專利名稱：蛋白質(zhì)的制作方法
引言
本發(fā)明涉及先前未曾報道的人類乳腺癌細(xì)胞中膜蛋白的鑒定，所述膜蛋白可以構(gòu)成生物靶，可以制備針對所述靶的治療抗體或其它藥物，或者所述膜蛋白具有作為乳腺癌和乳腺癌轉(zhuǎn)移癌的診斷和預(yù)后標(biāo)記地效用。
背景技術(shù)：
乳腺癌是一種在美國婦女中最常診斷出的非皮膚癌。在癌癥相關(guān)的死亡中，它僅次于肺癌。1997年將診斷出大約180,000個乳腺癌新病例，預(yù)期約44,000名婦女死于該疾病(National Cancer Institute，www.nci.nih.gov，USA，1999)。在英國，乳腺癌是迄今婦女最常見的癌癥，1998年有34,600個新病例(Cancer Research Campaign，www.crc.org.uk，UK，2000)。99％的乳腺癌發(fā)生在婦女中。發(fā)生乳腺癌的危險隨年齡穩(wěn)定增加；終身發(fā)生乳腺癌的危險在美國估計為每8個婦女中有1個。在美國，乳腺癌治療的年費用大約是$100億(Fuqua等2000，American Association for Cancer Research，www.aacr.org，USA)。在過去50年間，乳腺癌發(fā)生率一直在上升，但最近變?yōu)槠椒€(wěn)。這可能反映出通過乳房X射線照相術(shù)較早檢測出乳腺癌的時期。多種已建立的因素可以增加婦女患此病的危險。這些因素包括年紀(jì)較大、先前有乳腺癌病史、顯著暴露于輻射、強(qiáng)的乳腺癌家族史、社會經(jīng)濟(jì)等級較高、未經(jīng)產(chǎn)、初潮早、絕經(jīng)晚或初次妊娠時年齡超過30歲。在生命較早期延長應(yīng)用口服避孕藥似乎略微增加危險。延長的絕經(jīng)后雌激素替代療法增加危險20-40％。已經(jīng)推測，初潮時年齡的降低、改變分娩形式、或外源雌激素應(yīng)用增加，導(dǎo)致乳腺癌發(fā)病率增加(Fuqua等2000，American Association for Cancer Research，www.aacr.org，USA)。乳腺癌的病因
乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病。雖然雌性激素在驅(qū)動許多乳房腫瘤的起源和進(jìn)化方面起重要作用，但也涉及許多其它已被識別的因子和未知因子。已鑒定癌基因的微擾包括HER-2和表皮生長因子受體基因的擴(kuò)增和細(xì)胞周期蛋白D1的過量表達(dá)?？梢詫⑦@些癌基因的過量表達(dá)與明顯預(yù)后差相聯(lián)系。同樣，在乳腺癌方面大量記載了遺傳的改變或者腫瘤抑制基因例如p53基因的喪失，它們也與預(yù)后較差有關(guān)。研究人員已經(jīng)鑒定出兩種基因，稱為BRCA1和BRCA2，它們是絕經(jīng)前家族性乳腺癌的預(yù)兆。遺傳危險的評價現(xiàn)在是可能的，它們可能加強(qiáng)供化學(xué)保護(hù)試驗用的候選者的鑒定(Fuqua等2000，American Associationfor Cancer Research，www.aacr.org，USA)。診斷
乳腺癌的早期診斷對于保證最佳治療結(jié)果是至關(guān)重要的。具有先進(jìn)保健系統(tǒng)的許多國家制定了乳腺癌的篩選計劃。這通常在50-60年齡段采用乳房的定期X射線檢查(乳房X射線照相術(shù))，其中顯示了這種干涉的最大益處。某些專家主張將這種計劃擴(kuò)大至60歲以上和40-49年齡組。許多國家的健康專家也宣傳了婦女定期乳房自查的重要性。在這些篩選過程中檢出的異常和表現(xiàn)出癥狀的病例通常可以通過針吸活組織檢查細(xì)胞學(xué)、用立體定位(stereotatic)技術(shù)或超聲技術(shù)對不可觸知的病灶進(jìn)行核心針吸活組織檢查、或者切開性或切除性活組織檢查加以證實。同時，可以測定與治療選擇和預(yù)后相關(guān)的其它信息例如雌激素(ER)和孕酮受體(PR)狀況(National Cancer Institute，USA，2000，Breast Cancer PDQ，www.nci.nih.gov)。疾病分期和預(yù)后
疾病分期是查明癌癥擴(kuò)散到多遠(yuǎn)的一種方法。the American JointCommittee on Cancer(AJCC)的疾病分期系統(tǒng)也稱為TNM系統(tǒng)，是乳腺癌最常用的系統(tǒng)。用于疾病分期的TNM系統(tǒng)給出三類關(guān)鍵的信息
后接0-4的數(shù)字的字母T描述了腫瘤的大小以及擴(kuò)散至乳房下皮膚或胸部。較大的數(shù)字是指較大的腫瘤和/或更多地擴(kuò)散至乳房附近的組織。
后接0-3的數(shù)字的字母N指出癌癥是否擴(kuò)散至乳房附近的淋巴結(jié)，如果是，那么受影響的淋巴結(jié)是否附著于臂下其它結(jié)構(gòu)。
后接0或1的字母M表明癌癥是否轉(zhuǎn)移到機(jī)體其它器官或轉(zhuǎn)移到不在乳房附近的淋巴結(jié)。
為了使該信息略微清楚，TNM描述可以結(jié)合為一組更簡單的病期，標(biāo)為0期至IV期(0-4)。一般而言，數(shù)字越小，癌癥擴(kuò)散就越少。數(shù)字越大，例如IV期(4)，意味著癌癥越嚴(yán)重(American Cancer Society，2000，USA，www.cancer.org)。
按病期的乳腺癌存活率
病期 5年相對存活率
0 100％
I 98％
IIA88％
IIB76％
IIIA 56％
IIIB 49％
IV 16％
(American Cancer Society，2000，USA，www.cancer.org)
盡管解剖學(xué)病期(原發(fā)性腫瘤的大小、涉及腋淋巴結(jié))是一個重要的預(yù)后因素，但其它特征可能具有預(yù)測價值。例如，得自the NationalSurgical Adjuvant Breast and Bowel Project(NSABP)和the InternationalBreast Cancer Study Group(IBCSG)的研究已經(jīng)表明，腫瘤細(xì)胞核分級和組織學(xué)分級分別是乳腺癌輔佐治療后結(jié)果的重要指標(biāo)。有重要證據(jù)表明，雌激素受體狀況和原發(fā)性腫瘤增殖能力的測量(胸苷標(biāo)記指數(shù)或S期和倍性的流式細(xì)胞術(shù)測量)可能有重要的獨立預(yù)測價值。在II期疾病中，PR狀況可能比ER狀況的預(yù)后價值更大。腫瘤血管形成、c-erbB-2、c-myc、p53表達(dá)和淋巴管侵入也可能是乳腺癌患者的預(yù)后指標(biāo)(National Cancer Institute，USA，2000，Breast Cancer PDQ，www.nci.org和其中的參考文獻(xiàn))。治療
外科手術(shù)、放射療法、激素療法和化學(xué)療法是最常見的乳腺癌療法。
外科手術(shù) 大多數(shù)患有乳腺癌的婦女將接受某種類型的外科手術(shù)。外科手術(shù)的目的是盡可能多地除去癌癥。這可能以腫塊切除術(shù)形式，或者更多的是根治性乳房切除術(shù)加上乳房整復(fù)。外科手術(shù)也可以與其它療法如化學(xué)療法、激素療法或放射療法聯(lián)合。也可以實施外科手術(shù)，以查明乳腺癌是否擴(kuò)散至臂下淋巴結(jié)(腋窩解剖)、恢復(fù)更為正常的外觀(整復(fù)外科)或緩解晚期癌癥的癥狀。
化學(xué)療法 化學(xué)療法是應(yīng)用抗癌藥殺傷癌細(xì)胞。在外科手術(shù)后給予化學(xué)療法(輔佐療法)時，可能減少癌癥復(fù)發(fā)的機(jī)會?；瘜W(xué)療法也可以用作癌癥發(fā)現(xiàn)時已廣為擴(kuò)散、或者在初次治療后廣泛擴(kuò)散的婦女的主要療法。在外科手術(shù)之前給出新佐劑化學(xué)療法，常常使腫瘤縮小并使其更易于切除。化學(xué)療法以周期給予，在每個治療期后是一個恢復(fù)期?？偗煶坛掷m(xù)3-6個月。應(yīng)用幾種藥物常常比僅用一種藥物更為有效。最常用的組合是環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤和氟尿嘧啶(CMF)，環(huán)磷酰胺、多柔比星(阿霉素)和氟尿嘧啶(CAF)，多柔比星(阿霉素)和環(huán)磷酰胺(AC)，加上或不加紫杉醇(紫杉酚)多柔比星(阿霉素)，然后是CMF。
放射療法 放射療法最常用于乳腺癌的治療。它可以用來在外科手術(shù)之前減小腫瘤的大小，或在外科手術(shù)之后破壞乳房、胸壁或腋下區(qū)域中殘余的癌細(xì)胞。
激素療法和化學(xué)防護(hù) 激素-雌激素可以增加某些婦女中乳腺癌細(xì)胞的生長。給予阻斷雌激素效應(yīng)的藥物例如他莫昔芬，以對抗這種生長。另一種新藥-雷洛昔芬也阻斷雌激素對乳腺組織和乳腺癌的效應(yīng)。有越來越多的證據(jù)表明，這些抗雌激素療法也可能在高危個體中在乳腺癌的化學(xué)防護(hù)方面有作用。
免疫療法 Trastuzumab(Herceptin)是一種新的免疫治療藥，它與稱為c-erbB2/HER2/neu的生長因子受體結(jié)合，所述受體以少量存在于正常乳腺細(xì)胞表面，而在某些乳腺癌中以高得多的水平存在。這種蛋白可以使癌生長并且擴(kuò)散更快。Herceptin可以阻止c-erbB2/HER2/neu蛋白對乳腺癌細(xì)胞生長的促進(jìn)作用。它也可能幫助免疫系統(tǒng)更好地攻擊癌癥。目前在標(biāo)準(zhǔn)激素療法或化學(xué)療法不再有效之后開始Herceptin(American Cancer Society，2000，USA，www.cancer.org)。
治療挑戰(zhàn)
乳腺癌療法的主要挑戰(zhàn)是提高早期檢出率、發(fā)現(xiàn)新的可以用來跟蹤疾病進(jìn)程并鑒定復(fù)發(fā)的非侵入性標(biāo)記、以及發(fā)現(xiàn)改善且毒性較小的療法，尤其對于5年存活率仍非常差的更晚期疾病而言。非常需要鑒定出對于癌細(xì)胞更具特異性的靶，理想的是在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的靶，使得它們可以用有前景的新方法如免疫治療藥和靶向毒素來攻擊。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供用于乳腺癌篩選、診斷、預(yù)后和治療、用于監(jiān)測乳腺癌治療療效以及用于乳腺癌治療藥物開發(fā)的方法和組合物。
我們已經(jīng)應(yīng)用質(zhì)譜法鑒定出通過實驗室培養(yǎng)的人乳腺細(xì)胞系膜蛋白提取物的凝膠電泳和胰蛋白酶消化產(chǎn)生的肽。將肽序列與現(xiàn)有的cDNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比較，鑒定出相應(yīng)的基因序列。這些序列中的許多序列先前在乳腺細(xì)胞膜中未曾報道過，代表一組新的有潛在診斷和/或治療價值的蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的第一個方面提供乳腺癌的診斷方法，所述方法包括通過單向電泳測定至少一種乳腺癌相關(guān)膜蛋白(BCMP)(例如本文公開的一種或多種BCMP或其任何組合)，分析乳腺組織樣品。這些方法也適用于篩選、預(yù)后、治療結(jié)果的監(jiān)測、藥物開發(fā)和用于藥物治療的新靶的發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的第二個方面提供治療乳腺癌的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的一種化合物，所述化合物調(diào)節(jié)(例如正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié))或者互補(bǔ)乳腺癌患者體內(nèi)BCMP的表達(dá)或生物活性(或這兩者)，以便(a)防止乳腺癌發(fā)作或發(fā)生；(b)防止乳腺癌發(fā)展；或(c)緩解乳腺癌的癥狀。
本發(fā)明的第三個方面提供調(diào)節(jié)(例如正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié))BCMP表達(dá)或生物活性的化合物的篩選方法。
本發(fā)明的第四個方面提供能夠與BCMP(例如本文公開的BCMP)免疫特異性結(jié)合的單克隆抗體和多克隆抗體。
因此，在第五個方面，本發(fā)明提供一種人類受治療者乳腺癌的篩選和/或診斷方法，所述方法包括下述步驟鑒定在得自所述人類受治療者的生物樣品中本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP是否存在。
第六個方面，本發(fā)明提供一種人類受治療者中乳腺癌治療的監(jiān)測和/或評價方法，所述方法包括下述步驟鑒定在得自所述人類受治療者的生物樣品中本文表1或表2中限定的一種或多種BCMP是否存在。
第七個方面，本發(fā)明提供一種鑒定在得自所述人類受治療者的生物樣品中是否存在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟鑒定本文表1或表2中限定的一種或多種BCMP是否存在。
第八個方面，本發(fā)明提供一種人類受治療者中乳腺癌治療的監(jiān)測和/或評價方法，所述方法包括下述步驟鑒定在得自患者的生物樣品中本文表1或表2中限定的一種或多種BCMP是否增加/減少。
所用的生物樣品可以來自任何來源，例如血清樣品或組織樣品，例如乳腺組織。例如，當(dāng)尋找轉(zhuǎn)移性乳腺癌的證據(jù)時，人們可以考慮乳腺轉(zhuǎn)移癌的主要部位，例如淋巴結(jié)、肝、肺和/或骨。
最好是，本發(fā)明的方法不基于檢查表1和表2中限定的所有BCMP的存在與否，而是著眼于“類(cluster)”或其組。
下文和本文的權(quán)利要求書中敘述了本發(fā)明的其它方面。附圖簡述


圖1顯示了BCMP 81的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。指定至所預(yù)測蛋白的質(zhì)譜以粗體和下劃線或虛線下劃線表示。串聯(lián)質(zhì)譜以粗體和斜體顯示。
圖2顯示了BCMP 81的基因組結(jié)構(gòu)，顯示出所鑒定的胰蛋白酶肽的位置。所述肽(GDAEKPEEELEEDDDEELDETLSER)跨越外顯子1和外顯子2。
圖3顯示了BCMP 81 mRNA的組織分布。正常組織、乳腺癌細(xì)胞系和前列腺癌細(xì)胞系中mRNA的水平通過實時RT-PCR定量。mRNA水平以ng-1cDNA的拷貝數(shù)表示。表達(dá)水平非常低，平均小于150個拷貝/ngcDNA。
圖4(a)顯示了BCMP 11的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。預(yù)測的N末端信號序列以下劃線顯示。指定至所預(yù)測蛋白的質(zhì)譜以粗體和下劃線顯示。串聯(lián)質(zhì)譜以粗體和斜體表示。圖4(b)顯示了與hAG-2的氨基酸序列(下部)(Thompson，D.A.和Weigel，R.J.)對齊的BCMP 11的預(yù)測的氨基酸序列(上部)。hAG-2是有爪蟾蜍(Xenopus laevis)膠粘腺基因XAG-2的人類同系物，在乳腺癌細(xì)胞系中與雌激素受體共表達(dá)。Biochem.Biophys.Res.Commun.251，111-116(1998))。通過垂直的實線指出相同的氨基酸。
圖5顯示了BCMP 11 mRNA的組織分布。正常組織和乳腺癌細(xì)胞系中mRNA的水平通過實時RT-PCR定量。mRNA水平以ng-1 cDNA的拷貝數(shù)表示；
圖6顯示了BCMP 84的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列。串聯(lián)質(zhì)譜以粗體和斜體顯示。MALDI質(zhì)譜以粗體和下劃線表示；
圖7顯示了BCMP 84 mRNA的組織分布。正常組織和乳腺癌細(xì)胞系中mRNA的水平通過實時RT-PCR定量。mRNA水平以ng-1 cDNA的拷貝數(shù)表示；
圖8顯示了各種組織中BCMP 7的mRNA表達(dá)水平；
圖9顯示了各種組織中BCMP 17的mRNA表達(dá)水平；且
圖10顯示了各種組織中BCMP 23的mRNA表達(dá)水平。發(fā)明詳述
以下詳細(xì)描述的本發(fā)明提供了用于以下目的的方法和組合物用于哺乳動物受治療者乳腺癌的臨床篩選、診斷和預(yù)后；用于鑒定最有可能對特定治療性治療有反應(yīng)的患者；用于監(jiān)測乳腺癌治療的結(jié)果；用于藥物篩選和藥物開發(fā)。本發(fā)明也包括將治療組合物給予哺乳動物受治療者，以治療或預(yù)防乳腺癌。所述哺乳動物受治療者可以是非人類哺乳動物，但優(yōu)選為人，更優(yōu)選為成人，即至少21歲(更優(yōu)選至少35歲、至少50歲、至少60歲、至少70歲或至少80歲)的人類受治療者。為了闡明公開內(nèi)容并且并不作為限制，本發(fā)明將在乳腺組織樣品的分析方面進(jìn)行描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，下述的測定和技術(shù)可以適用于其它類型的患者樣品，包括體液(例如血液、血清、血漿或唾液)、得自有患乳腺癌危險的患者的組織樣品(例如活檢樣品，例如乳腺組織活檢樣品)或其勻漿。本發(fā)明的方法和組合物尤其適用于活受治療者的篩選、診斷和預(yù)后，但也可以用于受治療者的尸體剖檢診斷，例如以鑒定有發(fā)生相同疾病危險的家族成員。
本文所用的乳腺組織是指乳腺本身以及乳腺下層的鄰近組織和/或所述層內(nèi)的組織。乳腺癌相關(guān)膜蛋白(BCMP)
在本發(fā)明的一個方面，應(yīng)用單向電泳分析得自受治療者(最好是活受治療者)的乳腺組織，以便測量一種或多種乳腺癌相關(guān)膜蛋白(BCMP)的表達(dá)，以篩選或診斷乳腺癌，以決定乳腺癌患者的預(yù)后、以監(jiān)測乳腺癌治療的療效、或用于藥物開發(fā)。本文所用的“單向電泳”(1D-電泳)是指包括變性電泳的技術(shù)；這產(chǎn)生含有多種經(jīng)分離的蛋白的單向凝膠(1D-凝膠)。最好是，變性電泳步驟應(yīng)用十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)。尤其優(yōu)選在WO 98/23950中描述的高度準(zhǔn)確的自動化方法和裝置(“the Preferred Technology”)，該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中，尤其參考第19-29頁的優(yōu)選方案。簡而言之，thePreferred Technology提供了用于鑒定、選擇和特征鑒定生物樣品中生物分子的有效的計算機(jī)輔助方法和裝置。通過將生物分子在單向凝膠上根據(jù)其電泳遷移率分離，產(chǎn)生單向排列。產(chǎn)生一個所述排列的計算機(jī)產(chǎn)生的數(shù)字分布，代表在所述單向排列中檢出的多種生物分子的身份、表觀分子量，從而允許對得自多種生物樣品的分布進(jìn)行計算機(jī)介導(dǎo)的比較以及所分離的目的蛋白的計算機(jī)輔助的切取。
用于檢測熒光標(biāo)記蛋白的優(yōu)選掃描器在WO 96/36882和David A.Basiji的博士論文(題為“利用內(nèi)部反射光學(xué)和相位靈敏檢測的高通量熒光掃描器的開發(fā)(全內(nèi)部反射，電泳)”，University of Washington(1997)，Dissertation Abstracts Interntiational的第58/12-B卷，第6686頁中有描述，所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。這些文件描述了為高速自動綜合操作特別設(shè)計的圖象掃描器。所述掃描器可以將已經(jīng)用熒光染料或銀染料染色的凝膠成像以及存儲熒光屏。Basiji的論文提供了一個相位靈敏檢測系統(tǒng)，以供分辨經(jīng)調(diào)制的熒光與由于激光散射所致的基線噪聲或均勻熒光，但所述掃描器也可以以非相位靈敏方式進(jìn)行操作。與傳統(tǒng)的熒光成像系統(tǒng)相比，這種相位靈敏檢測能力能夠?qū)x器的靈敏度提高一個數(shù)量級或更多。靈敏度提高，將減少上游儀器的樣品制備上樣量，而圖象質(zhì)量的提高簡化了該方法中下游的圖象分析。
一種更為高度優(yōu)選的掃描器是Apollo 2掃描器(OxfordGlycosciences，Oxford，UK)，這是一種上述掃描器的改進(jìn)形式。在Apollo 2掃描器中，凝膠在精密引導(dǎo)螺桿驅(qū)動系統(tǒng)上傳送通過掃描器。這最好將玻璃板置于Basiji論文中所述的皮帶傳動系統(tǒng)上，因為它提供一種準(zhǔn)確傳送凝膠通過成像光學(xué)系統(tǒng)的可再現(xiàn)方法。
在Apollo 2掃描器中，凝膠用三個對準(zhǔn)止動件固定，將玻璃板大致保持在已知位置。借此并且連同上述精密傳送系統(tǒng)，可以預(yù)測并記錄凝膠的絕對位置。這確?？梢愿鼫?zhǔn)確地測量凝膠上每個特征(feature)的坐標(biāo)，如果需要，將其傳送至切割機(jī)械人，以切取所述特征。在Apollo2掃描器中，承載凝膠的載體有4個一體化熒光標(biāo)記，用來校正圖象的幾何形狀。這些標(biāo)記是證實掃描正確進(jìn)行的質(zhì)量控制特征。
與Basiji論文中所述的掃描器相比，Apollo 2掃描器的光學(xué)部件倒置。在Apollo 2掃描器中，激光、反射鏡、波導(dǎo)和其它光學(xué)部件在被掃描的玻璃板之上。在Basiji論文中所述的掃描器中，這些部件在所述玻璃板之下。在Apollo 2掃描器中，玻璃板固定在掃描器上，凝膠面向下，使得光路仍通過玻璃板。借此，離開玻璃板的任何凝膠顆粒將落在儀器的底部，而不是落在光學(xué)器件上。這不影響該系統(tǒng)的功能性，而提高了其可靠性。
再更優(yōu)選的是Apollo 3掃描器，其中信號輸出被數(shù)字化為全16比特數(shù)據(jù)，而沒有任何峰飽和，或者沒有信號的平方根編碼。補(bǔ)償算法也已經(jīng)用來校正沿掃描束路徑的檢測靈敏度的任何變化。這種變化是光學(xué)系統(tǒng)的異常和波導(dǎo)兩端收集效率的差異所致。用具有均勻熒光通量的有機(jī)玻璃板進(jìn)行校準(zhǔn)。從該板掃描接受的數(shù)據(jù)用來確定將所述信號從每個像素電平提高至靶電平所需的放大系數(shù)。這些放大系數(shù)然后用于隨后的凝膠掃描，以除去任何內(nèi)部光學(xué)變化。
本文所用術(shù)語“乳腺癌相關(guān)膜蛋白”(BCMP)是指通過乳腺組織樣品的1D電泳可檢測的、存在于得自乳腺癌受治療者的乳腺組織中的一個特征(例如1D凝膠中的一個條帶)。
已經(jīng)在實驗室培養(yǎng)的人乳腺細(xì)胞系的膜蛋白提取物中，通過thePreferred Technology的方法和裝置(一般為1D凝膠電泳和實驗室培養(yǎng)的人乳腺細(xì)胞系膜蛋白提取物的胰蛋白酶消化)，鑒定出本文公開的BCMP。將肽序列與SWISS-PROT和trEMBL數(shù)據(jù)庫(the Swiss Instituteof Bioinformatics(SIB)和the European Bioinformatics Institute(EBI)維護(hù)，它們可在http//www.expasy.com/得到)和GenBank數(shù)據(jù)庫(由theNational Institute of Health(NIH)維護(hù)，它可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/得到)進(jìn)行了比較，鑒定出相應(yīng)的基因。搜索了已發(fā)表的報道和數(shù)據(jù)庫，包括在正常人乳腺腔上皮細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Page等，Proc Natl Acad Sci USA.199996(22)12589-94；英國專利申請?zhí)?919258.5)，以確立所述鑒定的基因中的任一種的產(chǎn)物是否先前已經(jīng)證明在人乳腺細(xì)胞膜或人乳腺癌細(xì)胞膜中表達(dá)。鑒定了兩組BCMP(1)匹配未曾描述過蛋白質(zhì)或生物功能、本發(fā)明確定所述蛋白產(chǎn)物的存在及其在人乳腺癌細(xì)胞膜中定位的cDNA的概念翻譯的蛋白質(zhì)序列；(2)先前未在乳腺細(xì)胞膜方面描述過的已知蛋白，本發(fā)明表明所述蛋白可能還涉及人乳腺癌。所有這些BCMP都可用作乳腺細(xì)胞、尤其是乳腺癌細(xì)胞的標(biāo)記。屬于第一類的那些蛋白的氨基酸序列示于以下表1，屬于第二類的那些蛋白的氨基酸序列示于以下表2。表1和表2中的每種蛋白用Swiss Prot或GenBank登記號來識別，每種序列通過引用結(jié)合到本文中。在這些表中也列出了通過串聯(lián)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫搜索(例如實施例中描述的，參見下文)鑒定的這些BCMP的胰蛋白酶消化肽的表觀分子量和氨基酸序列。
表1匹配未曾描述過蛋白質(zhì)或生物功能的cDNA的概念翻譯的蛋白
質(zhì)序列
表2先前未在乳腺細(xì)胞膜方面描述過的已知蛋白
以上表1和表2中描述的BCMP可以單獨應(yīng)用或者與以下更詳細(xì)提及的乳腺癌診斷和治療聯(lián)合應(yīng)用。另外，這些BCMP中的一種或多種可以與以下表3中所述蛋白質(zhì)中的一種或多種聯(lián)合應(yīng)用。
表3可以與表1和表2的蛋白質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的蛋白質(zhì)
在WO98/07749中公開了BCMP 7和BCMP 11的序列。如本文實施例3中所述克隆了BCMP 11。BCMP81的序列公開于WO99/18202，而BCMP84的序列公開于WO99/47669。
對于任何給定的BCMP而言，相對于分析得自無乳腺癌受治療者的乳腺組織時獲得的檢測水平而言，分析得自乳腺癌受治療者的乳腺組織時獲得的檢測水平將取決于所用的具體分析方案和檢測技術(shù)，條件是這類BCMP在正常組織和疾病組織之間差異表達(dá)。因此，本發(fā)明考慮到，每個實驗室將根據(jù)應(yīng)用中的分析方案和檢測技術(shù)，為無乳腺癌受治療者中的每種BCMP建立一個參比范圍，在診斷領(lǐng)域通常也是如此。最好是，在每批分析的試驗樣品中，包括至少一個得自已知有乳腺癌的受治療者的對照陽性乳腺組織樣品、或者至少一個得自已知無乳腺癌的受治療者的對照陰性乳腺組織樣品(更優(yōu)選既包括陽性對照樣品，也包括陰性對照樣品)。
在一個實施方案中，測定相對于本底值的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，本底值定義為得自圖象鄰近區(qū)的信號水平，所述圖象(a)以面積計等于所研究的特定特征，和(b)不含可檢出的蛋白質(zhì)特征。
BCMP可以用于乳腺癌的檢測、預(yù)后、診斷或監(jiān)測或者用于藥物開發(fā)。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過1D電泳分析得自受治療者(例如懷疑患有乳腺癌的受治療者)的乳腺組織，以檢測表1和表2中的一種或多種BCMP。相對于一個或多個無乳腺癌受治療者的乳腺組織(例如，對照樣品)或者先前測定的參比范圍而言得自所述受治療者的乳腺組織中所述一種或多種BCMP豐度的減少，指示乳腺癌的存在與否。
在一個優(yōu)選實施方案中，分析得自受治療者的乳腺組織，以定量測定表1、2和3中的多類BCMP。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見的，可以按照為表1和表2中的BCMP提供的數(shù)據(jù)，描述給定的BCMP。所述BCMP是一種包含有關(guān)該BCMP所述的肽序列(最好包含多個、更優(yōu)選所有有關(guān)該BCMP所述的肽序列)的蛋白質(zhì)。
在一個實施方案中，分析得自受治療者的乳腺組織，以定量測定表1和表2中BCMP中的一種或多種或其任何組合，其中相對于得自一個或多個無乳腺癌受治療者的乳腺組織(例如對照樣品或先前測定的參比范圍)而言，得自所述受治療者的乳腺組織中所述一種或多種BCMP(或其任何組合)豐度的改變指示存在乳腺癌。
在一個優(yōu)選實施方案中，分析得自受治療者的乳腺組織，以定量測定表1、表2和表3中的多類BCMP。
對于每種BCMP而言，本發(fā)明還提供(a)包含所述分離的BCMP的制劑；(b)包含所述BCMP的一個或多個片段的制劑；和(c)與所述BCMP結(jié)合、與所述片段結(jié)合或與所述BCMP并且與所述片段結(jié)合的抗體。本文所用的BCMP是“分離的”，當(dāng)它存在于制劑中時，基本上不含污染蛋白，即其中低于10％(優(yōu)選低于5％，更優(yōu)選低于1％)的所存在的總蛋白為污染蛋白的制劑。污染蛋白是通過質(zhì)譜分析測定，其氨基酸序列顯著不同于所述分離的BCMP的氨基酸的蛋白質(zhì)。本文所用的“顯著不同的”序列是通過按照the Reference Protocol進(jìn)行的質(zhì)譜分析，使得能夠分辨所述污染蛋白質(zhì)與所述BCMP的序列。
本發(fā)明的BCMP可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法分析，所述方法包括但不限于本文所述的the Preferred Technology、激酶測定、酶測定、結(jié)合測定和其它功能分析、免疫測定和蛋白質(zhì)印跡法。在一個實施方案中，根據(jù)其MW在1-D凝膠上分離所述BCMP，并且通過將凝膠染色來顯現(xiàn)。在一個實施方案中，所述BCMP用熒光染料染色，并用熒光掃描器成像。Sypro Red(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon)是一種用于此目的的合適染料。一種優(yōu)選的熒光染料公開于1999年10月5日申請的美國申請第09/412,168號，該申請通過引用全部結(jié)合到本文中。
或者，可以用免疫測定檢測BCMP。在一個實施方案中，如下進(jìn)行免疫測定通過使得自受試受治療者的樣品與抗BCMP抗體接觸，其接觸條件使得當(dāng)所述BCMP存在時可以發(fā)生免疫特異性結(jié)合；并且檢測或測量所述抗體的任何免疫特異性結(jié)合的量。抗BCMP抗體可以通過本文所述的方法和技術(shù)來產(chǎn)生。
在一個實施方案中，組織切片中的抗體結(jié)合可以用來檢測異常的BCMP定位或一種或多種BCMP的異常水平。在一個具體實施方案中，抗BCMP抗體可以用來分析患者組織(例如乳腺組織活檢樣品)中所述BCMP的水平，其中BCMP的異常水平指示乳腺癌。本文所用的“異常水平”是指與無乳腺癌受治療者的水平或參比水平相比增加或減少的水平。如果需要，可以與得自同一受治療者、取自不受乳腺癌影響的機(jī)體部分的匹配樣品進(jìn)行比較。
可以使用任何合適的免疫測定，包括但不限于利用諸如以下技術(shù)的競爭性測定系統(tǒng)和非競爭性測定系統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、凝集測定、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫放射分析、熒光免疫測定和A蛋白免疫測定。
例如，可以通過兩步夾心測定，測定體液樣品(例如血液、尿或乳腺組織勻漿)中的BCMP。在第一步中，用捕獲試劑(例如抗BCMP抗體)來捕獲所述BCMP。所述捕獲試劑可以任選地固定化于固相上。在第二步中，用直接或間接標(biāo)記的檢測試劑來檢測所捕獲的BCMP。在一個實施方案中，所述檢測試劑是凝集素。與具有與所述BCMP相同核心蛋白的其它同種型相比或與共享所述抗體所識別的抗原決定簇的其它蛋白相比，優(yōu)先與所述BCMP結(jié)合的任何凝集素，都可以用于此目的。在一個優(yōu)選實施方案中，所選凝集素與所述BCMP結(jié)合的親合性比具有與所述BCMP相同核心蛋白的所述其它同種型或與共享所述抗體所識別的抗原決定簇的所述其它蛋白高至少2倍、更優(yōu)選高至少5倍，再更優(yōu)選高至少10倍。根據(jù)本文的描述，適用于檢測給定BCMP的凝集素可以用本領(lǐng)域眾所周知的方法容易地鑒定，例如通過測試Sumar等，作為疾病相關(guān)糖形指示的凝集素，Gabius H-J和Gabius S(編著)，1993，Lectins and Glycobiology，第158-174頁(該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)的第158-159頁表I中列舉的一種或多種凝集素。在一個可供選擇的實施方案中，所述檢測試劑是一種抗體，例如免疫特異性地檢測其它翻譯后修飾的抗體，諸如免疫特異性地與磷酸化氨基酸結(jié)合的抗體。這類抗體的實例包括與磷酸酪氨酸結(jié)合的抗體(BDTransduction Laboratories，產(chǎn)品目錄號P11230-050/P11230-150；P11120；P38820；P39020)、與磷酸絲氨酸結(jié)合的抗體(ZymedLaboratories，Inc.，South San Francisco，CA，產(chǎn)品目錄號61-8100)和與磷酸蘇氨酸結(jié)合的抗體(Zymed Laboratories，Inc.，South San Francisco，CA，產(chǎn)品目錄號71-8200，13-9200)。
