專利名稱：從含有高水平葉綠素的金盞花提取物中純化葉黃素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從可能含有高水平葉綠素色素的粗金盞花提取物中純化黃體素和玉米黃素的方法。
來自金盞花提取物的類胡蘿卜素，尤其是葉黃素，在家禽產業(yè)用于給肉雞皮膚和蛋黃著色已經有數(shù)十年。金盞花提取物中存在的黃體素的濃度遠遠高于玉米黃素的濃度。用于家禽產業(yè)的含有相對高濃度玉米黃素的著色配方最近已經出現(xiàn)在市場上，其中黃體素已經被異構化以便產生玉米黃素(Torres的美國專利5,523,494，和Rodriguez的美國專利5,973,211)。
除了類胡蘿卜素在家禽產業(yè)中的商業(yè)重要性，最近關于它們在促進人類健康中的潛在角色使類胡蘿卜素已經受到了科學家們相當大的關注。像α和β-胡羅卜素、黃體素和玉米黃素這樣的化合物已經表現(xiàn)出具有很強的抗氧化活性，該活性可以阻礙或阻止像癌癥、動脈硬化、白內障、黃斑退化和其它疾病(Bowen，WO98/45241)。黃體素和玉米黃素是存在于人類視網(wǎng)膜的黃斑部位的僅有的類胡蘿卜素，而且與負責視覺敏銳度的黃斑的正常功能有關。也已經報導，類胡蘿卜素增強了免疫反應。作為代謝過程的副產物而產生，和發(fā)源于環(huán)境污染物(例如二氧化氮、污染空氣構成的臭氧層、重金屬、鹵化烴、電離輻射和香煙煙霧)的自由基被暗示為影響上述提到的許多疾病的致病因素。類胡蘿卜素是能夠促使一連串有害化學反應的高活性氧自由基的有力猝滅劑。類胡蘿卜素也作為鏈斷裂抗氧化劑，尤其是在低氧分壓下。因此，類胡蘿卜素可以猝滅誘導自由基的反應，也能阻止自由基的產生，從而限制了自由基/氧化的破壞。
從萬壽菊手摘的金盞花花瓣含有一種在自然界發(fā)現(xiàn)的最高濃度的類胡蘿卜素。工業(yè)規(guī)模栽培金盞花以及機械化收割過程已經增加了通常與花瓣一起獲得的葉、莖、雜草和其它植物部分的收獲量。當從這樣的原材料提取粗粉時，就可以獲得含有高水平葉綠素和有關化合物的油樹脂。因此，黃體素和玉米黃素在這樣的油樹脂中的濃度比從手摘花中獲得的濃度相對低一些。
具有高含量葉綠素的金盞花提取物通常是在堿性條件下皂化來完成類胡蘿卜素以及葉綠素的水解?？勺兯降钠渌?、葉綠酸和不可皂化物也通常存在于反應混合物中。因此，來自機械化收割的金盞花粗粉的油樹脂中相對低濃度的葉黃素，以及雜質色素水平的可變性已經阻止了用于人類消費的葉黃素產物的商業(yè)發(fā)展。因此，存在對于從可能含有高水平葉綠素的大規(guī)模、機械化收割的金盞花栽培物所得粗粉中獲得高純度的黃體素和玉米黃素濃縮物的工業(yè)方法的需求。
更明確地說，本發(fā)明涉及一種從皂化提取物中純化葉黃素的方法。該方法包括如下步驟將皂化提取物分散在水中以形成分散體；在一定條件下混合分散體，使任何水溶性化合物的一部分溶解在水中，以形成含水相和不能溶解于水的殘余物；從殘余物中分離含水相；在一定條件下用非極性溶劑接觸殘余物，使任何脂溶性化合物的一部分溶解在非極性溶劑以及一部分葉黃素從非極性溶劑中沉淀出來，以形成沉淀物；從沉淀物中分離非極性溶劑；用極性溶劑洗滌沉淀物，使任何殘余葉綠素中至少一部分溶解在極性溶劑中；從沉淀物中分離極性溶劑，以生產一種包括具有期望純度水平的葉黃素的產物。
在本發(fā)明的一個方面，皂化提取物是從含有類胡蘿卜素和葉綠素混合物的機械化收割的金盞花中獲得的。
作為其變化，該方法進一步可以包括如下步驟從非極性和極性溶劑中回收任何類胡蘿卜素的絕大部分；在惰氣環(huán)境下將產物去溶劑化且干燥；在混合之前，將分散體的pH值調整到大約5.0～7.0之間?？梢酝ㄟ^加入一種選自磷酸、硫酸、鹽酸、乙酸或任何具有類似特性的無機酸或有機酸的酸來調整pH值。
進一步變化中，該方法可以包括如下額外的步驟在混合之前，將分散體的溫度調整到大約45℃～80℃之間；在用非極性溶劑接觸殘余物之前，用水洗滌殘余物，其中用于洗滌的水的pH值被調整到大約5.0～7.0之間，溫度被調整到大約45℃～80℃之間。
一方面，非極性溶劑選自己烷、庚烷、環(huán)己烷、辛烷、芳族烴、醚和鹵代烴，極性溶劑選自酮、醇、胺及其混合物。
另一方面，該產物中的葉黃素包括水解黃體素和玉米黃素的混合物。在皂化提取物中黃體素和玉米黃素可以超過類胡蘿卜素的95％。該產物在每一千克皂化提取物也可以包括400～900克總類胡蘿卜素。皂化提取物可以包括0～20％的葉綠素。類胡蘿卜素在分散體中的濃度可以是每一千克皂化提取物中含大約0.1～15克類胡蘿卜素，或更優(yōu)選的是每一千克皂化提取物中含大約5～10克類胡蘿卜素。
