專利名稱：丹參丹酚酸類化合物在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及丹參丹酚酸類化合在制藥中的應(yīng)用。
丹參丹酚酸類化合物是從常用中藥丹參中提取分離的，該類化合物溶于水。丹參及同屬植物類丹酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)為 4R1＝Y(jié)；R2＝CH2COOH；R3＝H6R1＝Y(jié)；R2＝R3＝H14R1＝Y(jié)；R2＝H；R3＝Gluc.
用現(xiàn)代技術(shù)研制的多種丹參制劑可用于治療冠心病、慢性肝腎功能疾病、感染性疾病、皮膚科疾病、血液病、II型糖尿病等；現(xiàn)有技術(shù)中報道，丹參丹酚酸類化合物具有抗心、腦缺血作用和抑制動物白內(nèi)障等作用，并己廣泛應(yīng)用于臨床。
本發(fā)明的目的在于提供丹參丹酚酸類化合物，特別是丹參總丹酚酸(SAS)和其中的丹酚酸A(SalA)、丹酚酸B(SalB)的新的用途，即在制藥中的新應(yīng)用。
為了完成本發(fā)明之發(fā)明目的，實際上，本發(fā)明涉及丹參總丹酚酸(SAS)在制備抗血栓類藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及丹參總丹酚酸(SAS)在制備抗血小板聚集藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及丹參丹酚酸類化合物在制備抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及丹酚酸A(SalA)、丹酚酸B(SalB)及其合成衍生物在制備抑制哺乳動物艾滋病毒SIVmac感染類藥物中的應(yīng)用。應(yīng)用時丹酚酸A(SalA)或丹酚酸B(SalB)及其合成衍生物的濃度應(yīng)在(10-6-10-9mol/L)之間。
本發(fā)明的物質(zhì)可以采用下述文獻(xiàn)報道的方法獲得1.黎蓮娘，譚銳，陳未名“丹酚酸A，從中藥丹參根中提取的一種新的縮酚酸類化合物”，《藥用植物》1984；50227-228。
2.劉雨，張均田“丹酚酸的自由基清除作用“《中國藥學(xué)雜志》1994；3(1)43-49。
經(jīng)過研究表明，丹酚酸特別是丹酚酸A和B的抗氧化作用明顯強(qiáng)于VITE、VITC、甘露醇和銀杏提取物(Egb761)，是目前已知的抗氧化作用最強(qiáng)的天然成分。
用本發(fā)明的丹酚酸與藥學(xué)上可接受的載體可以制備成各種藥劑，它可以是粉針劑、液體口服液等，采用常規(guī)藥物制備方法即可制得上述的藥劑。
實驗結(jié)果表明本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明對已知的丹參丹酚酸類化合物發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域；2.由于本發(fā)明所使用的丹參丹酚酸類化合物是常用中藥丹參的已知天然分離提取物、提取物的生成物，因此安全無毒，藥理作用強(qiáng)，有著很好的藥用前景；3.本發(fā)明的物質(zhì)提取技術(shù)成熟，原料來源廣泛，無毒副作用，無特殊制備工藝要求，制備工藝簡單；4.用本發(fā)明的物質(zhì)制成的藥物具有顯著的抗血栓、抗血小板凝聚作用，并且安全可靠，無出血等危險，對缺血皮層的血流量也有明顯的改善作用；5.用低濃度本發(fā)明的物質(zhì)制成的藥物，對哺乳動物艾滋病毒有明顯的抑制作用；6.用本發(fā)明的物質(zhì)制成的藥物，有很好的抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用，并對線粒體損傷有明顯的保護(hù)作用。
使用本發(fā)明的藥物時，建議用量為50～150mg/人天，優(yōu)選用量為100mg/人天。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將分別用丹參總丹酚酸(SAS)、丹酚酸A、酚酸B及其合成衍生物的藥理實驗結(jié)果和相關(guān)藥理結(jié)果的附圖，說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