如果需要，在雜交分析中也可以使用編碼BCMP的基因、相關(guān)基因或相關(guān)核酸序列或亞序列，包括互補(bǔ)序列。編碼BCMP的核苷酸或其包含至少8個核苷酸、優(yōu)選至少12個核苷酸、最優(yōu)選至少15個核苷酸的亞序列，可以用作雜交探針。雜交分析可以用于與BCMP編碼基因異常表達(dá)相關(guān)的病癥、疾病或病狀的檢測、預(yù)后、診斷或監(jiān)測，或用于具有暗示乳腺癌的體征或癥狀的受治療者的鑒別診斷。具體而言，這樣一種雜交分析可以通過這樣一種方法進(jìn)行，所述方法包括使受治療者的含有核酸的樣品與能夠與編碼BCMP的DNA或RNA雜交的核酸探針在使得可以發(fā)生雜交的條件下接觸，并且檢測或測量任何所產(chǎn)生的雜交。核苷酸可以用于乳腺癌受治療者的治療，如下所述。
本發(fā)明也提供診斷試劑盒，所述診斷試劑盒包含一種抗BCMP抗體。另外，這樣一種試劑盒可以任選地包含以下的一種或多種(1)關(guān)于使用所述抗BCMP抗體進(jìn)行診斷、預(yù)后、治療監(jiān)測或這些應(yīng)用任何組合的說明；(2)所述抗體的標(biāo)記結(jié)合配偶體；(3)抗BCMP在其上固定化的固相(例如試劑紙條)；和(4)標(biāo)簽或插頁，表明管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于診斷、預(yù)后或治療應(yīng)用或其任何組合。如果沒有提供所述抗體的標(biāo)記結(jié)合配偶體，則所述抗BCMP抗體本身可以用可檢測標(biāo)記(例如化學(xué)發(fā)光部分、酶部分、熒光部分或放射性部分)標(biāo)記。
本發(fā)明也提供一種包含能夠與編碼BCMP的RNA雜交的核酸探針的試劑盒。在一個具體實施方案中，試劑盒在一個或多個容器中包含一對引物(例如每種引物的大小范圍為6-30個核苷酸，更優(yōu)選10-30個核苷酸，再更優(yōu)選10-20個核苷酸)，所述一對引物在合適的反應(yīng)條件下可以引發(fā)編碼BCMP的核酸的至少一部分?jǐn)U增，例如通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(參見例如Innis等，1990，PCR Protocols，Academic Press，Inc.，San Diego，CA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(參見EP 320，308)、應(yīng)用Qβ復(fù)制酶、環(huán)狀探針反應(yīng)或本領(lǐng)域已知的其它方法。
也提供允許檢測多種BCMP或分別編碼一種BCMP的多種核酸的試劑盒。試劑盒可以任選地還包含預(yù)定量的一種分離BCMP蛋白或編碼一種BCMP的一種核酸，例如用作標(biāo)準(zhǔn)或?qū)φ?。臨床研究方面的應(yīng)用
本發(fā)明的診斷方法和組合物可以有助于監(jiān)測臨床研究，例如以評價用于治療乳腺癌的藥物。在一個實施方案中，測試候選分子將乳腺癌受治療者的BCMP水平恢復(fù)至無乳腺癌受治療者中的水平的能力，或者測試候選分子在經(jīng)治療的受治療者體內(nèi)(例如在用紫杉酚或多柔比星治療后)將BCMP水平保持在無乳腺癌數(shù)值水平或其附近的能力?？梢苑治鲆环N或多種BCMP的水平。
在另一實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可以用來篩選可供臨床研究以鑒定患乳腺癌個體的候選者；然后可以將所述個體從該項研究中排除，或者可以將其置于單獨的群組，以進(jìn)行治療或分析。如果需要，可以同時篩選所述候選者，以鑒定患乳腺癌個體；用于這些篩選的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。BCMP的純化
在許多特定方面，本發(fā)明提供分離的BCMP(最好是人BCMP)以及包含抗原決定簇(即可為抗體識別)或者具有其它功能活性的其片段和衍生物、以及編碼前述BCMP、片段和衍生物的核酸序列。本文所用的“功能活性”是指物質(zhì)顯示出與全長(野生型)BCMP相關(guān)的一種或多種功能活性，例如與BCMP底物或BCMP結(jié)合配偶體結(jié)合、抗原性(與抗靶抗體結(jié)合)、免疫原性、酶活性等。
在具體的實施方案中，本發(fā)明提供BCMP的肽片段，所述肽片段包含至少5個氨基酸、至少10個氨基酸、至少50個氨基酸或至少75個氨基酸。也提供缺乏BCMP的某些區(qū)或所有區(qū)的片段，也提供包含這類片段的蛋白質(zhì)(例如融合蛋白)。提供編碼上述肽片段或上述蛋白質(zhì)的核酸。
一旦鑒定出編碼所述BCMP、所述BCMP的一部分或所述BCMP前體的重組核酸，則可以分析所述基因產(chǎn)物。這可以通過基于所述產(chǎn)物的物理特性或功能特性的測定來達(dá)到，所述測定包括所述產(chǎn)物的放射性標(biāo)記，然后進(jìn)行凝膠電泳、免疫測定等分析。
本文鑒定的BCMP可以用標(biāo)準(zhǔn)方法分離和純化，所述方法包括色譜(例如離子交換色譜、親和色譜和大小柱色譜)、離心、差別溶解性或通過用于蛋白質(zhì)純化的的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
或者，一旦鑒定出編碼所述BCMP的重組核酸，則可以從所述重組核酸中包含的所述基因編碼區(qū)的核苷酸序列，推導(dǎo)出所述BCMP的完整氨基酸序列。結(jié)果，可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法，合成所述蛋白質(zhì)(參見例如Hunkapiller等，1984，Nature 310105-111)。
在另一個可供選擇的實施方案中，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法例如上述方法(例如免疫親和純化)，從天然來源中純化天然BCMP。
因此，本發(fā)明提供分離的BCMP、分離的BCMP相關(guān)多肽和BCMP或BCMP相關(guān)多肽的分離的衍生物或片段；任何上述物質(zhì)都可以通過重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成方法來生產(chǎn)。編碼BCMP的DNA的分離
以下介紹用于克隆BCMP編碼基因的具體實施方案，所述實施方案僅作為實例，而非限制性的。
本發(fā)明的核苷酸序列(包括DNA和RNA并且包含編碼BCMP或其片段或BCMP相關(guān)多肽的序列)可以采用本領(lǐng)域已知的方法合成，例如采用常規(guī)的化學(xué)方法或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。本發(fā)明的核苷酸序列也使得有可能鑒定和克隆編碼BCMP同系物或BCMP直向同系物的基因，包括例如通過篩選cDNA文庫、基因組文庫或表達(dá)文庫。
例如，為了通過PCR技術(shù)克隆編碼BCMP的基因，可以為鑒定為BCMP蛋白部分的所有BCMP肽片段設(shè)計錨定簡并寡核苷酸(或一組最有可能寡核苷酸)?？梢杂玫米砸环N或多種物種的相關(guān)cDNA和基因組DNA(例如得自乳腺組織或得自免疫系統(tǒng)細(xì)胞)，進(jìn)行多種條件下的PCR反應(yīng)。也可以用上述寡核苷酸(最好是嵌套式的)，在任何可得到的cDNA和基因組DNA上進(jìn)行vectorette反應(yīng)。vectorette PCR是在僅已知一種引物序列的情況下使特定DNA片段能夠擴(kuò)增的一種方法。因此，它將PCR的應(yīng)用延伸至僅可獲得一端的序列信息的DNA序列段。(Arnold C，1991，PCR Methods Appl.1(1)39-42；Dyer KD，Biotechniques，1995，19(4)550-2)。可以用例如為編碼BCMP肽片段的錨定簡并寡核苷酸(或最可能的寡核苷酸)的探針，用基因組文庫或cDNA文庫的庫(pool)作為模板，進(jìn)行vectorette PCR。
可以為所有BCMP肽片段設(shè)計錨定簡并寡核苷酸(和最可能的寡核苷酸)。這些寡核苷酸可以被標(biāo)記，并且與含有cDNA文庫和基因組DNA文庫的濾膜雜交。針對得自同一蛋白的不同肽的寡核苷酸將通常鑒定所述文庫的相同成員。cDNA文庫和基因組DNA文庫可以得自任何合適或所需的哺乳動物物種，例如得自人類。
包含編碼本發(fā)明BCMP或BCMP片段的核苷酸序列的核苷酸序列，尤其它們能夠與編碼其它蛋白的基因的互補(bǔ)序列段選擇性雜交，因而是有用的。根據(jù)應(yīng)用，可以使用各種各樣的雜交條件，以獲得與編碼BCMP的核苷酸序列至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的核苷酸序列。
對于高度的選擇性，用相對嚴(yán)格的條件形成雙鏈體，例如低鹽或高溫條件。本文所用的“高度嚴(yán)格條件”是指在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃下與濾膜結(jié)合的DNA雜交，并且在0.1×SSC/0.1％SDS中于68℃洗滌(Ausubel，F(xiàn).M.等編著，1989，Current Protocols in Molecular Biology，第I卷，Green PublishingAssociates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，New York，第2.10.3頁；所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。對于某些應(yīng)用，需要較低的嚴(yán)格條件來形成雙鏈體。本文所用的“中等嚴(yán)格條件”是指在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌(Ausubel等，1989，參見上文)。通過提高甲酰胺的量以使雜種雙鏈體不穩(wěn)定，也可以使得雜交條件更為嚴(yán)格。因此，可以容易地操作具體的雜交條件，一般根據(jù)所需結(jié)果來選擇。一般而言，在50％甲酰胺存在下方便的雜交溫度是對于與編碼BCMP的基因片段有95-100％同一性的探針而言為42℃，對于有90-95％同一性的探針而言為37℃，而對于有70-90％同一性的探針而言為32℃。
在基因組文庫的制備中，產(chǎn)生DNA片段，其中某些DNA片段將編碼BCMP的部分或完全的BCMP。用于制備DNA片段的任何合適的方法都可以用于本發(fā)明。例如，可以用各種限制性酶在特定位點切割所述DNA?；蛘撸藗兛梢栽阱i存在下使用DNA酶，使DNA片段化，或者可以例如通過超聲處理，物理剪切所述DNA。然后，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，包括但不限于瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳、柱色譜和蔗糖梯度離心，可以根據(jù)大小分離所述DNA片段。然后可以將所述DNA片段插入到合適的載體中，所述載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、噬菌體λ或T4和酵母人工染色體(YAC)。(參見例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.(編著)，1985，DNA CloningA Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.第I、II卷；Ausubel F.M.編著，1989，Current Protocols in MolecularBiology，第I卷，Green Publishing Associates，Inc.，和John Wiley&Sons，Inc.，New York)?？梢酝ㄟ^與標(biāo)記探針進(jìn)行核酸雜交，來篩選基因組文庫(Benton和Davis，1977，Science 196180；Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961)。
根據(jù)本發(fā)明的描述，可以用本領(lǐng)域眾所周知的最佳方法，用對應(yīng)于所述BCMP任何肽的氨基酸序列的標(biāo)記簡并寡核苷酸探針，篩選基因組文庫。所用的任何探針至少長10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少25個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、至少70個核苷酸、至少80個核苷酸或至少100個核苷酸。探針優(yōu)選長10個核苷酸或更長，更優(yōu)選長15個核苷酸或更長。
在以上表1和表2中，發(fā)現(xiàn)本文公開的某些BCMP對應(yīng)于先前鑒定的由公眾已知其序列的基因編碼的蛋白質(zhì)的同種型。(用實施例中所述的方法進(jìn)行BCMP的序列分析和蛋白質(zhì)鑒定)。為了篩選這樣一種基因，可以使用與所述基因或其互補(bǔ)物互補(bǔ)的任何探針；所述探針優(yōu)選長10個核苷酸或更長，更優(yōu)選長15個核苷酸或更長。SWISS-PROT和trEMBL數(shù)據(jù)庫(由the Swiss Institute of Bioinformatics(SIB)和theEuropean Bioinformatics Institute (EBI)維護(hù)，它們可在http//www.expasy.ch/得到)和GenBank數(shù)據(jù)庫(由the National Institute ofHealth(NH)維護(hù)，它可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/得到)提供了表1和表2中所列BCMP的蛋白序列，每個序列通過引用結(jié)合到本文中。
當(dāng)篩選文庫時，具有編碼所述BCMP其片段的插入DNA的克隆，將與一組對應(yīng)的簡并寡核苷酸探針(或其互補(bǔ)物)的一個或多個成員雜交。用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行這類寡核苷酸探針與基因組文庫的雜交。例如，可以在如上定義的高度嚴(yán)格或中等嚴(yán)格條件下，進(jìn)行與上述簡并寡核苷酸探針組中的一組探針或其互補(bǔ)物(或該組探針的任何成員或其互補(bǔ)物)的雜交，或者所述雜交可以在2×SSC、1.0％SDS中于50℃下進(jìn)行，并且用上文所述的用于高度嚴(yán)格或中等嚴(yán)格雜交的洗滌條件進(jìn)行洗滌。
在本發(fā)明的再一方面，含有編碼完整BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽的片段的核苷酸序列的克隆，也可以通過篩選表達(dá)文庫來獲得。例如，分離出得自相關(guān)來源的DNA，制備隨機(jī)片段，并連接到表達(dá)載體(例如噬菌體、質(zhì)粒、噬菌粒或粘粒)中，使得所述載體中所插入的序列能夠由所述載體隨后所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞表達(dá)。然后，可以用各種篩選測定，根據(jù)對所表達(dá)的BCMP或BCMP相關(guān)多肽來進(jìn)行選擇。在一個實施方案中，本發(fā)明的各種抗BCMP抗體可以用來采用本領(lǐng)域已知的方法鑒定所需克隆。參見例如Harlow和Lane，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，附錄IV。使得自所述文庫的菌落或噬斑與所述抗體接觸，以鑒定結(jié)合抗體的那些克隆。
在一個實施方案中，含有編碼BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽的片段的DNA的菌落或噬斑，可以用DYNA微珠，按照Olsvick等，29th ICAAC，Houston，Tex.1989(該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)所述來檢測。使抗BCMP抗體與甲苯磺?；疍YNA微珠M280交聯(lián)，然后使這些含抗體的微珠與表達(dá)重組多肽的菌落或噬斑接觸。表達(dá)BCMP或BCMP衍生多肽的菌落或噬斑鑒定為結(jié)合所述微珠的那些菌落或噬斑中的任一種。
或者，可以將所述抗BCMP抗體非特異性地固定化至合適的支持體上，例如二氧化硅或Celite樹脂。然后這種材料用來吸附至表達(dá)本文所述的BCMP蛋白或BCMP相關(guān)多肽的菌落。
另一方面，可以用PCR擴(kuò)增，從基因組DNA中分離編碼所述完整BCMP或其部分的基本純的DNA(即基本上不含污染核酸的DNA)。這種DNA的純度優(yōu)選至少為95％，更優(yōu)選純度至少為99％。對應(yīng)于本文公開的BCMP的肽序列的簡并的或者其它的寡核苷酸序列，可以用作引物。
可以例如利用Perkin-Elmer Cetus熱循環(huán)儀和Taq聚合酶(GeneAmp或AmpliTaq DNA聚合酶)進(jìn)行PCR。人們可以選擇合成幾種不同的簡并引物，以供用于PCR反應(yīng)。也有可能改變引發(fā)PCR反應(yīng)所用的雜交條件的嚴(yán)格性，以提供所述簡并引物和所述DNA中對應(yīng)序列之間更高或更低的核苷酸序列相似性程度。在成功擴(kuò)增BCMP編碼序列一個區(qū)段后，可以將該區(qū)段進(jìn)行分子克隆并測序，并且用作探針以分離完整的基因組克隆。這又將允許測定所述基因的完整核苷酸序列、其表達(dá)的分析以及生產(chǎn)其蛋白產(chǎn)物以供功能分析，如下文所述。
編碼BCMP的基因也可以通過mRNA選擇，通過核酸雜交，然后進(jìn)行體外翻譯來鑒定。在這種方法中，利用片段，通過雜交來分離互補(bǔ)的mRNA。這種DNA片段可以代表可得到的、經(jīng)純化的、編碼另一物種(例如小鼠、人類)的BCMP的DNA。所分離mRNA的分離產(chǎn)物的體外翻譯產(chǎn)物的免疫沉淀分析或功能分析(例如體外聚集能力；與受體結(jié)合)，鑒定出所述mRNA，并因此鑒定出含有所需序列的互補(bǔ)DNA片段。另外，通過使從細(xì)胞中分離的多核糖體吸附至特異性識別一種BCMP的固定化抗體上，可以選擇特定的mRNA。用所述經(jīng)選擇的mRNA(得自吸附的多核糖體)作為模板，可以合成編碼BCMP的放射性標(biāo)記的cDNA。然后可以用所述放射性標(biāo)記的mRNA或cDNA作為探針，從其它基因組DNA片段中鑒定編碼BCMP的DNA片段。
分離編碼BCMP的基因組DNA的替代方法包括但不限于根據(jù)已知序列化學(xué)合成所述基因序列本身、或者從編碼所述BCMP的mRNA制備cDNA。例如，可以從表達(dá)BCMP的細(xì)胞中，分離出RNA以供編碼所述BCMP的基因的cDNA克隆。根據(jù)本文的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，可以使用其它方法，并且這些方法在本發(fā)明范圍內(nèi)。
任何合適的真核細(xì)胞都可以作為可供BCMP編碼基因的分子克隆的核酸來源。可以從脊椎動物、哺乳動物、靈長類、人類、豬、牛、貓、鳥類、馬、犬或鼠類來源，分離出編碼所述BCMP的核酸序列?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過化學(xué)合成、cDNA克隆或基因組DNA或其片段的克隆，從由所需細(xì)胞中純化的克隆的DNA(例如DNA“文庫”)中獲得所述DNA。(參見例如Sambrook等，1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.(編著)，1985，DNACloningA Practical Approach，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.第I、II卷)。來源于基因組DNA的克隆除編碼區(qū)外，可能還含有調(diào)節(jié)DNA區(qū)和內(nèi)含子DNA區(qū)；來源于cDNA的克隆將僅含有外顯子序列。
然后，可以將所述經(jīng)鑒定并分離的基因或cDNA插入任何合適的克隆載體中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的許多載體-宿主系統(tǒng)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到的，唯一的限制是所選的載體系統(tǒng)與所用的宿主細(xì)胞匹配。這類載體包括但不限于噬菌體例如λ噬菌體、質(zhì)粒例如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物或Bluescript載體(Stratagene)或經(jīng)修飾的病毒例如腺病毒、腺伴隨病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。例如通過將所述DNA片段連接到具有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體中，可以完成在克隆載體的插入。然而，如果用來使所述DNA片段化的互補(bǔ)限制位點在所述克隆載體中不存在，那么可以用酶修飾所述DNA分子的末端?；蛘撸梢酝ㄟ^將核苷酸序列(接頭)連接到所述DNA末端，產(chǎn)生所需的任何位點；這些連接的接頭可以包含特定的化學(xué)合成的編碼限制性內(nèi)切核酸酶識別序列的寡核苷酸。在一個可供選擇的方法中，可以通過同聚物加尾反應(yīng)，修飾所經(jīng)切割的載體和編碼BCMP的基因?？梢詫⒅亟M分子通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔等導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，使得產(chǎn)生許多拷貝的所述基因序列。
在具體實施方案中，用加入編碼所述BCMP的分離基因的重組DNA分子、cDNA或合成DNA序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使得能夠產(chǎn)生多拷貝的所述基因。因此，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，從轉(zhuǎn)化子中分離所述重組DNA分子，必要時從所分離的重組DNA中提取所插入的基因，可以大量獲得所述基因。
本發(fā)明的核苷酸序列包括編碼與天然BCMP氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的核苷酸序列、編碼具有功能等同氨基酸的氨基酸序列的核苷酸序列、編碼BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽的片段的核苷酸序列。
在一個具體實施方案中，通過在BCMP的核苷酸序列中引入一個或多個核苷酸取代、添加或缺失，使得在所編碼的蛋白質(zhì)中引入一個或多個氨基酸取代、添加或缺失，可以構(gòu)建編碼BCMP相關(guān)多肽的分離的核酸分子。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入突變，所述技術(shù)包括例如定點誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。最好在一種或多種預(yù)測非必需的氨基酸殘基上進(jìn)行保守氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈笔瞧渲兴霭被釟埢痪哂袔嗨齐姾傻膫?cè)鏈的氨基酸殘基取代的氨基酸取代。在本領(lǐng)域中，已經(jīng)確定了具有帶相似電荷的側(cè)鏈的氨基酸的多個類別。這些類別包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。或者，可以例如通過飽和誘變，沿整個編碼序列或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，并且可以根據(jù)生物活性篩選所產(chǎn)生的突變體，以鑒定保留活性的突變體。在誘變之后，可以表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)，并且可以測定所述蛋白質(zhì)的活性。編碼BCMP的DNA的表達(dá)
可以將編碼BCMP、BCMP類似物、BCMP相關(guān)肽或者任何上述物質(zhì)的片段或其它衍生物的核苷酸序列，插入到合適的表達(dá)載體中，所述載體例如含有所插入的蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體。所述必需轉(zhuǎn)錄信號和翻譯信號也可以由編碼所述BCMP的天然基因或其側(cè)翼區(qū)來供應(yīng)，或者由編碼所述BCMP相關(guān)多肽的天然基因或其側(cè)翼區(qū)來供應(yīng)。在本發(fā)明中可以利用多種宿主-載體系統(tǒng)來表達(dá)所述蛋白編碼序列。這些包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)感染的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；微生物，例如含有酵母載體的酵母；或用噬菌體、DNA或質(zhì)粒DNA或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。載體的表達(dá)元件在其強(qiáng)度和特異性方面不同。根據(jù)所用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用多種合適轉(zhuǎn)錄元件和翻譯元件中的任何一種。在具體實施方案中，表達(dá)編碼人類基因的核苷酸序列(或編碼人類BCMP的功能活性部分的核苷酸序列)。在另一實施方案中，表達(dá)包含所述BCMP結(jié)構(gòu)域的BCMP片段。
先前描述用于將DNA片段插入載體中的任何方法，都可以用來構(gòu)建含有由合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號和所述蛋白編碼序列組成的嵌合基因的表達(dá)載體。這些方法可以包括體外重組DNA技術(shù)和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組體(基因重組)。編碼BCMP或其片段的核酸序列的表達(dá)，可以由第二種核酸序列來調(diào)節(jié)，使得所述BCMP或片段在用所述重組DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主中表達(dá)。例如，BCMP的表達(dá)，可以由本領(lǐng)域已知的任何啟動子或增強(qiáng)子元件來控制?？梢杂脕砜刂凭幋a述BCMP或BCMP相關(guān)多肽的基因表達(dá)的啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、在勞斯肉瘤病毒的3’長末端重復(fù)中含有的啟動子(Yamamoto等，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等，1981，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)、四環(huán)素(Tet)啟動子(Gossen等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547-5551)；原核表達(dá)載體，例如β-內(nèi)酰胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)或tac啟動子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25；也參見“得自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”，Scientific American，1980，24274-94)；含有胭脂堿合成酶啟動子區(qū)的植物表達(dá)載體(Herrera-Estrella等，Nature 303209-213)或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(Gardner等，1981，Nucl.Acids Res.92871)、以及光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的啟動子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310115-120)；得自酵母和其它真菌的啟動子元件，例如Gal 4啟動子、ADC(醇脫氫酶)啟動子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動子、堿性磷酸酶啟動子和以下動物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，所述控制區(qū)表現(xiàn)出組織特異性，并且已經(jīng)用于轉(zhuǎn)基因動物中彈性蛋白酶I基因控制區(qū)，它在胰腺腺泡細(xì)胞中有活性(Swift等，1984，Cell 38639-646；Ornitz等，1986，Cold Sprigg Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；胰島素基因控制區(qū)，它在胰腺β細(xì)胞中有活性(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、免疫球蛋白基因控制區(qū)，它在淋巴樣細(xì)胞中有活性(Grosschedl等，1984，Cell 38647-658；Adames等，1985，Nature 318533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、小鼠乳腺瘤病毒控制區(qū)，它在睪丸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有活性(Leder等，1986，Cell 45485-495)、清蛋白基因控制區(qū)，它在肝中有活性(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1268-276)、甲胎蛋白基因控制區(qū)，它在肝中有活性(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer等，1987，Science 23553-58)、α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)，它在肝中有活性(Kelsey等，1987，Genes andDevel.1161-171)、β-珠蛋白基因控制區(qū)，它在骨髓性細(xì)胞中有活性(Mogram等，1985，Natur 315338-340；Kollias等，1986，Cell 4689-94)；髓鞘堿性蛋白基因控制區(qū)，它在腦中少突膠質(zhì)細(xì)胞中有活性(Readhead等，1987，Cell 48703-712)；肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)，它在骨骼肌中有活性(Sani，1985，Nature 314283-286)；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，它在神經(jīng)元細(xì)胞中有活性(Morelli等，1999，Gen.Virol.80571-83)；腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)基因控制區(qū)，它在神經(jīng)元細(xì)胞中有活性(Tabuchi等，1998，Biochem.Biophysic.Res.Com.253818-823)；膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子，它在星形膠質(zhì)細(xì)胞中有活性(Gomes等，1999，Braz J Med Biol Res 32(5)619-631；Morelli等，1999，Gen.Virol.80571-83)和促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)，它在下丘腦中有活性(Mason等，1986，Science 2341372-1378)。
在一個具體實施方案中，使用一種載體，所述載體包含一個與BCMP編碼核酸有效連接的啟動子、一個或多個復(fù)制起點和任選的一個或多個選擇標(biāo)記(例如抗生素抗性基因)。
