芳基氨基、雜芳基氨基、環(huán)烷基氨基和雜環(huán)烷基氨基，前提是Y可以另外任選被X11或X12取代；X11選自以下基團烷基、鏈烯基、鏈炔基、環(huán)烷基、環(huán)烷基-烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、雜芳基、烷基雜芳基或雜芳基烷基，前提是X11可以另外任選被X12取代；X12為羥基、烷氧基、芳氧基、硫代基、烷硫基、芳硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷基磺酰基、芳基磺?；⑼榛鶃喕酋０被?、芳基亞磺酰氨基、羧基、烷氧羰基、羧酰胺基、烷氧基羰基氨基、烷氧基羰氧基、烷基脲基、芳基脲基、鹵素、氰基或硝基，前提是所述烷基、烷氧基和芳基可以另外任選被獨立選自X12的部分取代；R1為COR5或B(OR)2，其中R5選自以下基團H、OH、OR8、NR9R10、CF3、C2F5、C3F7、CF2R6、R6和COR7，其中R7選自以下基團H、OH、OR8、CHR9R10和NR9R10，其中R6、R8、R9和R10可以相同或不同并且獨立選自以下基團H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、環(huán)烷基、芳基烷基、雜芳基烷基、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)R’ 、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)COOR11和CH(R1’)CONHCH(R2’)CONHCH(R3’)CONHCH(R4’)CONHCH(R5’)CONR12R13，其中R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R11、R12、R13和R’可以相同或不同并且獨立選自以下基團H、烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、環(huán)烷基、烷基-芳基、烷基-雜芳基、芳基-烷基和雜芳烷基；Z選自O、N或CH；W可能存在或者不存在，且當W存在時，W選自C＝O、C＝S或SO2；R、R’、R2、R3和R4獨立選自以下基團H；C1-C10烷基；C2-C10鏈烯基；C3-C8環(huán)烷基；C3-C8雜環(huán)烷基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基；氧、氮、硫或磷原子(所述氧、氮、硫或磷原子的數(shù)目為0-6個)；(環(huán)烷基)烷基和(雜環(huán)烷基)烷基，其中所述環(huán)烷基的組成為3-8個碳原子，0-6個氧、氮、硫或磷原子，而所述烷基具有1-6個碳原子；芳基；雜芳基；烷基-芳基；烷基-雜芳基；其中所述烷基、雜烷基、鏈烯基、雜鏈烯基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基部分可任選被取代，所述術語“取代”指任選并且化學上適當?shù)谋?個或多個選自以下的基團取代烷基、鏈烯基、鏈炔基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、鹵素、羥基、硫代基、烷氧基、芳氧基、烷硫基、芳硫基、氨基、酰氨基、酯、羧酸、氨基甲酸酯、脲、酮、醛、氰基、硝基、氨磺酰、亞砜、砜、磺酰脲、酰肼和異羥肟酸酯。
2.權利要求1的化合物，其中R1為COR5，而R5為H、OH、COOR8或CONR9R10。
3.權利要求2的化合物，其中R1為COCONR9R10，而R9為H，R10選自H、CH(R1’)COOR11、CH(R1’)CONR12R13、CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13和CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)。
4.權利要求3的化合物，其中R10為CH(R1’)CONHCH(R2’)COOR11、CH(R1’)CONHCH(R2’)CONR12R13或CH(R1’)CONHCH(R2’)(R’)，其中R1’為H或烷基、雜烷基，R2’為苯基、取代的苯基、雜原子取代的苯基、苯硫基、環(huán)烷基、哌啶基或吡啶基。
5.權利要求4的化合物，其中R1’為H。
6.權利要求5的化合物，其中R11為H或叔丁基；R’為羥甲基；R2’選自 其中U1和U2可以相同或不同，并且獨立選自H、F、CH2COOH、CH2COOMe、CH2CONH2、CH2CONHMe、CH2CONMe2、疊氮基、氨基、羥基、取代的氨基、取代的羥基；U3和U4可以相同或不同，并且為O或S；U5選自烷基磺?；⒎蓟酋；㈦s烷基磺?；㈦s芳基磺?；⑼榛驶?、芳基羰基、雜烷基羰基、雜芳基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、雜芳氧基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、雜芳基氨基羰基或它們的組合；NR12R13選自NH2，NHMe，N(Me)OMe，NMe2， 其中U6為H、OH或CH2OH。
7.權利要求2的化合物，其中R2選自以下部分
8.權利要求7的化合物，其中R3選自 和 其中R31＝OH或O-烷基；Y19選自以下部分 Y20選自以下部分