附圖簡要說明

圖1為實施例1中，8組試驗對象大鼠在被注射不同種、不同劑量的藥物后，藥物對其腦血栓形成的作用圖，即病理檢查圖；其中ASham組，B模型組，C Sal 3 mg/kg，DSal 6 mg/kg，ESal 10 mg/kg，F(xiàn)FD 50 mg/kg，GFD 200 mg/kg，HFD 2000mg/kg。
圖2為SalA、SalB和SalAA對試管內(nèi)猴艾滋病毒SIVmac引起的Hut-78細(xì)胞感染陽性率的影響結(jié)果，圖中○——○代表Sal A；●——●代表Sal B；△——△代表Sal AA；▲——▲對照；*、**和***分別代表p＜0.05，p＜0.01和p＜0.001(n＝4)圖3為Sal A、SalB和Sal AA對感染SIV mac的Hut-78細(xì)胞上清液中病毒的產(chǎn)生量的影響結(jié)果，其中*、**和***分別代表PC0.05和0.01(n＝4)；圖4為SalB抑制6-OHDA引起的PC12-Bax細(xì)胞系細(xì)胞凋亡數(shù)的影響的效果圖，其中A正常；B溶媒；C、D6-OHDA處理的同時加入SalB0.1和1.0mg/mml。
實施例1 丹參總丹酚酸的抗血栓藥理試驗及結(jié)果Wista大鼠，體重240-260克，共64只，以12％的水合氯醛麻醉后，于顱底開一1cm×1cm骨窗，暴露一段大腦中動脈，將吸有50％三氯化鐵溶液10ul的小片定量濾紙(2×2cm)敷在此段大腦中動脈中，30分鐘后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)，術(shù)中術(shù)后室溫嚴(yán)格控制在24-25℃，于術(shù)后30分鐘由舌下靜脈給藥一次，24小時后判斷神經(jīng)缺失癥狀，然后斷頭取腦，測定腦梗塞面積和進(jìn)行病理學(xué)檢查以了解血管內(nèi)血栓形成情況。
以上試驗分8組，即A假手術(shù)組；B模型組；CSal 3mg/kg組；DSal6mg/kg組；ESal 10mg/kg組；FFD 50mg/kg組；GFD 200mg/kg組；HFD2000mg/kg組，各組的具體給藥種類、劑量和實驗結(jié)果見表1、表2和病理檢查結(jié)果見圖2。
表1丹酚酸對大鼠中動脈血栓模型的大鼠神經(jīng)癥狀的影響(n＝8，X±s)
與模型組比較**p＜0.01，***P＜0.001表2丹酚酸對大腦中動脈血栓模型的大鼠腦梗塞面積的影響(n＝8，X±s)
與模型組比較**p＜0.01，***P＜0.001于術(shù)后30分鐘iv觀察，可發(fā)現(xiàn)注射總丹酚酸6、10mg/kg的兩組大鼠，明顯縮小腦梗塞面積和改善行為障礙；在腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察中，注射丹酚酸6、10mg/kg的兩組動物大腦中動脈內(nèi)血栓減少，而注射復(fù)方丹參注射液50、200和2000mg/kg的三組均未顯示作用。試驗結(jié)果表明，丹參總丹酚酸注射液有明顯的抗血栓作用。
實施例2實施例2為丹參總丹酚酸對凝血系統(tǒng)功能影響的藥理試驗。
將昆明種小鼠分為6組，分別尾靜脈注射生理鹽水、復(fù)方丹參注射液200mg/kg，2000mg/kg，總丹酚酸3mg/kg，6mg/kg，10mg/kg，半小時后將小鼠用摘眼球法取血，滴血后載玻璃片上測凝血時間，其余血用3.8％檸檬酸鈉抗凝，測定血小板數(shù)，凝血酶原和纖維蛋白原。
如表3至6所示的試驗結(jié)果表明，總丹酚酸具有明顯抗血栓和抗血小板聚集作用，但對凝血系統(tǒng)的上述指標(biāo)均無影響，說明總丹酚酸用于抗血栓、抗血小板聚集很安全，無出血等危險性。
表3靜脈注射丹酚酸對小鼠凝血時間的影響(n＝10)
表4靜脈注射總丹酚酸對小鼠血小板計數(shù)的影響(n＝5)
表5靜脈注射丹酚酸對小鼠凝血酶原的影響(n＝5)
表6靜脈注射總丹酚酸對小鼠纖維蛋白原的影響(n＝5)
實施例3實施例3為丹參總丹酚酸抗血小板凝聚作用的藥理試驗。
采用體外和體內(nèi)實驗，研究了總丹酚酸對膠原、ADP和花生四烯酸(AA)誘導(dǎo)血小板聚集功能的影響。體外給藥試驗用1％硅油硅化攪拌棒、試管、離心管等。
