專利名稱：用于預防香煙中或者發(fā)酵食品或酒精飲料中的致癌物質(zhì)引起的癌誘發(fā)和轉移的米那利提取物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有預防癌和癌轉移的成分的植物米那利(Minari)提取物。更詳細地說，本發(fā)明涉及對于預防發(fā)酵食品和酒精飲料中存在的尿烷(EC(氨基甲酸乙酯))或者香煙中存在的致癌物質(zhì)NNK[{(4-N-甲基-N-亞硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}]誘發(fā)的癌和癌轉移有用的米那利提取物。
尿烷對于小鼠以用量依存的方式誘發(fā)肺癌和肝癌，已經(jīng)計算出尿烷對人的安全用量(virtually safe dose，VSD)，對于肺癌是1.8×10-4mg/kg體重，對于肝癌是7.2×10-5mg/kg體重(K.Inai等，Jpn.J.Cancer Res.82，380～385頁，1991年4月)。
在妊娠和催乳期間用尿烷處理過的小鼠的后代會發(fā)生通過胎盤傳遞顯著增加的胚胎癌、肺癌和卵巢囊腺瘤，而且對于親代的妊娠小鼠，也會誘發(fā)子宮內(nèi)膜增生和子宮血管瘤(T.Nomura，Cancer Research，33，1677-1683頁，1973，7月)。
口服給藥的尿烷對于小鼠會誘發(fā)肺癌、淋巴瘤、肝癌、胃乳頭瘤、皮脂腺腺瘤、乳房瘤、肺腺瘤、扁平上皮細胞瘤、白血病、間葉瘤等(IARC MONOGRAPHS ON THE EVALUATION OF THE CARSINOGENIC RISCRISK OF CHEMICALS TO MAN，第7卷，111～131頁，the views of twoIARC Working Groups on the Evaluation of the CarcinogenicRisks of Chemicals to Man which met in Lyon，1974年2月4日～11日，以及1974年6月18日～24日)。
另外，尿烷通過酒精發(fā)酵生成，在葡萄酒等釀造產(chǎn)品中以一定水平含有，因此在加拿大成為限制對象(Ethyl Carbamate in AlcoholicBeverages and Fermented Foods，ACS Symposium Series No.484，F(xiàn)ood Safety Assessment，John W.Finley等編，419～428頁，American Chemical Society，1992年；Identification of VolatileConstituents from Grapes，J.Agric.Food Chem.，第24卷，第2號，329～331頁，1976年；RATIONALE FOR THE ESTABLISHMENT OFGUIDELINES TO LIMIT ETHYL CARBAMATE LEVELS IN ALCOHOLICBEVERAGES，BUREAU OF CHEMICAL SAFETY FOOD DIRECTORATE HEALTHPROTECTION BRANCH，HEALTH & WELFARE CANADA，1～8頁；Ethylcarbamate in Fermented Beverages and Foods，Cornelius S.Ough，J.Agric.Food Chem.，第24卷，第2號，323～327頁)。
NNK是香煙中潛在的致癌物質(zhì)之一(Djordijevic，M.V.等，AComparison of selected components in the mainstream smoke ofthe leading U.S.and Japanese cigarettes.InProceedings ofthe CORESTA smoke and Technology Meeting，200～217頁，1996年，11月3日～8日)。
在癌中，肺癌的發(fā)生不問男性女性均持續(xù)顯著增加。肺癌的發(fā)病與吸煙、酒精攝取關系密切。國際癌研究所(The Internationalagency for Research on Cancer)指出吸煙和酒精攝取相互增進消費，并提出通過吸煙和酒精飲料攝取完全攝入的NNK和尿烷是肺癌發(fā)病的原因。還指出吸煙與男性由于癌引起的死亡的45％直接相關，與女性的21.5％直接相關。現(xiàn)在認為肺癌引起的死亡作為美國吸煙者死亡的主要原因已經(jīng)取代了心臟病。
