專利名稱：疫苗的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗的研制和生產(chǎn)。本發(fā)明特別涉及病毒蛋白和/或病毒的生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及使用哺乳動物細胞、優(yōu)選人體細胞生產(chǎn)生長于真核細胞動物優(yōu)選哺乳動物特別優(yōu)選人體細胞中的病毒。本發(fā)明特別實用于疫苗的生產(chǎn)，以有助于脊椎動物，尤其哺乳動物特別是人對病毒病原體的抵抗力。
本發(fā)明揭示了優(yōu)選使用一種已知成分合成培養(yǎng)基在人體細胞中產(chǎn)生病毒和/或病毒蛋白，以及從細胞或培養(yǎng)基中純化病毒或其組分的手段和方法。本發(fā)明還提供了含有病毒或其組分的藥物組合物，及生產(chǎn)和回收和/或純化它們的方法。
背景技術(shù)：
接種是對付病毒感染的一條最重要的途徑。盡管已有許多抗病毒制劑，但這些制劑的效力有限。一旦個體被感染(被動免疫)，施用抗病毒的抗體也許是一種對付病毒感染的良好方式，而且典型地人抗體或人源化抗體確實有希望對付一些病毒感染，但對付病毒感染的最安全有效的方式是并也許是通過主動免疫進行預(yù)防。主動免疫一般是指進行接種，而且疫苗包含典型地一種病毒的至少一個抗原性決定簇，優(yōu)選包含至少一種病毒或其它病原體的多個不同的抗原性決定簇，例如通過將產(chǎn)生自病毒的至少一種(病毒)多肽或蛋白摻入疫苗中(亞單位疫苗)。典型地上述形式的疫苗包括佐劑以增強免疫應(yīng)答。還可以是基于整個病毒(病原體)的疫苗，例如滅活形式的疫苗。另一種可能形式是使用活的但減毒形式的病原性病毒。另一種可能形式是使用野生型病毒，例如在成熟個體不受感染的威脅，但通過母體抗體對嬰幼兒也許有保護作用的情況中。疫苗的生產(chǎn)不總是一種簡便的步驟。在一些情況中，病毒材料是在雞蛋中生產(chǎn)的，這導(dǎo)致難以純化材料和對污染物進行深入的安全性控制等。另外，有時但不經(jīng)常是作為在雞蛋中生產(chǎn)的替代的在細菌和或酵母上的生產(chǎn)也需要許多純化和安全步驟。在哺乳動物細胞上生產(chǎn)是另一種替代方式，但所用的哺乳動物細胞均需要例如存在血清和/或粘著于固體支持物以生長。在第一種情況中，同樣，純化和安全性及例如蛋白酶的需要以支持一些病毒的復(fù)制成為一個問題。在第二種情況中，高產(chǎn)量和便利性成為另一個問題。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中至少一些與用于疫苗的病毒和/或病毒蛋白的生產(chǎn)系統(tǒng)相關(guān)的問題。
發(fā)明詳述本發(fā)明揭示了一種新的用以增殖和收獲病毒的人體無限增殖化細胞系，以生產(chǎn)所述病毒。PER.C6細胞(WO97/00326)是通過使用含有在人磷酸甘油激酶(PGK)啟動子控制下的Ad血清型5(Ad5)E1A-和E1B編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代人胚胎視網(wǎng)膜細胞產(chǎn)生的。
以下特點使PER.C6或其衍生物特別適用作產(chǎn)生病毒的宿主其是一種充分定性的人體細胞系，其是順應(yīng)GLP開發(fā)的，其可以在已知成分無血清培養(yǎng)基中作為懸浮培養(yǎng)物生長，沒有任何人或動物血清蛋白；其生長與滾瓶，搖瓶，旋轉(zhuǎn)瓶和生物反應(yīng)器相適應(yīng)，倍增時間為大約35小時。流感流行病學流感病毒，正粘病毒科的成員，是急性呼吸道疾病年度流行的致病因素。僅在美國每年就有5千萬美國人染上流感。估計全世界的死亡人數(shù)(1972-1992)為60000(CDC統(tǒng)計)。有3次全世界流行性流感爆發(fā)，1918年(西班牙流感，估計4千萬人死亡)，1957年(亞洲流感，估計1千萬人死亡)，和1968年(香港流感，估計70000人死亡)。流感病毒感染與許多疾病和并發(fā)癥相關(guān)，導(dǎo)致實質(zhì)上世界范圍發(fā)病率和死亡率，尤其在患有慢性疾病的老人和病人中?？