專(zhuān)利名稱(chēng)：血管生成抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及固體砷華(As4O6)及其藥物組合物的用途，其中As4O6為一種血管生成抑制劑。特別是，本發(fā)明涉及As4O6(已知為‘Chonjisan’)應(yīng)用于治療血管生成和其它相關(guān)疾病的新應(yīng)用。
2.技術(shù)背景描述血管生成，即由內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的過(guò)程，其對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)很關(guān)鍵(Folkman J.Watson K，Ingber D，Hnahan D，在細(xì)胞增生向瘤形成的轉(zhuǎn)化過(guò)程中誘導(dǎo)血管生成(Induction of angiognesis during the transitionfrom hyperplasia to neoplasia)，Nature 1989 May 4；339(6219)；58-61)。其主要特性在一些血管性疾病中更為顯見(jiàn)，例如在糖尿病性視網(wǎng)膜病、關(guān)節(jié)炎、血管瘤和牛皮癬(Klagsbrun M & Folkman J in PeptideGrowth Factors and Their Receptors II(eds Sporn M.B & Boberts，A.B.)549-586(Spring，Berlin，1990))。
通?？稍谝恍┗颊叩慕悄ぶ杏^(guān)察到血管的侵入和再生，這些患者包括患有Stevens-Johnson氏癥狀簇(糜爛性多口外胚葉發(fā)育不全癥)及類(lèi)似疾病、眼類(lèi)天皰瘡及類(lèi)似疾病、由毒性化學(xué)品，即堿、酸、洗滌劑或各種溶劑和揮發(fā)性氣體，而引起的角膜化學(xué)性損傷、沙眼、病毒感染、小水泡角膜炎；角膜移植患者；長(zhǎng)期使用隱型眼鏡的患者。水性腔、晶狀體或玻璃體最初是透明無(wú)血管的，如果在這些組織中發(fā)生了新血管生成，嚴(yán)重的視力下降會(huì)導(dǎo)致日常生活困難。因此，人們對(duì)抑制新血管生成進(jìn)行了一些醫(yī)學(xué)研究。
一般已知的血管生成抑制劑包括魚(yú)精蛋白敷用藥物(Taylor，S.etal.，Nature，297，307，1982)、肝素與cortizon的組合物(Folkman，J.Etal.，Science，221，71，1983)、醋酸強(qiáng)的松龍(Robin，J.B.，Arch，Opthalmol.，103，284，1985)、磺化多糖(日本專(zhuān)利laid-open No.63-119500)、除莠霉素A(日本專(zhuān)利laid-open No.63-295509)、煙曲霉素(日本專(zhuān)利laid-open No.1-279828)及β-干擾素(美國(guó)專(zhuān)利5,948,403)。然而，由于活性不充分，它們中的大多數(shù)并不能令人滿(mǎn)意，且它們對(duì)人體的不利副作用尤其令人關(guān)注。
砷是眾所周知的強(qiáng)環(huán)境致癌物，可引起皮膚癌和肺癌。但是，它在中藥中一直用于治療牛皮癬、梅毒和風(fēng)濕。令人注意的是，直到1970年，中國(guó)人發(fā)現(xiàn)三氧化砷(As2O3)可治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)。目前，在全世界包括美國(guó)在內(nèi)，一些關(guān)于砷化合物功能基團(tuán)和其應(yīng)用的研究正在積極地進(jìn)行(Zhang TD用“AiLing No.1”治療急性粒細(xì)胞性白血病-臨床分析和實(shí)驗(yàn)室研究(Treatment of acutegranulocytic leukemia with“Ai Ling No.1”-Clinical analysis andexperimental research).Chin J Integrated Chin West Med 419，1984)(LiYS，Zhang TD，Li CHW，Zhao XL，Wei ZHR，Tan W，Li RL，Mao YY27位惡性淋巴瘤患者治療中的中藥和西藥(Traditional Chinese andWestern Medicine in the treatment of 27 patients with malignantlymphoma).Chin J Oncol 1061，1988)(Sun HD，Ma L，Hu XC，Zhang TDAi-Lin