需要一種預防吸煙和酒精攝取致癌的飲食成分。
屬于傘形科的植物米那利在濕潤的土壤或稻子中培養(yǎng)、發(fā)育，已知傳統(tǒng)上作為解毒劑。已知它通過促進酒精排泄非常有效地解除酒精的毒性。
在中藥里，米那利用于治療黃疸、消化器官疾病、神經(jīng)病、肥胖。但是，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)米那利能夠預防癌癥的發(fā)病，并抑制癌的轉移。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)米那利提取物的飲食性成分通過抑制潛在的前致癌物質(zhì)活化，而且除去致癌物質(zhì)代謝產(chǎn)生的潛在的自由基，并直接除去化學致癌物質(zhì)中的自由基產(chǎn)生體，米那利提取物對于預防癌非常有效，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供含有預防癌和癌轉移的成分的米那利提取物。
本發(fā)明的1種方式中，上述提取物通過溶劑提取制備。在本發(fā)明的另一方式中，上述提取物通過熱水提取制備。
在本發(fā)明的另一方式中，上述組合物選自蓼黃素、金絲桃甙、蕓香苷、五羥黃酮、葉綠素、葉黃素、イソハメチン、苯乙基異硫氰酸酯、苯烷基異硫氰酸酯(phenalkylisothiocyanate)、黃酮類、黃酮醇類和d-檸檬烯。
在本發(fā)明的另一方式中，上述癌是能夠被尿烷或NNK〔{(4-N-甲基-N-亞硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}〕誘發(fā)的癌。在本發(fā)明進一步的方式中，上述癌是肺癌，或者是胎盤轉遞的癌或胚胎癌。
本發(fā)明還提供預防癌和癌轉移的組合物，含有米那利提取物以及藥學上可以接受的載體。
在本發(fā)明的1種方式中，上述組合物為選自粉末、液體、片劑、膠囊、小丸的形態(tài)。
圖2表示對于3個A/J小鼠試驗組采用胃管營養(yǎng)法分別將不同量的尿烷單次給藥4個月后癌基因即細胞周期蛋白D1(cyclin D1)在肺組織中的表達水平的不同以及米那利提取物的抑制效果。對于3個試驗組，分別以125、250、500mg/kg的用量單次給予尿烷，分別再分成2個小組。一組給予常規(guī)飼料(尿烷對照組)，另一組使之自由攝取以5％濃度(w/w)添加了米那利提取物的飼料4個月(尿烷+米那利)。試驗結束后，測定各組的細胞周期蛋白D1的表達水平。
圖3表示對于3個A/J小鼠試驗組采用胃管營養(yǎng)法分別將不同量的尿烷單次給藥4個月后肺組織中S期(S-phase)細胞周期的PCNA(增殖性細胞核抗原)表達水平的不同以及米那利提取物的抑制效果。對于3個試驗組，分別以125、250、500mg/kg的用量單次給予尿烷，分別再分成2個小組。一組給予常規(guī)飼料(尿烷對照組)，另一組使之自由攝取以5％濃度(w/w)添加了米那利提取物的飼料4個月(尿烷+米那利)。試驗結束后，測定各組的肺組織中的PCNA水平。
圖4表示對于3個A/J小鼠試驗組采用胃管營養(yǎng)法分別將不同量的尿烷單次給藥4個月后肺組織中分離DNA的8-OH脫氧鳥苷的水平以及米那利提取物的抑制效果。對于3個試驗組，分別以125mg/kg(數(shù)據(jù)未表示)、250mg/kg、500mg/kg(數(shù)據(jù)未表示)的用量單次給予尿烷，分別再分成2個小組。一組給予常規(guī)飼料(尿烷對照組)，另一組使之自由攝取以5％濃度(w/w)添加了米那利提取物的飼料4個月(尿烷+米那利)。試驗結束后，測定各組的肺組織中的分離DNA的8-OH脫氧鳥苷水平。
圖5表示對于4個A/J小鼠試驗組分別將不同量的香煙的煙中潛在的致癌物質(zhì)即NNK〔{(4-N-甲基-N-亞硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}〕單次腹腔給藥4個月后誘發(fā)肺癌的多重性以及米那利提取物的抑制效果。其中，4個試驗組是指NNK對照組(給予4mg NNK)、以3種不同的給藥量(以1.25、2.5、5％w/w將米那利添加到飼料中)使之自由攝取米那利的3個組。
