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Afmk在制備具有自由基清除作用的藥物中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:1112165閱讀:1034來源:國知局
專利名稱:Afmk在制備具有自由基清除作用的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種褪黑激素衍生物在制備具有自由基清除作用的藥物中的應(yīng)用。
自由基是指一類分子在最外圍軌道上含有未曾成對的電子,這類分子的化學(xué)反應(yīng)性非常活潑,有從其它的物質(zhì)或分子獲取一個電子的趨勢。自由基是在生物氧化代謝過程中不可避免的附屬產(chǎn)物。生物所利用的氧,最終有2-4%最終轉(zhuǎn)變成自由基。如這些自由基逃逸出生物抗氧化防御系統(tǒng),包括抗氧化酶及內(nèi)外源性小分子抗氧化劑,這些自由基就會攻擊生物大分子物質(zhì),如蛋白質(zhì)、細胞膜、DNA,造成這些大分子的變性和損傷,最終導(dǎo)致細胞或生物體結(jié)構(gòu)的破壞與功能的喪失。根據(jù)目前為科學(xué)家廣泛接受的自由基理論,氧自由基與許多病理生理有直接或間接的聯(lián)系,其中包括衰老、老年性癡呆、帕金森病、心臟病、腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、發(fā)熱性炎癥、痛風(fēng)等臨床常見病多發(fā)病。
褪黑激素(melatonin)即N-乙?;?,是人體及哺乳動物體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì),主要由位于大腦正中部位的松果體腺生成。近年來發(fā)現(xiàn)褪黑激素為目前強的內(nèi)源性自由基清除劑,能延長實驗動物的壽命達30%,保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)對抗多種有毒物質(zhì)的損傷,又發(fā)現(xiàn)對愛滋病有輔助治療效果。褪黑激素的半衰期短,僅為約40分鐘,需反復(fù)多次給藥才能維持的需要的治療濃度。褪黑激素的抗氧化作用為直接清除自由基,其通過受體介導(dǎo)的作用就成了副作用,例如導(dǎo)致嗜睡。因而,褪黑激素具有半衰期短,有一定的副作用的缺點。
本發(fā)明目的就在于克服褪黑激素半衰期短、存在一定毒副作用的缺點,提供一種化合物在制備具有強自由基清除作用的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供如下化合物 N1-乙酰-N2-甲醛-5-甲氧基尿黑胺;N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine(AFMK)。
AFMK的理化性質(zhì)為無味,淡黃色結(jié)晶,易溶于水和乙醇,在室溫下其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,分子量264。
譚等于2000年將該物質(zhì)的合成及結(jié)構(gòu)鑒定的有關(guān)內(nèi)容發(fā)表在美雜志上(Free Redical Biology & Medicine 2000,29:1177-1185),AFMK的合成方法為褪黑激素溶于高濃度的過氧化氫中(如(30%),避光、靜置于室溫下24~48小時,褪黑激素大部分被氧化成AFMK。用氯仿提取,收集氯仿,真空干燥后再溶于甲醇,通過硅膠柱層析,用乙酸乙酯洗脫,收集洗脫液,真空干燥,可獲得較高純度的AFMK(90%以上),合成效率(生成物比反應(yīng)物)約為40%。終產(chǎn)物經(jīng)電子轟擊質(zhì)譜分析及H1核磁共振結(jié)構(gòu)分析,證實其結(jié)構(gòu)為AFMK,AFMK已被發(fā)現(xiàn)存在于動物體內(nèi),但是對其生物活性及功能的研究未見文獻報導(dǎo)。
我們發(fā)現(xiàn),AFMK為一類高效的抗氧化自由基清除劑。對于由自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)DNA損傷及海馬神經(jīng)細胞的死亡具有強大的保護作用。其實驗依據(jù)如下一、AFMK抗氧化作用的機理,雙電子供給作用能直接還原氧自由基的小分子抗氧化劑,又稱為自由基清除劑,能夠直接提供電子給自由基來清除這些有害的分子。因此,測定自由基清除劑的氧化——還原電位可以評估這些物質(zhì)的自由基清除能力。目前一種比較新穎的方法就是用循環(huán)電壓測定儀來達到這一目的。本實驗在測定AFMK的供電子能力時,將50毫摩爾濃度的AFMK(10%甲醇90%磷酸緩沖液100毫摩爾,PH7.4)溶液1毫升置于微循環(huán)電壓測定儀的測量室內(nèi)。測定儀型號CV-50W(生物分析系統(tǒng),westlafayette公司,美國),在操作過程中,電壓-電流曲線記錄在循環(huán)電壓圖像儀上(圖一)。從圖一上可見,在電壓456和668毫伏處,有兩個正電極電流波。這顯示了AFMK可能存在著兩個供電子基團。AFMK在循環(huán)電壓場中能提供兩個電子的特征,提示此化合物為一高效抗氧化自由基清除劑,其作用應(yīng)優(yōu)于經(jīng)典的抗氧化劑維生素C,維生素E,谷胱甘肽等,這些傳統(tǒng)的抗氧化劑在循環(huán)電壓場中僅顯示一個正電極電流,也就是只能提供一個電子去中和自由基。