體外試管試驗結(jié)果見表7，丹酚酸試管內(nèi)濃度0.123、0.164，0.205、0.256、0.320mg/ml的五組都可有效抑制膠原ADP和AA誘導(dǎo)的血小板聚集，復(fù)方丹參注射液12.5、25.0、50.0mg/ml也有抑血小板聚集作用。
體內(nèi)給藥試驗將昆明種小鼠分成6組，采用與實施例3相同的檢驗方法，各組的給藥種類和給藥量及結(jié)果見表8，從表8的結(jié)果可以看出，總丹酚酸6、10mg/kg的兩組可完全抑制膠元誘導(dǎo)的血小板聚集(P＜0.01)，總丹酚酸10mg/kg的一組可顯著抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，而復(fù)方丹參注射液200mg/kg和2g/kg的兩組對膠原和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集無抑制作用。藥理試驗結(jié)果表明，丹參總丹酚酸有很好的抗血小板凝聚作用。
表7丹酚酸體外給藥對血小板聚集的影響(X±S，N＝3-4)
*p＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 VS，對照組▲n＝3▲▲n＝4(動物數(shù))復(fù)方丹參；復(fù)方丹參注射液。
表8丹酚酸體內(nèi)給藥對膠原和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響(X±S，n＝8)
***P＜0.001 VS.對照組實施例4實施例4為丹參總丹酚酸對缺血皮層血流量的改善作用的藥理試驗及結(jié)果。
Wista大鼠，雌雄各半，體重180-200克，用25％烏拉坦ip麻醉，切開頸正中皮膚，分離右側(cè)頸動脈，在動脈下埋線并打活結(jié)，以備結(jié)扎。在右側(cè)眼眶后皮膚作一個1.5cm長的切口，剝離并切除頸肌，暴露顳鱗骨，在顳鱗骨接縫處開一1.5cm的骨窗，暴露大腦中動脈主干，以備凝閉，切開顱頂皮膚在右側(cè)顱頂前囟中心后1mm，旁開2mm處開一2.5cm骨窗，以備插測量電極，分離頸后皮膚，以備插參比電極。實驗共分7組，分別是假手術(shù)組、模型組、復(fù)方丹參注射液0.2g/kg，2g/kg，丹酚酸3mg/kg，6mg/kg及10mg/kg，將大鼠固定于立體定位儀，參比電極置于頸部皮下，測量電極通過顱頂骨窗置于皮層下0.8mn，測定正常血流，然后將大鼠頸總動脈結(jié)扎，并將大腦中動脈凝閉，30分鐘后舌下靜脈給藥，分別于給藥后15分鐘及30分鐘測定血流，此外，取正常鼠按上法測定腦皮層血流量及丹酚酸對正常血流量的影響，結(jié)果列于表9，結(jié)果顯示，單側(cè)大腦中動脈凝閉合并單側(cè)頸總動脈結(jié)扎后缺血區(qū)皮層血流量明顯減少。丹酚酸6mg/kg及10mg/kg組皮層血流明顯恢復(fù)(p＜0.05)，但丹酚酸對正常鼠腦皮層血流量無影響，說明丹酚酸有改善缺血區(qū)皮層血流量的作用。
表9丹酚酸靜脈注射對大腦中動脈凝閉合并同側(cè)頸總動脈結(jié)扎大鼠皮層血流量的影響
實施例5實施例5為丹酚酸A(SalA)、B(SalB)及乙?；し铀酇(SalAA)抗恒河猴艾滋病毒(SIVmac)病變的藥理試驗及結(jié)果。
試驗用病毒為SIVmac感染的Hut-78細(xì)胞，三周后培養(yǎng)上清，用CEMx-174滴定病毒滴度為1600ccID50(50％細(xì)胞感染劑量)，-20℃凍存?zhèn)溆谩１狙芯坑^察了丹酚酸A，B及乙?；し铀酇對SIV感染引起Hut-78陽性細(xì)胞率和病毒的產(chǎn)量。低濃度藥物(10-6-10-9mol/L)可明顯抑制SIVmac病毒的產(chǎn)生，對細(xì)胞病變改善也有一定作用，相反藥物濃度過高(3×10-6-10-5mol/L)對SIV感染有促進(jìn)作用，具體情況附圖3和附圖4。
試驗結(jié)果表明，丹酚酸A、丹酚酸B和乙?；し铀酇在低濃度(10-6-10-9mol/L)時對恒河猴艾滋病毒(SIVmac)的病變有明顯的抑制作用。
實施例6實施例6為丹參總丹酚酸(SAS)及丹酚酸B(SalB)對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用藥理試驗及結(jié)果。