I治療32例急性粒細(xì)胞性白血病(Ai-Lin I treated 32 cases ofacute promyelocytic leukemia).Chin J Integrated Chin West Med 12170，1992，Blood 1997 May 1；89(9)3354-60在治療急性粒細(xì)胞性白血病(APL)中使用三氧化砷(As2O3)II對(duì)復(fù)發(fā)患者的臨床療效及藥代動(dòng)力學(xué)(Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocyticleukemia(APL)II.Clinical efficacy and pharmacokinetics in relapsedpatients).Shen ZX，Chen GQ，Ni JH，Li XS，Xiong SM，Qiu QY，Zhu J，Tang W，Sun GL，Yang KQ，Chen Y，Zhou L，F(xiàn)ang ZW，Wang YT，Ma J，Zhang TD，Chen SJ，Chen Z，Wang ZY)。
在西方國(guó)家，曾用砷化合物治療梅毒，而現(xiàn)在一種用于治療錐蟲(chóng)病的有機(jī)砷米拉索普是唯一使用的砷化合物。體外研究揭示，通過(guò)經(jīng)減量調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白和/或caspases活性來(lái)誘導(dǎo)凋亡，三氧化砷和米拉索普不僅對(duì)APL細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，而且對(duì)其它類(lèi)型的白血病細(xì)胞也具有細(xì)胞毒性(Blood 1998 Sep 1；92(5)1497-504三氧化砷和米拉索普誘導(dǎo)骨髓性白血病細(xì)胞系中的細(xì)胞程序死亡并通過(guò)PML和PML-RAR alpha非依賴(lài)性方式發(fā)揮作用(Arsenic trioxide and melarsoprolinduce programmed cell death in myeloid leukemia cell lines and functionin PML and PML-RAR alpha independent manner).Wang ZG，Rivi R，Delva L，Konig A Scheinberg DA，Gambacorti-Passerini C，Gabrilove JL，Warrell RP Jr.，Pandolfi PP，Blood 1996 Aug 1；88(3)1052-61對(duì)三氧化砷(As2O3)在治療急性粒細(xì)胞性白血病中的細(xì)胞與分子機(jī)制的體外研究伴隨Bcl-2表達(dá)的減量調(diào)節(jié)和PML-RAR alpha/PML蛋白的調(diào)節(jié)，As2O3誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡(In vitro studies on cellular and molecularmechanisms of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acutepromyelocytic leukemiaAs2O3induces NB4 cell apoptosis withdownregulation of Bel-2 expression and modulation of PML-RARalpha/PML proteins).Chen GQ，Zhu J，Shi XG，Ni JH，Zhong HJ，SiGY，Jin XL，Tang W，Li XS，Xong SM，Shen ZX，Sun GL，Ma J，Zhang P，Zhang TD，Gazin C，Naoe T，Chen SJ，Wang ZY，Chen Z，Blood 1997 May1；89(9)3345-53三氧化砷(As2O3)在急性粒細(xì)胞性白血病(APL)治療中的使用I.As2O3對(duì)APL細(xì)胞發(fā)揮劑量依賴(lài)性雙重功效(Use of arsenictrioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia(APL)I.As2O3exerts dose-dependent dual effects on APL celis).Chen GQ，Shi XG，Tang W，Xiong SM，Zhu J，Cai X，Han ZG，Ni JH，Shi GY，Jia PM，LiuMM，He KL，Niu C，Ma J，Zhang P，Zhang