沽鞲薪臃N在預(yù)防與這種感染相關(guān)的通常致命的并發(fā)癥中是最有效的(Murphy，B.R.和R.G.Webster，1996)。已經(jīng)報道了在二倍體人體細胞系MRC-5上生產(chǎn)流感病毒(Herrero-Euribe L等，1983)。然而，流感病毒的效價非常低。流感病毒毒株目前流感疫苗含有流感病毒A和B的純化的血凝素和神經(jīng)氨酸酶。代表流行病學重要的毒株的3種病毒是流感病毒A(H1N1)，流感病毒A(H3N2)和流感病毒B。將流感病毒分為A和B型是基于其核蛋白(NP)和基質(zhì)(M)蛋白抗原之間的抗原性差異。流感病毒A還可基于血凝素(H1-H15)和神經(jīng)氨酸酶(N1-N9)分子的抗原性組分(序列)進一步分為亞型。這些亞型的每一種代表物均已經(jīng)從水棲鳥類中分離，其可能是鳥類和哺乳動物物種的所有流感病毒的原始儲存宿主。已經(jīng)示出在豬和人之間的傳染性，近來示出了在鳥和人之間的傳染性(H5N1)。流感疫苗目前在世界通用的3種滅活的流感疫苗是全病毒，片段疫苗和表面抗原或亞單位疫苗。這些疫苗均含有預(yù)期在隨即的季節(jié)中將要在人群中傳播的流感病毒毒株的表面糖蛋白，血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。將這些摻入疫苗中的毒株在含胚卵中生長，并隨后在進一步加工之前純化病毒顆粒。需要逐年調(diào)整流感疫苗是因為由已知稱為“抗原性漂移”和“抗原性轉(zhuǎn)變”所致的抗原發(fā)生變化。
“抗原性漂移”是由于在病毒的H或N蛋白中積累一系列點突變而發(fā)生的，導(dǎo)致氨基酸取代。這些取代防止由各種感染產(chǎn)生的中和抗體的結(jié)合，而且新變體可以感染宿主。
“抗原性轉(zhuǎn)變”是通過在動物和人流感病毒A之間進行遺傳重配而出現(xiàn)一種新的亞型。1957年(H2N2)和1968年(H3N2)的全世界流行性毒株例如是重配的病毒，通過其鳥類H或N基因?qū)胙h(huán)的人體病毒中，隨后可以在人群中傳播。
基于對一百個以上的國際流感病毒中心的流行病學監(jiān)測，世界衛(wèi)生組織(WHO)每年常在2月對北半球，在9月對南半球推薦一些流感疫苗組合物。這種慣例限定了疫苗產(chǎn)生和標準化的時間窗，最大為9個月。在急需大劑量疫苗的情況中，例如當流感病毒A的一種新亞型通過抗原性轉(zhuǎn)變和抗原性漂移產(chǎn)生時，雞蛋的有限資源可能妨礙疫苗的快速生產(chǎn)。這種生產(chǎn)系統(tǒng)的另一個缺點是適應(yīng)性差，有存在毒素的風險和存在外來病毒尤其逆轉(zhuǎn)錄病毒的風險，并關(guān)系到不育性。目前在含胚卵上生產(chǎn)流感疫苗的實踐存在嚴重問題。
因此，使用生產(chǎn)流感疫苗的一種細胞培養(yǎng)系統(tǒng)是具有吸引力的另一種選擇?？梢詫⒘鞲胁《驹谠S多原代細胞，包括猴腎，小牛腎，倉鼠腎和小雞腎細胞上培養(yǎng)。但還未將它們實際用于生產(chǎn)疫苗，因為為制備疫苗，需要從這些原代細胞中重建培養(yǎng)物。因此，使用生產(chǎn)流感疫苗的持續(xù)性無限增殖化細胞系是另一種有吸引力的選擇。
認識到HA蛋白酶解成其兩個亞單位(HA1和HA2)是流感病毒感染性所需的，并可以通過加入胰蛋白酶而獲得這一點有助于應(yīng)用培養(yǎng)系統(tǒng)。包涵胰蛋白酶允許在Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞中復(fù)制并形成噬斑(Tobita等，1975)。
近來示出MDCK細胞系支持用以生產(chǎn)疫苗的流感病毒生長，(Brand等，1996和1997，Palache等，1997)。使用胰蛋白酶需要MDCK細胞在無血清的組織培養(yǎng)基(MDCK-SF1)中生長。然而，MDCK細胞目前未經(jīng)認可用作生產(chǎn)流感病毒的底物。
