專利名稱：聚乙二醇修飾重組人干擾素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干擾素，具體地說是一種聚乙二醇修飾的干擾素。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)藥物臨床應(yīng)用的安全性和有效性一直是人們關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)藥物由于穩(wěn)定性差，血漿清除率高，體內(nèi)半衰期短，易產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，因此在臨床治療中受到很大的限制。因此研究人員采用了各種藥物傳遞技術(shù)來提高蛋白質(zhì)藥物的療效，包括采用不同的給藥途徑(如口服，鼻腔給藥，透皮吸收)，不同的載體(如微球，脂質(zhì)體，紅細(xì)胞，單克隆抗體)，不同高分子材料(如多糖)，不同藥物釋放技術(shù)(如控釋緩釋技術(shù)，前藥)。而目前在藥物傳遞技術(shù)中研究最為廣泛的就是聚乙二醇[Poly(ethylene glycol)，PEG]修飾技術(shù)，這是近二十年來發(fā)展起來的一種用于改進(jìn)蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的新技術(shù)，它將活化的聚乙二醇分子鍵合到蛋白質(zhì)分子表面上，影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改變。研究證實(shí)，通過共價(jià)鍵用PEG來修飾蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基可以有效提高血漿半衰期，減少給藥次數(shù)，還可以降低蛋白質(zhì)的免疫原性[參見Katre NV.The conjugation of proteins with polyethylene glycol andother polymersAltering properties of proteins to enhance theirtherapeutic potential.Adv Drug Delivery Reviews 10.199391-114；NucciML，Shorr R，Abuchowshi A.The therapeutic value of poly(ethyleneglycol)-modified proteins.Advanced Drug Delivery Reviews6，1991133-151；Zalipsky S.Chemistry of polyenthylene glycol conjugateswith biologicallyactive molecules.Advanced Drug Delivery Reviews16，1995157-182；Inada Y，F(xiàn)urukawa M，Sasaki H et al.Biomedical andbiotechnological applications of PEG- and PM-modified proteins.Focus，1995；1386-91.]。
早在十年前，重組IFN-α就被FDA批準(zhǔn)用于多毛細(xì)胞白血病的治療，目前它的適應(yīng)癥覆蓋了很大一塊治療領(lǐng)域，在臨床上主要應(yīng)用于病毒性肝炎、抗癌、急性傳染病、免疫功能低下和IFN缺乏綜合癥的治療[胡天兵，梁文素.干擾素的臨床應(yīng)用.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2000；19(1)，71.]。但目前臨床上使用的由大腸桿菌產(chǎn)生重組的IFN-α2b同樣具有體內(nèi)半衰期短的缺點(diǎn)，且具有抗原性，副作用較為明顯。如何獲得緩釋、長(zhǎng)效形式的干擾素，改善它的藥物動(dòng)方學(xué)以提高耐受性及給藥便利程度，一直是研究的重點(diǎn)。
目前大多數(shù)的研究是將多肽分子中的氨基作為修飾位點(diǎn)。制備蛋白質(zhì)和聚乙二醇結(jié)合物的最常用的方法是利用PEG活化后形成的親電子基團(tuán)和蛋白質(zhì)上的氨基進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后可以在一個(gè)球蛋白分子上共價(jià)連接數(shù)個(gè)聚合物長(zhǎng)鏈，聚合物長(zhǎng)鏈的數(shù)目取決于蛋白質(zhì)分子上可供結(jié)合的位點(diǎn)數(shù)(自由氨基和其他親電子基團(tuán))、修飾劑的化學(xué)性質(zhì)，修飾劑的過量比例及反應(yīng)條件。PEG的衍生物大致有芳化試劑(含氯化芳基基團(tuán)，可以與蛋白質(zhì)上的親核基團(tuán)反應(yīng))、酰化試劑(含?；c蛋白質(zhì)通過酰氨鍵相連)或烷化試劑(與蛋白質(zhì)上的氨基形成仲氨連接)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是將重組人干擾素用聚乙二醇長(zhǎng)鏈修飾。
本發(fā)明的具體的技術(shù)方案如下一種聚乙二醇修飾的重組人干擾素，它是重組人干擾素上連接有一條，或者二條或二條以上的聚乙二醇鏈。上述的重組人干擾素可以是干擾素α2b。上述的聚乙二醇鏈的平均聚合度n為45-230。