TD，Paul P，Naoe T，KitamuraK，Miller W，Waxam S，Wang ZY，de The H，Chen SJ，Chen Z，Br JHaematol 1998 Sep；102(4)1055-60砷誘導(dǎo)體外B細(xì)胞白血病細(xì)胞系中的凋亡caspases的活化及Bcl-2蛋白的減量調(diào)節(jié)(Arsenic inducesapoptosis in B-cell leukaemic cell lines in vitroactivation of caspases anddown-regulation of Bcl-2 protein).Akao Y，Mizoguchi H，Kojima S，NaoeT，Ohishi N，Yagi K，Blood 1997 Jul 15；90(2)562-70，米拉索普和三氧化砷在慢性B細(xì)胞白血病細(xì)胞系中的相對(duì)活性(Comparative activity ofmelarsoprol and arsenic trioxide in chronic B-cell leukemia lines).，KonigA，Wrazel L，Warrell RP Jr.，Rivi R，Pandolfi PP，Jakubowski A，Gabrilove JL)。
砷華(固體As4O6)為三氧化砷和其它大多數(shù)砷化合物提供了起始原料，它也用于殺蟲(chóng)劑，并還用作玻璃制造中的脫色劑和皮革防腐劑。因此，與三氧化砷一樣，砷華也被認(rèn)為是一種有毒的致癌化學(xué)物質(zhì)，化學(xué)家主要關(guān)心的僅是其分子結(jié)構(gòu)(Becker KA.，Plieth K.，andStranski I.N.三氧化砷的多形性變化(The polymorphic modifications ofarsenic trioxide).Prog.Inorg.Chem.4，1-72(1962)，Pupp C，Lao R.C.，Murray J.J.，pottie R.F.，一些多環(huán)芳香烴類(lèi)、As4O6和SeO2的平衡蒸氣壓，以及這些空氣污染物的收集效率(Equilibrium vapor concentrationsof some polycyelic aromatic hybrocarbons.As4O6and SeO2and thecollection efficiencies of these air pollutants).Atmospheric EnvironmentVol.8，pp 915-925，1974，Grzechnik A.固體As4O6的可壓縮性及振動(dòng)方式(Compressibility and vibrational modes in solid As4O6)Journal ofSolid State Chemistry，144(2)416-422，1999 May)。
同時(shí)，該發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，源自天然砷礦的As4O6可用作一種抗癌劑。因此，他向韓國(guó)工業(yè)產(chǎn)權(quán)局申請(qǐng)專(zhuān)利1998-16486，在1999年，日本專(zhuān)利局以同一發(fā)明授權(quán)他專(zhuān)利(日本專(zhuān)利No.3007627)。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，當(dāng)通過(guò)口服給藥時(shí)，三氧化砷在胃腸道和肝臟引起嚴(yán)重的副作用(Shen ZX，Chen GQ，Ni JH，Li XS，Xiong SM，Qiu QY，Zhu J，Tang W，Sun GL，Yang KQ，Chen Y，Zhou L，F(xiàn)ang ZW，Wang YT，Ma J，Zhang P，Zhang TD，Chen SJ，Chen Z，Wang ZY三氧化砷在急性粒細(xì)胞性白血病(APL)治療中的使用II.對(duì)復(fù)發(fā)患者的臨床療效及藥代動(dòng)力學(xué)(Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acutepromyelocytic leukemia(APL)II.Clinical efficacy and pharmacokineticsin relapsed patients).Blood 1997 May 1；89(9)3354-60)。然而，根據(jù)發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)，當(dāng)對(duì)重約200g的Sprague Dawley鼠口服給藥砷華100mg/kg28天時(shí)，只在腎觀(guān)察到較小的組織學(xué)變化，且并沒(méi)有在胃腸道和肝臟觀(guān)察到副作用。而且，如果使用10mg/kg和1mg/kg，則沒(méi)有觀(guān)察到任何的副作用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由上述血管生成抑制劑構(gòu)成的藥物組合物。