本方法的另一個變化中，每份殘余物中非極性溶劑的使用比例為大約1～25份，更優(yōu)選的為大約5～12份溶劑。每份沉淀物中所使用的極性溶劑的比例為大約1～15份，更優(yōu)選的為大約4～10份。非極性溶劑和極性溶劑可以在周圍環(huán)境溫度下使用。
在本發(fā)明的一個方面，該產物適合于人類使用。
本方法的另一個變化中，公開了一種獲得具有期望純度水平的葉黃素的方法。該方法包括獲得一種機械化收割的植物組合物的皂化提取物。植物組合物包括第一種包括葉黃素的植物部分和第二種包括葉綠素的植物部分。用水洗滌皂化提取物，以留下含油殘余物。用非極性溶劑在一定條件下接觸殘余物，使任何脂溶性化合物的至少一部分溶解在非極性溶劑中以及至少一部分葉黃素從非極性溶劑中沉淀出來以形成沉淀物。從沉淀物中分離非極性溶劑。然后用極性溶劑洗滌沉淀物，使任何殘余葉綠素的至少一部分溶解在極性溶劑中。從沉淀物中分離極性溶劑，以生產一種包括具有期望純度水平的葉黃素的產物。
Kitaoka(EP 732 378 A2)描述了一種適用于使用非極性溶劑和水溶液的液-液萃取的極稀著色提取物。為了分析及闡明結構的目的，但不是設計為了商業(yè)規(guī)模應用，Repeta(Monofr.Oceanogr.Methodol.，1997，10239-60)對多種純化類胡蘿卜素的方法做了詳盡的回顧。
本發(fā)明公開了從天然資源中，尤其包括含有相對高水平葉綠素的金盞花提取物中，分離和純化黃體素和玉米黃素的方法。更明確地說，用于該方法的原材料包括含有20g/kg或更多的綠色物質的皂化金盞花提取物。然而，所公開的方法也適用于從其它含有較低水平的雜質葉綠素色素的原材料資源中分離和純化葉黃素。各種原材料資源包括藻類、蠶排泄物、菠菜和苜蓿葉子。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，每一千克含有大約40～150克類胡蘿卜素和大約5～20克葉綠素的金盞花提取物被用作起始材料。這樣的提取物是Productos Deshidratados de Mexico(PRODEMEX)，LosMochis，Sinaloa，Mexico生產的。用于制備這些提取物的金盞花的花可以是機械化收割的，含有大量葉子、莖干、花梗和其它含有豐富的葉綠素及其衍生物的植物部分。
金盞花粗粉是用機械收割的花脫水制備的。脫水的方式有好幾種，包括帶式、盤式、架式和轉鼓式干燥器或太陽干燥。將干材料磨細，隨后用非極性溶劑如己烷來進行溶劑萃取。然后通過蒸發(fā)去除溶劑，這樣就獲得了金盞花油樹脂。然后將油樹脂皂化以完成所存在的葉黃素和葉綠素的水解。可以通過用氫氧化鈉或氫氧化鉀或一些其它堿處理油樹脂來實現(xiàn)皂化。本領域普通技術人員都熟知皂化條件。
在皂化反應中可以獲得游離黃體素、玉米黃素和其它游離葉黃素，以及脂肪酸像肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸的鈉鹽和鉀鹽。另外，依賴于用作皂化劑的堿(如分別為NaOH或KOH)，可以用鈉或鉀取代色素分子上的植基和甲基基團。在皂化過程中，也可以生產水溶性葉綠素。
然后用水洗滌皂化提取物。將提取物分散在水中，并且稀釋到最終濃度為每一千克含水分散體含有的全部葉黃素為大約0.1～30克。優(yōu)選是每一千克含水分散體含有大約5～10克。優(yōu)選地，將含水的分散體徹底地混合，以形成均勻混合物。
然后用選自乙酸、磷酸、硫酸、鹽酸或任何具有類似特性的無機酸或有機酸的水溶液將混合物的pH值調整到大約1.0～7.0之間，優(yōu)選地在大約5.0～6.5之間?？梢詫⑺崛芤旱臐舛裙潭ㄔ诖蠹s5～25％(w/w)之間?；旌衔锏臏囟葢摫３衷?0℃～80℃之間，優(yōu)選地在45℃～70℃之間。當含有水溶性葉綠素和其它水溶性雜質的水相可以容易地從上層含油殘余物中分離時，混合物的pH值被充分地降低(中和)?？梢杂脗鹘y(tǒng)的分液儀將下層水相分離。含油殘余物含有一些殘余的水溶性葉綠素和葉黃素。
可以用維持固定pH值的額外的水洗滌降低來自含油的上層相的殘余水溶性綠色物質的濃度。對于每次洗滌，每體積份殘余物使用4～20體積份的水是可能的，優(yōu)選是8～15體積份?？梢詫⑺磪R合，用于后續(xù)的綠色色素的分離。水洗可以持續(xù)到含油殘余物基本上不含葉綠素和相應化合物，并且主要含有脂類、水和葉黃素。