二、AFMK對生物膜脂質(zhì)過氧化的保護作用脂質(zhì)過氧化是細胞膜脂質(zhì)受到氧自由基攻擊損傷的一個重要標(biāo)志。為了檢測AFMK對細胞膜脂質(zhì)過氧化的保護作用,用以下實驗方法。取大白鼠肝細胞進行勻漿(100毫克肝組織加入1毫升磷酸緩沖液PH7.5,50毫摩爾濃度),漿液加入過氧化氫(H2O2)和兩價的鐵離子(Fe2+)一起溫育(37℃,一小時),在實驗組標(biāo)本中同時加入不同濃度的AFMK。實驗結(jié)果顯示,H2O2和Fe2+能使大白鼠肝細胞勻漿液的脂質(zhì)過氧化物明顯增高,其機理為2價的鐵通過Fenton反應(yīng)使H2O2還原成細胞毒性的羧基自由基,羧基自由基導(dǎo)致了細胞膜的損傷。AFMK能抑制大白鼠肝細胞勻漿液的脂質(zhì)過氧化物生成,其抑制作用呈劑量依賴關(guān)系(圖二),從而證明AFMK通過清除H2O2,還原成細胞毒性的羧基自由基,有效地保護了生物膜由H2O2和二價鐵離子(Fe2+)導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化。
三、AFMK對由氧自由基引起DNA損傷的保護作用8-羧基脫氧鳥嘌呤核苷(8-OH-dG)是DNA受到氧化損傷的一個重要指標(biāo)。8-OH-dG被認(rèn)為是羧基自由基攻擊DNA所生成的具有特征性的產(chǎn)物,已被廣泛應(yīng)用于檢測DNA損傷的一種有效的方法。本實驗中采用了小牛胸腺純DNA與H2O2和三價鉻離子(Cr3+)一起溫育(37℃,60分鐘),三價的鉻離子能提供一個電子給H2O2,使其還原成細胞毒性的羧基自由基,羧基自由基攻擊DNA鏈上的鳥嘌呤堿基使其第8位上羧基化。然后加入核苷酸酶P1(Nuclease p1)消化DNA,使DNA水解成堿基核苷,再用高壓液相(HPLC)-電化學(xué)檢測儀來測定8-OH-dG結(jié)果顯示1、H2O2和Cr3+一起溫育的DNA,8-OH-dG的含量比正常對照組增加了大約20倍。2、AFMK能抑制由H2O2和Cr3+導(dǎo)致的8-OH-dG的升高,這種抑制呈明顯的劑量依賴關(guān)系(圖三),當(dāng)AFMK的濃度為5微摩爾時,8-OH-dG的生成被減少了80%,此實驗證明了AFMK有強大的DNA保護作用。
四、AFMK對培養(yǎng)神經(jīng)細胞的保護作用海馬回神經(jīng)元是與人類短期記憶關(guān)系最為密切的細胞。老年性癡呆發(fā)病原因之一就是海馬回神經(jīng)元退行性病變。海馬回神經(jīng)細胞株(HT22)被選擇作為本實驗的培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)方法為常規(guī)的細胞培養(yǎng)法,于DENEM培養(yǎng)液中加入10%小牛血清,被用作HT22海馬回神經(jīng)細胞培養(yǎng)基質(zhì),然后,在溫度37℃,5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第二天換培養(yǎng)液一次。3-(4,5-dimethythiazol-zyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)被用于檢測神經(jīng)細胞的存活率。具體方法為96孔培養(yǎng)板,每孔置于大約1500個細胞(100毫升培養(yǎng)液),處理組細胞預(yù)先與AFMK一起培養(yǎng)24小時,讓細胞貼壁生長,再加入細胞毒性物質(zhì)包括H2O2,谷氨酸和β-淀粉肽,共同培育16小時,然后加入MTT(最終濃度0.5毫克/毫升)一起培養(yǎng)(37℃,4小時),藍色的沉淀物被溶于溶解液中(溶解液20%SDS,50%N,N-dimethylformamide,PH4.7)用培養(yǎng)板閱讀儀(UQuantBio-Tek Instruments In)在750納米處檢測細胞的存活率。所有的MTT分析至少重復(fù)3次,每次每組7個標(biāo)本,所有資料都用于平均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤表示(mean±SE),統(tǒng)計學(xué)分析用ANOWA法,然后用StudentNewman-Reuls檢驗。當(dāng)P值<0.05時被認(rèn)為有顯著性差異。