圖2顯示本發(fā)明的砷華治療對(duì)BCE細(xì)胞增殖的抑制。
圖3顯示砷華對(duì)BCE細(xì)胞趨化性的影響。
圖4(A)至4(C)顯示本發(fā)明的砷華對(duì)新血管生成的抑制作用。
圖5(A)至5(B)顯示本發(fā)明的砷華經(jīng)口服給藥對(duì)鼠角膜新血管生成的抑制作用。
圖5(C)至5(E)是鼠經(jīng)口服給藥本發(fā)明的砷華后，其角膜的新血管生成的血管長(zhǎng)度、鐘時(shí)和血管區(qū)域示意圖。
發(fā)明詳述為達(dá)到上述目的，本發(fā)明人使用

圖1所示結(jié)構(gòu)的砷華進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)砷華抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化性及由基礎(chǔ)纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)誘導(dǎo)的新血管生成。
本發(fā)明的砷華已知為‘Chonjisan’，其制備方法已通過(guò)同一發(fā)明人的韓國(guó)專(zhuān)利1998-16486得以公開(kāi)。按照此方法，通過(guò)使用天然砷礦或砷試劑經(jīng)一系列的熱途徑來(lái)制備純的固體砷華。由于此方法可參考上述專(zhuān)利，所以在此不作詳細(xì)描述。只要提到以下一點(diǎn)就已足夠，即只要制得的砷華與圖1所示結(jié)構(gòu)相同，也可使用其它的制備方法。
當(dāng)約50mg/kg/天本發(fā)明的血管生成抑制劑對(duì)一只鼠口服給藥時(shí)，證明由bFGF刺激的角膜新血管生成可被顯著抑制。在用于人時(shí)，可根據(jù)患者的疾病、年齡、性別和健康狀況調(diào)節(jié)血管生成抑制劑的劑量。
本發(fā)明的血管生成抑制劑可單獨(dú)使用，或與其他血管生成抑制劑組合使用。賦形劑、崩解劑、調(diào)味劑、助流劑及其他藥學(xué)可接受的添加物經(jīng)常與砷華組合，并通過(guò)口服或腸胃外投藥法得以使用。這里，劑型可選自粉劑、片劑或液態(tài)劑型。
而且，本發(fā)明的血管生成抑制劑可單獨(dú)使用，或與其他藥物聯(lián)合使用，這些藥物用于治療與血管生成機(jī)制相關(guān)的一些疾病，如癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管瘤和牛皮癬。
現(xiàn)在參照以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。實(shí)施例1.抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以下實(shí)驗(yàn)用于研究砷華是否抑制牛毛細(xì)血管上皮(BCE)細(xì)胞的增殖。
1)動(dòng)物、試劑和細(xì)胞使用重200g的雄性Sprague-Dawley鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。將砷華(固體As4O6)溶于水中直至其成為lmM儲(chǔ)備液，并保持于室溫。牛毛細(xì)血管上皮(BCE)細(xì)胞由Dr.Tae-Hee Lee提供(Lee，T.H.，Rhim，T.，andKim，S.S.(1998)凝血酶原inkringle-2域?qū)τ诨A(chǔ)纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激的毛細(xì)血管上皮細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制活性(Prothromb inkringle-2domain has a growth inhibitory activity against basic fibroblast growthfactor-stimulated capillary endothelial cells).J.Biol.Chem.273，28805-28812)。