在一個具體實施方案中，通過將BCMP或BCMP相關(guān)多肽編碼序列亞克隆到三種pGEX載體(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體；Smith和Johnson，1988，Gene 731-40)中任一種的EcoRI限制位點中，制備一種表達(dá)構(gòu)建體。這保證地來自以正確讀框亞克隆的BCMP產(chǎn)物或BCMP相關(guān)多肽的表達(dá)。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在使用腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，可以將所述BCMP編碼序列或BCMP相關(guān)多肽編碼序列與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物(例如晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列)連接。然后將這種嵌合基因通過體外或體內(nèi)重組，插入到腺病毒基因組中。在病毒基因組的非必需區(qū)(例如E1區(qū)和E3區(qū))中插入，將產(chǎn)生有活力的并且能夠在被感染細(xì)胞中表達(dá)所述抗體分子的重組病毒。(參見例如Logan和Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81355-359)。所插入抗體編碼序列的有效翻譯，也可能需要特定的起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰序列。此外，所述起始密碼子必須符合所需編碼序列的讀框，以確保翻譯完整的插入片段。這些外源的翻譯控制信號和起始密碼子可以有多種來源，可以是天然的，也可以是合成的。通過包括合適的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等，可以提高表達(dá)效率。(參見Bitner等，1987，Methods inEnzymol.15351-544)。
含有BCMP或BCMP相關(guān)多肽編碼基因的插入片段的表達(dá)載體可以通過三個通用方法來鑒定(a)核酸雜交，(b)“標(biāo)記”基因功能是否存在，和(c)所插入序列的表達(dá)。在第一個方法中，用包含與所插入的BCMP編碼基因同源的序列的探針，通過核酸雜交，可以檢測表達(dá)載體中插入的BCMP編碼基因的存在。在第二個方法中，根據(jù)由于在所述載體中插入BCMP編碼基因引起的某些“標(biāo)記”基因功能(例如胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉(zhuǎn)化表型、在桿狀病毒中形成包含體等)存在與否，可以鑒定和選擇所述重組載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果所述BCMP編碼基因插入到該載體的標(biāo)記基因序列中，則根據(jù)所述標(biāo)記基因功能的缺乏，可以鑒定出含有所述BCMP編碼基因插入片段的重組體。在第三個方法中，通過分析由所述重組體表達(dá)的所述基因產(chǎn)物(即BCMP)，可以鑒定重組表達(dá)載體。這類方法可以基于例如體外測定系統(tǒng)中所述BCMP的物理特性或功能特性，例如與抗BCMP抗體的結(jié)合。
另外，可以選擇調(diào)節(jié)所插入序列表達(dá)、或者以所需的特定方式修飾和加工所述基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。來自某些啟動子的表達(dá)在存在某些誘導(dǎo)物的情況下可以增加；因而可以控制遺傳工程BCMP或BCMP相關(guān)多肽的表達(dá)。此外，不同的宿主細(xì)胞具有翻譯和翻譯后加工和修飾(例如蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化)的特征性和特定機(jī)制?？梢赃x擇合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保所表達(dá)的外源蛋白的所需修飾和加工。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)將產(chǎn)生非糖基化產(chǎn)物，在酵母中表達(dá)將產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物。可以使用具有正確加工初級轉(zhuǎn)錄物、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)器的真核宿主細(xì)胞。這類哺乳動物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、3T3和WI38。此外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可能在不同程度上影響加工反應(yīng)。
對于重組蛋白長期高產(chǎn)量的生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以對穩(wěn)定表達(dá)差異表達(dá)蛋白或途徑基因蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行工程改造。不使用含有病毒復(fù)制起點的表達(dá)載體，而是用受合適表達(dá)控制元件(例如啟動子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制的DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。在導(dǎo)入外源DNA后，讓工程細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長1-2天，然后轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基上。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予對所述選擇的抗性，使得細(xì)胞能夠?qū)⑺鲑|(zhì)粒穩(wěn)定地整合到其染色體中，生長形成轉(zhuǎn)化灶，可以進(jìn)而將轉(zhuǎn)化灶克隆，擴(kuò)充為細(xì)胞系。該方法可以有利地用來對表達(dá)差異表達(dá)的或途徑基因蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行工程改造。這類工程細(xì)胞系可能在影響所述差異表達(dá)的或途徑基因蛋白的內(nèi)源活性的化合物的篩選和評價方面特別有用。
可以使用許多選擇系統(tǒng)，包括但不限于在tk-細(xì)胞、hgprt-細(xì)胞或aprt-細(xì)胞中可以分別使用單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell11223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，Cell 22817)基因。此外，抗代謝物抗性可以用作對以下基因的選擇基礎(chǔ)dhfr它賦予對氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 773567；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，它賦予對霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，它賦予對氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)；hypro，它賦予對潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene 30147)。
在其它具體實施方案中，所述BCMP、片段、類似物或衍生物可以作為融合蛋白產(chǎn)物或嵌合蛋白產(chǎn)物(包含通過肽鍵與一種異源蛋白序列連接的所述蛋白、片段、類似物或衍生物)表達(dá)。例如，本發(fā)明的多肽可以與免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定區(qū)或其部分(CH1、CH2、CH3，或其任何組合或其部分)融合，產(chǎn)生嵌合多肽。這類融合蛋白可以有助于純化、增加體內(nèi)半壽期和增強(qiáng)抗原穿越表皮屏障傳遞至免疫系統(tǒng)。已經(jīng)表明由人CD4-多肽的前兩個結(jié)構(gòu)域和哺乳動物免疫球蛋白重鏈或輕鏈恒定區(qū)的不同結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白的體內(nèi)半壽期增加并且有利于純化。參見例如EP 394，827；Traunecker等，Nature，33184-86(1988)。已經(jīng)證明，對與FcRn結(jié)合配偶體(例如IgG或Fc片段)綴合的抗原(例如胰島素)而言，其抗原穿越表皮屏障至免疫系統(tǒng)的傳遞增強(qiáng)(參見例如PCT公開說明書WO 96/22042和WO 99/04813)。
編碼BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段的核酸，可以與附加表位(例如血凝素(“HA”)標(biāo)志或flag標(biāo)志)融合，以有助于所表達(dá)多肽的檢測和純化。例如，Janknecht等描述的系統(tǒng)，提供在人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白的快速純化(Janknecht等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888972-897)。
融合蛋白可以如下制備用本領(lǐng)域已知的方法，將編碼所需氨基酸序列的合適核酸序列在正確的編碼框內(nèi)相互連接，并且通過本領(lǐng)域周知的方法表達(dá)所述嵌合產(chǎn)物?；蛘?，可以通過蛋白合成技術(shù)，例如利用肽合成儀，制備融合蛋白。
cDNA序列和基因組序列都可以克隆和表達(dá)。BCMP的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)
某些BCMP的結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域已知的，并且描述于科學(xué)文獻(xiàn)中。此外，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)鑒定BCMP的結(jié)構(gòu)域。例如，通過采用一種或多種以下程序可以鑒定BCMP的一個或多個結(jié)構(gòu)域ProDom、TMpred和SAPS。ProDom將多肽的氨基酸序列與編譯的結(jié)構(gòu)域的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較(參見例如http//www.toulouse.inra.fr/prodom.html； Corpet F.，Gouzy J.和Kahn D.，1999，Nucleic Acids Res.，27263-267)。TMprep預(yù)測多肽跨膜區(qū)及其定向。該程序使用基于TMbase的統(tǒng)計學(xué)分析的算法，TMbase是天然存在的跨膜蛋白的數(shù)據(jù)庫(參見例如http//www.ch.embnet.org/software/TMPRED.form.html；Hofmann和Stoffel.(1993)“TMbase-跨膜蛋白區(qū)段的數(shù)據(jù)庫”。Biol.Chem.Hoppe-Seyler 347，166)。SAPS程序分析多肽的統(tǒng)計學(xué)顯著性特征，如電荷-簇(charge-cluster)、重復(fù)序列、疏水區(qū)、復(fù)合結(jié)構(gòu)域(參見例如Brendel等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892002-2006)。因此，基于本發(fā)明的描述，技術(shù)人員可以鑒定具有酶活性或結(jié)合活性的BCMP結(jié)構(gòu)域，還可以鑒定編碼這類結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。這些核苷酸序列然后可以用于保留所述BCMP酶活性或結(jié)合活性的BCMP片段的重組表達(dá)。
基于本發(fā)明的描述，技術(shù)人員可以鑒定具有酶活性或結(jié)合活性的BCMP結(jié)構(gòu)域，還可以鑒定編碼這類結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。這些核苷酸序列然后可以用于保留所述BCMP酶活性或結(jié)合活性的BCMP片段的重組表達(dá)。
在一個實施方案中，BCMP具有與已知多肽的已鑒定結(jié)構(gòu)域足夠相似的氨基酸序列。本文所用的術(shù)語“足夠相似”是指第一種氨基酸序列或核苷酸序列含有足夠數(shù)目的與第二種氨基酸序列或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似側(cè)鏈)的氨基酸殘基或核苷酸，使得所述第一種和第二種氨基酸序列或核苷酸序列具有或者編碼共同的結(jié)構(gòu)域或共同的功能活性或共同的結(jié)構(gòu)域和共同的功能活性。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)，評價BCMP結(jié)構(gòu)域的功能。例如，可以采用技術(shù)人員已知的技術(shù)，評價結(jié)構(gòu)域的激酶活性或者其與DNA結(jié)合的能力。例如通過測量多肽將底物磷酸化的能力，可以評價激酶活性。例如通過在電泳遷移率變動測定中測量多肽與DNA結(jié)合元件結(jié)合的能力，可以評價DNA結(jié)合活性?？笲CMP抗體的產(chǎn)生
按照本發(fā)明，BCMP、BCMP類似物、BCMP相關(guān)蛋白或任何上述物質(zhì)的片段或衍生物，可以用作免疫原來產(chǎn)生免疫特異性結(jié)合這種免疫原的抗體。這類免疫原可以通過任何常規(guī)方法包括上述方法來分離。本發(fā)明的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體、人源化抗體或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab’)片段、通過Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段、抗獨特型(抗Id)抗體和任何上述抗體或片段的表位結(jié)合片段。本文所用的術(shù)語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結(jié)合抗原的抗原結(jié)合部位的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD和Iga)或亞類。
在一個實施方案中，識別BCMP編碼基因的基因產(chǎn)物的抗體是公眾可得到的。在另一實施方案中，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生識別BCMP、BCMP類似物、BCMP相關(guān)多肽或任何上述物質(zhì)的片段或衍生物的抗體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，產(chǎn)生針對BCMP的一個特定結(jié)構(gòu)域的抗體。在一個具體實施方案中，BCMP的親水性片段用作供抗體生產(chǎn)用的免疫原。
在抗體的生產(chǎn)中，所需抗體的篩選可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)來完成。例如，為了選擇識別BCMP特定結(jié)構(gòu)域的抗體，人們可以分析所產(chǎn)生的雜交瘤中與含這種結(jié)構(gòu)域的BCMP片段結(jié)合的產(chǎn)物。關(guān)于選擇特異性結(jié)合第一種BCMP同系物、但不特異性地結(jié)合(或結(jié)合急劇減少)第二種BCMP同系物的抗體，人們可以根據(jù)與所述第一種BCMP同系物的結(jié)合陽性且缺乏與所述第二種BCMP同系物結(jié)合(或結(jié)合減少)來進(jìn)行選擇。同樣，對于選擇特異性結(jié)合一種BCMP、但不特異性地結(jié)合(或結(jié)合急劇減少)同一蛋白的不同同種型(例如具有與BCMP相同核心肽的不同糖形)的抗體，人們可以根據(jù)與所述BCMP的結(jié)合陽性且缺乏與所述不同同種型(例如不同糖形)結(jié)合(或結(jié)合減少)來進(jìn)行選擇。因而，本發(fā)明提供與BCMP結(jié)合的親和性高于(優(yōu)選親和性高至少2倍、更優(yōu)選至少5倍、再更優(yōu)選至少10倍)與所述BCMP的一種或多種不同同種型(例如糖形)結(jié)合的親和性的抗體(最好是單克隆抗體)。
可用于本發(fā)明方法的多克隆抗體是來源于免疫動物血清的不均一的抗體分子群體。也可以使用未分級分離的免疫血清。本領(lǐng)域已知的各種方法可以用來產(chǎn)生針對BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽片段的多克隆抗體。在一個具體實施方案中，可以獲得針對BCMP或BCMP相關(guān)多肽的表位的兔多克隆抗體。例如，為了生產(chǎn)多克隆抗體或單克隆抗體，可以通過注射天然形式或合成(例如重組)形式的BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽片段，免疫各種宿主動物，包括但不限于兔子、小鼠、大鼠等。本文所述的the Preferred Techndogy提供了適用于這類免疫的分離的BCMP。如果所述BCMP通過凝膠電泳純化，則可以在將所述BCMP用于免疫之前，從聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行或不進(jìn)行提取。根據(jù)宿主物種，可以用各種佐劑來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述佐劑包括但不限于弗氏完全或不完全佐劑、礦物凝膠例如氫氧化鋁、表面活性劑例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳液、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基酚和佐劑例如BCG(卡介苗)或小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。其它佐劑也是本領(lǐng)域眾所周知的。
對于針對BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽片段的單克隆抗體(mAb)的制備，可以使用提供用培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的任何技術(shù)。例如，最早由Kohler和Milstein(1975，Nature 256495-497)開發(fā)的雜交瘤技術(shù)以及trioma技術(shù)-人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，1983，Immunology Today 472)和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96頁)。這類抗體可以是任何免疫球蛋白類別(包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD)和其任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可以體外或體內(nèi)培養(yǎng)。在本發(fā)明的另一實施方案中，可以利用已知技術(shù)，在無菌動物中生產(chǎn)單克隆抗體(PCT/US90/02545，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)。
所述單克隆抗體包括但不限于人單克隆抗體和嵌合單克隆抗體(例如人-小鼠嵌合體)。嵌合抗體是其中不同部分來源于不同動物種的分子，例如具有人免疫球蛋白恒定區(qū)和來源于鼠mAb的可變區(qū)的分子。(參見例如Cabilly等，美國專利第4,816,567號；和Boss等，美國專利第4,816,397號，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。人源化抗體是來自非人類物種的抗體分子，這種分子具有一個或多個得自所述非人類物種的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)和一個得自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)。(參見例如Queen，美國專利第5,585,089號，該專利通過引用全部結(jié)合到本文中)。
嵌合單克隆抗體和人源化單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，例如采用在以下文獻(xiàn)中描述的方法PCT公開說明書WO 87/02671；歐洲專利申請184,187；歐洲專利申請171,496；歐洲專利申請173,494；PCT公開說明書WO 86/01533；美國專利第4,816,567號；歐洲專利申請125,023；Better等，1988，Science2401041-1043；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood等，1985，Nature 314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison，1985，Science 2291202-1207；Oi等，1986，Bio/Techniques 4214；美國專利第5,225,539號；Jones等，1986，Nature321552-525；Verhoeyan等(1988)Science 2391534；和Beidler等，1988，J.Immunol.1414053-4060。
完全人抗體，對于人類受治療者的治療性治療而言是尤其理想的。這類抗體可以采用轉(zhuǎn)基因小鼠來生產(chǎn)，所述轉(zhuǎn)基因小鼠不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，但它可以表達(dá)人類重鏈和輕鏈基因。所述轉(zhuǎn)基因小鼠用所選抗原(例如完整的本發(fā)明BCMP或本發(fā)明BCMP的一部分)以正常方式免疫?？梢圆捎贸Ｒ?guī)雜交瘤技術(shù)獲得針對所述抗原的單克隆抗體。所述轉(zhuǎn)基因小鼠帶有的人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化期間重排，隨后經(jīng)歷類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。因此，采用這種技術(shù)，有可能生產(chǎn)治療上有用的IgG、IgAA、IgM和IgE抗體。有關(guān)生產(chǎn)人抗體的這種技術(shù)的綜述，參見Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.1365-93)。有關(guān)生產(chǎn)人抗體和人單克隆抗體的這種技術(shù)和生產(chǎn)這類抗體的方案的詳細(xì)討論，參見例如美國專利5,625,126；美國專利5,633,425；美國專利5,569,825；美國專利5,661,016；和美國專利5,545,806。另外，可以雇用例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)的公司，采用與上述技術(shù)相似的技術(shù)提供針對所選抗原的人抗體。
可以采用稱為“指導(dǎo)選擇(guided selection)”的技術(shù)，產(chǎn)生識別所選表位的完全人抗體。在這種方法中，用所選非人類單克隆抗體(例如小鼠抗體)來指導(dǎo)識別同一表位的完全人抗體的選擇。(Jespers等(1994)Bio/technology 12899-903)。
本發(fā)明的抗體也可以采用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法來產(chǎn)生。在噬菌體展示方法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域展示在攜帶編碼所述抗體的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面。特別是，這類噬菌體可以用來展示由所有組成部分或聯(lián)合抗體文庫(例如人或鼠)表達(dá)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？梢杂每乖?，例如采用標(biāo)記抗原或結(jié)合或捕獲在固體表面或微珠上的抗原，選擇或鑒定表達(dá)結(jié)合目的抗原的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體。用于這些方法中的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13，將由噬菌體表達(dá)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Fab、Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv抗體結(jié)構(gòu)域與或者噬菌體基因III或者基因VIII蛋白重組融合?？梢杂脕碇苽浔景l(fā)明抗體的噬菌體展示方法包括公開于下述文獻(xiàn)中的方法Brinkman等，J.Immunol.Methods 18241-50(1995)；Ames等，J.Immunol.Methods184177-186(1995)；Kettleborough等，Eur.J.Immunol.24952-958(1994)；Persic等，Gene 1879-18(1997)；Burton等，Advances inImmunology 57191-280(1994)；PCT申請PCT/GB91/01134；PCT公開說明書WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；和美國專利第5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908；5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108號，所述文獻(xiàn)中的每個都通過引用全部結(jié)合到本文中。
正如上述參考文獻(xiàn)中所述的，在噬菌體選擇后，如下詳述，可以分離得自噬菌體的所述抗體編碼區(qū)，將其用來產(chǎn)生完整抗體包括人抗體或任何其它所需的抗原結(jié)合片段，然后在任何所需的宿主(包括哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌等)中表達(dá)。例如，也可以采用重組產(chǎn)生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技術(shù)，采用例如在以下文獻(xiàn)中公開的本領(lǐng)域已知的方法PCT公開說明書WO 92/22324；Mullinax等，BioTechniques 12(6)864-869(1992)；和Sawai等，AJRI3426-34(1995)和Better等，Science 2401041-1043(1988)(所述參考文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。
可以用來產(chǎn)生單鏈Fv和抗體的技術(shù)的實例包括以下文獻(xiàn)中公開的那些技術(shù)美國專利4,946,778和5,258,498；Huston等，Methods inEnzymology 20346-88(1991)；Shu等，PNAS 907995-7999(1993)；和Skerra等，Science 2401038-1040(1988)。
本發(fā)明還提供雙特異性抗體的應(yīng)用，所述雙特異性抗體可以用本領(lǐng)域已知的方法制備。全長雙特異性抗體傳統(tǒng)上的生產(chǎn)，基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)，其中所述兩條鏈具有不同的特異性(Milstein等，1983，Nature 305537-539)。因為免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機(jī)分配，所以這些雜交瘤(quadromas)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中僅一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。正確分子的純化(通常通過親和色譜步驟來進(jìn)行)相當(dāng)麻煩，并且產(chǎn)物收率低。在于1993年5月13日公開的WO 93/08829和Traunecker等，1991，EMBO J.103655-3659中公開了相似的方法。
按照一種不同的更優(yōu)選的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合部位)抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。所述融合體最好具有免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。最好在至少一種所述融合體中存在含有輕鏈結(jié)合所必需部位的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼所述免疫球蛋白重鏈融合體和(必要時)免疫球蛋白輕鏈的DNA插入到單獨的表達(dá)載體中，共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物中。當(dāng)在構(gòu)建中所用的三種多肽鏈不等的比率提供最佳收率時，這在調(diào)節(jié)實施方案中所述三種多肽片段的相互比率方面提供很大的靈活性。然而，當(dāng)至少兩種多肽鏈等比率的表達(dá)導(dǎo)致高收率時，或者當(dāng)所述比率沒有特別的重要性時，有可能將編碼兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入到一種表達(dá)載體中。
在這種方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述雙特異性抗體由在一個臂中一條具有第一結(jié)合特異性的雜種免疫球蛋白重鏈和在另一個臂中一條雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)有利于從不想要的免疫球蛋白鏈組合中分離出所需雙特異性化合物，因為僅在所述雙特異性分子中的一半中存在免疫球蛋白輕鏈，提供了一種靈活的分離途徑。這種方法公開于1994年3月3日公開的WO 94/04690中。有關(guān)產(chǎn)生雙特異性抗體的其它細(xì)節(jié)，參見例如Suresh等，Methods in Enzymology，1986，121210。
本發(fā)明提供所述抗BCMP免疫球蛋白分子的功能活性片段、衍生物或類似物。功能活性是指所述片段、衍生物或類似物能夠引發(fā)識別所述片段、衍生物或類似物所來源的抗體所識別的相同抗原的抗抗獨特型抗體(即第三抗體)。具體地說，在一個優(yōu)選實施方案中，通過缺失構(gòu)架序列和位于特異性識別所述抗原的CDR序列C端的CDR序列，可以增強(qiáng)所述免疫球蛋白分子的獨特型的抗原性。為了確定哪些CDR序列結(jié)合所述抗原，可以用本領(lǐng)域已知的任何結(jié)合測定方法，將含所述CDR序列的合成肽用于與所述抗原的結(jié)合測定中。
本發(fā)明提供抗體片段，例如但不限于F(ab’)2片段和Fab片段。識別特定表位的抗體片段可以用已知技術(shù)來產(chǎn)生。F(ab’)2片段由可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)和重鏈的CH1區(qū)組成，通過胃蛋白酶消化所述抗體分子產(chǎn)生F(ab’)2片段。通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生Fab片段。本發(fā)明也提供本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈的二聚體、或其任何最小片段，例如Fv或單鏈抗體(SCA)(參見，如以下文獻(xiàn)中所述美國專利4,946,778；Bird，1988，Science 242423-42；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；和Ward等，1989，Nature 334544-54)，或具有與本發(fā)明抗體相同特異性的任何其它分子。通過將Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段通過一個氨基酸橋連接產(chǎn)生單鏈多肽，形成單鏈抗體?？梢允褂迷诖竽c桿菌(E.coli)中裝配功能Fv片段的技術(shù)(Skerra等，1988，Science 2421038-1041)。