重要地是，任何生產(chǎn)流感疫苗的非人系統(tǒng)具有已知為“適應(yīng)性”的固有的缺點。由于在含胚卵中的適應(yīng)性，人流感病毒A和B均攜帶HA中的突變。這些突變導(dǎo)致抗原性改變(Newman等，1993，Williams和Robertson 1993，Robertson等，1994，Gubareva等，1994，Schild等，1993，Robertson等，1987，Kodihalli等，1995)。在人體中，用含有并攜帶適應(yīng)含胚卵引起突變的HA的疫苗進行免疫，產(chǎn)生較少的對含有非含胚卵適應(yīng)的HA的病毒的中和抗體(Newman等，1993)。
在犬細胞如MDCK細胞中增殖的人流感病毒，雖然程度較低，但也示出適應(yīng)性。這種病毒相對于含胚卵產(chǎn)生的病毒更類似原始的人中的病毒分離物(Robertson等，1990)。
另外，有這樣的跡象即NA中的宿主特異性變化和NA的宿主特異性磷酸化模式可以影響流感病毒的復(fù)制(Schulman和Palese1977；Sugiara和Ueda 1980；Kistner等1976)。
因此，避免流感病毒的適應(yīng)性或其它宿主導(dǎo)致的變化無疑是有益的。這可以產(chǎn)生更同源的病毒群，并最終使疫苗更有效。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供人體細胞，這種人體細胞作為生產(chǎn)高效價流感病毒的底物，適于研制疫苗。輪狀病毒和輪狀病毒疫苗輪狀病毒是導(dǎo)致世界范圍幼兒嚴重脫水性胃腸炎的最重要因素。在發(fā)展中國家，輪狀病毒感染每年導(dǎo)致800000以上病人死亡。在美國，每年估計花費在治療輪狀病毒感染上的費用就超過10億美元。
輪狀病毒，是呼吸道腸道病毒科的成員，是由11個RNA節(jié)段組成的雙鏈RNA病毒，每個節(jié)段均編碼結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)病毒蛋白(VP)。這種病毒的內(nèi)核心包含4種VPVP1，2，3和6。VP決定HRV-組，亞組和血清型的3種主要抗原性性質(zhì)。已經(jīng)鑒別了由VP6編碼的7種抗原性不同的組(A-G)。人輪狀病毒(HRV)感染主要是由A組輪狀病毒導(dǎo)致的，所述A組輪狀病毒具有與95％的臨床疾病相關(guān)的血清型1-4。天然的疾病防護是血清型特異性的。A組還進一步分為亞組I和II。
形成病毒衣殼的雙層外殼由兩種病毒蛋白組成，VP4和VP7，它們是參與保護性免疫的中和抗原，并決定血清型，盡管VP4在血清型決定中只起微弱作用。在用不同的血清型共同感染期間，分節(jié)段的基因組易于進行遺傳重配，這種性質(zhì)已經(jīng)用于生產(chǎn)疫苗(Marsha等，1999)。
根據(jù)提供的世界范圍流行輪狀病毒相關(guān)的嬰幼兒發(fā)病率和死亡率，大規(guī)模接種抗輪狀病毒疫苗是抵抗這種病毒的最有效的方式。接種的目的不是預(yù)防疾病而是降低其嚴重程度和并發(fā)癥，尤其在出生前幾年期間。
目前可以獲得的唯一有效的疫苗是基于人輪狀病毒的RNA節(jié)段的重配的口服活減毒疫苗，所述RNA節(jié)段編碼恒河猴血清型1，2和4的VP7，與血清型3的VP7一起提供減毒背景。用這種人恒河猴重配四價疫苗(RRV-TV)進行接種，盡管可以高效預(yù)防嚴重的胃腸炎，但其與腸套迭這種腸道梗阻疾病相關(guān)。為此這種疫苗不再使用。發(fā)明描述本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)用作疫苗的非腺病毒或腺病毒蛋白的病毒和/或病毒蛋白的方法，包括提供一種細胞，其具有至少一個編碼至少一種腺病毒的E1基因的基因產(chǎn)物或其功能衍生物的序列，將編碼所述病毒或所述病毒蛋白的核酸提供給所述細胞，將所述細胞在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)并使所述病毒繁殖或所述病毒蛋白表達，以及從所述培養(yǎng)基和/或所述細胞中收獲所述病毒和/或病毒蛋白。