BCE細(xì)胞保存于Dulbecco改進(jìn)的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)，其中添加有10％熱滅活的牛胎血清(BCS；Hyclone Laboratories，Logan，Utah)L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(110單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)和1.5ng/ml重組的人基礎(chǔ)纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF；R&D Systems，Minneapolis，MN)。然后，將細(xì)胞在10％CO2的條件下于37℃溫育。本實(shí)驗(yàn)使用傳代10-15的細(xì)胞。
2)內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)的進(jìn)行如Cao等所述(Cao，Y.，A.，An，S.S.A.，Ji，R.W.，Davodson，D.，Cao，Y.，and Llinas，M.(1997)血纖維蛋白溶酶原的Kringle5是新的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑(Kringle5 of plasminogen is anovel inhibitor for endothelial cell growth).J.Biol.Chem.271，22924-22928)。將生長(zhǎng)于明膠包被板的細(xì)胞分散在0.05％胰蛋白酶溶液中并用含10％BCS的DMEM使之重新懸浮。將近12,500個(gè)細(xì)胞加入明膠化24孔板的每一個(gè)孔中，在10％CO2下于37℃溫育24小時(shí)。用0.25ml含5％BCS的新鮮DMEM替換培養(yǎng)基，并將樣品加入每一孔中。溫育30分鐘后，加入培養(yǎng)基，使最終達(dá)到0.5ml DMEM含5％BCS和3ng/ml bFGF。溫育72小時(shí)后，細(xì)胞被胰蛋白酶化，并用血球計(jì)計(jì)數(shù)。每一種條件平行進(jìn)行三份，且實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。
特別地，在3ng/ml bFGF的存在下，用BCE細(xì)胞分析濃度為10-200nM(10nM、20nM、50nM、100nM和200nM)的砷華。圖2顯示來(lái)自bFGF刺激的細(xì)胞和用作比較的無(wú)bFGF刺激的對(duì)照細(xì)胞的數(shù)據(jù)。結(jié)果，砷華對(duì)BCE細(xì)胞的抑制在100nM時(shí)最大，這顯示抑制作用依賴(lài)于劑量(IC50＝99nM)。在3天的溫育后，未檢測(cè)出明顯的與凋亡內(nèi)皮細(xì)胞相伴隨的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，其包括脫離、變圓和碎裂。實(shí)施例2.砷華對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞侵入的影響確定了砷華對(duì)牛毛細(xì)血管內(nèi)皮(BCE)細(xì)胞侵入的影響。
1)動(dòng)物和細(xì)胞使用與實(shí)施例1相同的動(dòng)物和細(xì)胞。
2)砷華對(duì)趨化性的影響用改進(jìn)的Boyden室進(jìn)行趨化性試驗(yàn)，其中Boyden室裝有聚碳酸酯核孔膜(Boyden Chamber，Corning，Coring，NY)，其述于雜志(Veronique Rigot，Maxime Lehmann，F(xiàn)rederic andre，Noucha Daemi，Jacques Marvaldi and Jose Luis結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移所需的整合蛋白的連接和PCC的活化(Integrin ligation and PKC activation are required formigration of colon carcinoma cells).Journal of cell science 11l，3119-3129(1998))。將預(yù)涂布的濾膜(直徑6.5mm，孔尺寸8μm，Matrigel100itg/cm2)用250μl培養(yǎng)基重新水化。將在含有或不含有砷華(濃度為10nM、20nM、50nM、100nM和200nM)的200μl培養(yǎng)基中的1×105個(gè)細(xì)胞以三個(gè)一組分別移入每個(gè)室的上部，而下面的隔室填充有200μl無(wú)血清的DMEM，其中添加有0.1％BSA，還有(陽(yáng)性對(duì)照)/沒(méi)有(陰性對(duì)照)作為化學(xué)誘發(fā)劑的10ng/ml bFGF。