在其它實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明免疫球蛋白的融合蛋白(或其功能活性片段)，例如其中所述免疫球蛋白通過一個共價鍵(例如肽鍵)融合于另一種非免疫球蛋白的蛋白(或其部分，最好是所述蛋白的至少10個、20個或50個氨基酸的部分)的氨基酸序列的或者N末端或者C末端。所述免疫球蛋白或其片段最好在恒定區(qū)的N末端共價連接于所述其它蛋白。如上所述，這類融合蛋白可以有利于純化，增加體內(nèi)半壽期并且增強(qiáng)抗原穿越表皮屏障傳遞至免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明的免疫球蛋白包括或者經(jīng)修飾(即通過共價連接任何類型的分子，只要這種共價連接不損害免疫特異性結(jié)合)的類似物和衍生物。例如但不作為限制，所述免疫球蛋白的衍生物和類似物包括例如通過糖基化、乙?；EG化、磷酸化、酰胺化、用已知保護(hù)基/封閉基團(tuán)衍生化、蛋白酶剪切、與細(xì)胞配體或其它蛋白連接等進(jìn)行進(jìn)一步修飾的衍生物和類似物。許多化學(xué)修飾中的任一種都可以用已知技術(shù)來進(jìn)行，所述已知技術(shù)包括但不限于特異性化學(xué)切割、乙酰化、甲酰化等。另外，所述類似物或衍生物可以含有一個或多個非典型氨基酸。
上述抗體可以用于本領(lǐng)域已知的涉及本發(fā)明BCMP定位和活性的方法中，例如使這些蛋白成像、測量其在合適生理樣品中的水平，用于診斷方法中等?？贵w的表達(dá)
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域用于合成抗體已知的任何方法尤其是通過化學(xué)合成或重組表達(dá)來生產(chǎn)，最好通過重組表達(dá)技術(shù)來生產(chǎn)。
抗體、或其片段、衍生物或類似物的重組表達(dá)需要構(gòu)建編碼所述抗體的核酸。如果所述抗體的核苷酸序列是已知的，則可以由化學(xué)合成的寡核苷酸(例如如Kutmeier等，1994，BioTechniques 17242中所述)來裝配編碼所述抗體的核酸，簡而言之，這包括合成含有抗體編碼序列的部分的重疊寡核苷酸，使那些寡核苷酸退火和連接，然后通過PCR擴(kuò)增所連接的寡核苷酸。
或者，可以通過克隆所述抗體，獲得編碼所述抗體的核酸。如果含有編碼所述特定抗體的核酸的克隆不能獲得，但已知所述抗體分子的序列，則采用可與所述序列的3’端和5’端雜交的合成引物，從合適的來源(例如抗體cDNA文庫，或由表達(dá)所述抗體的任何組織或細(xì)胞中產(chǎn)生cDNA文庫)通過PCR擴(kuò)增，或者用對所述特定基因序列特異性的寡核苷酸探針通過克隆，可以獲得編碼所述抗體的核酸。
如果特異性識別特定抗原的抗體分子(或者用于克隆編碼這種抗體的核酸的cDNA文庫的來源)不能獲得，則可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法產(chǎn)生對特定抗原特異性的抗體，例如通過免疫動物(例如兔子)產(chǎn)生多克隆抗體，或者更優(yōu)選通過產(chǎn)生單克隆抗體?；蛘?，通過在Fab表達(dá)文庫(例如如Huse等，1989，Science 2461275-1281中所述)中篩選結(jié)合所述特定抗原的Fab片段的克隆，或者通過篩選抗體文庫(參見例如Clackson等，1991，Nature 352624；Hane等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 944937)，可以獲得編碼所述抗體的至少Fab部分的克隆。
一旦獲得編碼所述抗體分子的至少可變區(qū)的核酸后，則可以將其引入含有編碼所述抗體分子恒定區(qū)的核苷酸序列的載體中(參見例如PCT公開說明書WO 86/05807；PCT公開說明書WO 89/01036；和美國專利第5,122,464號)。也可得到含有所述完整輕鏈或重鏈以供與所述核酸共表達(dá)、以允許表達(dá)完整抗體分子的載體。然后，編碼所述抗體的核酸可以用來引入用不含巰基的任何氨基酸殘基取代(或缺失)參與鏈內(nèi)二硫鍵的一個或多個可變區(qū)半胱氨酸殘基所必需的核苷酸取代或缺失。這類修飾可以通過用于在核苷酸序列中引入特定突變或缺失的本領(lǐng)域已知的任何方法來進(jìn)行，所述方法例如但不限于化學(xué)誘變、體外定點誘變(Hutchinson等，1978，J.Biol.Chem.2536551)、基于PCR的方法等。
另外，可以使用開發(fā)用于產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81851-855；Neubeger等，1984，Nature312604-608；Takeda等，1985，Nature 314452-454)，所述技術(shù)包括將得自小鼠的具有合適抗原特異性的抗體分子的基因與得自人類的具有合適生物活性的抗體分子的基因剪接在一起。正如上文所述，嵌合抗體是一種其中不同部分來源于不同動物種的分子，例如具有來源于鼠mAb的可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)的抗體，例如人源化抗體。
一旦獲得編碼本發(fā)明抗體分子的核酸后，則可以采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生可供用于生產(chǎn)所述抗體分子的載體。因此，本文描述了用于通過表達(dá)含有所述抗體分子序列的核酸制備本發(fā)明蛋白的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可以用來構(gòu)建含有抗體分子編碼序列和合適轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。參見例如在Sambrook等(1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)和Ausubel等(編著，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY)中描述的技術(shù)。
通過常規(guī)技術(shù)將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，然后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。
用來表達(dá)本發(fā)明重組抗體的宿主細(xì)胞可以或者是細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌，或者最好是真核細(xì)胞，尤其是對于表達(dá)完整的重組抗體分子而言。特別是，哺乳動物細(xì)胞例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)與載體例如來自人巨細(xì)胞病毒的主要立即早期基因啟動子元件是一個抗體的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等，1986，Gene 45101；Cockett等，1990，Bio/Technology 82)。
可以使用多種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明的抗體分子。這類宿主-表達(dá)系統(tǒng)代表可以用來生產(chǎn)并隨后純化目的編碼序列的載體，但也代表當(dāng)用所述合適核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后可以原位表達(dá)本發(fā)明抗體分子的細(xì)胞。這些包括但不限于微生物，例如用含有抗體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如大腸桿菌、枯草桿菌(B.subtilis))；用含有抗體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia))；用含有所述抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用含有抗體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒CaMV；煙草花葉病毒TMV)感染或用含有抗體編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或帶有含來源于哺乳動物細(xì)胞基因組的啟動子(例如金屬硫蛋白啟動子)或得自哺乳動物病毒基因組的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子；痘苗病毒7.5K啟動子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3細(xì)胞)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)所表達(dá)抗體分子的計劃用途，可以有利地對多種表達(dá)載體進(jìn)行選擇。例如，當(dāng)需生產(chǎn)大量的這種蛋白以供生產(chǎn)包含抗體分子的藥用組合物時，可能理想的是指導(dǎo)高水平的易純化的融合蛋白產(chǎn)物表達(dá)的載體。這類載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO J.21791)，其中可以將所述抗體編碼序列單獨連接到載體中，并且與lac Z編碼區(qū)符合讀框，使得產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye和Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109；Van Heeke和Schuster，1989，J.Biol.Chem.245503-5509)等。pGEX載體也可以用來表達(dá)作為具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般而言，這類融合蛋白是可溶性的，可以通過吸附和與基質(zhì)谷胱甘肽-瓊脂糖微珠結(jié)合，然后通過在游離谷胱甘肽存在下洗脫，容易地從裂解細(xì)胞中純化。設(shè)計pGEX載體，使其包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點，使得可以從GST部分釋放出所克隆的靶基因產(chǎn)物。
在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)用作表達(dá)外源基因的載體。所述病毒在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中生長。所述抗體編碼序列可以單獨克隆到該病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)中，并置于AcNPV啟動子(例如多角體蛋白啟動子)的控制之下。在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以利用多種基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)(例如腺病毒表達(dá)系統(tǒng))。
如上所述，可以選擇調(diào)節(jié)所插入序列表達(dá)或者以所需特定方式修飾和加工所述基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白產(chǎn)物的這類修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可能對于所述蛋白的功能是重要的。
對于重組抗體長期高產(chǎn)量的生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可以如下產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)目的抗體的細(xì)胞系用含有目的抗體的核苷酸序列和選擇標(biāo)記(例如新霉素或潮霉素)的核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，并根據(jù)所述選擇標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行選擇。這類工程細(xì)胞系可能在與所述抗體分子直接或間接相互作用的化合物的篩選和評價方面特別有用。
所述抗體分子的表達(dá)水平可以通過載體擴(kuò)增來提高(有關(guān)綜述，參見Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplificationfor the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，第3卷(Academic Press，New York，1987))。當(dāng)表達(dá)抗體的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記可擴(kuò)增時，宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的抑制劑水平的增加，將增加所述標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。由于所述擴(kuò)增的區(qū)與所述抗體基因相連，所以所述抗體的產(chǎn)生也將增加(Crouse等，1983，Mol.Cell.Biol.3257)。
可以用兩種本發(fā)明表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞，第一種載體編碼重鏈來源的多肽，而第二種載體編碼輕鏈來源的多肽。所述兩種載體可以含有相同的選擇標(biāo)記，所述選擇標(biāo)記能夠使重鏈多肽和輕鏈多肽的表達(dá)相等?；蛘?，可以使用單一載體，所述載體既編碼重鏈多肽，也編碼輕鏈多肽。在這種情況下，輕鏈應(yīng)該置于重鏈之前，以避免有毒性的游離重鏈過量(Proudfoot，1986，Nature 32252；Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可以包括cDNA或基因組DNA。
一旦重組表達(dá)了本發(fā)明的抗體分子，則可以通過用于純化抗體分子的本領(lǐng)域已知的任何方法來純化，所述方法例如通過色譜(例如離子交換色譜、親和色譜如具有A蛋白或特定抗原的親和色譜以及大小柱色譜)、離心、差別溶解性、或通過用于蛋白質(zhì)純化的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化。
或者，通過利用對所表達(dá)的融合蛋白特異性的抗體，可以容易地純化任何融合蛋白。例如，Janknecht等所述的系統(tǒng)，可供用于在人細(xì)胞系中表達(dá)的非變性融合蛋白的快速純化(Janknecht等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888972-897)。在這種系統(tǒng)中，將目的基因亞克隆到痘苗病毒重組質(zhì)粒(vaccinia recombination plasmid)中，使得所述基因的可讀框在轉(zhuǎn)錄上與由6個組氨酸殘基組成的氨基末端標(biāo)志融合。所述標(biāo)志用作所述融合蛋白的基質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。將得自用重組痘苗病毒感染的細(xì)胞的提取物，上樣到Ni2+氮川乙酸-瓊脂糖柱上，用含咪唑的緩沖液選擇性地洗脫含組氨酸標(biāo)志的蛋白。綴合抗體
在一個優(yōu)選實施方案中，抗BCMP抗體或其片段與一個診斷或治療部分綴合。所述抗體可以用于診斷或給定治療方案療效的測定。通過將所述抗體與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)，可以有利于檢測?？蓹z測物質(zhì)的實例包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性核素、發(fā)射正電子的金屬(用于正電子發(fā)射斷層掃描)和非放射性順磁性金屬離子。有關(guān)可以與抗體綴合用作按照本發(fā)明的診斷劑的金屬離子，一般參見美國專利第4,741,900號。合適的酶包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基包括鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合適的熒光物質(zhì)包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯和藻紅蛋白；合適的發(fā)光物質(zhì)包括魯米諾；合適的生物發(fā)光物質(zhì)包括熒光素酶、熒光素和水母發(fā)光蛋白；合適的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。
抗BCMP抗體或其片段可以與治療藥或藥物部分綴合，以改變給定生物應(yīng)答。所述治療藥或藥物部分不應(yīng)解釋為限于典型的化學(xué)治療藥。例如，所述藥物部分可以是一種具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這類蛋白可以包括例如毒素，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物、血栓形成劑(thrombotic agent)或抗血管生成劑例如制管張素或endostatin；或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物，例如淋巴因子、白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF)或其它生長因子。
用于將這類治療部分與抗體綴合的技術(shù)是眾所周知的，參見例如Arnon等，“用于癌癥治療中藥物的免疫靶向的單克隆抗體”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(編著)，第243-56頁(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“用于給藥的抗體”ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等(編著)，第623-53頁(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌癥治療中細(xì)胞毒性劑的抗體載體綜述”，Monoclonal Antibodies‘84Biological And Clinical Applications，Pinchera等(編著)，第475-506頁(1985)；“放射性標(biāo)記抗體在癌癥治療中的治療應(yīng)用的分析、結(jié)果和未來前景”，Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin等(編著)，第303-16頁(Academic Press1985)，和Thorpe等，“抗體-毒素綴合物的制備和細(xì)胞毒性特性”，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。
或者，可以將抗體與第二抗體綴合，形成抗體異源綴合物，如Segal在美國專利第4,676,980號中所述。
具有或不具有與其綴合的治療部分的抗體，可以用作單獨給予或與細(xì)胞毒性因子和/或細(xì)胞因子聯(lián)合給予的治療劑。乳腺癌的診斷
按照本發(fā)明，得自懷疑患有或已知患有乳腺癌的受治療者的乳腺組織、血清、血漿或尿試驗樣品，可以用于診斷或監(jiān)測。在一個實施方案中，與對照樣品(得自一個或多個無乳腺癌的受治療者)或預(yù)先確定的參比范圍相比，試驗樣品中一種或多種BCMP豐度的改變指示存在乳腺癌；正如以上詳述的，在表1和表2中鑒定了適用于此目的的BCMP。在另一實施方案中，與對照樣品或預(yù)先確定的參比范圍相比，試驗樣品中一種或多種BCMP的相對豐度指示存在一種亞型的乳腺癌(例如家族性或散發(fā)性乳腺癌)。在再一實施方案中，與對照樣品或預(yù)先確定的參比范圍相比，試驗樣品中一種或多種BCMP的相對豐度指示乳腺癌的嚴(yán)重程度(例如轉(zhuǎn)移的可能性)。在任一上述方法中，本文表1和表2中所述的一種或多種BCMP的檢測可以任選地與以上表3中鑒定的一種或多種BCMP和/或其它乳腺癌生物標(biāo)記的檢測相結(jié)合。本領(lǐng)域中的任何合適方法都可以用來測定BCMP的水平，包括但不限于本文所述的the Preferred Technology、激酶測定、檢測和/或顯現(xiàn)所述BCMP的免疫測定(例如蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀后接十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細(xì)胞化學(xué)等)。在BCMP具有已知功能時，可以使用針對該功能的測定來測量BCMP的表達(dá)。在再一實施方案中，與對照樣品或預(yù)先確定的參比范圍相比，試驗樣品中表1和表2所鑒定的編碼一種或多種BCMP的mRNA的豐度的改變指示存在乳腺癌。任何合適的雜交測定都可以用來通過檢測和/或顯現(xiàn)編碼所述BCMP的mRNA來測定BCMP的表達(dá)(例如RNA印跡分析、斑點印跡法、原位雜交等)。任選的是，也可以檢測以上表3中鑒定的一種或多種BCMP。
在本發(fā)明的另一實施方案中，與BCMP特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體、其衍生物和類似物可以用于診斷目的，以檢測、診斷或監(jiān)測乳腺癌。最好是，在動物中、更優(yōu)選在哺乳動物中、最優(yōu)選在人類中檢測乳腺癌。篩選測定
本發(fā)明提供與BCMP結(jié)合或?qū)CMP的表達(dá)或活性具有刺激或抑制效應(yīng)的因子(例如候選化合物或試驗化合物)的鑒定方法。本發(fā)明也提供與BCMP相關(guān)多肽或BCMP融合蛋白結(jié)合或?qū)CMP相關(guān)多肽或BCMP融合蛋白的表達(dá)或活性具有刺激或抑制效應(yīng)的因子、候選化合物或試驗化合物的鑒定方法。因子、候選化合物或試驗化合物的實例包括但不限于核酸(例如DNA和RNA)、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、小分子和其它藥物?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域已知的組合文庫法方法的多種方法中的任一種獲得因子，所述文庫法包括生物學(xué)文庫；空間可尋址平行固相或溶液相文庫；需要去卷積(deconvolution)的合成文庫法；“一微珠一化合物”文庫法；和利用親和色譜選擇的合成文庫法。所述生物學(xué)文庫法限于肽文庫，而其它四種方法適用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(Lam，1997，Anticancer Drug Des.12145；美國專利第5,738,996號和美國專利第5,807,683號，每個所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。
分子文庫合成方法的實例可以在本領(lǐng)域中找到，例如DeWitt等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906909；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422；Zuckermann等，1994，J.Med.Chem.372678；Cho等，1993，Science 2611303；Carrell等，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332059；Carell等，1994，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.332061；和Gallop等，1994，J.Med Chem.371233，每個文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
化合物文庫可以存在，例如存在于溶液中(例如Houghten，1992，Bio/Techniques 13412-421)或存在于微珠上(Lam，1991，Nature 35482-84)、芯片(Fodor，1993，Nature 364555-556)、細(xì)菌(美國專利第5,223,409號)、孢子(spore)(專利第5,571,698號；第5,403,484號；和第5,223,409號)、質(zhì)粒(Cull等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891865-1869)或噬菌體(Scott和Smith，1990，Science 249386-390；Devlin，1990，Science249404-406；Cwirla等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 876378-6382；和Felici，1991，J.Mol.Biol.222301-3 10)，每個文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
在一個實施方案中，在一個基于細(xì)胞的測定系統(tǒng)中，鑒定與BC、BCMP的片段(例如功能活性片段)、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段或BCMP融合蛋白相互作用(即與其結(jié)合)的因子。按照該實施方案，使表達(dá)BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白的細(xì)胞與候選化合物或?qū)φ栈衔锝佑|，測定所述候選化合物與所述BCMP相互作用的能力。如果需要，這種測定可以用來篩選多種候選化合物(例如文庫)。所述細(xì)胞例如可以來源于原核生物(例如大腸桿菌)或者來源于真核生物(例如酵母或哺乳動物)。此外，所述細(xì)胞可以是內(nèi)源表達(dá)所述BCMP、所述BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽、所述BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白，或者可以對所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，以表達(dá)所述BCMP、所述BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽、所述BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白。在某些情況下，可以用放射性標(biāo)記(例如32P、35S和125I)或熒光標(biāo)記(例如異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二醛或熒光胺)，標(biāo)記所述BCMP、所述BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽、所述BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白或所述候選化合物，使得可以檢測BCMP和候選化合物之間的相互作用。所述候選化合物與BCMP、BCMP的片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白直接或間接相互作用的能力，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測定。例如，候選化合物和BCMP、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白之間的相互作用，可以通過流式細(xì)胞術(shù)、閃爍測定、免疫沉淀或蛋白質(zhì)印跡分析來測定。
在另一實施方案中，在一個無細(xì)胞測定系統(tǒng)中，鑒定與BCMP、BCMP的片段(例如功能活性片段)、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段或BCMP融合蛋白相互作用(即與其結(jié)合)的因子。按照該實施方案，使天然或重組BCMP或其片段、或天然或重組BCMP相關(guān)多肽或其片段、或BCMP融合蛋白或其片段與候選化合物或?qū)φ栈衔锝佑|，測定所述候選化合物與所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽或BCMP融合蛋白相互作用的能力。如果需要，這種測定可以用來篩選多種候選化合物(例如文庫)。最好是首先例如通過使所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白與特異性識別其并與其結(jié)合的固定化抗體接觸，或者通過使所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白的純化制劑與設(shè)計用以結(jié)合蛋白質(zhì)的表面接觸，將所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白固定化?？梢詫⑺鯞CMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白部分或完全純化(例如部分或完全不含其它多肽)，或者它們是細(xì)胞裂解液的部分。此外，所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽的片段可以是包含所述BCMP或者其生物活性部分或BCMP相關(guān)多肽和一個結(jié)構(gòu)域例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白?；蛘?，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)(例如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals；Rockford，IL)，將所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白生物素化。所述候選化合物與BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白相互作用的能力，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定。
在另一實施方案中，用一種基于細(xì)胞的測定系統(tǒng)來鑒定與負(fù)責(zé)BCMP的產(chǎn)生或降解或者負(fù)責(zé)BCMP的翻譯后修飾的蛋白(例如酶)或其生物活性部分結(jié)合或者調(diào)節(jié)其活性的因子。在初次篩選中，使多種化合物(例如文庫)與天然表達(dá)或重組表達(dá)以下BCMP的細(xì)胞接觸(i)BCMP、BCMP同種型、BCMP同系物、BCMP相關(guān)多肽、BCMP融合蛋白或任何上述BCMP的生物活性片段；和(ii)負(fù)責(zé)加工所述BCMP、BCMP同種型、BCMP同系物、BCMP相關(guān)多肽、BCMP融合蛋白或它們的片段的蛋白質(zhì)，以鑒定調(diào)節(jié)所述BCMP、BCMP同種型、BCMP同系物、BCMP相關(guān)多肽、BCMP融合蛋白或它們的片段的產(chǎn)生、降解或翻譯后修飾的化合物。如果需要，可以在第二次篩選中，針對天然表達(dá)或重組表達(dá)所述特定目的BCMP的細(xì)胞，分析在所述初次篩選中鑒定的化合物。所述候選化合物調(diào)節(jié)BCMP、同種型、同系物、BCMP相關(guān)多肽或BCMP融合蛋白的產(chǎn)生、降解或翻譯后修飾的能力，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定，所述方法包括但不限于流式細(xì)胞術(shù)、閃爍測定、免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡法。