9.權利要求8的化合物，其中R3選自以下結構
10.權利要求9的化合物，其中Z＝N，R4＝H。
11.權利要求10的化合物，其中W為C＝O或SO2。
12.權利要求11的化合物，其中Y選自以下部分 其中Y11選自H、COOH、COOEt、Ome、Ph、Oph、NHMe、NHAc、NHPh、CH(Me)2、1-三唑基、1-咪唑基和NHCH2COOH；Y12選自H、COOH、COOMe、Ome、F、Cl或Br；Y13選自以下部分 Y14選自MeSO2、Ac、Boc、iBoc、Cbz或Alloc；Y15和Y16可以相同或不同，并且獨立選自烷基、芳基或雜烷基、或雜芳基；Y17為CF3、NO2、CONH2、OH、COOCH3、OCH3、OC6H5、C6H5、COC6H5、NH2或COOH；Y18為COOCH3、NO2、N(CH3)2、F、OCH3、CH2COOH、COOH、SO2NH2或NHCOCH3。
13.權利要求12的化合物，其中Y選自 其中Y17＝CF3、NO2、CONH2、OH、NH2或COOH；Y18＝F、COOH。
14.權利要求13的化合物，其中J選自
15.權利要求14的化合物，其中J為H、CH3或Bn。
16.權利要求15的化合物，其中G選自以下部分
17.權利要求16的化合物，其中G選自
18.一種藥用組合物，它包含作為活性成分的權利要求1的化合物。
19.權利要求18的藥用組合物，它用于治療丙型肝炎病毒相關性疾病。
20.權利要求18的藥用組合物，它還包含藥學上可接受載體。
21.一種治療HCV蛋白酶相關性疾病的方法，所述方法包含給予需要這種治療的患者一種藥用組合物，該組合物包含治療有效量的權利要求1的化合物。
22.權利要求21的方法，其中所述給藥為通過皮下給藥。
23.權利要求1的化合物用于制造藥物的用途，所述藥物用于治療HCV蛋白酶相關性疾病。
24.一種制備用于治療HCV蛋白酶相關性疾病的藥用組合物的方法，所述方法包括使權利要求1的化合物與藥學上可接受的載體密切接觸。
25.一種具有HCV蛋白酶抑制活性的化合物，包括所述化合物的對映異構體、立體異構體、旋轉異構體和互變異構體，以及所述化合物藥學上可接受的鹽或溶劑化物，所述化合物選自具有以下結構的化合物 R＝MeR＝芐基 X＝OtBuX＝OHX＝NH2X＝NMeOMeX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH X＝H，Y＝tBu；X＝tBu，Y＝H R＝炔丙基；R＝烯丙基 X＝OtBu；X＝OH X＝Ot丁基X＝OH X＝Ot丁基X＝OHX＝NMe2 X＝OtBuX＝OH R＝tBuR＝HR＝Me X＝H，Y＝COOHX＝COOH，Y＝H
26.一種用于治療HCV蛋白酶相關性疾病的藥用組合物，所述組合物包含治療有效量的一種或多種權利要求25的化合物和藥學上可接受的載體。
27.權利要求26的藥用組合物，它還包含抗病毒藥物。
28.權利要求26或27的藥用組合物，它還包含干擾素。
29.權利要求28的藥用組合物，其中所述抗病毒藥物為利巴韋林，所述干擾素為α-干擾素。
30.一種選自以下的化合物， 和 或其對映異構體、立體異構體、旋轉異構體或互變異構體，或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中所述化合物具有HCV抑制活性。
31.一種藥用組合物，它包含一種或多種權利要求30的化合物。
32.一種治療丙型肝炎病毒相關性疾病的方法，該方法包括給予有效量的一種或多種權利要求30的化合物。
33.一種調節(jié)丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶活性的方法，該方法包括使HCV蛋白酶與一種或多種權利要求30的化合物接觸。
34.一種治療、預防或改善一種或多種丙型肝炎癥狀的方法，該方法包括給予有效量的一種或多種權利要求30的化合物。
35.權利要求33的方法，其中所述HCV蛋白酶為NS3/NS4a蛋白酶。
36.權利要求35的方法，其中所述一種或多種化合物抑制HCVNS3/NS4a蛋白酶。
37.一種調節(jié)丙型肝炎病毒(HCV)多肽加工的方法，該方法包括使包含所述HCV多肽的組合物在加工所述多肽的條件下與一種或多種權利要求30的化合物接觸。
38.權利要求7的化合物，其中R3為環(huán)己基。
39.權利要求11的化合物，其中Y選自2-羧基-3-羥苯基、3-四氫呋喃基甲氧基和2-磺苯基。
40.權利要求15的化合物，其中G選自乙基磺?；谆?、苯基磺酰基甲基、2-苯基乙基磺?；谆?-萘基磺?；谆?。
全文摘要
本發(fā)明公開了具有HCV蛋白酶抑制活性的新型肽化合物以及制備所述化合物的方法。在另一實施方案中，本發(fā)明公開了包含所述化合物的藥用組合物以及將其用于治療HCV蛋白酶相關性疾病的方法。
文檔編號A61K31/445GK1446201SQ01813921
公開日2003年10月1日 申請日期2001年7月19日 優(yōu)先權日2000年7月21日
發(fā)明者A·K·薩克塞納, V·M·吉里亞瓦拉班, S·L·伯根, R·G·洛維, E·E·堯, F·本尼特, J·L·麥克科爾米克, H·王, R·E·皮克, 劉怡宗, 覃天佑, 朱昭寧, A·阿拉薩潘, 陳新海, S·文卡特拉曼, T·N·帕雷克, P·A·平托, B·桑塔納姆, F·G·恩約羅格, A·K·甘古利, H·A·瓦卡羅, S·J·坎普, O·E·萊維, M·利姆-維爾比, S·Y·塔穆拉 申請人:先靈公司, 科瓦斯國際公司