細(xì)胞在37℃溫育72小時(shí)后，用棉拭擦拭濾膜上表面的未遷移的細(xì)胞。固定濾膜下表面的已遷移的細(xì)胞，并用含0.125％Cumassie Blue的混合物(甲醇∶乙酸∶水，體積比為45∶10∶45)染色。通過(guò)計(jì)算每孔在五個(gè)顯微鏡視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)來(lái)確定趨化性，遷移的程度表達(dá)為每個(gè)顯微鏡視野內(nèi)的平均細(xì)胞數(shù)目。如圖3所示，在用bFGF處理后，細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重的侵入。然而，砷華預(yù)處理以濃度依賴(lài)性方式阻斷了這種侵入。在100nM(IC50為48nM)，抑制高達(dá)83.4％。另一方面，沒(méi)有觀(guān)察到明顯的與凋亡內(nèi)皮細(xì)胞相伴隨的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，其包括脫離、變圓和碎裂。實(shí)施例3砷華對(duì)在3-D培養(yǎng)基中的BCE細(xì)胞的管道形成的影響為研究砷華對(duì)血管生成的成熟過(guò)程，特別是毛細(xì)血管上皮細(xì)胞管道結(jié)構(gòu)形成的影響，在纖維蛋白凝膠上使用三維培養(yǎng)基培養(yǎng)BCE細(xì)胞。
1)動(dòng)物和細(xì)胞使用與實(shí)施例1相同的動(dòng)物和細(xì)胞。
2)管道形成試驗(yàn)用以下己報(bào)道的途徑制備纖維蛋白凝膠(Bastaki M，Nelli EE，Dell’Era P，Rusnati M，Molinari-Tosatti MP，Parolini S，Auerbach R，RucoLP，Possati L，Presta M，在鼠內(nèi)皮中的由基礎(chǔ)纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管生成表型。主動(dòng)脈和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞系的研究。(Basic fibrolastgrowth factor-induced angiogenic phenotype in mouse endothelium.Astudy of aortic and microvascular endothelial cell lines).ArteriosclerThromb Vasc Bio 1997 Mar；17(3)454-64)。簡(jiǎn)要地說(shuō)，將2.5mg/ml纖維蛋白原(Calbiochem，San Diego，CA)溶于DMEM，加入培養(yǎng)的BCE細(xì)胞至終濃度為105細(xì)胞/ml，然后加入凝血酶(0.5單位/ml)使凝結(jié)開(kāi)始。將混合物立刻轉(zhuǎn)移到24孔板，在37℃5分鐘使凝膠形成。凝膠形成后，向每孔加入含或不含bFGF(10ng/ml)的0.5ml培養(yǎng)基和砷華(100nM)。48或96小時(shí)后，用倒置顯微鏡檢查管道的形成。
圖4A和4B顯示纖維蛋白凝膠上的BCE細(xì)胞排列成索狀并完成最大管道樣結(jié)構(gòu)的形成。圖4C顯示砷華處理減少了BCE細(xì)胞的管道生成。總之，砷華抑制了在3D培養(yǎng)基中的內(nèi)皮細(xì)胞的分化。實(shí)施例4角膜微囊血管生成試驗(yàn)為進(jìn)一步研究砷華在體內(nèi)的抗血管生成活性，對(duì)系統(tǒng)性給藥的砷華對(duì)bFGF誘導(dǎo)的新血管生成的抑制作用進(jìn)行研究。角膜微囊試驗(yàn)通過(guò)對(duì)已報(bào)道的程序微小改進(jìn)(Polverini Pj，Bouck Np，Rastinejad F.血管生成的天然發(fā)生抑制劑的分析與純化(Assay and purification ofnaturally occurring inhibitor of angiogenesis)，Methods Enzymol.1991；198440-450)來(lái)進(jìn)行。即，用氯胺酮麻醉鼠。通過(guò)插入白內(nèi)障刀來(lái)制造角膜囊，囊的基底距其下緣1-1.5mm。通過(guò)將含2μg重組bFGF(R&DSystems，Minneapolis，MN，U.S.A.)的30μl鹽水和300μg硫酸鋁(Sigma，St.Louis，Mo，U.S.A.)