在另一實施方案中，在一種競爭性結(jié)合測定中，鑒定與BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段或BCMP融合蛋白競爭性相互作用(即與其結(jié)合)的因子。按照該實施方案，使表達(dá)BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽的片段或BCMP融合蛋白的細(xì)胞與候選化合物或已知與所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段或BCMP融合蛋白相互作用的化合物接觸；然后測定所述候選化合物與所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段或BCMP融合蛋白優(yōu)先相互作用的能力?；蛘?，在一個無細(xì)胞測定系統(tǒng)中，通過使BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段或BCMP融合蛋白與候選化合物和已知與所述BCMP、BCMP相關(guān)多肽或BCMP融合蛋白相互作用的化合物接觸，鑒定優(yōu)先與所述BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽、BCMP相關(guān)多肽片段或BCMP融合蛋白相互作用(即與其結(jié)合)的因子。如上所述，所述候選化合物與BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽片段相互作用的能力，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定。這些測定無論是基于細(xì)胞的測定，還是無細(xì)胞測定，都可以用來篩選多種候選化合物(例如一種文庫)。
在另一實施方案中，通過使表達(dá)BCMP或BCMP相關(guān)多肽的細(xì)胞(例如原核來源或真核來源的細(xì)胞)與候選化合物或?qū)φ栈衔?即磷酸緩沖鹽溶液(PBS))接觸，并且測定所述BCMP、BCMP相關(guān)多肽或BCMP融合蛋白、編碼所述BCMP的mRNA或編碼所述BCMP相關(guān)多肽的mRNA的表達(dá)，鑒定調(diào)節(jié)(即正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié))所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽表達(dá)或活性的因子。將在存在所述候選化合物情況下選定的BCMP、BCMP相關(guān)多肽、編碼所述BCMP的mRNA或編碼所述BCMP相關(guān)多肽的mRNA的表達(dá)水平與在缺乏所述候選化合物的情況下(例如在存在對照化合物時)所述BCMP、BCMP相關(guān)多肽、編碼所述BCMP的mRNA或編碼所述BCMP相關(guān)多肽的mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行比較。則根據(jù)這種比較，所述候選化合物被鑒定為所述BCMP或所述BCMP相關(guān)多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。例如，所述BCMP或mRNA在存在所述候選化合物時的表達(dá)顯著高于無所述候選化合物時的表達(dá)，則所述候選化合物被鑒定為所述BCMP或mRNA表達(dá)的刺激物?；蛘撸?dāng)所述BCMP或mRNA在存在所述候選化合物時的表達(dá)顯著低于無所述候選化合物時的表達(dá)，則所述候選化合物被鑒定為所述BCMP或mRNA表達(dá)的抑制劑。BCMP或編碼其的mRNA的表達(dá)水平，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測定。例如，mRNA的表達(dá)可以通過RNA印跡分析或RT-PCR來評價，而蛋白水平可以通過蛋白質(zhì)印跡分析來評價。
在另一實施方案中，通過使含有BCMP或BCMP相關(guān)多肽的制劑或表達(dá)所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽的細(xì)胞(例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞)與試驗化合物或?qū)φ栈衔锝佑|，并且測定所述試驗化合物調(diào)節(jié)(例如刺激或抑制)所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽的活性的能力，鑒定調(diào)節(jié)所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽活性的因子。通過測定所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(例如胞內(nèi)Ca2+、二?；视?、IP3等)的誘導(dǎo)、測定所述靶對合適底物的催化活性或酶活性、測定報道基因(例如對BCMP或BCMP相關(guān)多肽應(yīng)答并且與編碼可檢測標(biāo)記例如熒光素酶的核酸有效連接的調(diào)節(jié)元件)的誘導(dǎo)、或者測定細(xì)胞應(yīng)答例如細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖，可以評價所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽的活性。根據(jù)本發(fā)明的描述，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來測量這些活性(參見例如美國專利第5,401,639號，其通過引用結(jié)合到本文中)。然后，通過將所述候選化合物的效應(yīng)與對照化合物的效應(yīng)進(jìn)行比較，將這些候選化合物鑒定為BCMP或BCMP相關(guān)多肽活性的調(diào)節(jié)劑。合適的對照化合物包括磷酸緩沖鹽溶液(PBS)和生理鹽水(NS)。
在另一實施方案中，在動物模型中鑒定調(diào)節(jié)(即正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié))BCMP或BCMP相關(guān)多肽的表達(dá)、活性或者表達(dá)和活性兩者的因子。合適動物的實例包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、猴、豚鼠、犬和貓。所用的動物最好代表一種乳腺癌模型(例如人乳腺癌細(xì)胞系例如MDA-MB-345在缺乏雌激素的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中的異種移植物，Eccles等，1994 Cell Biophysics 24/25，279)。這些可以用來測試調(diào)節(jié)BCMP水平的化合物，因為在這些模型中表現(xiàn)出的病狀與乳腺癌的病狀相似。按照該實施方案，將所述試驗化合物或?qū)φ栈衔锝o予(例如口服、直腸或胃腸外給予，例如腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給予)合適的動物，并測定對所述BCMP或BCMP相關(guān)多肽的表達(dá)、活性或者表達(dá)和活性兩者的影響。可以通過以上概述的方法，評價BCMP或BCMP相關(guān)多肽表達(dá)的改變。
在又一實施方案中，在雙雜種測定或三雜種測定中，BCMP或BCMP相關(guān)多肽用作“餌蛋白”，以鑒定與BCMP或BCMP相關(guān)多肽結(jié)合或相互作用的其它蛋白(參見例如美國專利第5,283,317號；Zervos等(1993)Cell 72223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等(1993)Bio/Techniques 14920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 81693-1696；和PCT公開說明書WO 94/10300)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到的，這類結(jié)合蛋白也可能作為例如涉及本發(fā)明BCMP的信號途徑的上游或下游元件參與本發(fā)明BCMP的信號傳播。
本發(fā)明還提供通過上述篩選測定鑒定的新型因子及其在本文所述治療方法的用途。另外，本發(fā)明也提供與一種或多種本發(fā)明BCMP相互作用或調(diào)節(jié)其活性的因子在乳腺癌治療藥物生產(chǎn)方面的用途。BCMP的治療用途
本發(fā)明可供用于通過給予治療化合物治療或預(yù)防各種疾病和障礙。這類化合物包括但不限于BCMP、BCMP類似物、BCMP相關(guān)多肽和它們的衍生物(包括片段)；針對上述BCMP、BCMP類似物、BCMP相關(guān)多肽和它們的衍生物的抗體；編碼BCMP、BCMP類似物、BCMP相關(guān)多肽和它們的片段的核酸；BCMP或BCMP相關(guān)多肽編碼基因的反義核酸；和BCMP或BCMP相關(guān)多肽編碼基因的調(diào)節(jié)劑(例如激動劑和拮抗劑)。本發(fā)明的一個重要特征是鑒定涉及乳腺癌的BCMP編碼基因。通過給予一種提升患乳腺癌受治療者的乳腺組織中被降低的一種或多種BCMP的功能或表達(dá)的治療化合物，或者通過給予降低患乳腺癌受治療者的乳腺組織中被增加的一種或多種BCMP的功能或表達(dá)的治療化合物，可以治療(例如緩解癥狀或延遲發(fā)作或發(fā)展)或預(yù)防乳腺癌。
在一個實施方案中，單獨給予或者與一種或多種其它治療化合物或療法聯(lián)合給予分別與一種BCMP特異性結(jié)合的一種或多種抗體。這類治療化合物或療法的實例包括但不限于紫杉酚、環(huán)磷酰胺、他莫昔芬和多柔比星。
最好是，生物產(chǎn)物例如抗體對于接受給藥的受治療者而言是同種異體的(allogeneic)。在一個優(yōu)選實施方案中，將人BCMP或人BCMP相關(guān)多肽、編碼人BCMP或人BCMP相關(guān)多肽的核苷酸序列、或針對人BCMP或人BCMP相關(guān)多肽的抗體給予人類受治療者以用于治療(例如緩解癥狀或延遲發(fā)作或發(fā)展)或預(yù)防。乳腺癌的治療和預(yù)防
通過給予懷疑或已知患有乳腺癌或者有發(fā)生乳腺癌危險的受治療者一種調(diào)節(jié)(即提高或降低)在患乳腺癌受治療者的乳腺組織中相對于無乳腺癌受治療者乳腺組織而言差別存在的一種或多種BCMP水平或活性(即功能)的化合物，治療或預(yù)防乳腺癌。在一個實施方案中，通過給予懷疑或已知患有乳腺癌或者有發(fā)生乳腺癌危險的受治療者一種正調(diào)節(jié)(即提高)在患乳腺癌受治療者的乳腺組織中被降低的一種或多種BCMP水平或活性(即功能)的化合物，治療或預(yù)防乳腺癌。在另一實施方案中，給予負(fù)調(diào)節(jié)在患乳腺癌受治療者的乳腺組織中被增加的一種或多種BCMP水平或活性(即功能)的化合物。這種化合物的實例包括但不限于BCMP、BCMP片段和BCMP相關(guān)多肽；編碼BCMP、BCMP片段和BCMP相關(guān)多肽的核酸(例如用于基因治療)；具有酶活性的那些BCMP或BCMP相關(guān)多肽、已知調(diào)節(jié)該酶活性的化合物或分子。可以用體外測定，鑒定可以使用的其它化合物例如BCMP激動劑。
通過給予懷疑或已知患有乳腺癌或者有發(fā)生乳腺癌危險的受治療者一種負(fù)調(diào)節(jié)在患乳腺癌受治療者的乳腺組織中被增加的一種或多種BCMP水平或活性的化合物，也可治療或預(yù)防乳腺癌。在另一實施方案中，給予正調(diào)節(jié)在患乳腺癌受治療者的乳腺組織中被降低的一種或多種BCMP水平或活性的化合物。這種化合物的實例包括但不限于BCMP反義寡核苷酸、核酶、針對BCMP的抗體以及抑制BCMP酶活性的化合物?？梢杂皿w外測定鑒定其它有用的化合物，例如BCMP拮抗劑和小分子BCMP拮抗劑。
在一個優(yōu)選實施方案中，使治療或預(yù)防適應(yīng)各個受治療者的需要。因此，在具體實施方案中，將提升一種或多種BCMP水平或功能的化合物，治療性或預(yù)防性地給予懷疑或已知患有乳腺癌的、體內(nèi)所述一種或多種BCMP的水平或功能缺乏或相對于對照或正常參比范圍降低的受治療者。在其它實施方案中，將提升一種或多種BCMP水平或功能的化合物，治療性或預(yù)防性地給予懷疑或已知患有乳腺癌的、體內(nèi)所述一種或多種BCMP的水平或功能相對于對照或正常參比范圍增加的受治療者。在其它實施方案中，將降低一種或多種BCMP水平或功能的化合物，治療性或預(yù)防性地給予懷疑或已知患有乳腺癌的、體內(nèi)所述一種或多種BCMP的水平或功能相對于對照或正常參比范圍增加的受治療者。在其它實施方案中，將降低一種或多種BCMP水平或功能的化合物，治療性或預(yù)防性地給予懷疑或已知患有乳腺癌的、體內(nèi)所述一種或多種BCMP的水平或功能相對于對照或正常參比范圍降低的受治療者。例如通過獲得樣品(例如乳腺組織、血液或尿或者組織樣品例如活檢組織樣品)并且體外分析所述BCMP的水平或活性、或者編碼所述BCMP的mRNA的水平、或者上述的任何組合，可以容易地檢測出由于給予這類化合物所致的BCMP功能或水平的改變。這類測定可以在給予本文所述化合物之前和之后進(jìn)行。
本發(fā)明的化合物包括但不限于將所述BCMP分布型朝正常分布型恢復(fù)的任何化合物，例如小有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、肽、抗體、核酸等，條件是這類化合物或治療不包括紫杉酚、環(huán)磷酰胺、他莫昔芬和多柔比星。本發(fā)明的化合物可以與任何其它化合物聯(lián)合給予，所述其它化合物包括紫杉酚、環(huán)磷酰胺、他莫昔芬和多柔比星。疫苗治療
BCMP可用作抗原性物質(zhì)，可以用于生產(chǎn)供乳腺癌治療或預(yù)防用的疫苗。這類物質(zhì)可以是“抗原性”和/或“免疫原性”物質(zhì)。一般而言，“抗原性”是指蛋白質(zhì)能夠用來在受治療者體內(nèi)產(chǎn)生抗體或?qū)嶋H上能夠誘發(fā)抗體應(yīng)答?！懊庖咴浴笔侵杆龅鞍踪|(zhì)能夠在受治療者體內(nèi)引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。因此，在后一種情況下，所述蛋白質(zhì)可能不僅能夠產(chǎn)生抗體應(yīng)答，而且能夠產(chǎn)生基于非抗體的免疫應(yīng)答。
技術(shù)人員會認(rèn)識到，所述BCMP的同系物或衍生物也可用作抗原性/免疫原性物質(zhì)。因此，本發(fā)明包括例如包括一種或多種添加、缺失、取代等的蛋白質(zhì)。另外，一種氨基酸有可能用相似“類型”的另一種氨基酸取代。例如，一種疏水性氨基酸用另一種疏水性氨基酸取代。人們可以使用程序例如CLUSTAL程序來比較氨基酸序列。該程序比較氨基酸序列，通過在任一個序列中適當(dāng)插入空位發(fā)現(xiàn)最佳比對。有可能計算最佳比對的氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸類型的保守)。如BLASTx的程序?qū)ψ铋L的相似序列段進(jìn)行比對，并賦予所述擬合(fit)一個分值。因此，在發(fā)現(xiàn)幾個相似性區(qū)時有可能獲得比較，每個區(qū)具有一個不同的分值。在本發(fā)明中考慮了兩種類型的分析。
在同系物和衍生物的情況下，與本文所述的蛋白質(zhì)的同一性程度的重要性低于所述同系物或衍生物應(yīng)該保留其抗原性和/或免疫原性的重要性。然而，適宜提供與本文所述蛋白或多肽具有至少60％相似性(如上文所討論的)的同系物或衍生物。優(yōu)選提供具有至少70％相似性、更優(yōu)選至少80％相似性的同系物或衍生物。最優(yōu)選提供具有至少90％或甚至95％相似性的同系物或衍生物。
在另一方法中，所述同系物或衍生物可以是融合蛋白，加入使得更易于純化(例如通過有效標(biāo)記所需蛋白或多肽)的部分?？赡鼙匦璩ニ觥皹?biāo)記”，或可能是所述融合蛋白本身保留足夠的有用的抗原性。
眾所周知，有可能篩選出抗原性蛋白或多肽以鑒定表位區(qū)，即負(fù)責(zé)所述蛋白或多肽的抗原性或免疫原性的那些區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可以用來測試片段和/或同系物和/或衍生物的抗原性。因此，本發(fā)明的片段應(yīng)該包括一個或多個這類表位區(qū)或與這類區(qū)足夠相似，以保留其抗原性/免疫原性特性。因此，關(guān)于按照本發(fā)明的片段，同一性的程度也許不重要，因為它們可以與本文所述的一種蛋白或多肽、同系物或衍生物的一個特定部分100％相同。再者，關(guān)鍵的問題是所述片段保留其所來源蛋白的抗原性/免疫原性特性。
對同系物、衍生物和片段而言重要的是，它們具有至少一定程度的其所來源的蛋白或多肽的抗原性/免疫原性。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供BCMP的抗原性/免疫原性片段或其同系物或衍生物。
所述BCMP或其抗原性片段可以單獨提供，或者作為純化或分離的制劑提供。它們可以作為一種或多種其它本發(fā)明蛋白或其抗原性片段的混合物的部分提供。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種抗原組合物，所述抗原組合物包含一種或多種本發(fā)明BCMP和/或一種或多種其抗原性片段。這種組合物可以用于乳腺癌的檢測和/或診斷。
第六方面，本發(fā)明提供一種乳腺癌的檢測和/或診斷方法，所述方法包括
使一種本發(fā)明的抗原性BCMP或其抗原性片段或抗原組合物與受檢樣品接觸；并且
檢測抗乳腺癌抗體的存在。
具體地說，本發(fā)明的蛋白、其抗原性片段或抗原組合物可以用來檢測IgA、IgM或IgG抗體。受檢樣品適宜為生物樣品，例如血液或唾液樣品。
另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明抗原性BCMP、其抗原性片段或抗原組合物在乳腺癌檢測和/或診斷方面的用途。所述檢測和/或診斷最好在體外進(jìn)行。
本發(fā)明的抗原性BCMP、其抗原性片段或抗原組合物可以作為試劑盒提供，以供用于乳腺癌的體外檢測和/或診斷。因此，在再一方面，本發(fā)明提供用于乳腺癌檢測和/或診斷的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的抗原性BCMP、其抗原性片段或抗原組合物。
另外，本發(fā)明的抗原性BCMP、其抗原性片段或抗原組合物可以用來誘發(fā)針對乳腺癌的免疫應(yīng)答。因此，在又一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的抗原性BCMP、其抗原性片段或抗原組合物在藥物中的應(yīng)用。
另一方面，本發(fā)明提供能夠誘發(fā)受治療者體內(nèi)免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含本發(fā)明的BCMP、其抗原性片段或抗原組合物。所述組合物適宜為疫苗組合物，任選包含一種或多種合適的佐劑。這種疫苗組合物可以或者是預(yù)防性或者是治療性疫苗組合物。
本發(fā)明的疫苗組合物可以包括一種或多種佐劑。本領(lǐng)域眾所周知的實例包括無機(jī)凝膠例如氫氧化鋁和油包水乳液例如弗氏不完全佐劑。其它有用的佐劑是技術(shù)人員眾所周知的。
在其它方面，本發(fā)明提供
(a)本發(fā)明BCMP、其抗原性片段或抗原組合物在制備免疫原性組合物(最好是疫苗)方面的用途；
(b)這種免疫原性組合物在誘發(fā)受治療者體內(nèi)免疫應(yīng)答方面的用途；和
(c)治療或預(yù)防受治療者乳腺癌的方法或為受治療者接種抗乳腺癌的疫苗的方法，所述方法包括下述步驟給予所述受治療者有效量的本發(fā)明BCMP、至少一種其抗原性片段或抗原組合物，最好是作為疫苗給予。
在一個具體實施方案中，一種或多種選自表1和表2的BCMP或BCMP肽片段的制劑用作治療乳腺癌的疫苗。這類制劑可以包括佐劑或其它載體。
在另一實施方案中，包含與一種編碼選自表1和表2的一種或多種BCMP或BCMP肽片段的核苷酸序列互補(bǔ)的10個或更多個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸制劑，用作治療乳腺癌的疫苗。這種制劑可以包括佐劑或其它載體?；蛑委?br> 在一個具體實施方案中，給予編碼BCMP、BCMP片段、BCMP相關(guān)多肽或BCMP相關(guān)多肽片段的核酸，以借助基因治療增進(jìn)BCMP功能?；蛑委熓侵附o予受治療者一種已表達(dá)或可表達(dá)核酸。在這一實施方案中，所述核酸產(chǎn)生其編碼的、通過增進(jìn)BCMP功能介導(dǎo)治療效應(yīng)的多肽。
本領(lǐng)域可利用的任何基因治療方法都可以按照本發(fā)明使用。以下描述示例性的方法。
有關(guān)基因治療方法的綜述，參見Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy 12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science260926-932；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；1993年5月，TIBTECH 11(5)155-215?？梢允褂玫闹亟MDNA技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法描述于Ausubel等(編著)，1993，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY；和Kriegler，1990，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。
在一個優(yōu)選方面，所述化合物包含編碼BCMP或其片段或其嵌合蛋白的核酸，所述核酸是在合適宿主中表達(dá)BCMP或其片段或其嵌合蛋白的表達(dá)載體的部分。具體地說，這種核酸具有與所述BCMP編碼區(qū)有效連接的啟動子，所述啟動子是誘導(dǎo)型或組成型(任選地為組織特異性)啟動子。在另一具體實施方案中，使用一種核酸分子，其中所述BCMP編碼序列和任何其它所需序列鄰接啟動在所述基因組中所需位點同源重組的區(qū)域，因而保證所述BCMP核酸的染色體內(nèi)表達(dá)(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342435-438)。
可以直接將所述核酸傳遞至受治療者體內(nèi)，在這種情況下，所述受治療者直接暴露于所述核酸或攜帶核酸的載體；這種方法稱為體內(nèi)基因治療。或者，可以間接地將所述核酸傳遞至所述受治療者體內(nèi)，在這種情況下，首先用所述核酸體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞，然后將細(xì)胞移植到所述受治療者體內(nèi)；這種方法稱為離體基因治療。
在一個具體實施方案中，體內(nèi)直接給予所述核酸，其中所述核酸表達(dá)，產(chǎn)生所編碼的產(chǎn)物。這可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法中任一種來完成，例如通過將其作為合適核酸表達(dá)載體的一部分來構(gòu)建，然后給予所述核酸使其成為胞內(nèi)的，例如通過用缺陷型或減毒反轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒載體感染(參見美國專利第4,980,286號)；通過直接注射裸DNA；通過利用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic，Dupont)；通過包上脂質(zhì)、細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑；通過包囊于脂質(zhì)體、微?；蛭⒛抑校煌ㄟ^給予與已知進(jìn)入細(xì)胞核的肽連接的所述核酸；或通過給予與經(jīng)歷受體介導(dǎo)胞吞的配體連接的所述核酸(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，所述配體可以用來靶向特異性表達(dá)所述受體的靶細(xì)胞。在另一實施方案中，可以形成核酸-配體復(fù)合物，其中所述配體包含病毒融合肽以破壞內(nèi)體，使得所述核酸避免被溶酶體降解。在再一實施方案中，通過靶向特異性受體，可以使所述核酸在體內(nèi)定向，以利于細(xì)胞特異性攝取和表達(dá)(參見例如1992年4月16日公開的PCT公開說明書WO 92/061 80(Wu等)；1992年12月23日公開的WO 92/22635(Wilson等)；1992年11月26日公開的WO92/203 16(Findeis等)；1993年7月22日公開的WO93/14188(Clarke等)；1993年10月14日公開的WO 93/20221(Young))?；蛘撸梢詫⑺龊怂釋?dǎo)入胞內(nèi)，并且通過同源重組摻入到宿主細(xì)胞DNA中以供表達(dá)(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342435-438)。
在一個具體實施方案中，使用含有編碼BCMP的核酸的病毒載體。例如，可以使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見Miller等，1993，Meth.Enzymol.217581-599)。這些反轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)過修飾，缺失了對于病毒基因組包裝和整合到宿主細(xì)胞DNA中非必需的反轉(zhuǎn)錄病毒序列。將待用于基因治療的編碼所述BCMP的核酸克隆到所述載體中，這有助于將所述基因傳遞到受治療者體內(nèi)。有關(guān)反轉(zhuǎn)錄病毒載體的更詳細(xì)的細(xì)節(jié)可以在Boesen等，1994，Biotheray6291-302中找到，所述文獻(xiàn)描述了應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體將mdr1基因傳遞到造血干細(xì)胞中，以便使所述干細(xì)胞更抗化學(xué)治療。描述在基因治療中應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的其它參考文獻(xiàn)是Clowes等，1994，J.Clin.Invest.93644-651；Kiem等，1994，Blood 831467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy4129-141；和Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3110-114。
腺病毒是可以用于基因治療的其它病毒載體。對于將基因傳遞至呼吸上皮而言，腺病毒是尤其有吸引力的載體。腺病毒正常感染呼吸道上皮，在此它們引起輕度疾病?；谙俨《镜膫鬟f系統(tǒng)的其它靶是肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉。腺病毒的優(yōu)點是能夠感染非分裂細(xì)胞。Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinoin in Genetics andDevelopment 3499-503對基于腺病毒的基因治療進(jìn)行了綜述。Bout等，1994，Human Gene Therapy 53-10證明了應(yīng)用腺病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至獼猴呼吸上皮。在基因治療中應(yīng)用腺病毒的其它例子可以在以下文獻(xiàn)中找到Rosenfeld等，1991，Science 252431-434；Rosenfeld等，1992，Cell 68143-155；Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91225-234；PCT公開說明書WO94/12649；和Wang等，1995，Gene Therapy 2775-783。
已經(jīng)提出將腺伴隨病毒(AAV)用于基因治療(Walsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204289-300；美國專利第5,436,146號)。
基因治療的另一方法涉及通過例如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染的方法將基因轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)物的細(xì)胞中。通常，所述轉(zhuǎn)移方法包括將選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。然后將所述細(xì)胞置于選擇之下，以分離攝入并表達(dá)所轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞。然后將那些細(xì)胞給予受治療者。
在該實施方案中，將所述核酸引入細(xì)胞中，然后體內(nèi)給予所產(chǎn)生的重組細(xì)胞。這類引入可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、用含所述核酸序列的病毒載體或噬菌體載體感染、細(xì)胞融合、染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、原生質(zhì)球融合等。用于將外源基因?qū)爰?xì)胞的許多技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217599-618；Cohen等，1993，Meth.Enzymol.217618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.2969-92)，并且可以按照本發(fā)明使用，條件是不破壞受體細(xì)胞必需的發(fā)育功能和生理功能。所述技術(shù)應(yīng)該保證將所述核酸穩(wěn)定地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，使得所述核酸被所述細(xì)胞表達(dá)，并且最好是可遺傳的且可為其細(xì)胞子代表達(dá)。
可以將所產(chǎn)生的重組細(xì)胞通過本領(lǐng)域已知的各種方法傳遞給受治療者。在一個優(yōu)選實施方案中，例如皮下注射上皮細(xì)胞。在另一實施方案中，重組皮膚細(xì)胞可以作為皮膚移植物應(yīng)用于所述受治療者。最好靜脈內(nèi)給予重組血細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞)。設(shè)想使用的細(xì)胞量取決于所需的效應(yīng)、受治療者的病癥等，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。
可以導(dǎo)入核酸以用于基因治療的細(xì)胞包括任何所需的、可得到的細(xì)胞類型，包括但不限于神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(例如少突膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞)、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞；血細(xì)胞，例如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞；各種干細(xì)胞或祖細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如得自骨髓、臍帶血、外周血或胎肝的干細(xì)胞或祖細(xì)胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，用于基因治療的細(xì)胞是所治療的受治療者的自體細(xì)胞。
在一個將重組細(xì)胞用于基因治療的實施方案中，將編碼BCMP的核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，使得所述核酸可被所述細(xì)胞或其子代表達(dá)，然后體內(nèi)給予重組細(xì)胞以實施治療。在一個具體實施方案中，使用干細(xì)胞或祖細(xì)胞?？梢苑蛛x并且體外保持的任何干細(xì)胞或祖細(xì)胞都可以按照本發(fā)明的該實施方案使用(參見例如1994年4月28日公開的PCT公開說明書WO 94/08598；Stemple和Anderson，1992，Cell 71973-985；Rheinwald，1980，Meth.Cell Bio.21A229；和Pittelkow和Scott，1986，Mayo Clinic Proc.61771)。
在一個具體實施方案中，待導(dǎo)入以用于基因治療的核酸包含與所述編碼區(qū)有效連接的誘導(dǎo)型啟動子，使得所述核酸的表達(dá)可通過控制轉(zhuǎn)錄的合適誘導(dǎo)物的存在與否來控制。
直接注射編碼BCMP的DNA也可以按照例如美國專利第5,589,466號中所述的技術(shù)來進(jìn)行。這些技術(shù)涉及注射“裸DNA”，即無脂質(zhì)體、細(xì)胞或除合適載體外的任何其它物質(zhì)情況下的分離的DNA分子。注射編碼蛋白質(zhì)并與合適啟動子有效連接的DNA，導(dǎo)致在注射部位附近的細(xì)胞中產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)，并且引發(fā)受治療者體內(nèi)針對所注射DNA編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。在一個優(yōu)選實施方案中，將包含(a)編碼BCMP的DNA和(b)啟動子的裸DNA注射到受治療者體內(nèi)，以誘發(fā)針對所述BCMP的免疫應(yīng)答。抑制BCMP以治療乳腺癌