然后用非極性溶劑提取濕潤的含油殘余物。溶劑可以選自短鏈脂肪族(如己烷)或芳族烴、烷基取代溶劑或其混合物。優(yōu)選地，烴含有6～8個碳原子。對于每一份含油殘余物，每次提取可以使用大約1～20份非極性溶劑(w/w)，優(yōu)選地為大約5～10份(w/w)。優(yōu)選地，使用至少兩次提取。提取是在大約-20℃～70℃的溫度下進行的，優(yōu)選地為15℃～45℃，更優(yōu)選為大約35℃～45℃。脂類和胡蘿卜素，以及其它脂溶性物質可以在被分離和混合的非極性溶劑中提取。
在提取過程中從非極性溶劑中沉淀出來的固體富含黃體素和玉米黃素。葉綠素的殘余量可能仍然存在。使用極性溶劑的一次或兩次額外洗滌應該足以使葉綠素污染物的水平最小化。極性溶劑可以是酮、醇、胺或任何其它具有類似特性的極性溶劑。應該使用與葉綠素分離相同的酸來酸化溶劑。相對于殘余固體的重量，可以使用3～20份溶劑，但優(yōu)選為6～10份。優(yōu)選地，洗滌在環(huán)境溫度下進行。可以收集溶劑洗滌物，并將溶劑回收。用通常方法將溶劑去除，并將最終的固體干燥，優(yōu)選在惰氣氣氛下進行。
下面的實施例將使得對本發(fā)明的理解更全面
在環(huán)境溫度下，用每份油中含有6份己烷的溶液洗滌含油殘余組分。葉黃素開始從溶劑相中沉淀出來，其中溶劑相富含脂肪酸、胡羅卜素和其它可溶于己烷的脂類。然后通過過濾分離溶劑，用與第一次相同的方式將用己烷重復洗滌兩次以上。在惰性氣體下，將殘余固體干燥到大約4％的濕度。
獲得了一種重量為49克的含有80％的初始色素的產物。這相當于每一千克產物中含有660克類胡蘿卜素的濃度，其中黃體素92.2％和玉米黃素6.1％，這使得它非常適合于人類使用。
用己烷∶庚烷(2∶1)混合物洗滌殘余糊狀物，每份糊狀物使用8份溶劑。在一個箱式離心轉桶中離心該混合物，將固相提取兩次以上，以去除大部分脂類。通過蒸發(fā)從脂類組分中回收溶劑，以留下含有起始物質大約14％的全部類胡蘿卜素的含油殘余物。這些類胡蘿卜素主要代表胡蘿卜素、β-玉米黃質、順式和反式黃體素的環(huán)氧化物以及微量反式黃體素。通過在氮氣下干燥，從離心機獲得的固體顆粒(pellet)中的溶劑被除去，從而產生一種含有原材料中大約80％的色素的產物。黃體素和玉米黃素的總和為全部類胡蘿卜素的97.5％。干燥產物的重量是150克。
雖然我們已經描述了許多本發(fā)明的實施方案，但顯而易見，可以對我們所做的描述進行一些修改，以提供使用本發(fā)明的基本方法的其它實施方案。因此，本領域普通技術人員將理解，本發(fā)明的范圍受所附權利要求的限定，而不受上述通過實施例的方式所詳細描述的特定
權利要求
1.一種從皂化提取物中獲得高純化水平葉黃素的方法，該方法包括將皂化提取物分散在水中以形成分散體；在一定條件下混合分散體，使任何水溶性化合物的一部分溶解在水中，以形成含水相和不能溶解于水的殘余物；從殘余物中分離含水相；在一定條件下用非極性溶劑接觸殘余物，使任何脂溶性化合物的至少一部分溶解在非極性溶劑中，以及至少一部分葉黃素從非極性溶劑中沉淀出來，以形成沉淀物；從沉淀物中分離非極性溶劑；用極性溶劑洗滌沉淀物，使任何殘余葉綠素中至少一部分溶解在極性溶劑中；從沉淀物中分離極性溶劑，以生產一種包括具有期望純度水平的葉黃素的產物。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的皂化提取物是從含有類胡蘿卜素和葉綠素混合物的機械化收割的金盞花中獲得的。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，該方法進一步包括從非極性和極性溶劑中回收任何類胡蘿卜素的絕大部分的步驟。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，該方法進一步包括在惰氣環(huán)境中將產物去溶劑化且干燥的步驟。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在混合之前，將分散體的pH值調整到大約5.0～7.0之間。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中可以通過加入一種選自磷酸、硫酸、鹽酸、乙酸或任何具有類似特性的無機酸或有機酸的酸來調整pH值。