本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人干擾素的制備方法是在干擾素α的溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調(diào)節(jié)其pH值至7.5-9.5，然后加入碳酸單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯在0-15℃下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間不少于15分鐘，將反應(yīng)混合液進(jìn)行色譜分離，采用Superdex 75 Highload制備型凝膠色譜柱，流動(dòng)相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液，色譜分離可得聚乙二醇單修飾的重組人干擾素和聚乙二醇多修飾的重組人干擾素。 SchemeUse of SC-mPEG for attachment of mPEG to proteinsmPEGCH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人干擾素的用途是用于制備抗病毒藥物、抗癌藥物、及治療免疫功能低下和IFN缺乏綜合癥的藥物。
本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人干擾素能夠基本保持干擾素的抗病毒活性，同時(shí)它又比未修飾的重組人干擾素有較好的熱穩(wěn)定性和酶穩(wěn)定性，它的血漿清除率低，體內(nèi)半衰期長(zhǎng)，肝臟積蓄能力強(qiáng)，因此作為抗病毒、抗癌等素藥物，它比未修飾的重組人干擾素有更大的優(yōu)越性。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人干擾素的制備方法，簡(jiǎn)單易行。
四

圖1是SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖，其中1為天然干擾素；2為蛋白質(zhì)分子量的標(biāo)樣；3為干擾素峰；4為單甲氧基聚乙二醇單修飾的重組人干擾素峰；5為單甲氧基聚乙二醇多修飾的重組人干擾素峰。
圖2是干擾素α2b和單甲氧基聚乙二醇修飾的干擾素α2b在鼠的肝臟中分布的比較。
圖3是用125I標(biāo)記法研究修飾后干擾素藥代動(dòng)力學(xué)的流程圖。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1碳酸單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯(SC-mpEG)的制備稱取6g單甲氧基聚乙二醇5000，三光氣0.56g，溶于甲苯20ml和二氯甲烷12ml中，逐滴加入無水三乙胺1ml，攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液抽真空，揮去大部分溶劑，將所得殘?jiān)匦氯芙庥诩妆?ml和二氯甲烷10ml中。加入羥基琥珀酰亞胺0.21g，取三乙胺0.3ml，用二氯甲烷3ml稀釋，逐滴加入反應(yīng)液中，繼續(xù)反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液過濾并抽真空，所得殘?jiān)芙庥?0℃乙酸乙酯60ml中，過濾，冷卻后所得結(jié)晶即SC-PEG粗品。將所得產(chǎn)物用乙酸乙酯反復(fù)重結(jié)晶。測(cè)定產(chǎn)品的紅外光譜，有如下特征峰1812，1789(C＝O，琥珀酰亞胺)；1742(C＝O，羧基)；1114(CH2OCH2)。測(cè)定產(chǎn)品的核磁共振光譜(H-NMR，CDCl3)，有如下特征峰4.35(m，4H，CH2OCO2)；3.55(s，～500H，PEG)；2.74(s，8H，CH2C＝O)。
實(shí)施例2 SC-PEG對(duì)干擾素的修飾條件的選擇反應(yīng)時(shí)間的選擇取干擾素濃縮液1ml(0.9mg/ml)，加入0.2M的磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5-8.5，取0.2ml分別置于4支帶塞試管中。每支試管分別加入0.1mg的SC-PEG反應(yīng)15min、30min、1h、2h后終止反應(yīng)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。比較修飾率，確定修飾條件。結(jié)果表明，反應(yīng)15分鐘是修飾率較低，大部分干擾素沒有被修飾，反應(yīng)30分鐘時(shí)修飾率有所提高，產(chǎn)物以修飾一條和兩條鏈的干擾素為主，反應(yīng)1-2小時(shí)，圖譜條帶無明顯差異。
反應(yīng)pH值的選擇取干擾素濃縮液1ml(0.9mg/ml)，各取0.2ml分別置于3支帶塞試管中，加入0.2M的磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5、8.5、9.5，每支試管分別加入0.1mg的SC-PEG反應(yīng)1h后終止反應(yīng)，以HPLC檢測(cè)。確定修飾反應(yīng)的pH值。結(jié)果表明當(dāng)pH為7.5時(shí)修飾率過低，大部分干擾素沒有被修飾，而pH9.5時(shí)修飾過度，多于兩條鏈的修飾產(chǎn)物較多，且不均一，不利于保持干擾素的活性。