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過給予一種拮抗(抑制)在患乳腺癌受治療者的乳腺組織中與無乳腺癌受治療者的乳腺組織相比被增加的一種或多種BCMP水平和/或功能的化合物，治療或預(yù)防乳腺癌。
可用于此目的的化合物包括但不限于抗BCMP抗體(和含有其結(jié)合區(qū)的片段和衍生物)、BCMP反義核酸或核酶核酸、以及可以用來通過同源重組“敲除”內(nèi)源BCMP功能的、編碼功能異常BCMP的核酸(參見例如Capecchi，1989，Science 2441288-1292)。抑制BCMP功能的其它化合物可以通過利用已知的體外測定來鑒定，所述體外測定例如對試驗化合物抑制BCMP與另一蛋白或結(jié)合配偶體結(jié)合的能力、或抑制已知BCMP功能的測定。最好在體外或在細(xì)胞培養(yǎng)物中分析這類抑制，但也可以使用遺傳分析。也可以在給予所述化合物之前和之后，用the Preferred Technology來測定所述BCMP的水平。最好是，如下文更詳細(xì)描述的，利用合適的體外或體內(nèi)測定來測定特定化合物的效應(yīng)，以及確定其給予是否是適用于受影響組織的治療。
在一個具體實施方案中，將抑制BCMP功能的化合物治療性或預(yù)防性給予與無乳腺癌的受治療者的乳腺組織或預(yù)定參比范圍相比檢測出體內(nèi)所述BCMP的乳腺組織水平或功能活性增加(例如高于正常水平或所需水平)的受治療者。可以如上所概述的，用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，測量BCMP水平或功能的增加。優(yōu)選的BCMP抑制劑組合物包括小分子，即1000道爾頓或更小的分子。這類小分子可以通過本文所述的篩選方法來鑒定。BCMP的反義調(diào)節(jié)
在一個具體實施方案中，利用BCMP反義核酸抑制BCMP的表達(dá)。本發(fā)明提供包含至少6個核苷酸的核酸的治療性或預(yù)防性用途，其中所述核酸為編碼BCMP或其部分的基因或cDNA的反義核苷酸。本文所用的BCMP“反義”核酸是指借助一定的序列互補(bǔ)性能夠與編碼BCMP的RNA(最好是maNA)的一部分雜交的核酸。所述反義核酸可以與編碼BCMP的mRNA的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)互補(bǔ)。這類反義核酸可用作抑制BCMP表達(dá)的化合物，并且可以用于乳腺癌的治療或預(yù)防。
本發(fā)明的反義核酸是雙鏈或單鏈寡核苷酸、RNA或DNA或其修飾物或衍生物，可以直接給予細(xì)胞，或通過外源所導(dǎo)入的序列的轉(zhuǎn)錄在胞內(nèi)產(chǎn)生。
本發(fā)明還提供藥用組合物，所述藥用組合物包含藥學(xué)上可接受的載體中的有效量的本發(fā)明BCMP反義核酸，如下文所述。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供用于抑制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中BCMP核酸序列表達(dá)的方法，所述方法包括為所述細(xì)胞提供有效量的包含本發(fā)明BCMP反義核酸的組合物。
以下詳細(xì)描述BCMP反義核酸及其用途。BCMP反義核酸
所述BCMP反義核酸具有至少6個核苷酸，最好是范圍為6至約50個寡核苷酸的寡核苷酸。在具體方面，所述寡核苷酸至少有10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少100個核苷酸或至少200個核苷酸。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或其修飾形式，可以是單鏈或雙鏈的。所述寡核苷酸可以在堿基部分、糖部分或磷酸骨架上加以修飾。所述寡核苷酸可以包括其它附加的基團(tuán)，例如肽；促進(jìn)穿越細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運的因子(參見例如Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 866553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84648-652；1988年12月15日公開的PCT公開說明書WO88/09810)或血腦屏障(參見例如1988年4月25日公開的PCT公開說明書WO 89/10134)；雜交觸發(fā)的切割劑(參見例如Krol等，1988，BioTechniques 6958-976)或嵌入劑(參見例如Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，提供一種BCMP反義寡核苷酸，最好是單鏈DNA。所述寡核苷酸可以在其結(jié)構(gòu)的任何位置用本領(lǐng)域一般已知的取代基來修飾。
所述BCMP反義寡核苷酸可以包含至少一種以下經(jīng)修飾的堿基部分5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(Queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、4-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2，6-二氨基嘌呤和其它堿基類似物。
在另一實施方案中，所述寡核苷酸包含至少一個經(jīng)修飾的糖部分，例如以下糖部分之一阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在再一實施方案中，所述寡核苷酸包含至少一種以下經(jīng)修飾的磷酸骨架硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、formacetal或formacetal類似物。
在又一實施方案中，所述寡核苷酸是α-端基異構(gòu)寡核苷酸。α-端基異構(gòu)寡核苷酸與互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜交體，其中與通常的β-單位相反，所述鏈相互平行(Gautier等，1987，Nucl.Acids Res.156625-6641)。
可以將所述寡核苷酸與另一種分子(例如肽)、雜交觸發(fā)交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運因子或雜交觸發(fā)切割因子綴合。
本發(fā)明的寡核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，例如利用自動DNA合成儀(例如市場上可得自Biosearch，Applied Biosystems等的自動DNA合成儀)來合成。例如，可以用Stein等的方法(1988，Nucl.Acids Res.163209)合成硫代磷酸寡核苷酸、可以利用控制的多孔玻璃聚合物支持體制備甲基膦酸酯寡核苷酸(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA857448-745 1)。
在一個具體實施方案中，通過從外源序列轉(zhuǎn)錄，在胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的BCMP反義核酸。例如，可以將載體導(dǎo)入體內(nèi)，使得所述載體被細(xì)胞攝入，所述載體或其部分在所述細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生本發(fā)明的反義核酸(RNA)。這種載體可能含有編碼所述BCMP反義核酸的序列。這種載體可以保持為附加型，或者整合到染色體上，只要它可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的反義RNA。這類載體可以通過本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來構(gòu)建。載體可以是質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域已知的用于在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的其它載體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的在哺乳動物細(xì)胞(優(yōu)選人類細(xì)胞)中起作用的任何啟動子，表達(dá)編碼所述BCMP反義RNA的序列。這類啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。以上概述了這類啟動子的實例。
本發(fā)明的反義核酸包含與BCMP編碼基因(最好是編碼BCMP的人類基因)的RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補(bǔ)的序列。然而，雖然優(yōu)選絕對的互補(bǔ)性，但并不需要絕對的互補(bǔ)性。本文所指的“與RNA的至少一部分互補(bǔ)的”序列是指具有足夠的互補(bǔ)性能夠在嚴(yán)格條件下(例如高嚴(yán)格條件包括在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中于65℃雜交并且在0.1×SSC/0.1％SDS中68℃洗滌；或中等嚴(yán)格條件包括在0.2×SSC/0.1％SDS中于42℃洗滌)與所述RNA雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的序列；在雙鏈BCMP反義核酸的情況下，可能必須測試所述雙鏈體DNA的一條鏈，或分析三鏈體的形成。雜交的能力既取決于互補(bǔ)的程度，也取決于所述反義核酸的長度。一般而言，所述雜交核酸越長，可能含有的與編碼BCMP的RNA錯配的堿基則越多，但仍形成穩(wěn)定的雙鏈體(或三聯(lián)體，情況同樣如此)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用測定所述雜交復(fù)合體解鏈溫度的標(biāo)準(zhǔn)方法，來確定可耐受的錯配程度。BCMP反義核酸的治療用途
當(dāng)所述靶BCMP在懷疑患有或患有乳腺癌的受治療者的乳腺組織中過量表達(dá)時，所述BCMP反義核酸可以用來治療或預(yù)防乳腺癌。在一個優(yōu)選實施方案中，使用單鏈DNA反義BCMP寡核苷酸。
表達(dá)或過量表達(dá)編碼BCMP的RNA的細(xì)胞類型，可以采用本領(lǐng)域已知的各種方法來鑒定。這類細(xì)胞類型包括但不限于白細(xì)胞(例如嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞)和居留細(xì)胞(例如星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和室管膜細(xì)胞)。這類方法包括但不限于與BCMP特異性核酸雜交(例如通過RNA印跡雜交、斑點印跡雜交、原位雜交)、觀測來自所述細(xì)胞類型的RNA在體外翻譯成BCMP的能力、免疫測定等。在一個優(yōu)選方面，在治療之前，可以例如通過免疫細(xì)胞化學(xué)或原位雜交，分析得自受治療者的原代組織中的BCMP表達(dá)。
可以將包含藥學(xué)上可接受的載體中的有效量的BCMP反義核酸的本發(fā)明藥用組合物，給予患有乳腺癌的受治療者。
在乳腺癌治療方面有效的BCMP反義核酸的量，可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來確定。
在一個具體實施方案中，通過脂質(zhì)體、微?；蛭⒛医o予包含一種或多種BCMP反義核酸的藥用組合物。在本發(fā)明的各個實施方案中，這類組合物可以用來達(dá)到所述BCMP反義核酸的緩釋。在一個具體實施方案中，可能理想的是使用通過針對特定的可鑒定腫瘤抗原的抗體靶向的脂質(zhì)體(Leonetti等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872448-2451；Renneisen等，1990，J.Biol.Chem.26516337-16342)。抑制性核酶和三股螺旋法
在另一實施方案中，通過利用編碼所述BCMP的基因序列結(jié)合熟知的基因“敲除”、核酶或三股螺旋法降低BCMP的基因表達(dá)，來降低BCMP水平或BCMP活性，可以緩解乳腺癌的癥狀。在這種方法中，用核酶或三股螺旋分子來調(diào)節(jié)編碼所述BCMP的基因的活性、表達(dá)或合成，因而緩解乳腺癌的癥狀?？梢栽O(shè)計這類分子，使其降低或抑制突變型或非突變型靶基因的表達(dá)。用于生產(chǎn)和使用這類分子的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
可以使用設(shè)計用于催化切割編碼BCMP的基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子，防止靶基因mRNA的翻譯，因而防止所述基因產(chǎn)物的表達(dá)。(參見例如1990年10月4日公開的PCT國際公開說明書WO 90/11346；Sarver等，1990，Science 2471222-1225)。
核酶是能夠催化RNA特異性切割的酶性RNA分子。(有關(guān)綜述，參見Rossi，1994，Current Biology 4，469-471)。核酶的作用機(jī)制涉及核酶分子與互補(bǔ)靶RNA的序列特異性雜交，后接內(nèi)切核酸水解(endonucleolytic)切割事件。核酶分子的組成必須包括與靶基因mRNA互補(bǔ)的一個或多個序列，并且必須包括眾所周知的負(fù)責(zé)mRNA切割的催化序列。關(guān)于這種序列，參見例如美國專利第5,093,246號，所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中。
雖然可以用在位點特異性識別序列切割mRNA的核酶，來破壞編碼BCMP的mRNA，但優(yōu)選使用錘頭型核酶。錘頭型核酶在與靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對的側(cè)翼區(qū)所指示的位置切割mRNA。唯一的要求是，靶mRNA具有兩個堿基的以下序列5’-UG-3’。錘頭型核酶的構(gòu)建和產(chǎn)生是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在以下文獻(xiàn)中有更為全面的描述Myers，1995，Molecular Biology and BiotechnologyA ComprehensiveDesk Reference，VCH Publishers，New York，(尤其參見圖4、第833頁)，以及Haseloff和Gerlach，1988，Nature，334，585-591，每個所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
最好對所述核酶進(jìn)行工程改造，使得所述切割識別位點位于編碼所述BCMP的mRNA的5’端附近，即提高效率并且將非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的胞內(nèi)積累減至最小。
本發(fā)明的核酶也包括RNA內(nèi)切核糖核酸酶(下文稱為“Cech型核酶”)，例如在嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)中天然存在的RNA內(nèi)切核糖核酸酶(稱為IVS或L-19 IVS RNA)和Thomas Cech及其同事廣泛描述的RNA內(nèi)切核糖核酸酶(Zaug等，1984，Science，224，574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231，470-475；Zaug等，1986，Nature，324，429-433；由University Patents Inc.公開的國際專利申請WO 88/04300；Been和Cech，1986，Cell，47，207-216)。Cech型核酶具有一個8堿基對活性部位，所述活性部位與靶RNA序列雜交，此后發(fā)生靶RNA切割。本發(fā)明包括靶向所述BCMP編碼基因中存在的8堿基對活性部位序列的那些Cech型核酶。
同反義方法中一樣，所述核酶可以由經(jīng)修飾的寡核苷酸組成(例如以改進(jìn)穩(wěn)定性、靶向等)，并且應(yīng)該傳遞給在體內(nèi)表達(dá)所述BCMP的細(xì)胞。一種優(yōu)選的傳遞方法包括使用“編碼”在強(qiáng)組成型polIII和polII啟動子控制之下的所述核酶的DNA構(gòu)建體，使得轉(zhuǎn)染細(xì)胞將產(chǎn)生足量的所述核酶，以破壞編碼所述BCMP的內(nèi)源mRNA，并且抑制翻譯。因為核酶與反義分子不同，是催化性的，所以為達(dá)到功效所要求的胞內(nèi)濃度較低。
內(nèi)源BCMP的表達(dá)也可以通過采用定向同源重組使編碼所述BCMP的基因或這種基因的啟動子失活或“敲除”來降低(例如參見Smithies等，1985，Nature 317230-234；Thomas和Capecchi，1987，Cell51503-512；Thompson等，1989，Cell 5313-321；和Zijlstra等，1989，Nature 342435-438，每個所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。例如，可以用鄰接與所述內(nèi)源基因(所述BCMP編碼基因的或者編碼區(qū)或者調(diào)節(jié)區(qū))同源的DNA、編碼非功能性BCMP的突變基因(或完全不相關(guān)的DNA序列)以及加上或不加上選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記，來轉(zhuǎn)染體內(nèi)表達(dá)所述靶基因的細(xì)胞。通過定向同源重組插入所述DNA構(gòu)建體，導(dǎo)致所述靶基因的失活。這類方法特別適合于農(nóng)場，在農(nóng)場中可以用對ES(胚胎干細(xì)胞)細(xì)胞的修飾來產(chǎn)生具有無活性靶基因的動物后代(例如參見Thomas和Capecchi，1987，和Thompson，1989，參見上文)。然而，可以修改這種方法以用于人類，條件是用合適的病毒載體將所述重組DNA構(gòu)建體直接體內(nèi)給予或靶向所需的部位。
或者，編碼BCMP的基因的內(nèi)源表達(dá)的降低可以如下進(jìn)行靶向與所述基因的調(diào)節(jié)區(qū)(即所述基因的啟動子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸序列，形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)阻止編碼所述BCMP的基因在體內(nèi)靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。(一般參見Helene，1991，Anticancer Drug Des.，6(6)，569-584；Helene等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660，27-36；和Maher，1992，Bioassays 14(12)，807-815)。
用于形成三股螺旋以抑制轉(zhuǎn)錄的核酸分子應(yīng)該是單鏈的，并且由脫氧核糖核苷酸組成。必須設(shè)計這些寡核苷酸的堿基組成，以促進(jìn)通過Hoogsteen堿基配對原則形成三股螺旋，這一般需要在雙鏈體的一條鏈上存在相當(dāng)大的或者嘌呤或者嘧啶序列段。核苷酸序列可以基于嘧啶，這將產(chǎn)生跨越所得三股螺旋的三條相連鏈的TAT和CGC+三聯(lián)體。富含嘧啶的分子提供與所述雙鏈體中一條鏈的富含嘌呤區(qū)以與該鏈平行方向互補(bǔ)的堿基。另外，可以選擇富含嘌呤(例如含有G殘基的序列段)的核酸分子。這些分子將與富含GC對、其中大多數(shù)所述嘌呤殘基位于所靶向雙鏈體中一條鏈上的DNA雙鏈體形成三股螺旋，產(chǎn)生跨越所述三聯(lián)體中三條鏈的GGC三聯(lián)體。
或者，通過構(gòu)建所謂的“Z形(switchback)”核酸分子，可以增加靶向形成三股螺旋的潛在序列。Z型分子可以以交替的5’-3’、3’-5’方式合成，使得它們首先與雙鏈體的一條鏈進(jìn)行堿基配對，然后與另一條鏈進(jìn)行堿基配對，使得無需要求相當(dāng)大的或者嘌呤或者嘧啶序列段存在于雙鏈體中一條鏈上。
在其中使用本文所述的反義分子、核酶分子或三股螺旋分子抑制突變基因表達(dá)的情況下，有可能所述技術(shù)可以如此有效地降低或抑制BCMP正?；虻牡任换虍a(chǎn)生的mRNA的轉(zhuǎn)錄(三股螺旋)或翻譯(反義分子、核酶)，使得可能產(chǎn)生其中BCMP的存在濃度可能低于正常表型的必需濃度的情況。在這種情況下，為了確保維持BCMP編碼基因的基本正常水平或活性，可以用基因治療來將編碼并表達(dá)所述BCMP的核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞中，其中所述核酸分子表現(xiàn)出正常的基因活性，并且不含無論對所使用的反義治療、核酶治療還是三股螺旋治療都敏感的序列?；蛘?，在所述基因編碼胞外蛋白的情況下，可以共同給予正常BCMP，以便維持BCMP活性所必需的水平。
本發(fā)明的反義RNA和DNA、核酶和三股螺旋分子，可以用如上所述的本領(lǐng)域已知的用于合成DNA和RNA分子的任何方法來制備。這些包括本領(lǐng)域眾所周知的用于化學(xué)合成寡脫氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技術(shù)，例如固相亞磷酰胺化學(xué)合成法。或者，通過編碼所述反義RNA分子的DNA序列的體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，可以產(chǎn)生RNA分子。可以將這類DNA序列加入到各種各樣的加入了合適RNA聚合酶啟動子(例如T7或SP6聚合酶啟動子)的載體中?；蛘撸鶕?jù)所用的啟動子，可以將組成型或誘導(dǎo)型合成反義RNA的反義cDNA構(gòu)建體穩(wěn)定導(dǎo)入到細(xì)胞系中。治療或預(yù)防化合物的測定
本發(fā)明也提供用于藥物發(fā)現(xiàn)以鑒定或證實化合物治療或預(yù)防乳腺癌的功效的測定?？梢苑治鲈囼灮衔飳⑷橄侔┦苤委熣叩腂CMP水平向無乳腺癌受治療者的水平恢復(fù)的能力，或者在乳腺癌實驗動物模型中產(chǎn)生相似變化的能力。能夠?qū)⑷橄侔┦苤委熣叩腂CMP水平向無乳腺癌受治療者的水平恢復(fù)或在乳腺癌實驗動物模型中產(chǎn)生相似變化的化合物，可以用作可供進(jìn)一步藥物發(fā)現(xiàn)的前導(dǎo)化合物，或者用于治療。BCMP的表達(dá)可以通過以下測定來分析the PreferredTechnology、免疫測定、凝膠電泳然后顯現(xiàn)、BCMP活性的檢測、或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或本文所述的任何其它方法。在其中BCMP的豐度可以用作臨床疾病的替代標(biāo)記的情況下，在臨床監(jiān)測或藥物開發(fā)方面，這類測定可以用來篩選候選藥物。
在各種具體實施方案中，可以用涉及受治療者疾病的細(xì)胞類型的代表細(xì)胞來進(jìn)行體外測定，以確定所述化合物對這類細(xì)胞類型具有所需效應(yīng)。
在進(jìn)行人體試驗之前，可以在合適的動物模型系統(tǒng)中測試用于治療的化合物，所述動物模型包括但不限于大鼠、小鼠、雞、牛、猴子、兔子等。對于體內(nèi)試驗，在給予人體之前，可以使用本領(lǐng)域已知的任何動物模型系統(tǒng)。乳腺癌的動物模型的實例包括但不限于人乳腺癌細(xì)胞系(例如MDA-MB-435)在缺乏雌激素的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中的異種移植物(Eccles等，1994，Cell Biophysics 24/25，279)。這些可以用來測試調(diào)節(jié)BCMP水平的化合物，因為在這些動物模型中表現(xiàn)出的病狀與乳腺癌的病狀相似。根據(jù)本文公開的內(nèi)容，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以用編碼一種或多種BCMP的一種或多種基因的“敲除”突變，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物?；虻摹扒贸蓖蛔兪且环N使得突變基因不表達(dá)或者以異常形式表達(dá)或以低水平表達(dá)、使得與所述基因產(chǎn)物相關(guān)的活性幾乎沒有或完全缺乏的突變。所述轉(zhuǎn)基因動物最好是哺乳動物，更優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因動物是小鼠。
在一個實施方案中，在表達(dá)BCMP的非人類動物(例如小鼠、大鼠、猴、兔子和豚鼠)、優(yōu)選乳腺癌的非人類動物模型中，鑒定調(diào)節(jié)所述BCMP表達(dá)的試驗化合物。按照該實施方案，將試驗化合物或?qū)φ栈衔锝o予所述動物，測定所述試驗化合物對一種或多種BCMP表達(dá)的影響。通過比較用試驗化合物治療的一只動物或一組動物中所選一種或多種BCMP(或其編碼mRNA)的水平與用對照化合物治療的一只動物或一組動物中的所述BCMP或mRNA的水平，可以鑒定出改變所述BCMP(或多種BCMP)表達(dá)的試驗化合物?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來測定所述mRNA和蛋白質(zhì)的水平，例如用原位雜交法?？梢蕴幩阑虿惶幩浪鰟游?，以分析試驗化合物的效應(yīng)。
在另一實施方案中，在表達(dá)BCMP的非人類動物(例如小鼠、大鼠、猴、兔子和豚鼠)、優(yōu)選乳腺癌的非人類動物模型中，鑒定調(diào)節(jié)所述BCMP或其生物活性部分的活性的試驗化合物。按照該實施方案，將試驗化合物或?qū)φ栈衔锝o予所述動物，測定所述試驗化合物對所述BCMP活性的影響。通過分析用對照化合物治療的動物和用試驗化合物治療的動物，可以鑒定出改變所述BCMP(或多種BCMP)活性的試驗化合物。通過檢測所述BCMP的細(xì)胞第二信使(例如胞內(nèi)Ca2+、二酰基甘油、IP3等)的誘導(dǎo)、檢測所述BCMP或其結(jié)合配偶體的催化活性或酶活性、檢測報道基因(例如對本發(fā)明BCMP應(yīng)答并且與編碼可檢測標(biāo)記例如熒光素酶或綠色熒光蛋白的核酸有效連接的調(diào)節(jié)元件)的誘導(dǎo)、或者檢測細(xì)胞應(yīng)答(例如細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖)，可以評價所述BCMP的活性?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來檢測BCMP活性的改變(參見例如美國專利第5,401,639號，其通過引用結(jié)合到本文中)。
在另一實施方案中，在患有乳腺癌的人類受治療者、最好是患有重癥乳腺癌的人類受治療者中，鑒定調(diào)節(jié)BCMP(或多種BCMP)的水平或表達(dá)的試驗化合物。按照該實施方案，將所述試驗化合物或?qū)φ栈衔锝o予所述人類受治療者，并且通過分析生物樣品(例如乳腺組織、血清、血漿或尿)中所述BCMP或編碼所述BCMP的mRNA的表達(dá)，測定試驗化合物對所述BCMP表達(dá)的影響。通過比較用對照化合物治療的一位受治療者或一組受治療者體內(nèi)BCMP或編碼所述BCMP的mRNA的水平與用試驗化合物治療的一位受治療者或一組受治療者體內(nèi)的所述水平，可以鑒定出改變所述BCMP表達(dá)的試驗化合物?；蛘?，通過比較在給予試驗化合物之前和之后的一位受治療者或一組受治療者體內(nèi)BCMP或編碼所述BCMP的mRNA的水平，可以鑒定出所述BCMP表達(dá)的改變。可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，獲得所述生物樣品，并分析所述mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。例如，可以用本文所述的the Preferred Technology來評價BCMP水平的改變。
在再一實施方案中，在患有乳腺癌的人類受治療者(最好是患有重癥乳腺癌的人類受治療者)中，鑒定調(diào)節(jié)BCMP(或多種BCMP)活性的試驗化合物。在該實施方案中，將試驗化合物或?qū)φ栈衔锝o予所述人類受治療者，測定試驗化合物對BCMP活性的影響。通過比較得自用對照化合物治療的受治療者的生物樣品與得自用所述試驗化合物治療的受治療者的生物樣品，可以鑒定出改變所述BCMP活性的試驗化合物。或者，通過比較在給予試驗化合物之前和之后的一位受治療者或一組受治療者體內(nèi)BCMP的活性，可以鑒定出BCMP活性的改變。通過檢測生物樣品(例如乳腺組織、血清、血漿或尿)中所述BCMP的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(例如胞內(nèi)Ca2+、二酰基甘油、IP3等)的誘導(dǎo)、所述BCMP或其結(jié)合配偶體的催化活性或酶活性、或者細(xì)胞應(yīng)答(例如細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖)，可以評價所述BCMP的活性?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，檢測BCMP的第二信使誘導(dǎo)的改變、或細(xì)胞應(yīng)答的改變。例如，可以用RT-PCR檢測細(xì)胞第二信使誘導(dǎo)的改變。
在一個優(yōu)選實施方案中，選擇將BCMP的水平或表達(dá)朝在對照受治療者(例如無乳腺癌的人)中檢測到的水平改變的試驗化合物，以供進(jìn)一步試驗或治療應(yīng)用。在另一優(yōu)選實施方案中，選擇將BCMP活性朝在對照受治療者(例如無乳腺癌的人)中檢測到的活性改變的試驗化合物，以供進(jìn)一步試驗或治療應(yīng)用。
在另一實施方案中，在患有乳腺癌的人類受治療者、最好是患有重癥乳腺癌的人類受治療者中，鑒定降低一個或多個與乳腺癌相關(guān)癥狀的嚴(yán)重程度的試驗化合物。按照該實施方案，將試驗化合物或?qū)φ栈衔锝o予所述受治療者，并且測定試驗化合物對乳腺癌的一個或多個癥狀的影響。通過比較用對照化合物治療的受治療者與用試驗化合物治療的受治療者，可以鑒定出緩解一個或多個癥狀的試驗化合物。可以用熟悉乳腺癌的醫(yī)師已知的技術(shù)，確定試驗化合物是否緩解與乳腺癌相關(guān)的一個或多個癥狀。例如，減小患有乳腺癌的受治療者體內(nèi)所帶腫瘤的試驗化合物，將有益于患有乳腺癌的受治療者。
在一個優(yōu)選實施方案中，選擇在患有乳腺癌的病人中降低一個或多個與乳腺癌相關(guān)癥狀的嚴(yán)重程度的試驗化合物，以供進(jìn)一步試驗或治療應(yīng)用。治療和預(yù)防組合物及其應(yīng)用
本發(fā)明提供治療(和預(yù)防)方法，所述方法包括給予受治療者有效量的本發(fā)明化合物。在一個優(yōu)選方面，所述化合物是基本純化的(例如基本上無限制其效應(yīng)或產(chǎn)生不想要的副作用的物質(zhì))。所述受治療者最好是動物，包括但不限于諸如牛、豬、馬、雞、貓、狗等的動物，優(yōu)選哺乳動物，最優(yōu)選人類。在一個具體實施方案中，非人類哺乳動物是所述受治療者。
當(dāng)所述化合物包含核酸時可以使用的制劑和給藥方法如上所述；以下描述其它合適的制劑和給藥途徑。
各種傳遞系統(tǒng)是已知的，可以用來給予本發(fā)明的化合物，例如在脂質(zhì)體、微粒、微囊中包囊、能夠表達(dá)所述化合物的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)胞吞作用(參見例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)、作為反轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體的部分的核酸的構(gòu)建等。導(dǎo)入方法可以是腸溶或胃腸外途徑，包括但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻腔、硬膜外和口服途徑。所述化合物可以通過任何方便的途徑給予，例如通過輸注或大劑量注射、通過上皮或粘膜內(nèi)襯(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，并且可以與其它生物活性劑一起給予?？梢韵到y(tǒng)給藥或局部給藥。另外，可能理想的是通過任何合適的途徑(包括腦室內(nèi)注射和鞘內(nèi)注射)將本發(fā)明的藥用組合物導(dǎo)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；通過例如與貯器(例如Ommaya貯器)連接的腦室內(nèi)插管，可以便于進(jìn)行腦室內(nèi)注射。也可以利用肺部給藥，例如利用吸入器或霧化器和具有氣霧化劑的制劑。