將沙土鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎致腦缺血，3.5～4分鐘后恢復(fù)血供，至第3天取出大腦固定，包埋、切片，用TUNEL染色在10×20倍光鏡下計數(shù)海馬CAI區(qū)錐體細(xì)胞層1mm長度的細(xì)胞凋亡數(shù)。
如表10所示，分別使用總丹酚酸(SAS)5mg/kg和10mg/kg于術(shù)前15分鐘及術(shù)后10分鐘iv一次，結(jié)果表明對腦缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡的抑制率為24.4～43.6％；再分別使用丹酚酸B(SalB)5mg/kg和10mg/kg于術(shù)前15分鐘及術(shù)后10分鐘iv一次，結(jié)果表明對腦缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡的抑制率為29.2～44.8％；許多因子參與凋亡的發(fā)生和發(fā)展過程，其中Bax，C-jun，p53等系重要的促凋亡基因，bcl-2和P35等為重要的抗凋亡基因。研究表明，Bax導(dǎo)致線粒體膜對某些分子通透性的改變是凋亡的啟動因子。為此，我們首次建立了Bax高表達(dá)的PC12細(xì)胞株，Western印跡法顯示Bax蛋白有高水平的表達(dá)，用神經(jīng)毒素6-羥基多巴誘導(dǎo)Baxα高表達(dá)會引起PC12細(xì)胞凋亡，如圖5所示，丹酚酸B0.1和1.0ng.ml能顯著降低6-OHDA誘導(dǎo)的PC12-Baxα的凋亡細(xì)胞率，使細(xì)胞凋亡率從41％下降為19％和14.8％。
試驗結(jié)果表明，丹參總丹酚酸和丹酚酸B對神經(jīng)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。
表10SAS和SalB對沙鼠腦缺血再灌注海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡數(shù)目的影響X±s，n＝權(quán)利要求
1.丹參總丹酚酸(SAS)在制備抗血栓類藥物中的應(yīng)用。
2.丹參總丹酚酸(SAS)在制備抗血小板凝聚類藥物中的應(yīng)用。
3.丹酚酸A(SalA)或其合成衍生物在制備抑制哺乳動物艾滋病毒感染類藥物中應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于丹酚酸A(SalA)或其合成衍生物的濃度應(yīng)在10-6-10-9mol/L之間。
5.丹酚酸B(SalB)或其合成衍生物在制備抑制哺乳動物艾滋病毒感染類藥物中應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于丹酚酸B(SalB)或其合成衍生物的濃度應(yīng)在10-6-10-9mol/L之間。
7.丹參丹酚酸在制備抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡類藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于丹參丹酚酸是指總丹酚酸(SAS)或丹酚酸(BalB)。
全文摘要
本發(fā)明涉及丹參丹酚酸類化合物在制藥領(lǐng)域中的新用途。利用本發(fā)明的物質(zhì),可以制備具有很好的抗血栓、抗血小板凝集作用的藥物和具有較強(qiáng)抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用的藥物,并且利用低濃度本發(fā)明的物質(zhì)即可制備有效抑制哺乳動物艾滋病毒感染的藥物。本發(fā)明的物質(zhì)藥理作用強(qiáng),安全可靠,采用常規(guī)藥物制備方法,即可制得注射液和其它劑型藥物。
文檔編號A61P7/00GK1378837SQ01110378
公開日2002年11月13日 申請日期2001年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月9日
發(fā)明者張均田, 黎蓮娘, 杜冠華, 屈志煒 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所