實(shí)施例3修飾產(chǎn)物的分離純化與鑒定取干擾素α2b原液50ml(0.09mg/ml)，將其pH值調(diào)至8.5，再加入SC-mPEG固體80mg，溶解，混勻，于4℃反應(yīng)1h，加入2g甘氨酸固體終止反應(yīng)。
取上述反應(yīng)液10ml，上柱分離。色譜條件Superdex 75 Highload制備型凝膠色譜柱(26×600mm，22-24μm)，柱體積320ml，流動(dòng)相為含0.15M NaCl的0.01M磷酸鹽緩沖液(pH7.18)，流速1.5ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。收集各洗脫峰。結(jié)果表明，分子量大于標(biāo)準(zhǔn)干擾素的洗脫峰有兩個(gè)，分別為單修飾干擾素和多修飾干擾素。
將各洗脫峰適當(dāng)濃縮，采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)，分離膠15％，濃縮膠5％。結(jié)果見圖1，其表明各分離組分呈單一條帶。實(shí)施例4修飾后各組分的抗病毒活性測(cè)定[中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中國(guó)生物制品規(guī)程一部.一九九五年版.北京中國(guó)人口出版社，1995268-269.]用Wish細(xì)胞(人羊膜傳代細(xì)胞)-VSV病毒(濾泡性口腔炎病毒)系統(tǒng)測(cè)定各洗脫峰的抗病毒活性。采用CPE(細(xì)胞致病效應(yīng))抑制為基礎(chǔ)的抑制微量測(cè)定法，以每毫升干擾素檢品的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞(50％)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數(shù)為干擾素單位。以國(guó)際單位(IU)表示，并用國(guó)家IFNα標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正。結(jié)果見表1。
Tab 1.Antiviral Activity of Conjugates of IFNα2b and SC-mPEG.
Specific ActivitySamples(IU/mg)Unmodified IFN45.5×107α2bMono-mPEG-IF 47.4×106Nα2bPoly- 1.5×106mPEG-IFNα2b實(shí)施例5修飾后干擾素體外穩(wěn)定性的研究熱穩(wěn)定性取IFN、mono-mPEG-IFN、poly-mPEG-IFN各IMIU，分別置于4℃、25℃、37℃條件下，定時(shí)取樣測(cè)定干擾素的抗病毒活性。結(jié)果表明，干擾素α2b在37℃下2h內(nèi)活性不變，單修飾干擾素α2b在4-6h內(nèi)能夠維持90％的活性，多修飾干擾素α2b在4-6h內(nèi)能夠維持活性不變。25℃時(shí)干擾素α2b在1天內(nèi)能夠活性不變，單修飾干擾素α2b在2天以上能夠維持90％的活性，而多修飾干擾素α2b在2-4天內(nèi)能夠維持活性不變。干擾素α2b在4-6天內(nèi)可以保持活性不變。而單修飾干擾素α2b8-10天，多修飾干擾素α2b18-24天，維持抗病毒活性不變(上述穩(wěn)定性試驗(yàn)是在液體狀態(tài)，無任何保護(hù)劑的條件下進(jìn)行的)。因此，可以初步認(rèn)為聚乙二醇修飾可以明顯增加干擾素α2b的熱穩(wěn)定性。
酶穩(wěn)定性取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.84)2.7ml，各加入0.3mlIFN、mono-mPEG-IFN、poly-mPEG-IFN樣品，25℃保溫，于0，20，40，60，90min，3，4.5，6h取樣0.3ml，測(cè)定干擾素的抗病毒活性。結(jié)果表明，干擾素α2b在3-5min內(nèi)活性迅速降到原來的50％，而單修飾干擾素α2b在10-15min，多修飾干擾素α2b在15-30min。因此，聚乙二醇修飾能夠明顯增強(qiáng)干擾素α2b抵抗耐胰蛋白酶水解的能力。
人血清中的穩(wěn)定性結(jié)果表明，在37℃下。干擾素α2b 3h內(nèi)，單修飾干擾素α2b 6h內(nèi)，而多修飾干擾素α2b 12h內(nèi)，保持活性不變。
實(shí)施例6修飾后干擾素藥代動(dòng)力學(xué)研究(125I標(biāo)記法)主要參數(shù)包括(1)半衰期，(2)體內(nèi)分布干擾素α2b和單修飾干擾素α2b的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算將125I-干擾素α2b的全血的血藥濃度與125I-單修飾干擾素α2b的全血的血藥濃度進(jìn)行校正后。經(jīng)計(jì)算機(jī)擬合，結(jié)果符合一級(jí)消除動(dòng)力學(xué)的二房室模型，即C(t)＝A·e-αt+B·e-βt，計(jì)算各動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表2)。曲線下面積(AUC與劑量(D)成線性關(guān)系。125I-干擾素α2b的AUC對(duì)劑量D的回歸方程AUC＝-1.003+2.888·D(r＝0.994，n＝3)；125I-單修飾干擾素α2b的AUC對(duì)劑量D的回歸方程AUC＝-0.379+2.212·D(r＝0.9992，n＝3)。