在一個具體實施方案中，可能理想的是將本發(fā)明的藥用組合物局部給予需要治療的區(qū)域；這可以例如通過例如但不限于下述方法達(dá)到在手術(shù)期間局部輸注、局部應(yīng)用、例如通過注射、借助插管或利用植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝膠狀材料，包括膜例如sialastic膜或纖維。在一個實施方案中，可以通過直接注射到乳腺組織或惡性腫瘤或腫瘤或腫瘤前組織的部位(或腫瘤前(former)部位)進(jìn)行給藥。
在另一實施方案中，所述化合物可以在泡囊、特別是在脂質(zhì)體中給藥(參見Langer，1990，Science 2491527-1533；Treat等，Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(編著)，Liss，New York，第353-365頁(1989)；Lopez-Berestein，出處同上，第317-327；一般參見同一文獻(xiàn))。
在再一實施方案中，所述化合物在控釋系統(tǒng)中給予。在一個實施方案中，可以使用一種泵(參見Langer，參見上文；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等，1980，Surgery 88507；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一實施方案中，可以使用聚合材料(參見Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise(編著)，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Desi Design and Performance，Smolen和Ball(編著)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；也參見Levy等，1985，Science 228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71105)。在又一實施方案中，可以將控釋系統(tǒng)置于治療靶(例如胸部)附近，從而僅需要系統(tǒng)劑量的一部分(參見例如Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，參見上文，第2卷，第115-138頁(1984))。
在Langer的綜述(1990，Science 2491527-1533)中論述了其它控釋系統(tǒng)。
在本發(fā)明化合物為編碼蛋白的核酸的一個具體實施方案中，通過將所述核酸作為合適核酸表達(dá)載體的一部分來構(gòu)建，并且例如利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)或通過直接注射或利用微粒轟擊(例如基因槍；Biolistic，Dupont)，或包上脂質(zhì)或細(xì)胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑，或通過將其與已知進(jìn)入細(xì)胞核的同源框樣肽(參見例如Joliot等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881864-1868)連接給予等，給予所述載體使其成為胞內(nèi)的所述核酸可以體內(nèi)給予，以促進(jìn)其編碼蛋白的表達(dá)?；蛘撸梢詫⒑怂釋?dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，并通過同源重組摻入到宿主細(xì)胞DNA中以供表達(dá)。
本發(fā)明也提供藥用組合物。這類組合物包含治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體。在一個具體實施方案中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指由聯(lián)邦政府或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的或在美國藥典或用于動物(更優(yōu)選用于人類)的其它一般承認(rèn)的藥典中列出的。術(shù)語“載體”是指與所述治療藥一起給予的稀釋劑、輔料、賦形劑或載體。這類藥用載體可以是無菌液體，例如水和油，包括石油來源、動物來源、植物來源或合成來源的油，例如花生油、豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)靜脈內(nèi)給予所述藥用組合物時，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以作為液體載體使用，特別是對于注射液而言。合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊粉、硅膠、硬脂酸鈉、甘油一硬脂酸酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，所述組合物也可以含有少量潤濕劑或乳化劑、或pH緩沖劑。這些組合物可以采用溶液劑、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、緩釋制劑等的形式。所述組合物可以用傳統(tǒng)粘合劑和載體例如甘油三酯配制為栓劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體例如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在E.W.Martin的“Remington’sPharmaceutical Sciences”中描述了合適的藥用載體的實例。這類組合物將含有治療有效量的所述化合物、最好是純化形式的所述化合物與適量的載體，以便提供適當(dāng)給予所述受治療者的形式。所述制劑應(yīng)該適合給藥模式。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物按照常規(guī)方法配制為適用于靜脈內(nèi)給予人類的藥用組合物。通常，用于靜脈內(nèi)給藥的組合物是無菌等滲水性緩沖液中的溶液。必要時，所述組合物也可以包括增溶劑和局部麻醉藥例如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。一般而言，所述成分或者分開供應(yīng)，或者在單位劑型中混合在一起，例如作為凍干粉或密封容器(例如安瓿或指示有效成分?jǐn)?shù)量的小藥囊)中的無水濃縮物。當(dāng)所述組合物通過輸注給予時，它可以用含有無菌藥用級水或鹽水的輸液瓶調(diào)配。當(dāng)所述組合物通過注射給予時，可以提供注射用無菌水或鹽水的安瓿，使得可以在給藥前混合所述成分。
本發(fā)明的化合物可以以中性形式或鹽形式配制。藥學(xué)上可接受的鹽包括用游離氨基形成的鹽例如衍生于鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的鹽以及與游離羧基形成的鹽，例如由氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等衍生的鹽。
有效治療乳腺癌的本發(fā)明化合物的量可以通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來確定。另外，可以任選地用體外測定，幫助確定最適劑量范圍。所述制劑中的精確用量也取決于給藥途徑以及所述疾病或疾患的嚴(yán)重程度，應(yīng)該根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個受治療者的狀況來決定。然而，靜脈內(nèi)給藥的合適劑量范圍一般約為20-500微克活性化合物/kg體重。鼻腔給藥的合適劑量范圍一般約為0.01pg/kg體重至1mg/kg體重。有效量可以從得自體外或動物模型試驗系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線來外推。
栓劑一般含有范圍為0.5％-10％(重量)的有效成分；口服制劑最好含有10％-95％的有效成分。
本發(fā)明也提供藥用包裝或試劑盒，所述包裝或試劑盒包含一個或多個容器，所述容器裝有本發(fā)明藥用組合物的一種或多種成分。這種容器可以任選地伴有通知，所述通知是管理生產(chǎn)、藥物或生物制品的使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式，所述通知反映出(a)所述機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)生產(chǎn)、使用或銷售用于人類給藥，(b)使用說明，或這兩者。
本發(fā)明每個方面的優(yōu)選特征就每個其它方面而言在細(xì)節(jié)上作必要的修改。本文提及的現(xiàn)有技術(shù)文件在法律允許的最大程度上結(jié)合到本文中。實施例1在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)的膜蛋白的鑒定
采用以下參考方案，通過SDS-PAGE分離乳腺癌細(xì)胞系膜中的蛋白質(zhì)，并對其進(jìn)行分析。材料和方法1a-粘附乳腺癌細(xì)胞系的粗制分級分離
將人乳腺細(xì)胞系MDA-MB-468(ATCCHTB-132)、T47D(ATCCHTB-133)和BT20(ATCCHTB-19)在不同組織培養(yǎng)條件下培養(yǎng)(對于BT20細(xì)胞系培養(yǎng)基為改進(jìn)的Eagle氏培養(yǎng)基、10％胎牛血清、非必需氨基酸混合物、2mM谷氨酰胺、1％青霉素+鏈霉素。對于T47D和MDA-MB-468細(xì)胞系培養(yǎng)基為DMF12、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、1％青霉素+鏈霉素。細(xì)胞于37℃、5％CO2中在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng))。按照下述方案裂解細(xì)胞并進(jìn)行分級分離。
將5ml冷勻漿緩沖液(50mM TrisHCl，250mM蔗糖，1mM EDTApH 7.4)與抗蛋白酶(Sigma蛋白酶抑制劑混合物P2714)一起加入10個含有10e8乳腺癌細(xì)胞(約10mg蛋白)的15cm2培養(yǎng)皿的系列中。將平板中的細(xì)胞刮到冷勻漿緩沖液中，轉(zhuǎn)移到5ml螺帽小玻瓶(在冰上進(jìn)行)中。用帶有平底探頭的MSE Soniprep 150對所得樣品以5微米的振幅超聲處理(在冰上)10秒。然后，將樣品傾析到15ml falcon管中，以1000g于4℃離心5分鐘。將所得的上清液轉(zhuǎn)移到11×60mm透明超離心管中，小心不要擾動沉淀(不溶性蛋白)，向管中加勻漿緩沖液至幾乎加滿。然后將所述管以100 000×g于4℃離心1小時，然后將其置于冰上，除去上清液(細(xì)胞溶膠)。
沉淀(膜部分)用冰冷的PBS溫和洗滌3次，重懸于含有抗蛋白酶的洗滌緩沖液(50mM TrisHCl，1mM EDTA pH 7.4)中。然后在玻璃勻漿器溫和研磨(5-10個沖程)，轉(zhuǎn)移到干凈的超離心管中，以100000×g于4℃離心1小時。然后重復(fù)這最后一步，用0.5MNaCl洗滌，以除去周邊蛋白。得自10e8乳腺癌細(xì)胞的經(jīng)洗滌膜蛋白的產(chǎn)量約為1-2mg蛋白。1b-用去垢劑Tx114提取經(jīng)洗滌的膜蛋白
這種提取提供三個潛在部分去垢劑不溶性蛋白、膜周邊蛋白和膜內(nèi)在蛋白。
如以上1a中所述制備粗制細(xì)胞膜，用Dounce勻漿器通過勻漿將其重懸于50mM Tris HCl、1mM EDTA、1.5％Triton X114、蛋白酶抑制劑pH 7.4中。
將Triton X114(Tx114)膜混合物渦旋混合，在冰上孵育30分鐘。此后，將Tx114膜混合物以13000g于4℃離心10分鐘，小心從任何去垢劑不溶性蛋白沉淀中提取上清液。
將Tx114上清液在水浴中溫?zé)嶂?7℃達(dá)3分鐘，然后以13000g離心3分鐘。除去上層水層，將下層去垢劑相重懸于1ml Tris HCl、0.2mM EDTA pH 7.4中。將這一提取步驟再重復(fù)2次。
水相代表親水性膜蛋白，去垢劑相代表疏水性膜蛋白。
通過以下1d中所述的氯仿-甲醇提取，從水層和去垢劑相中提取蛋白。得自10e8細(xì)胞的親水性膜蛋白的產(chǎn)量約為0.5 mg，疏水性膜蛋白的產(chǎn)量約為0.1-0.2 mg。最后，將所述膜蛋白溶于約30微升1D裂解緩沖液中(1-2μg/μl)。1c-用去垢劑毛地黃皂苷提取經(jīng)洗滌的膜蛋白
用含去垢劑的緩沖液如下提取得自1a的經(jīng)洗滌的膜沉淀。
將冰冷的毛地黃皂苷緩沖液(0.01％的50mM Tris HCl pH 7.4溶液)加入到所述膜部分中，將所得溶液勻漿10個沖程，然后置于冰上30分鐘，以讓蛋白溶解。
然后將樣品以13000×g于4℃離心5分鐘，以沉淀任何不溶性蛋白，用如下1d所述的氯仿-甲醇提取法提取上清液。得自10e8癌細(xì)胞的毛地黃皂苷提取的蛋白的產(chǎn)量約為30-50微克。1d-用氯仿/甲醇從水溶液或去垢劑溶液中提取蛋白
將400μl甲醇、100μl氯仿和300μl水加入到100-200μl得自1b和1c的去垢劑溶液中。將所得混合物渦旋混合并震搖60秒，然后以13000×g于20℃離心10分鐘。
產(chǎn)生兩層，所需蛋白在所述兩層之間的界面中。小心除去上層，加入300μl甲醇，將離心管倒置，然后以13000g于4℃離心5分鐘，以沉淀蛋白。除去甲醇，讓沉淀風(fēng)干5-10分鐘。
此后，將沉淀再溶于1D裂解緩沖液(63mM Tris.HCl pH 7.4、10％甘油、2％SDS、0.0025％溴酚藍(lán)、2％巰基乙醇)中。1e-1D凝膠技術(shù)
將蛋白或膜沉淀溶于1D樣品緩沖液中(1-2μg/μl)。然后將樣品緩沖液和蛋白的混合物加熱至95℃達(dá)3分鐘。
用濃縮膠和濃縮膠梳子，按照Ausubel F.M等編著，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，第II卷，Green Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.，New York，第10.2節(jié)(該文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)中所述的程序，灌制9-16％丙烯酰胺梯度凝膠。
用10微升移液器吸頭將得自去垢劑處理的30-50微克蛋白混合物和分子量標(biāo)準(zhǔn)(66、45、31、21、14kDa)加入到濃縮膠孔中，將樣品以40mA電泳5小時。
然后撬開板，將凝膠置于盤中的固定液(10％乙酸、40％乙醇、50％水)中，震搖過夜。此后，在引發(fā)(primer)溶液(7.5％乙酸(75ml)、0.05％SDS(5ml 10％))中將凝膠震搖引發(fā)(prime)30分鐘。然后將凝膠與熒光染料(7.5％乙酸、0.06％OGS in-house染料(600μl)一起震搖溫育3小時。Sypro Red(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon)是一種用于此目的的合適染料。一種優(yōu)選的熒光染料公開于1999年10月5日申請的美國申請第09/412,168號中，該申請通過引用全部結(jié)合到本文中。
經(jīng)熒光染色的凝膠用Apollo 3掃描器(Oxford Glycosciences，Oxford，UK)成像，產(chǎn)生計算機(jī)可讀輸出。這種掃描器由WO 96/36882中和David A.Basiji的題為“利用內(nèi)部反射光學(xué)和相位靈敏檢測的高通量熒光掃描器的開發(fā)(全內(nèi)部反射，電泳)”，University of Washington(1997)，Dissertation Abstracts International的第58/12-B卷，第6686頁(所述文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)中描述的掃描器發(fā)展而來。該儀器的最新形式包括以下改進(jìn)凝膠在精密引導(dǎo)螺桿驅(qū)動系統(tǒng)上傳送通過掃描器。優(yōu)選將玻璃板置于Basiji論文中所述的皮帶傳動系統(tǒng)上，因為它提供一種準(zhǔn)確傳送凝膠通過成像光學(xué)系統(tǒng)的可再現(xiàn)方法。
在所述掃描器中，凝膠用三個對準(zhǔn)止動件固定，將玻璃板大致保持在已知位置。借此并且連同上述精密傳送系統(tǒng)以及凝膠結(jié)合于玻璃板上的事實，可以預(yù)測并記錄凝膠的絕對位置。這確保將凝膠上每一特征的準(zhǔn)確坐標(biāo)傳送至切割機(jī)器人以進(jìn)行切取。這種切割機(jī)器人對于玻璃板有相同的安裝配置，以保持位置的準(zhǔn)確。
將凝膠保持在適當(dāng)位置的載體有固有的熒光標(biāo)記(稱為M1、M2、M3)，它們可以用來校正圖象的幾何形狀，并且是一種質(zhì)量控制特征，以證實掃描正常進(jìn)行。
該系統(tǒng)的光學(xué)部件是倒置的。激光、反射鏡、波導(dǎo)和其它光學(xué)部件在被掃描的玻璃板之上。Basiji論文的實施方案中，這些部件在玻璃板之下。因此，玻璃板固定在掃描器上，凝膠面向下，使得光路仍通過玻璃板。借此，可能離開玻璃板的任何凝膠顆粒都將落在儀器的底部，而不是落到光學(xué)器件中。
在掃描凝膠時，將凝膠從染料中取出，用水沖洗并讓其短暫風(fēng)干，并在Apollo 3上成像。成像之后，將凝膠密封在含有小體積染色溶液的聚乙烯袋中，然后貯存于4℃。
通過從在樣品旁邊電泳的一組已知分子量標(biāo)記內(nèi)推，計算表觀分子量。
1f-所選蛋白的回收知分析
通過美國專利第6,064,754號第5.4節(jié)和第5.6、5.7、5.8節(jié)(所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中)中描述的適用于1D電泳的方法，由機(jī)器人從凝膠中切取蛋白質(zhì)，對所述方法的機(jī)器人切割手如下作出修改該切割手在所述泳道頂部開始，從該泳道的左邊邊緣開始切割直徑為1.7mm的凝膠片，然后切割手向右邊移動2mm，向下移動0.7mm，再切下另一凝膠片。然后重復(fù)這一步。切割手然后返回位于第一次凝膠切割正下方的位置，但向下偏轉(zhuǎn)2.2mm，重復(fù)所述三個斜線切割的模式。在凝膠的全長上繼續(xù)進(jìn)行這一模式。
注意若觀測到泳道顯著變寬，則也可以向旁邊作出校正，即不是返回到位于前次凝膠切割的正下方的位置，切割可以略微向左邊(泳道的左邊)和/或右邊(泳道的右邊)偏轉(zhuǎn)。對凝膠片內(nèi)含有的蛋白進(jìn)行加工，以產(chǎn)生胰蛋白酶肽；如WO98/53323和1998年6月15日申請的申請第09/094,996號中描述的質(zhì)譜法，測定這些肽的部分氨基酸序列。
對蛋白進(jìn)行加工，產(chǎn)生胰蛋白酶消化肽。用PerSeptive BiosystemsVoyager-DETM STR基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀通過質(zhì)譜法分析胰蛋白酶肽，通過串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)，用配有nanoflowTM電噴霧Z-噴霧源的Micromass四極時間飛行(Q-TOF)質(zhì)譜儀(Micromass，Altrincham，U.K.)，分析所選的胰蛋白酶肽。對于部分氨基酸測序和BCMP的鑒定，用SEQUEST搜索程序(Eng等，1994，J.Am.Soc.Mass Spectrom.5976-989)，version v.C.1，搜索胰蛋白酶肽的無解釋串聯(lián)質(zhì)譜。數(shù)據(jù)庫鑒定的標(biāo)準(zhǔn)包括胰蛋白酶的切割特異性；從數(shù)據(jù)庫返回的肽中一組a、b和y離子的檢測、和說明脲基甲基化的所有Cys殘基的質(zhì)量增加。搜索的數(shù)據(jù)庫是在由the National Centre forBiotechnology Information(NCBI)維護(hù)的非豐余數(shù)據(jù)庫中由蛋白實體構(gòu)成的數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/上接入。在用SEQUEST程序通過質(zhì)譜-質(zhì)譜相關(guān)鑒定蛋白質(zhì)后，將MALDI-TOF質(zhì)譜中檢測到的質(zhì)量賦予所鑒定的蛋白中的胰蛋白酶消化肽。運用SEQUEST程序通過搜索胰蛋白酶消化肽的無解釋MS/MS譜不能鑒定出氨基酸序列的情況下，采用本領(lǐng)域已知的方法人工解釋所述肽的串聯(lián)質(zhì)譜(在解釋肽離子的低能碎裂質(zhì)譜的情況下，參見Gaskell等，1992，Rapid Commun.Mass Spectrom.6658-662)。結(jié)果
這些初步實驗鑒定出匹配尚未描述蛋白或生物功能的cDNA概念翻譯的14種BCMP(表1)和匹配未曾在乳腺細(xì)胞膜中描述的已知蛋白的37種BCMP(表2)、與4種其它BCMP(表3)。
實施例2通過胰蛋白酶消化蛋白片段的質(zhì)譜法衍生串聯(lián)質(zhì)譜對基因組DNA序列中的基因作圖質(zhì)譜法
對于BCMP81，通過MALDI-TOF-MS(VoyagerSTR，AppliedBiosystems，F(xiàn)ramingham，MA)，用337nm波長激光進(jìn)行解吸和分析的反射模式，分析從1D凝膠切取的蛋白的胰蛋白酶消化物。所選質(zhì)譜([M+H]＝1557.81)通過串聯(lián)質(zhì)譜法，用配有納米噴霧離子源的QTOF-MS(Micromass UK Ltd，Manchester)進(jìn)一步表征。在MALDI分析之前，用C18 Zip TipsTM(Millipore，Bedford，MA)將樣品脫鹽和濃縮。用于串聯(lián)MS的樣品用加入C18 SPE材料的納米LC系統(tǒng)(LCPackings，Amsterdam，The Netherlands)純化。
人工分析串聯(lián)質(zhì)譜(Biemann K，通過串聯(lián)質(zhì)譜法和高能碰撞誘導(dǎo)解離對肽測序，Methods Enzymol1990；193455-79)，以測定部分位置的氨基酸序列以及所述肽片段的N末端和C末端其余部分的質(zhì)量(表4)。
表4. 得自BCMP 81的串聯(lián)質(zhì)譜法分析的氨基酸序列信息
a“核心序列”是由所述肽的碎片質(zhì)譜的解釋闡明的肽的部分氨基酸序列。
b所述肽的N末端質(zhì)量是核心序列起點和所述肽N末端之間的質(zhì)量。
c所述C末端質(zhì)量是核心序列末端和所述肽C末端之間的質(zhì)量。
發(fā)現(xiàn)從串聯(lián)質(zhì)譜讀出的序列(MEQQQQLQQR)存在于登記號為AL021707的人基因組DNA(可得自http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)的翻譯中，從核苷酸位置55443開始(BLAST，Atschul，Stephen F.，Gish，Warren，Miller，Webb，Myers，Eugene W.和Lipman，David，J.(1990).Basic局部比對搜索工具。J.Mol.Biol.215；403-410.Gapped BLAST描述于Altschul，Stephen F.，Madden，Thomas L，Schaffer，Alandro A.，Zhang，Jinghui Zhang，Zheng，Miller，Webb和Lipman，David J.(1997).GappedBLAST and PSI-BLASTa new generation of protein databasesearch programs.Nucleic Acids Res.25(17)；3389-3402)。
對該位置周圍序列的進(jìn)一步檢查，鑒定出可以翻譯匹配另一MALDI質(zhì)譜的DNA序列。將這一質(zhì)譜轉(zhuǎn)換為概念氨基酸序列(LWGLTEMFPER)，其質(zhì)量匹配可以從所述DNA序列(圖1)翻譯出的潛在胰蛋白酶片段。因此，根據(jù)讀框確定了基因組DNA的這一序列段的兩個區(qū)段，例如得自該串聯(lián)質(zhì)譜的序列緊接所述基因組DNA翻譯中的終止密碼子之后，表明或者這是該基因的末端，或者在該位置有一個內(nèi)含子。然而，任何潛在的內(nèi)含子都必須始于該串聯(lián)質(zhì)譜C末端的R殘基之后。
將對應(yīng)于匹配該串聯(lián)質(zhì)譜的序列任一側(cè)2kb的基因組DNA序列，用于針對已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)的blast搜索中。EST AA316462以＞99％匹配該基因組序列的多個區(qū)，有助于內(nèi)含子和外顯子邊界的鑒定。這一比對鑒定出4個外顯子，但該EST序列沒有足夠的質(zhì)量，來測定所述完整基因的蛋白序列，它們也沒有好到足以精確定位內(nèi)含子/外顯子邊界，特別是在缺乏任何同源序列的情況下。一旦將AL021707中的54575(DDEe(ag)/gt)概念剪接為54805(e(ag)/LDET)時(這些剪接位點的位置已經(jīng)由所述EST中測定)，最后一個質(zhì)譜可以匹配基因組序列(GDAEKPEEELEEDDDEELDETLSER)的翻譯。
有一個CpG島始于AL021707中的位置54283。人基因組DNA序列中的CpG島通常指示基因可以開始的區(qū)域(例如Kundu TK，RaoMR，染色質(zhì)組構(gòu)中的CpG島和基因表達(dá)。J.Biochem(Tokyo)1999-年2月；125(2)217-22)。一個可讀框顯然從AL021707的核苷酸54461以ATG(甲硫氨酸)開始。根據(jù)AA316462的3’EST序列通過質(zhì)譜建立的讀框，確定了該基因外顯子4中的終止密碼子。這種質(zhì)譜、基因組DNA序列和EST序列的組合，得出以下給出的要求保護(hù)的蛋白序列(圖1)。以下給予了對應(yīng)的DNA序列(圖1)。在圖2中給出了所述基因組片段內(nèi)的所述譜序列、內(nèi)含子和外顯子的位置。
鑒定出一個全長克隆
總RNA的制備
用Trizol(Life Technologies)，從得自細(xì)胞系MB-MDA468、BT20、PC30、PC3M、T47D和Cal51的培養(yǎng)物的約108細(xì)胞制備總RNA，以約1μ/μl重懸浮。cDNA克隆
用引物BCMP 81 F(5’cctacagtcatggctgccgc3’)和BCMP 81 R(5’gagacagctcaaacagcaataac3’)、30ng乳腺cDNA(Clontech)和PCR試劑(Qiagen，UK)，采用循環(huán)參數(shù)95℃15秒、55℃1分鐘40個循環(huán)，通過PCR擴(kuò)增BCMP 81的預(yù)測編碼區(qū)。獲得單一的500bp產(chǎn)物，將其從其它PCR試劑(Qiagen，UK)中經(jīng)柱純化，用引物BCMP 81F和BCMP81 R測序(ABI377，Oxford University Contract Sequencing)。
已經(jīng)從乳腺cDNA文庫中克隆出編碼BCMP 81的全長cDNA片段，對其測序，以證實身份和讀框。根據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量梯(mass ladder)確定，從1D凝膠切下的蛋白的分子量在14kDa和19kDa之間，概念翻譯的全長蛋白的預(yù)測質(zhì)量為15.3kDa。
雖然在GenBank的注釋中在所述肽/基因組DNA匹配的區(qū)域中容易鑒定并注意到CpG島，但從這些DNA序列沒有預(yù)測出蛋白。所述肽數(shù)據(jù)已經(jīng)能夠全面描述所述蛋白、被翻譯的mRNA和編碼其的該基因的基因組結(jié)構(gòu)。正常人組織以及乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞系中BCMP 81的mRNA分布型
采用實時RT-PCR，定量測量正常人組織mRNA(Clontech)和乳腺癌細(xì)胞系中的BCMP 81表達(dá)。使用寡聚dT引物和Superscript II RT試劑盒(Life technologies)，從1-5μg總RNA合成cDNA。在ABI7700序列測定系統(tǒng)(PE Biosystems，UK)上，分析含有10ng cDNA、10pmoles有義引物(5’gagctagatgagaccctgtc3’)和反義引物(5’gatcataaaggaagtccccaa3’)和SYBR green序列測定試劑(PE Biosystems，UK)的反應(yīng)物。PCR的條件是50℃2分鐘1個循環(huán)，95℃10分鐘1個循環(huán)，然后95℃15秒、55℃1分鐘40個循環(huán)。以報告染料熒光的增加實時測量PCR產(chǎn)物的積累，用Sequence Detector程序v1.6.3(PEBiosystems)分析數(shù)據(jù)。用所述經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為模板，產(chǎn)生原始模板拷貝數(shù)與熒光和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用該曲線來計算每種樣品中的BCMP 81 mRNA的拷貝數(shù)。
通過定量RT-PCR(Heid，C.A.，Stevens，J.，Livak，K.J.和Williams，P.M.實時定量PCR。Genome Res.6，986-994(1996))對所述mRNA的組織分布進(jìn)行的分析，證實了所述蛋白來源(MDA-MB468)以及其作為乳腺癌抗原的潛力，BT20和MDA-MB468細(xì)胞系都表現(xiàn)出與正常乳腺相比其表達(dá)顯著增加(圖3)。該蛋白的公共數(shù)據(jù)庫EST形式的微少反映在這些樣品中觀測到的一般mRNA拷貝數(shù)少(一般＜200拷貝/ngcDNA)。
實施例3新蛋白BCMP11的克隆
質(zhì)譜法
從1D凝膠切取的蛋白用胰蛋白酶消化，通過MALDI-TOF-MS(Voyager STR，Applied Biosystems)用337nm波長激光解吸和分析的反射模式進(jìn)行分析。BCMP 11的兩個選定質(zhì)量([M+H]＝1245.65和941.47)通過串聯(lián)質(zhì)譜法，用配有納米噴霧離子源的QTOF-MS(Micromass UKLtd.)進(jìn)一步表征。在MALDI分析之前，用C18 Zip TipsTM(Millipore)將樣品脫鹽和濃縮。供串聯(lián)MS用的樣品用加入C18 SPE材料的納米LC系統(tǒng)(LC Packings)純化。
人工分析串聯(lián)質(zhì)譜(Biemann K，通過串聯(lián)質(zhì)譜法和高能碰撞誘導(dǎo)解離對肽測序，Methods Enzymol1990；193455-79)，以測定部分位置的氨基酸序列以及所述肽片段的N末端和C末端其余部分的質(zhì)量(表5)。
發(fā)現(xiàn)得自蛋白BCMP 11的三個質(zhì)譜(一個串聯(lián)質(zhì)譜，表5，和一個MALDI-質(zhì)譜，圖4a)匹配得自人肺癌文庫的一個EST(登記號AI458391)的翻譯，該翻譯確定了一個166個氨基酸的可讀框(ORF)(圖4a)。用輸入項AI458391對人EST數(shù)據(jù)庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行Blast搜索，鑒定出幾種重疊EST，提供了額外的5’和3’UTR序列。得自BCMP 11的第二種肽串聯(lián)質(zhì)譜(表5)在這些EST序列中鑒定出一個差異預(yù)測的密碼子146編碼或者谷氨酰胺或者精氨酸，取決于翻譯哪種EST。串連質(zhì)譜清楚地表明，該精氨酸存在于所述分離蛋白中；所述谷氨酰胺或者是測序錯誤或者是多態(tài)性。
表5.得自BCMP 11的串聯(lián)質(zhì)譜法分析的氨基酸序列信息
a“核心序列”是由所述肽的碎片質(zhì)譜的解釋闡明的肽的部分氨基酸序列。
b所述肽的N末端質(zhì)量是核心序列起點和所述肽N末端之間的質(zhì)量。
c所述C末端質(zhì)量是核心序列末端和所述肽C末端之間的質(zhì)量。
通過PCR，從T-47D cDNA擴(kuò)增了一個全長克隆(圖4A)。總RNA的制備和cDNA合成
用Trizol試劑(Life Technologies)，按照生產(chǎn)商的說明，從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織樣品制備總RNA，并且以1μg/μl的濃度重懸于無RNA酶的水中。用1-5μg總RNA作為cDNA合成的模板，使用寡聚dT引物和Superscript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies)。cDNA經(jīng)柱純化(Qiagen)，以10ng/μl的濃度洗脫。
BCMP11cDNA的克隆