A、N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)對由H2O2誘導(dǎo)的海馬回神經(jīng)細胞死亡的保護作用細胞培養(yǎng)條件如上所述,HT22細胞株單獨或與不同濃度(1/100微摩和1毫摩)的AFMK預(yù)先培育24小時,然后加入不同濃度的H2O2(25,50,100微摩),H2O2為細胞代謝過程中的副產(chǎn)物,當(dāng)達到一定濃度或在有過渡金屬如2價鐵離子和1價銅離子等存在時,能致細胞的氧化損傷。實驗結(jié)果顯示H2O2能誘導(dǎo)劑量依賴性的HT22細胞死亡,AFMK在100微摩濃度和1毫摩濃度都有能有效地保護H2O2誘導(dǎo)的培養(yǎng)的海馬回神經(jīng)細胞死亡。在高濃度(1毫摩)保護率達100%(圖四)B、N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)對由谷氨酸誘導(dǎo)的海馬回神經(jīng)細胞死亡的保護作用。
細胞培養(yǎng)條件如上所述,HT22細胞株單獨或不同濃度的AFMK預(yù)先培養(yǎng)24小時,然后再加入不同濃度的谷氨酸(5毫摩和10毫摩),谷氨酸為興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì),當(dāng)濃度過高時可引起神經(jīng)細胞內(nèi)鈣過載,自由基產(chǎn)生,最終致細胞損傷。實驗結(jié)果顯示谷氨酸能誘導(dǎo)HT22細胞的死亡,AFMK對興奮性氨基酸-谷氨酸誘導(dǎo)海馬回神經(jīng)細胞的死亡具有顯著的保護作用,這種保護作用呈劑量依賴關(guān)系,AFMK為100微摩爾濃度時保護率達15%,1毫摩爾達60%(圖五)。
C、N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)對由β-淀粉樣肽誘導(dǎo)的海馬回神經(jīng)細胞死亡的保護作用細胞培養(yǎng)條件如上所述,HT22細胞株單獨或與不同濃度的AFMK預(yù)先培養(yǎng)24小時,然后再加入不同濃度(0.2,2和20微摩爾)的β-淀粉樣肽片斷(β-25-35)一起培育。β-淀粉樣肽被認(rèn)為是老年性癡呆神經(jīng)細胞病理改變、神經(jīng)斑塊形成的主要物質(zhì),β-淀粉蛋白的沉積,導(dǎo)致自由基形成最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡,實驗結(jié)果顯示β-淀粉樣肽片斷(β-25-35)能誘導(dǎo)HT22細胞的死亡。AFMK對由β-淀粉樣肽誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞死亡具有保護作用,這種保護作用具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(圖六)。
通過上述的實驗結(jié)果,證明AFMK在分子和細胞水平具強大的抗氧化和自由基清除作用,具有潛在的臨床應(yīng)用價值,可以加工成口服劑型,包括片劑、緩釋片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液,也可加工成注射液,包括粉針,注射液,還可加工成外用劑型,如透皮吸收膜劑、膏劑、霜劑,也可添加入化妝品中或作為防曬劑。
說明與結(jié)論N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺(AFMK)為一內(nèi)源性生物胺,自然存在于人和動物體中。褪黑激素的氧化代謝可能為其主要來源。迄今為止,缺少對其生物活性及功能的研究。本發(fā)明通過對AFMK的深入研究,用可信賴的科學(xué)方法首次發(fā)現(xiàn)并證實了AFMK為一強大的內(nèi)源性抗氧化自由基清除劑。采用新穎的循環(huán)電壓場技術(shù),可以檢測到在456和668毫伏的電壓場內(nèi)AFMK能形成2個正電極電流波,提示AFMK的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能存在著2個供電基團。提供電子用以中和氧自由基是經(jīng)典的小分子抗氧化劑或自由基清除劑抗氧化作用必備的重要條件。經(jīng)典的小分子抗氧化劑維生素C或維生素E在此電壓場中僅能形成一個正電極電流波。從理論意義上說AFMK的抗氧化自由基清除作用應(yīng)當(dāng)優(yōu)于傳統(tǒng)的抗氧化劑。
為了探討AFMK是否對生物大分子脂質(zhì)DNA是否有保護作用,細胞膜脂質(zhì)過氧化與DNA堿基氧化損傷的加成物8-羧基脫氧鳥苷被選好測定指標(biāo)。脂質(zhì)是組織細胞膜的主要成份,對于細胞膜的功能完整起關(guān)鍵作用。DNA為生物遺傳的基本物質(zhì),是所有生物信息的攜帶者。如果這些重要的生物大分子受到損傷,必將對細胞及生物的功能產(chǎn)生不利的影響。而氧自由基可以導(dǎo)致脂質(zhì)的損傷產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物,破壞細胞功能的完整性。氧自由基也可以攻擊DNA使堿基變性,導(dǎo)致疾病或腫瘤。實驗結(jié)果顯示,AFMK能有效地保護由于H2O2和兩價鐵所致的肝細胞均漿液的脂質(zhì)過氧化及由H2O2和三價鉻所致的DNA損傷,這種保護作用呈明顯的量效關(guān)系。