混合來(lái)制造球粒；將此懸浮液加入30μl 12％(質(zhì)量/體積)聚(甲基丙烯酸2-羥乙基酯)(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)的乙醇溶液。然后，使此混合物的等份試樣凹陷于Teflon栓上并干燥產(chǎn)生近17個(gè)球粒，以便每一球粒包含近100ng bFGF。將一個(gè)球粒植入己麻醉的雄性Sprague Dawley鼠的每只眼的角膜微囊中，接著將紅霉素膏單次局部敷用在角膜表面。從植入當(dāng)天開(kāi)始，對(duì)于治療組，每天通過(guò)給動(dòng)物灌胃喂50mg/kg砷華粉，而對(duì)于對(duì)照組，則喂給不含砷華的相同食物和水。每天用角膜顯微鏡檢查所有動(dòng)物雙眼角膜的新血管生成，并在第7天評(píng)定血管生成應(yīng)答。通過(guò)用標(biāo)度線(xiàn)測(cè)量從下緣開(kāi)始的血管長(zhǎng)度(L)和如前所報(bào)道(D’Amato RJ，Loughnan MS，F(xiàn)lynn E，F(xiàn)olkman J，反應(yīng)停是血管生成的抑制劑(Thalidomide is an inhibitor ofangiogenesis).Proc Natl Acad Sci USA 1994 Apr 26；91(9)4082-5)的下緣的鐘時(shí)數(shù)(C)，來(lái)確定角膜新血管生成的區(qū)域。使用一個(gè)公式來(lái)確定圓形條紋段的區(qū)域C/12×3.1416[r2-(r-L)2]，其中r是測(cè)量的鼠角膜的半徑，r＝5mm。
如圖5A和圖5B所示，通過(guò)口服給藥濃度為50mg/kg/天的砷華7天，對(duì)鼠的系統(tǒng)性治療顯著抑制了bFGF誘導(dǎo)的鼠角膜新血管生成。并且，如圖5C和圖5D所示，對(duì)角膜環(huán)形新血管生成的長(zhǎng)度和鐘時(shí)的抑制超過(guò)60％。圖5E證實(shí)，用砷華處理的鼠的新血管生成區(qū)域被抑制近90％。與對(duì)照組動(dòng)物相比較，經(jīng)砷華處理的鼠的角膜血管密度也顯著降低。在治療的過(guò)程中，受治鼠并沒(méi)有出現(xiàn)體重減少或不尋常的行為，這表明砷華在此實(shí)驗(yàn)使用的劑量下沒(méi)有毒性。
因此，本發(fā)明的砷華——固體As4O6是一種新的血管生成抑制劑，其有足夠的能力去抑制體外或體內(nèi)的血管生成。并且，砷化合物也可用于各種血管生成疾病的藥物治療。
提出本發(fā)明的上述討論的目的是進(jìn)行舉例說(shuō)明和描述。上述討論并不是要將發(fā)明限制為此處公開(kāi)的形式。盡管本發(fā)明的描述包括描述一個(gè)或更多實(shí)施例及某些變更和改進(jìn)，但是其它的變更和改進(jìn)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如本領(lǐng)域的技術(shù)人員和專(zhuān)家在理解本公開(kāi)之后所可能做出的變更和改進(jìn)。本發(fā)明保護(hù)范圍包括將實(shí)施例轉(zhuǎn)化至允許范圍，其包括替換與權(quán)利要求可互換和/或等價(jià)結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟，無(wú)論所述替換、可互換和/或等價(jià)的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟是否在此公開(kāi)。
權(quán)利要求
1.一種將砷華(固體As4O6)用于治療與血管生成相關(guān)的疾病的用途，即對(duì)患有此癥的動(dòng)物給予有效量的砷華(固體As4O6)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的動(dòng)物是人。
3.一種將砷華(固體As4O6)用于治療與血管生成相關(guān)的疾病的用途，即對(duì)患有此癥的動(dòng)物給予一種組合物，其中含有有效量的砷華(固體As4O6)和藥學(xué)上可接受的添加劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的動(dòng)物是人。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的血管生成抑制劑,特別涉及砷華(固體As
文檔編號(hào)A61P9/10GK1329891SQ01110419
公開(kāi)日2002年1月9日 申請(qǐng)日期2001年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月29日
發(fā)明者裴一周, 徐康文, 李昌勛 申請(qǐng)人:裴一周