圖6表示3組的肺組織中癌基因即細胞周期蛋白D1的表達水平以及米那利提取物的抑制效果，其中，這3組是作為對照組的在腹腔內(nèi)給予水后使之自由攝取常規(guī)飼料4個月的組(CTL)，單次腹腔給予NNK(4mg)后使之自由攝取常規(guī)飼料4個月的組(圖中以0表示)，以及單次腹腔給予NNK(4mg)后使之自由攝取添加了米那利提取物的飼料(1.25％，w/w)4個月的組。
圖7表示對照組(水)、NNK對照組、NNK-米那利給藥組(1.25％，w/w)3個試驗組的肺組織的S期的PCNA(增殖性細胞核抗原)表達水平上的不同以及米那利提取物的抑制效果。NNK組單次給予4mg的NNK。對于NNK-米那利給藥組，單次給予NNK后，以1.25％(w/w)濃度在飼料中添加米那利提取物，并對其它組給予常規(guī)飼料，分別使之攝取4個月。試驗結束后，測定各組的肺組織中的PCNA水平。
發(fā)明的最佳實施方式本發(fā)明使用的用語“米那利”是指屬于傘形科〔family Apiaceae(Umbelliferae)〕的植物中，代表性地屬于水芹屬的韓國原產(chǎn)dor-米那利。
用語“米那利提取物”是指由米那利植物體(葉、莖、根)通過以下記載的提取溶劑，通常為去離子水，提取得到的液體以及含有將其冷凍干燥得到的粉末的固體。
米那利提取物可以按照一般廣泛應用的方法制備。例如，首先將米那利洗凈，干燥，粉碎成粉末。接著，使用各種溶劑進行提取。一般，提取溶劑相對于米那利粉末添加2～10倍重量。而且，作為其提取溶劑，可以例舉水、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、1，3-丁二醇、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、甲醇。代表性地是使用水制備米那利提取物。也可以將上述溶劑中的2種以上混合使用。
代表性的是，米那利提取物和溶劑的混合物在室溫下使用電磁攪拌器等(100～500rpm的旋轉數(shù))攪拌的同時進行提取。例如使用去離子水，在70℃下連續(xù)攪拌24小時進行提取。之后，分離去離子水，冷凍干燥。以其冷凍干燥的粉末作為米那利提取物。這樣制備的米那利提取物中含有的成分可以采用本領域技術人員公知的HPLC(高效液相色譜法)分離，然后采用NMR法(核磁共振分析法)鑒定分離得到的成分。
本發(fā)明人等通過NMR分光法確認這樣得到的米那利提取物中含有蓼黃素(persicarin)、金絲桃甙(hyperoside)、蕓香苷(rutin)、五羥黃酮(quercetin)、葉綠素(chlorophyll)、葉黃素(xanthophyll)、isohamenetin、苯烷基異硫氰酸酯(phenalkylisothiocyanate)、苯乙基異硫氰酸酯(phenethylisothiocyanate)、黃酮類(flavons)、黃酮醇類(flavonols)和d-檸檬烯(d-limonene)。
這些天然物質(zhì)中的幾種作為抗氧化劑是已知的，這些成分協(xié)同作用預防癌變。因此，含有這些成分的米那利提取物能夠捕獲超氧化物和羥基自由基等各種自由基，從而抑制NNK(多環(huán)式芳香族烴(polyaromatic hydrocarbons)、氮雜芳烴(aza-arenes)、芳香族胺(aromatic amine)、烷基醛綴合物(conjugatedalkylaldehyde)、甲醛(formaldehyde)、NO、尿烷(urethane)和煙堿(nicotine)、亞硝基胺(nitrosamine)等致癌性化學物質(zhì)中潛在的致癌物質(zhì))、尿烷(發(fā)酵食品和酒精飲料中的氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate)、氨基甲酸烷基酯(alkyl carbamate))等誘發(fā)的肺癌和轉移瘤。或者，這些成分能夠抑制各種癌基因的表達。
米那利提取物可以單獨使用，也可以與Ostericum coreanum、Oenanthe stolinifera、水芹(Oenanthe javanica)配合使用。
米那利提取物可以制成干燥粉末劑、添加到食品中的添加劑和飲料劑、膠囊劑、片劑、使用一般粘合劑制備的小丸劑等劑型使用。以下，在實施例中敘述本發(fā)明涉及的方法論的詳細內(nèi)容，但是并沒有限定權利要求范圍的意圖。