直至本發(fā)明作出時，極少發(fā)現(xiàn)(人體)細胞適于以任何可再生和可大規(guī)模方式和/或足夠高的產(chǎn)量和/或易于純化的方式生產(chǎn)用作疫苗的病毒和/或病毒蛋白。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)優(yōu)選在其基因組中包含腺病毒E1序列的細胞能以顯著數(shù)量持續(xù)增殖病毒。
本發(fā)明優(yōu)選的細胞是從人體原代細胞中產(chǎn)生的，優(yōu)選從通過所述E1基因的基因產(chǎn)物無限增殖化的細胞中產(chǎn)生。為了能生長，原代細胞當然需要無限增殖化。這種細胞例如是衍生自人胚胎成視網(wǎng)膜細胞的細胞。
在本發(fā)明的細胞中，重要的是E1基因序列在細胞周期中不丟失。因此優(yōu)選編碼E1基因的至少一個基因產(chǎn)物的所述序列存在于所述(人體)細胞的基因組中?？紤]到安全性，最好在本發(fā)明的細胞中消除非所需腺病毒序列。這樣本發(fā)明的另一實施方案提供了不產(chǎn)生腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白的細胞。然而，為通過細胞培養(yǎng)達到大規(guī)模(持續(xù))生產(chǎn)病毒，優(yōu)選使細胞能不需要錨著而生長。本發(fā)明的細胞具有這種能力。為得到一種從中易于回收，及如果需要易于純化病毒的清潔和安全的生產(chǎn)系統(tǒng)，優(yōu)選本發(fā)明的方法，從而所述人體細胞不包含其它腺病毒序列。本發(fā)明的方法和使用中最優(yōu)選的細胞是PER.C6，在ECACC中的保藏號為96022940，或其衍生物。
因此本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明細胞的方法，其中所述細胞還包含一個編碼E2A或其功能衍生物或其類似物或片段的序列，優(yōu)選其基因組中存在編碼E2A或其功能衍生物或其類似物或片段的所述序列的人體細胞，并最優(yōu)選其中所述E2A編碼序列編碼溫度敏感性突變體E2A的細胞。
另外，本發(fā)明還提供了一種方法，其中所述(人體)細胞能懸浮生長。
本發(fā)明還提供了一種方法，其中所述人體細胞可以在沒有血清的情況下培養(yǎng)。本發(fā)明的細胞，尤其PER.C6細胞具有的另一優(yōu)勢是其能在沒有血清或血清成分的情況下培養(yǎng)。因此分離是簡便的，安全性增強，而且系統(tǒng)的可靠性良好(合成培養(yǎng)基的重復(fù)性最好)。本發(fā)明的人體細胞，尤其基于原代細胞的細胞，特別是基于HER細胞的那些細胞，能正常地在翻譯后和翻譯期間修飾和裝配。這意味著它們非常適于制備病毒蛋白和病毒以用于疫苗中。
因此本發(fā)明提供了一種方法，其中所述病毒和/或所述的病毒蛋白包含一種蛋白質(zhì)，其經(jīng)歷了翻譯后和/或翻譯期間修飾，尤其其中所述修飾包含糖基化。以任何可靠方式生產(chǎn)均較麻煩的病毒疫苗的一個良好實例是流感疫苗。本發(fā)明提供了一種方法，其中所述病毒蛋白包含至少一種流感病毒神經(jīng)氨酸酶和/或血凝素?？梢砸员景l(fā)明的方法生產(chǎn)的其它病毒蛋白(亞單位)和病毒(待滅活的野生型)或減毒的病毒，包括腸道病毒如鼻病毒，口蹄疫病毒，或脊髓灰質(zhì)炎病毒，皰疹病毒如單純皰疹病毒，假狂犬病病毒或牛皰疹病毒，正粘病毒如流感病毒，副粘病毒如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒如人免疫缺陷病毒或細小病毒或乳多空病毒，輪狀病毒或冠形病毒如感染性胃腸炎病毒或黃病毒如蜱傳腦炎病毒，或黃熱病毒，披膜病毒如風疹病毒或東方，西方，或委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒，肝炎病毒如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒，疫病毒如豬瘟病毒或彈狀病毒，如狂犬病毒，布尼病毒，如漢坦病毒。
在一個實施方案中，本發(fā)明的細胞用于生產(chǎn)一種在含胚卵上不能有效生長的流感病毒毒株。