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在混合之前，將分散體的溫度調整到大約45℃～80℃之間。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在用非極性溶劑接觸殘余物之前，該方法進一步包括用水洗滌殘余物。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述的用于洗滌的水的pH值被調整到大約5.0～7.0之間，溫度被調整到大約45℃～80℃之間。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的非極性溶劑選自己烷、庚烷、環(huán)己烷、辛烷、芳族烴、醚和鹵代烴。
11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的極性溶劑選自酮、醇、胺及其混合物。
12.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的產物中的葉黃素包括水解黃體素和玉米黃素的混合物。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中在皂化提取物中黃體素和玉米黃素含有超過95％的類胡蘿卜素。
14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的產物進一步包括在每一千克皂化提取物中400～900克的總類胡蘿卜素。
15.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的皂化提取物包括0～20％的葉綠素。
16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的類胡蘿卜素在分散體中的濃度是每一千克皂化提取物中是大約0.1～15克類胡蘿卜素。
17.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的類胡蘿卜素在分散體中的濃度是每一千克皂化提取物中含大約5～10克類胡蘿卜素。
18.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的每份殘余物中所使用的非極性溶劑的比例為1～25份。
19.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的每份殘余物中所使用的非極性溶劑的比例為5～12份。
20.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的每份沉淀物中所使用的極性溶劑的比例為1～15份。
21.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的每份沉淀物中所使用的極性溶劑的比例為4～10份。
22.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的非極性溶劑和極性溶劑可以在周圍環(huán)境溫度下使用。
23.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述的產物進一步的特征在于適合于人類服用。
24.一種獲得具有期望純度水平的葉黃素的方法，該方法獲得一種機械化收割的植物組合物的皂化提取物，所述組合物包括第一種包括葉黃素的植物部分和第二種包括葉綠素的植物部分；用水洗滌皂化提取物，以留下含油殘余物；用非極性溶劑在一定條件下接觸殘余物，使任何脂溶性化合物的至少一部分溶解在非極性溶劑中，以及至少一部分葉黃素從非極性溶劑中沉淀出來，形成沉淀物；從沉淀物中分離非極性溶劑；用極性溶劑洗滌沉淀物，使任何殘余葉綠素的至少一部分溶解在極性溶劑中；和從沉淀物中分離極性溶劑，以生產一種包括具有期望純度水平的葉黃素的產物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從可能含有高水平葉綠素的皂化金盞花提取物中獲得高純度黃體素和玉米黃素濃縮物的工業(yè)規(guī)模方法。
文檔編號A61P35/00GK1434792SQ01810854
公開日2003年8月6日 申請日期2001年6月7日 優(yōu)先權日2000年6月9日
發(fā)明者G·羅德里格斯, M－D·托里斯－卡爾－多納, A·迪亞茲 申請人:普羅德麥克斯公司