例如本發(fā)明以針對發(fā)酵食品和酒精飲料中存在的致癌物質(zhì)和/或香煙中存在的潛在致癌物質(zhì)的各種給藥劑型的米那利提取物的治療研究為基礎。但是，本發(fā)明人和申請人也可以將本發(fā)明適用于其他類型的癌和轉移癌(包括其它致癌物質(zhì)引起的癌)的預防。而且，也可以改變試驗設計及其草案實施。
可以通過考察含有各種濃度的米那利提取物的飼料是否影響尿烷處理后的小鼠肺組織中的細胞周期蛋白D1基因的表達水平進行確認。另外，本發(fā)明的米那利提取物對癌和癌轉移的預防效果也可以通過考察含有各種濃度的米那利提取物的飼料是否影響致癌性尿烷處理后的小鼠肺組織中的PCNA(增殖性細胞核抗原)的表達水平進行確認。
而且，本發(fā)明的米那利提取物對癌和癌轉移的預防效果也可以通過測定致癌性尿烷處理后的小鼠肺組織中的8-OH脫氧鳥苷，考察含有各種濃度的米那利提取物的飼料抑制對DNA的氧化性損傷的程度進行確認。而且，本發(fā)明的米那利提取物對癌和癌轉移的預防效果也可以通過考察含有各種濃度的米那利提取物的飼料是否阻止香煙中潛在的致癌性物質(zhì)NNK處理后的小鼠的肺癌發(fā)生進行確認。
而且，本發(fā)明的米那利提取物對癌和癌轉移的預防效果也可以通過考察含有各種濃度的米那利提取物的飼料對香煙中潛在的致癌性物質(zhì)NNK處理后的小鼠肺組織中的PCNA(增殖性細胞核抗原)的表達水平的抑制程度進行確認。
以下，結合實施例說明本發(fā)明。
(實施例1米那利提取物對尿烷活性的有效抑制)(步驟1肺癌預防)將A/J小鼠分為3組，對于各組采用胃管營養(yǎng)法單次給予人的尿烷暴露水平的10000、20000和40000倍(125、250和500mg/kg體重)的尿烷。
接著，將各組再分為2個試驗組。一組(米那利處置組)適當給予添加干燥米那利提取物達到飼料的5％得到的飼料4個月，另一組(尿烷對照組)給予常規(guī)飼料。其結果如

圖1所示，肺癌發(fā)生率在米那利處置組中顯著減少(p＜0.05)。
(步驟2對癌變基因細胞周期蛋白D1表達水平的抑制)將A/J小鼠分為對照組和尿烷給藥組。再將尿烷給予組分為3組，對于各組以125、250和500mg/kg的給藥量給予尿烷。再將尿烷給藥后的各組分為2個試驗組。一組(尿烷單獨給藥組)給予常規(guī)飼料，另一組(尿烷+米那利組)給予以5％濃度添加了米那利提取物的飼料4個月。測定試驗結束時細胞周期蛋白D1的表達水平(第91癌學會發(fā)表論文No.5313I.P.Lee，Pulmonary cyclin D1-induction byFumonisin B1 in Female A/J mice，2000年4月15日)。結果如圖2所示。尿烷單獨給藥組與米那利處置組相比顯示4倍高的結果。
(步驟3對PCNA表達的抑制)將A/J小鼠分為對照組和尿烷給藥組。再將尿烷給予組分為3組，對于各組以125、250和500mg/kg的給藥量給予尿烷。再將尿烷給藥后的各組分為2個試驗組。一組(尿烷單獨給藥組)給予常規(guī)飼料，另一組(尿烷+米那利組)給予以5％濃度添加了米那利提取物的飼料4個月。測定試驗結束時細胞周期的S期的PCNA(增殖性細胞核抗原)(第91癌學會發(fā)表論文No.5313I.P.Lee，Pulmonary cyclinD1-induction by Fumonisin B1 in Female A/J mice，2000年4月15日)。結果如圖3所示。尿烷單獨給藥組的PCNA水平與尿烷+米那利組相比上升4倍。
(步驟4由8-OH脫氧鳥苷濃度表示的對DNA損傷的抑制)將A/J小鼠分為對照組和尿烷給藥組。再將尿烷給予組分為3組，對于各組以125、250和500mg/kg的給藥量給予尿烷。再將尿烷給藥后的各組分為2個試驗組。一組(尿烷單獨給藥組)給予常規(guī)飼料，另一組(尿烷+米那利組)給予以5％濃度添加了米那利提取物的飼料4個月。測定試驗結束時8-OH脫氧鳥苷的濃度。結果如圖4所示。米那利處置組的8-OH脫氧鳥苷濃度與尿烷單獨處置組相比顯著減少。
(實施例2有效抑制NNK活化預防癌的米那利提取物)(步驟1肺癌發(fā)生的阻止)將香煙中潛在的致癌物質(zhì)NNK給予NNK單獨給藥(+常規(guī)飼料)組、NNK給藥+米那利添加飼料(1.25、2.5和5％(w/w))合計4組的A/J小鼠。其中，NNK的給藥量相當于1盒香煙持續(xù)吸100年以上的量(Djordijevic，M.V.等，Comparison of selected componentsin the mainstream smoke of the leading U.S.and Japanesecigarettes.InProceedings of the CORESTA smoke andTechnology Meeting，200～217頁，1996年，11月3日～8日)。4個月后測定A/J小鼠的肺癌多重性。