本實驗中的脂質(zhì)過氧化和DNA堿基氧化被認(rèn)為與羧基自由基形成有關(guān)。因為在H2O2與二價鐵及H2O2與三價鉻系統(tǒng)中都能通過Fenton反應(yīng)生成羧基自由基。為了證實AFMK在細胞水平的抗氧化自由基清除作用,實驗中選用了HT22細胞株。HT22細胞株起源于大白鼠海馬回神經(jīng)細胞,海馬回神經(jīng)細胞被認(rèn)為與記憶功能有密切的關(guān)系;老年性癡呆的記憶障礙也可能與患者海馬回神經(jīng)細胞的退行性病變有關(guān)。在實驗中,我們采用了三種不同的細胞毒性物質(zhì),包括H2O2,谷氨酸和β-淀粉樣蛋白來誘導(dǎo)HT22細胞株死亡。這三種細胞毒性物質(zhì)都認(rèn)為與神經(jīng)細胞的退行性病變有密切的關(guān)系,它們的共同點就是通過不同的途徑產(chǎn)生細胞毒性自由基。實驗結(jié)果顯示,這三種物質(zhì)都可誘導(dǎo)培養(yǎng)的HT22海馬回神經(jīng)細胞的死亡,而AFMK能夠有效的保護由各種不同的毒性物質(zhì)引起的HT22海馬神經(jīng)細胞損傷,其保護作用具有明顯的量效關(guān)系和顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(圖四、五、六)。從以上的實驗結(jié)果可以證實,AFMK為一新型有效的內(nèi)源性抗氧化自由基清除劑,其作用原理可能為提供電子以中和自由基。AFMK有能力提供2個電子,其抗氧化自由基清除能力可能優(yōu)于經(jīng)典的抗氧化劑維生素C或維生素E。AFMK不僅能在分子水平保護脂質(zhì)過氧化和DNA堿基氧化,而且也可在細胞水平保護由于不同的有害物質(zhì)引起的神經(jīng)細胞的死亡。
氧自由基與衰老,氧自由基與許多疾病的關(guān)系已得到越來越多實驗依據(jù)的支持。根據(jù)目前較為流行的衰老理論認(rèn)為,自由基對細胞的累積損傷是衰老過程中的一個重要原因。氧自由基損傷也是許多疾病的病理病因之一。其中包括神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(老年性癡呆,帕金森病),心臟病、腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病,痛風(fēng)以及失癥性疼痛。由于AFMK具有強大的抗氧化自由基清除作用,又為一內(nèi)源性物質(zhì)(提示可能無毒副作用),對于臨床用于延緩衰老及預(yù)防和治療上述疾病有著潛在的應(yīng)用價值。
通過實驗結(jié)果估計人體的有效劑量為2~10mg/天,每天1-4次。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1AFMK的合成。
稱取褪黑激素5克,溶于30%的過氧化氫100毫升中,避光、靜置24~48小時,加入氯仿提取二次,每次400毫升,合并提取液,回收氯仿,殘渣用5毫升甲醇溶解,過硅酸柱層析,用乙酸乙酯洗脫,用分部收集儀收集已包含AFMK的部分,真空干燥,獲得純度90%以上的AFMK2克。
實施例2AFMK的顆粒劑的制備。
取AFMK適量,加淀粉、糖粉,制成顆粒劑。
實施例3AFMK的片劑的制備。
取AFMK適量,加淀粉、糖粉制粒,加硬脂酸鎂、滑石粉,通過壓片機壓片。
本發(fā)明不限于上述實施例。
權(quán)利要求
1.N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺在制備具有自由基清除作用的藥物中的應(yīng)用,其結(jié)構(gòu)式為,
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺加工成的劑型為口服劑型、包括片劑、緩釋片劑、膠囊劑、顆粒劑或口服液,或加工成注射液,包括粉針或注射液,加工成外用劑型,包括透皮吸收膜劑,膏劑或霜劑,或加工成化妝品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備治療和預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備治療和預(yù)防心臟病的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備治療和預(yù)防風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)病、痛風(fēng)、失癥性疼痛的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于N1-乙酰-N2-甲醛-5甲氧基尿黑胺用于制備延緩衰老的藥物。
全文摘要
N
文檔編號A61P43/00GK1314151SQ0110760
公開日2001年9月26日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月28日
發(fā)明者譚敦憲, 顏美婷 申請人:譚敦憲, 顏美婷
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