組織分布除了腎臟(干擾素α2b的主要代謝器官)以外，125I-單修飾干擾素α2b在其他各組織中的分布比125I-干擾素α2b的高，因此可以認(rèn)為聚乙二醇修飾可以提高干擾素α2b在組織中的利用率。125I-干擾素α2b的總體分布胃＞腎＞肺＞脾＞肝＞心＞腦，而125I-單修飾干擾素α2b的總體分布胃＞肝＞腎＞脾＞肺＞心＞腦。聚乙二醇修飾明顯改變干擾素α2b的體內(nèi)分布比例，特別是聚乙二醇修飾干擾素α2b在腎臟的分布降低，而在肝臟的分布增加。從圖2可以看出，在不同時(shí)間點(diǎn)125I-單修飾干擾素α2b(125I-mono-PEG-IFNα2b)在肝臟的分布明顯高于125I-干擾素α2b(125I-IFN-α2b)。125I-單修飾干擾素α2b的含量為干擾素α2b的4-10倍。
Tab.2 Pharmacokinetic parmeters of125I-IFN-α2b and125I-mono-PEG-IFN-α2b afteri.v.injection in rats(n＝8)125I-IFNα2b125I-PEG-IFNα2b1ug/kg 3ug/kg 5ug/kg 1ug/kg 3ug/kg5ug/kgA(pg/ml) 48495 6805 21136 37025818724679B(pg/ml) 9087 1250 4124 791112314158α(h-1)16.85 23.47 20.92 20.6617.14 17.17β(h-1)0.9595 0.2545 0.21870.25780.6811 0.7582k21(h-1)3.35 3.86 3.60 3.852.833.129.63 18.31 16.27 15.69k12(h-1) 10.86 10.64 4.83 1.55 1.27 1.38k10(h-1) 4.134.170.0411 0.0295 0.03310.0335t1/2α(h) 0.0404 0.0404 0.665 2.72 3.17 2.69t1/2β(h) 1.020.914 8.39 12.4 11.88 11.13Vc(L/kg) 10.63 10.40 42.24 75.58 68.99 59.58Vd(L/kg) 64.46 57.20 1.381×1061.932×1056.060×1051.078×106AUC 2.25×1056.918×105(pg·h/ml) 0.362 0.518 0.495 0.464CL(ml/h·kg) 0.443 0.43權(quán)利要求
1.一種聚乙二醇修飾的重組人干擾素，其特征是重組人干擾素上連接有一條，或者二條或二條以上的聚乙二醇鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素，其特征是重組人干擾素是干擾素α2b。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素，其特征是聚乙二醇鏈的平均聚合度n為45-230。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素的方法，其特征是在干擾素α的溶液中加入堿溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.5-9.5，然后加入碳酸單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯，在0-15℃下進(jìn)行反應(yīng)，將反應(yīng)混合液進(jìn)行色譜分離，得聚乙二醇單修飾的重組人干擾素和聚乙二醇多修飾的重組人干擾素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是干擾素α加入碳酸單甲氧基聚二醇琥珀酰亞胺酯后的反應(yīng)時(shí)間不少于15分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是反應(yīng)混合液進(jìn)行色譜分離，色譜條件是采用Superdex 75 Highload制備型凝膠色譜柱，流動(dòng)相為含NaCl的磷酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙二醇修飾的重組人干擾素的用途，其特征是制備抗病毒藥物。
全文摘要
一種聚乙二醇修飾的重組人干擾素,它是重組人干擾素上連接有一條,或者二條或二長(zhǎng)以上的聚乙二醇鏈。上述的重組人干擾素可以是干擾素α2b。上述的聚乙二醇鏈的平均聚合度n為45－230。本發(fā)明的聚乙二醇修飾的重組人干擾素具有干擾素的生理活性,而穩(wěn)定性優(yōu)于干擾素,它的血漿清除率低,體內(nèi)半衰期長(zhǎng),可用于制備抗病毒、抗癌等藥物,本發(fā)明公開了聚乙二醇修飾的重組人干擾素的制法。
文檔編號(hào)A61K38/21GK1375502SQ0113408
公開日2002年10月23日 申請(qǐng)日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月25日
發(fā)明者姚文兵, 楊曉兵, 吳梧桐, 田浤, 林碧蓉 申請(qǐng)人:南京藥科大學(xué)