結果如圖5所示，將米那利提取物作為粉末給予2.5g和5％的組的癌發(fā)生率顯著降低(p＜0.05)。
(步驟2對癌基因細胞周期蛋白D1的抑制)將A/J小鼠分為水單次腹腔給藥(+常規(guī)飼料)組、NNK(4mg)單次腹腔給藥(+常規(guī)飼料)組、或NNK單次腹腔給藥(+添加米那利提取物使?jié)舛冗_到1.25％的飼料)3個試驗組。4個月后，測定各試驗組的癌基因即細胞周期蛋白D1的表達水平。結果如圖6所示，米那利處理組的癌基因之一細胞周期蛋白D1的表達水平與NNK對照組相比，減少至半量以下(p＜0.05)。由此表明米那利提取物在細胞周期蛋白D1表達方面顯著抑制NNK活性。
(步驟3對PCNA表達的抑制)將A/J小鼠分為水單次腹腔給藥(+常規(guī)飼料)組、NNK(4mg)單次腹腔給藥(+常規(guī)飼料)組和NNK單次腹腔給藥(+添加米那利提取物使?jié)舛冗_到1.25％的飼料)3個試驗組。4個月后，測定各試驗組的PCNA表達水平。結果如圖7所示，PCNA表達水平與水單獨給藥組相比，在NNK處理組中顯著上升。另一方面，對NNK給藥進行了米那利處理(飼料中1.25％，w/w)的組與水給藥組相比，顯著抑制了PCNA表達水平(p＜0.05)。工業(yè)實用性本發(fā)明人確認米那利提取物能夠抑制致癌性食物和酒精飲料中存在的尿烷以及香煙中存在的NNK〔{(4-N-甲基-N-亞硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮)〕誘發(fā)的肺癌，從而完成了本發(fā)明。作為米那利提取物預防癌的可能的機理，認為是阻斷前致癌物質(zhì)活化成更有活性的致癌物質(zhì)的階段，且通過米那利提取物中的大量自由基清除劑除去香煙中或酒精飲料中存在的游離基。而且，本發(fā)明的目的在于通過使用含有非常有效的化學預防物質(zhì)的米那利提取物的飲食性成分，代表性地預防以肺作為標的的致癌物質(zhì)引起的肺癌的發(fā)病和作為其結果發(fā)生的癌轉移。
如實施例中詳細說明的那樣，米那利提取物潛在地預防發(fā)酵食品、酒精飲料、香煙中存在的致癌物質(zhì)誘發(fā)的肺癌或其他癌，在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中非常重要。
權利要求
1.米那利提取物，含有預防癌和癌轉移的成分。
2.如權利要求1所述的米那利提取物，通過溶劑提取制備。
3.如權利要求2所述的米那利提取物，通過熱水提取制備。
4.如權利要求1所述的米那利提取物，上述成分選自蓼黃素、金絲桃甙、蕓香苷、五羥黃酮、葉綠素、葉黃素、isohamenetin、苯乙基異硫氰酸酯、苯烷基異硫氰酸酯、黃酮類、黃酮醇類和d-檸檬烯。
5.如權利要求1所述的米那利提取物，上述癌是能夠被尿烷或NNK〔{(4-N-甲基-N-亞硝基氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮}〕誘發(fā)的癌。
6.如權利要求1所述的米那利提取物，上述癌是肺癌。
7.如權利要求1所述的米那利提取物，上述癌是胎盤轉遞的癌或胚胎癌。
8.預防癌和癌轉移的組合物，含有米那利提取物以及藥學上可以接受的載體。
9.如權利要求8所述的組合物，該組合物為選自粉末、液體、片劑、膠囊、小丸的形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有預防癌和癌轉移的成分的植物米那利(Minari)提取物。更詳細地說，本發(fā)明涉及對于預防發(fā)酵食品和酒精飲料中存在的尿烷(EC(氨基甲酸乙酯))或者香煙中存在的致癌物質(zhì)NNK[{(4－N－甲基－N－亞硝基氨基)－1－(3－吡啶基)－1－丁酮}]誘發(fā)的癌和癌轉移有用的米那利提取物。
文檔編號A61K9/48GK1454094SQ00819673
公開日2003年11月5日 申請日期2000年12月20日 優(yōu)先權日2000年4月21日
發(fā)明者李仁秀 申請人:李仁秀, 河村吉植, 阿部邦昭