本發(fā)明還提供了一種人體細胞的應(yīng)用，所述人體細胞的基因組中具有編碼腺病毒的至少一個E1蛋白或其功能衍生物，同源物或片段或至少一種用于疫苗中的病毒蛋白的序列，這種細胞不產(chǎn)生用于產(chǎn)生病毒的腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白。當然為了這種用途，本發(fā)明的方法中優(yōu)選的細胞也是優(yōu)選的。本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法和用途獲得的產(chǎn)物，特別是通過這些用途和/或方法可以獲得的病毒蛋白和病毒，尤其當組成一種藥物組合物時，所述藥物組合物包含適當?shù)馁x形劑和在一些形式(滅活的病毒，亞單位)中包含的佐劑。給予劑量和方式可以通過常規(guī)臨床實驗選擇，如果它們不能通過已經(jīng)注冊的疫苗獲知。
因此本發(fā)明還提供了一種用于疫苗中的病毒或病毒蛋白，其可以通過本發(fā)明的方法和用途獲得，所述病毒或所述病毒蛋白沒有任何非人哺乳動物蛋白質(zhì)物質(zhì)，本發(fā)明還提供了一種包含這種病毒和/或病毒蛋白的藥物配方。
本發(fā)明還提供了一種人體細胞，所述人體細胞在其基因組中具有編碼腺病毒的至少一種E1蛋白或其功能衍生物，同源物或片段的序列，該細胞不產(chǎn)生腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并具有編碼一種病毒或至少一種非腺病毒蛋白的核酸。這種細胞可用于本發(fā)明的方法中。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了流感病毒，其可以通過本發(fā)明的方法或通過本發(fā)明的用途獲得。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了流感疫苗，其可以通過本發(fā)明的方法或通過本發(fā)明的用途獲得。
本發(fā)明的另一方面提供了一個試劑盒，用于確定樣品中蛋白酶的活性，所述試劑盒包含至少一種通過本發(fā)明的方法和用途可以獲得的病毒蛋白或病毒，所述病毒或病毒蛋白沒有任何非人哺乳動物蛋白質(zhì)物質(zhì)。本發(fā)明的這個方面特別用于確定培養(yǎng)基中的蛋白酶活性。已知難以確定培養(yǎng)基的蛋白酶活性。然而，使用本發(fā)明的病毒蛋白或病毒作為蛋白酶的靶，就可能精確確定培養(yǎng)基中所述蛋白酶的活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，樣品中所述蛋白酶活性包含在培養(yǎng)基中活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白酶包含胰蛋白酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述病毒蛋白包括HA0。
本發(fā)明的另一方面提供了在能至少部分保留病毒感染性的條件下濃縮流感病毒的一種方法，包括從細胞培養(yǎng)物中獲得一種包含所述病毒的澄清的細胞上清，并將此上清在低剪切條件下超濾。從含胚卵中收獲的流感病毒制品典型地需要純化，以制備疫苗。純化典型地必需至少一步病毒的濃縮步驟。目前從流感病毒的這種相對粗制品中濃縮流感病毒的方法是繁雜的。使用本發(fā)明的濃縮方法，可以在保留至少部分病毒感染性的條件下濃縮流感病毒。有效的，濃縮的病毒是感染性的或可以產(chǎn)生感染性?？梢援a(chǎn)生感染性至少意味著通過HA0的裂解產(chǎn)生感染性病毒。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述濃縮是用中空纖維進行的。中空纖維特別適于在低剪切條件下進行濃縮。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述細胞培養(yǎng)物包括體外培養(yǎng)的細胞。特別適于使用本發(fā)明的方法的離心濾液是來自體外培養(yǎng)的細胞的上清，特別是當所述上清包含無血清培養(yǎng)基時。