用以下引物F，5’GGCCAAGTCAGCTTCTTCTG 3’；R，5’GTATTTGTCAATGTGCCAGAGG 3’，通過PCR從T-47DcDNA擴(kuò)增預(yù)測的全長BCMP11ORF。反應(yīng)物含有10ng cDNA和PCR試劑(Qiagen)，采用以下循環(huán)參數(shù)94℃30秒、60℃30秒40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化(Qiagen)，克隆到T/A載體(Invitrogen)中，隨后證實所述核苷酸序列(University of Oxford，Sequencing Facility，UK)。
預(yù)測的BCMP 11蛋白與hAG-2高度同源，hAG-2是一種從MCF-7乳腺癌細(xì)胞系克隆的cDNA編碼的一種新的人類蛋白(Thompson，D.A.和Weigel，R.J.有爪蟾蜍膠粘腺基因XAG-2的人類同系物hAG-2在乳腺癌細(xì)胞系中與雌激素受體共表達(dá)。Biochem.Biophys.Res.Commun.251，111-116(1998))。hAG-2是在蟾蜍發(fā)育期間在膠粘腺中表達(dá)的有爪蟾蜍蛋白XAG-2(Aberger，F(xiàn).，Weidinger，G.，Grunz，H.和Rchter，K.胚胎外胚層的前特化(anterior specification)非洲蟾蜍屬(Xenopus)膠粘腺特異性基因XAG-2的作用。Mech.Dev.72，115-130(1998))的人類同系物。hAG-2和BCMP 11蛋白有71％相同，N末端的序列相似性相對低(圖4b)。BCMP 11同hAG-2一樣，預(yù)測其是一種具有N末端信號序列的胞外蛋白(http//psort.nibb.ac.jp)。
BCMP11mRNA在人組織中的表達(dá)
我們采用實時定量RT-PCR(Heid，C.A.，Stevens，J.，Livak，K.J.和Williams，P.M.實時定量PCR。Genome Res.6，986-994(1996)；Morrison，T.B.，Weis，J.J.和Wittwer，C.T.在擴(kuò)增期間通過連續(xù)SYBR Green I監(jiān)測定量測定低拷貝轉(zhuǎn)錄物。Biotechniques 24，954-958(1998))，以分析BCMP 11 mRNA在正常人組織和乳腺癌細(xì)胞系中的分布(圖5)。PCR所用的引物如下有義引物，5’CTGGAGGATTGTCAATACTC 3’，反義引物，5’GCATAAGGTTTAGCATGATG 3’。在ABI7700序列測定系統(tǒng)(PE Biosystems)上，分析含有如上所述制備的10ng cDNA、SYBRgreen序列測定試劑(PE Biosytems)以及有義引物和反義引物的反應(yīng)物。PCR的條件是50℃2分鐘1個循環(huán)，95℃10分鐘1個循環(huán)，然后95℃15秒、55℃1分鐘40個循環(huán)。以SYBR綠色熒光的增加實時測量PCR產(chǎn)物的積累，用Sequence Detector程序v1.6.3(PE Biosystems)分析數(shù)據(jù)。用所述經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為模板，產(chǎn)生原始模板拷貝數(shù)與熒光和擴(kuò)增循環(huán)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用該曲線來計算每種樣品中的BCMP 11的拷貝數(shù)。
在結(jié)腸中觀測到BCMP 11的最高表達(dá)水平(2800拷貝/ngcDNA)，在乳腺、小腸和氣管中觀測到較低的表達(dá)水平(295-435拷貝/ngcDNA)(圖5)。在該項研究中所用的BCMP 11蛋白來源T-47D細(xì)胞中也檢測到BCMP 11mRNA(1200拷貝/ng cDNA)，與正常乳腺組織相比，在該細(xì)胞系中的表達(dá)升高。在檢驗的其它細(xì)胞系或正常組織中檢測到很少BCMP 11mRNA或沒有檢測到BCMP 11mRNA。
BCMP 11mRNA和hAG-2mRNA的組織分布非常相似。這兩種基因都顯示出在正常人組織中的限制表達(dá)模式，結(jié)腸是兩種基因的主要表達(dá)部位(圖5，Thompson，D.A.和Weigel，R.J.有爪蟾蜍膠粘腺基因XAG-2的人類同系物hAG-2在乳腺癌細(xì)胞系中與雌激素受體共表達(dá)。Biochem.Biophys.Res.Commun.251，111-116(1998))。表明hAG-2的表達(dá)與ER的表達(dá)同時發(fā)生，當(dāng)MCF7細(xì)胞用雌二醇處理時，所述細(xì)胞中的hAG-2 mRNA水平增加(Thompson和Weigel，參見上文)。同樣，在ER陽性T-47D細(xì)胞中檢測到BCMP 11mRNA，但在ER陰性細(xì)胞系CAL51、BT20和MDA-MB-468中沒有觀測到表達(dá)(圖5)。在7號染色體上相互相鄰定位的兩個高度同源的基因同時正調(diào)節(jié)(參見Chromosomal localisation，下文)，提示一種協(xié)同控制機(jī)制，該機(jī)制可能不僅與ER狀態(tài)相關(guān)，而且與ER指導(dǎo)的治療例如他莫昔芬相關(guān)。染色體定位
用所述BCMP 11 cDNA序列(圖4a)對人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast搜索，識別出兩個條目-分別與BCMP 11的5’端和3’端具有同一性的AC004993和AC073333。已經(jīng)將兩個克隆作圖至染色體7p21。也可以將完整的hAG-2 ORF作圖至條目AC073333中與BCMP 11相同的重疊群上，證明這些高度同源的基因在人類基因組中聚集在一起。實施例4新蛋白BCMP 84的克隆質(zhì)譜法
從1D凝膠切取的蛋白用胰蛋白酶消化，通過MALDI-TOF-MS(Voyager STR，Applied Biosystems)用337nm波長激光解吸和分析的反射模式進(jìn)行分析。BCMP 84的一個選定質(zhì)量([M+H]＝1667.73)通過串聯(lián)質(zhì)譜法，用配有納米噴霧離子源的QTOF-MS(Micromass UK Ltd.)進(jìn)一步表征。在MALDI分析之前，用C18 Zip TipsTM(Millipore)將樣品脫鹽和濃縮。供串聯(lián)MS用的樣品用加入C18 SPE材料的納米LC系統(tǒng)(LC Packings)純化。
人工分析串聯(lián)質(zhì)譜(Biemann K，通過串聯(lián)質(zhì)譜法和高能碰撞誘導(dǎo)解離對肽測序，Methods Enzymol1990；193455-79)，以測定部分位置的氨基酸序列以及所述肽片段的N末端和C末端其余部分的質(zhì)量(表6)。
表6.得自BCMP 84的串聯(lián)質(zhì)譜法分析的氨基酸序列信息
a“核心序列”是由所述肽的碎片質(zhì)譜的解釋闡明的肽的部分氨基酸序列。
b所述肽的N末端質(zhì)量是核心序列起點和所述肽N末端之間的質(zhì)量。
c所述C末端質(zhì)量是核心序列末端和所述肽C末端之間的質(zhì)量。
發(fā)現(xiàn)所述串聯(lián)氨基酸序列和三個MALDI質(zhì)譜匹配得自人結(jié)腸癌細(xì)胞系的一個EST(登記號AA315020)的翻譯(圖6)。鑒定出重疊EST，這建立了一個104個氨基酸的完整ORF。
通過PCR，從MDA-MB-468 cDNA擴(kuò)增了一個全長克隆。總RNA的制備和cDNA合成
用Trizol試劑(Life Technologies)，按照生產(chǎn)商的說明，從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織樣品制備總RNA，并且以1μg/μl的濃度重懸于無RNA酶的水中。用1-5μg總RNA作為cDNA合成的模板，使用寡聚dT引物和Superscript II反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies)。cDNA經(jīng)柱純化(Qiagen)，以10ng/μl的濃度洗脫。BCMP 84 cDNA的克隆
用以下引物F，5’ATAGGACAACAGAACTCTCACC 3’；R，5’GCTTCAACGGAACTTTGCAGAG 3’，通過PCR從MDA-MB-468cDNA擴(kuò)增預(yù)測的全長BCMP 84 ORF。反應(yīng)物含有10ng cDNA和PCR試劑(Qiagen)，采用以下循環(huán)參數(shù)94℃30秒、60℃30秒40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)柱純化(Qiagen)，克隆到T/A載體(Invitrogen)中，隨后證實所述核苷酸序列(University of Oxford，Sequencing Facility，UK)。
預(yù)測的BCMP 84蛋白顯示出與鈣結(jié)合蛋白的S100家族(例如S100A13，登記號Q99584，與BCMP 84有36％的同一性和67％的同源性)和最近鑒定的cDNA(AAG01893)的相似性，AAG01893在其長度的大部分長度范圍內(nèi)與BCMP 84相同，已經(jīng)被命名為S100A14，并注釋為鈣結(jié)合蛋白S100家族的一個新成員。然而，沒有證明AAG01893/S100A14結(jié)合鈣，并且該基因和BCMP 84缺乏在該蛋白家族成員之間保守的鈣結(jié)合基序。BCMP 84和S100A14之間的2個氨基酸的差異可能是多態(tài)性，匹配我們在BCMP 84中發(fā)現(xiàn)的個體間變異。對該蛋白序列的分析揭示，沒有可能表明BCMP 84特定功能或細(xì)胞位置的蛋白基序。
BCMP 84 mRNA在人組織中的表達(dá)
我們采用實時定量RT-PCR(Heid，C.A.，Stevens，J.，Livak，K.J.和Williams，P.M.實時定量PCR。Genome Res.6，986-994(1996)；Morrison，T.B.，Weis，J.J.和Wittwer，C.T.在擴(kuò)增期間通過連續(xù)SYBR Green I監(jiān)測定量測定低拷貝轉(zhuǎn)錄物。Biotechniques 24，954-958(1998))，以分析BCMP 84mRNA在正常人組織和乳腺癌細(xì)胞系中的分布(圖7)。PCR所用的引物如下有義引物，5’TCTGTGCACTCTGTCTTGGA 3’，反義引物，5’TAGCCAGCTCCTCTCTGTT 3’。在ABI7700序列測定系統(tǒng)(PE Biosystems)上，分析含有如上所述制備的10ng cDNA、SYBRgreen序列測定試劑(PE Biosystems)以及有義引物和反義引物的反應(yīng)物。PCR的條件是50℃2分鐘1個循環(huán)，95℃10分鐘1個循環(huán)，然后95℃15秒、55℃1分鐘40個循環(huán)。以SYBR綠色熒光的增加實時測量PCR產(chǎn)物的積累，用Sequence Detector程序v1.6.3(PE Biosystems)分析數(shù)據(jù)。用所述經(jīng)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物作為模板，產(chǎn)生原始模板拷貝數(shù)與熒光和擴(kuò)增循環(huán)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用該曲線來計算每種樣品中的BCMP 84的拷貝數(shù)。
BCMP 84mRNA的分布限于少數(shù)組織，在結(jié)腸、甲狀腺和胸腺中的表達(dá)水平最高(260-930拷貝/ng cDNA)，在包括乳腺在內(nèi)的其它正常組織中僅檢測到低水平的BCMP 84信使。在BT-20和MDA-MB-468細(xì)胞中檢測到BCMP 84mRNA(分別為300和1600拷貝/ng cDNA)，但在T-47D或CAL51乳腺癌細(xì)胞系中沒有檢測到BCMP 84mRNA。染色體定位輻射雜種作圖
通過得自3’非翻譯區(qū)的以下引物對篩選Genebridge 4 RadiationHybrid panel(Research Genetics Inc.)，完成BCMP 84基因的染色體定位
有義引物，5’TCAGCTTCCTTCCCCAGGTC 3’
反義引物，5’CCCAGCTCCATTATTCA 3’。
擴(kuò)增BCMP 84序列的PCR條件是用Taq DNA聚合酶(Qiagen)和每個反應(yīng)25ng DNA，于94℃變性30秒，然后退火和于55℃延伸30秒(40個循環(huán))。所述引物從所述陽性雜種細(xì)胞系DNA和人基因組DNA中擴(kuò)增了預(yù)期的21 5bp片段，但不能從倉鼠基因組DNA(對照)中擴(kuò)增產(chǎn)物。
將輻射雜種作圖數(shù)據(jù)提交給Whitehead Institute/MIT Centre forGenome research STS作圖服務(wù)器(http//carbon.wi.mit.edu.8000/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)以供分析。
輻射雜種作圖將BCMP 84基因作圖至染色體1q21上S100鈣結(jié)合蛋白基因簇中的STS標(biāo)記AFM291xh1和AFM220xf8之間。因而，雖然BCMP 84與其它S100家族成員僅顯示出有限的同源性，并且缺乏明顯的鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但顯然它與這一蛋白大家族相關(guān)。實施例5組織分布分析材料和方法定量mRNA分析
用雙鏈DNA染料SYBR Green I，采用Morrison等，Biotechniques(1998)24954-8中所述的方法和試劑，使用ABI7700(PE Biosystems，UK)序列測定系統(tǒng)，通過定量實時PCR，測定表1和表2中所述的BCMP 7、17和23(即推定的分泌蛋白XAG(AF088867)、BST2(Q10589)和NCAM2(O15394)在不同細(xì)胞類型中的mRNA水平。
概括而言，通過用純化(Qiagen，UK)PCR產(chǎn)物作為模板產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到mRNA水平的定量。一式三份進(jìn)行含有104、105、106和107模板分子的PCR，以測定擴(kuò)增信號進(jìn)入log線性范圍的循環(huán)數(shù)(閾循環(huán)，Ct)。從而標(biāo)準(zhǔn)曲線確定了Ct和模板濃度之間的關(guān)系，可以用來根據(jù)其相應(yīng)的Ct值得出未知樣品中的原始模板濃度。樣品以一式兩份進(jìn)行測定，每份使用10ng第一鏈cDNA作為原料。
通過寡聚dT引發(fā)的反轉(zhuǎn)錄(SuperscriptII-Life Technologies，UK)，從由多個人類來源混合的RNA(Clontech，USA)衍生人組織cDNA。從通過用Trizol(Life Technologies，UK)提取的組織培養(yǎng)物樣品中，產(chǎn)生人細(xì)胞系T47D、Cal51、MDA-MB468、PC3、PC3M和BT20的總RNA。
用來測定推定的分泌蛋白XAG、BST2和NCAM2 mRNA水平的引物序列是
XAG
正向agataccacagtcaaacctg
反向gcactcatccaagtgatgaa
BST2
正向gatggagtgtcgcaatgtcacc
反向agacgcgtcctgaagcttatgg
NCAM2
正向gatcatagagctgtcgcagacc
反向tgtagtctccttgtccctttcc結(jié)果
結(jié)果示于圖8-10中。在所述圖中，注釋“x10”是指該樣品的數(shù)值是所指示數(shù)值的10倍。
權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防乳腺癌的方法，所述方法包括給予受治療者本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物、和任選的本文表3中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物。
2.本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物、和任選的本文表3中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物在生產(chǎn)乳腺癌治療或預(yù)防藥物方面的用途。
3.一種疫苗，所述疫苗包含本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP或其衍生物和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段。
4.一種權(quán)利要求3的疫苗，所述疫苗還包含本文表3中限定的一種或多種BCMP或其衍生物和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段。
5.一種能夠在受治療者體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答的組合物，所述組合物包含本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段和一種或多種合適的佐劑。
6.一種權(quán)利要求5的組合物，所述組合物還包含本文表3中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段。
7.權(quán)利要求5或權(quán)利要求6的組合物在受治療者體內(nèi)誘發(fā)免疫應(yīng)答方面的用途。
8.本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段、和任選的本文表3中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段在制備免疫原性組合物、優(yōu)選疫苗方面的用途。
9.一種治療或預(yù)防受治療者的乳腺癌、或者為受治療者接種抗乳腺癌的疫苗的方法，所述方法包括下述步驟給予所述受治療者有效量的本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段、和任選的本文表3中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段，最好是作為疫苗給予。
10.一種檢測、診斷和/或篩選乳腺癌的方法，所述方法包括
(a)使本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種抗原性或免疫原性片段、和任選的本文表3中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種抗原性或免疫原性片段與待測樣品接觸；知
(b)檢測抗乳腺癌抗體的存在。
11.本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段、和任選的表3中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段在篩選、檢測和/或診斷乳腺癌方面的用途。
12.一種用于篩選、檢測和/或診斷乳腺癌的試劑盒，所述試劑盒包含本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段。
13.一種權(quán)利要求12的試劑盒，所述試劑盒還包含表3中限定的一種或多種BCMP和/或其一種或多種抗原性或免疫原性片段。
14.一種抗體，所述抗體能夠與本文表1和表2中限定的BCMP免疫特異性結(jié)合。
15.一種試劑盒，所述試劑盒包含一種權(quán)利要求14的抗體。
16.一種試劑盒，所述試劑盒包含多種不同的權(quán)利要求14的抗體。
17.一種藥用組合物，所述藥用組合物包含治療有效量的權(quán)利要求14的抗體或其包含所述抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段或衍生物和任選的藥學(xué)上可接受的載體。
18.一種權(quán)利要求17的藥用組合物，所述藥用組合物還包含治療有效量的能夠與本文表3中限定的BCMP免疫特異性結(jié)合的抗體、或其包含所述抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段或衍生物。
19.一種治療或預(yù)防乳腺癌的方法，所述方法包括給予受治療者權(quán)利要求14的抗體或其包含所述抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段或衍生物和任選的能夠與本文表3中限定的BCMP免疫特異性結(jié)合的抗體或其包含所述抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段或衍生物。
20.權(quán)利要求14的抗體或其包含所述抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段或衍生物和任選的能夠與本文表3中限定的BCMP免疫特異性結(jié)合的抗體或其包含所述抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段或衍生物在生產(chǎn)乳腺癌治療藥物方面的用途。
21.一種治療或預(yù)防乳腺癌的方法，所述方法包括給予需要這種治療或預(yù)防的受治療者治療有效量的編碼本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物的核酸、和任選的治療有效量的編碼本文表3中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物的核酸。
22.一種治療或預(yù)防乳腺癌的方法，所述方法包括給予需要這種治療或預(yù)防的受治療者治療有效量的抑制本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP的功能或表達(dá)的核酸、和任選的治療有效量的抑制本文表3中限定的一種或多種BCMP的功能或表達(dá)的核酸。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述核酸是BCMP反義核酸或核酶。
24.編碼本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物的核酸、和任選的編碼本文表3中限定的一種或多種BCMP或其一種或多種片段或衍生物的核酸在生產(chǎn)乳腺癌治療或預(yù)防藥物方面的用途。
25.抑制本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP的功能或表達(dá)的核酸、和任選的抑制本文表3中限定的一種或多種BCMP的功能或表達(dá)的核酸在生產(chǎn)乳腺癌治療或預(yù)防藥物方面的用途。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述核酸是BCMP反義核酸或核酶。
27.一種篩選和/或診斷人類受治療者乳腺癌的方法，所述方法包括下述步驟鑒定在得自所述人類受治療者的生物樣品中是否存在本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP、和任選的本文表3中限定的一種或多種BCMP。
28.一種監(jiān)測和/或評價人類受治療者的乳腺癌治療的方法，所述方法包括下述步驟鑒定在得自所述人類受治療者的生物樣品中是否存在本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP、和任選地鑒定是否存在本文表3中限定的一種或多種BCMP。
29.一種鑒定在得自人類受治療者的生物樣品中是否存在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的方法，所述方法包括下述步驟鑒定是否存在本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP、和任選地鑒定是否存在本文表3中限定的一種或多種BCMP。
30.一種監(jiān)測和/或評價人類受治療者的乳腺癌治療的方法，所述方法包括下述步驟確定在得自患者的生物樣品中本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP是否增加/減少，和任選的下述步驟確定在得自患者者的生物樣品中本文表3中限定的一種或多種BCMP是否增加/減少。
31.一種權(quán)利要求27-30中任一項的方法，其中所述方法包括一個利用一種或多種針對所述BCMP或每種BCMP、或其衍生物、同系物或片段的抗體的免疫測定步驟。
32.一種權(quán)利要求27-30中任一項的方法，其中所述方法包括應(yīng)用核酸探針和/或PCR反應(yīng)來擴(kuò)增編碼所述BCMP或每種BCMP的核酸。
33.一種權(quán)利要求27-30中任一項的方法，其中對所述受治療者進(jìn)行全身掃描，以確定乳腺癌細(xì)胞、特別是轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的定位。
34.一種權(quán)利要求34的方法，其中使用標(biāo)記的抗體。
35.一種診斷試劑盒，所述試劑盒包含一種或多種用于檢測和/或測定本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP的試劑和任選的一種或多種用于檢測和/或測定本文表3中限定的一種或多種BCMP的試劑。
36.一種權(quán)利要求35的試劑盒，所述試劑盒包括一個或多個含有針對一種或多種BCMP的一種或多種抗體的容器。
37.一種權(quán)利要求36的試劑盒，所述試劑盒還包含所述抗體或每種抗體的標(biāo)記結(jié)合配偶體和/或一個所述抗體或每種抗體在其上固定化的固相(例如一種試劑紙條)。
38.一種權(quán)利要求36的試劑盒，所述試劑盒包含能夠與編碼所述BCMP或每種BCMP的DNA或RNA雜交的核酸探針。
39.一種對受治療者的乳腺癌進(jìn)行篩選、診斷或預(yù)后、或者監(jiān)測給予受治療者的抗乳腺癌藥物或治療效應(yīng)的方法，所述方法包括
(a)通過單向電泳產(chǎn)生特征的單向排列，分析得自所述受治療者的樣品；和
(b)對于其相對豐度與乳腺癌存在與否相關(guān)的至少一個所選特征，將所述樣品中每個這種所選特征的豐度與得自無乳腺癌的一個或多個人的樣品中該所選特征的豐度進(jìn)行比較，或者與先前確定的參比范圍進(jìn)行比較，
其中所述樣品中所述一個或多個所選特征的相對豐度，指示所述受治療者體內(nèi)是否存在乳腺癌。
40.權(quán)利要求39的方法，其中步驟(b)包括定量檢測本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP、和任選地定量檢測本文表3中限定的一種或多種BCMP。
41.一種權(quán)利要求39或權(quán)利要求40的方法，其中步驟(a)包括進(jìn)行等電聚焦電泳，然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。
42.一種對受治療者的乳腺癌進(jìn)行篩選、診斷或預(yù)后、或者監(jiān)測給予受治療者的抗乳腺癌藥物或治療效應(yīng)的方法，所述方法包括在得自所述受治療者的樣品中，定量檢測本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP、和任選地定量檢測本文表3中限定的一種或多種BCMP。
43.權(quán)利要求39-42中任一項的方法，其中所述樣品是乳腺組織樣品。
44.權(quán)利要求42或權(quán)利要求43的方法，其中所述定量檢測步驟包括測試所述樣品，所述測試步驟包括
(1)使所述樣品與對預(yù)選BCMP免疫特異性的抗體接觸；和
(2)檢測在所述抗體和所述樣品中的至少一個種類之間是否已經(jīng)發(fā)生結(jié)合。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述定量檢測步驟包括用多種抗體測試所述樣品，以定量檢測多種預(yù)選BCMP。
46.權(quán)利要求44的方法，其中定量檢測的步驟包括測試所述樣品，所述測試步驟包括
(1)使所述樣品與捕獲試劑接觸，以捕獲所述BCMP；和
(2)用直接或間接標(biāo)記的檢測試劑檢測所述捕獲的BCMP。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述捕獲試劑是一種抗體。
48.權(quán)利要求46或權(quán)利要求47的方法，其中所述BCMP是一種同種型，而所述捕獲試劑識別該同種型中使所述同種型區(qū)別于所述基因家族其它成員的組分，例如對于糖類為凝集素、或磷酸酪氨酸或磷酸絲氨酸/蘇氨酸Ab、或甲基化或乙?；疉b。
49.權(quán)利要求44-48中任一項的方法，其中所述抗體或每種抗體是單克隆抗體。
50.一種篩選與本文表1和表2中限定的BCMP或其生物活性部分相互作用的化合物的方法，所述方法包括
使所述BCMP或其生物活性部分與一種候選化合物接觸；和
測定所述候選化合物與所述BCMP或其生物活性部分相互作用的能力。
51.一種篩選或鑒定調(diào)節(jié)本文表1和表2中限定的BCMP或其生物活性部分活性的化合物的方法，所述方法包括
在第一個等分樣品中，使候選化合物與所述BCMP或其生物活性部分接觸；和
將加入所述候選化合物之后所述第一個等分樣品中所述BCMP或其生物活性部分的活性與對照等分樣品中所述BCMP或其生物活性部分的活性進(jìn)行比較，或者與預(yù)先確定的參比范圍進(jìn)行比較。
52.權(quán)利要求50或權(quán)利要求51的方法，其中所述BCMP或其生物活性部分由細(xì)胞表達(dá)。
53.權(quán)利要求50、51或52的方法，其中所述BCMP或其生物活性部分是重組的。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述多肽或其生物活性部分固定化在固相上。
55.一種篩選調(diào)節(jié)本文表1和表2中限定的BCMP的表達(dá)或活性的化合物的方法，所述方法包括
使一種負(fù)責(zé)產(chǎn)生或降解所述BCMP的酶與候選化合物接觸；
測定所述酶活性的調(diào)節(jié)。
56.一種篩選調(diào)節(jié)本文表1和表2中限定的BCMP的表達(dá)或活性的化合物的方法，所述方法包括
使表達(dá)所述BCMP的的第一組細(xì)胞與候選化合物接觸；
使表達(dá)所述BCMP的第二組細(xì)胞與對照化合物接觸；和
比較所述第一組細(xì)胞和第二組細(xì)胞中所述BCMP或者編碼所述BCMP的mRNA的水平，或者比較所述第一組細(xì)胞和第二組細(xì)胞中細(xì)胞第二信使的誘導(dǎo)水平。
57.一種篩選或鑒定調(diào)節(jié)本文表1和表2中限定的BCMP的表達(dá)或活性的化合物的方法，所述方法包括
將候選化合物給予第一組哺乳動物；
將對照化合物給予第二組哺乳動物；和
比較所述第一組和第二組中所述BCMP或者編碼所述BCMP的mRNA的表達(dá)水平，或者比較所述第一組和第二組中細(xì)胞第二信使的誘導(dǎo)水平。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述哺乳動物是乳腺癌的動物模型。
59.一種對受治療者的乳腺癌進(jìn)行篩選、診斷或預(yù)后、或者監(jiān)測給予受治療者的抗乳腺癌藥物或治療效應(yīng)的方法，所述方法包括
(a)使一種或多種包含與編碼本文表1和表2中限定的一種或多種BCMP的核苷酸序列互補(bǔ)的10個或更多個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸探針、和任選的一種或多種包含與編碼本文表3中限定的一種或多種BCMP的核苷酸序列互補(bǔ)的10個或更多個連續(xù)核苷酸的寡核苷酸探針，與從所述受治療者的生物樣品中獲得的RNA接觸，或者與從所述RNA拷貝的cDNA接觸，其中在存在所述核苷酸序列時則允許所述探針與所述核苷酸序列雜交的條件下發(fā)生所述接觸；
(b)檢測所述探針和所述核苷酸序列之間的雜交，如果有雜交的話；和
(c)如果有步驟(b)中雜交的話，將在步驟(b)中檢測到的雜交與在對照樣品中檢測到的雜交或與預(yù)先確定的參比范圍進(jìn)行比較。
60.權(quán)利要求61的方法，其中步驟(a)包括使所述核苷酸序列與一種核苷酸陣列、優(yōu)選DNA陣列雜交的步驟，其中所述陣列的一個或多個成員是與編碼不同BCMP的多個核苷酸序列互補(bǔ)的探針。
61.與表1和表2中限定的一種或多種BCMP相互作用或調(diào)節(jié)所述BCMP活性的因子在生產(chǎn)乳腺癌治療藥物方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于乳腺癌篩選、診斷和預(yù)后、監(jiān)測乳腺癌治療功效以及藥物開發(fā)的方法和組合物。
文檔編號A61K48/00GK1426307SQ01808488
公開日2003年6月25日 申請日期2001年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月25日
發(fā)明者R·S·博伊德, A·C·斯塔姆普斯, J·A·特雷特 申請人:牛津格萊克科學(xué)(英國)有限公司