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述超濾是用只使蛋白通過而保留病毒的濾膜進行的。優(yōu)選地，所述濾膜包含一個500KD截斷值。更優(yōu)選地所述濾膜包含一個750KD的截斷值。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述濃縮還包含至少部分除去分子量小于500KD，優(yōu)選小于750KD的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述純化是使用所述濾膜完成的。
本發(fā)明的又一方面提供了用本發(fā)明的方法濃縮的感染性流感病毒或其衍生物。本發(fā)明的一種感染性流感病毒的衍生物是可以用于免疫的一種病毒，病毒顆粒，或病毒蛋白或其部分。典型地這必需一個病毒失效性滅活步驟。
實施例為舉例說明本發(fā)明，提供了以下實施例，但沒有限制本發(fā)明范圍之意。實施例1材料和方法PER.C6和MDCK細胞培養(yǎng)物將Madin Darby犬腎(MDCK)細胞，在37℃和10％CO2條件下，在Dulbecco’s修飾的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM，LifeTechnologies Breda，荷蘭)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基含有10％熱滅活的胎牛血清和1×L-Glutamin(Gibco-BRL)。將PER.C6的懸浮培養(yǎng)物在37℃和10％CO2條件下，在補加1×L-Glutamin的ExCell 525(JRH Biosciences)中，在6孔培養(yǎng)皿(Greiner)靜置培養(yǎng)，或在490cm2組織培養(yǎng)滾瓶(Coming Costar公司)中持續(xù)以1rpm滾動培養(yǎng)。免疫熒光測試使用IMAGENTM流感病毒A和B試劑盒(Dako)，根據(jù)供應(yīng)商的標準方案檢測流感病毒感染。將樣品使用表面熒光照明進行顯微觀測。感染的細胞具有明亮的蘋果綠色熒光。碘化丙錠染色將細胞沉淀重懸浮于300μl冷PBS/0.5％BSA+5ul于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的PBS/FCS/疊氮化物溶液中的碘化丙錠(濃度50ug/ml)中。然后通過流式細胞熒光測定方法檢測存活和死亡的細胞。血細胞凝集分析通常地，對流感病毒效價進行的血細胞凝集分析是根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行的。在此，將50ul在PBS中雙倍稀釋的病毒溶液加入25ul PBS和25ul在PBS中的1％火雞紅細胞懸浮液中(Biotrading Benelux B.V)，并在96孔微滴定平板中在4℃溫育1小時。檢測并記錄血細胞凝集模式，并以血細胞凝集單位(HAU’s)表示。HAU’s的數(shù)目相當于最高病毒稀釋度的倒數(shù)值，示出完全的血細胞凝集。流感HA蛋白的Western印跡分析通常地，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將獲得的流感病毒在Laemmli緩沖液中破壞，并將不同體積的所得蛋白質(zhì)混合物用10％SDS/PAGE凝膠分離。簡而言之，將印跡在室溫用封閉溶液(TBST中5％脫脂奶粉(Biorad)，補加1％兔血清(Rockland))封閉30分鐘，隨后用TBST洗3次。然后，將印跡用在1％BSA/TBST中用5％兔血清(Rockland)稀釋1/500的抗A/Sydney/5/97 HA抗血清(98/768NIBSC)，在室溫溫育過夜。再將印跡用TBST洗8次。最后，將印跡用在封閉溶液中稀釋1/6000的兔抗綿羊抗血清(HRP標記的，Rockland)，在室溫溫育1小時。在用TBST洗8次后，將蛋白質(zhì)綴合的復(fù)合物用ECL(Amersham Pharmacia Biotbch)觀測，并曝光于膠片(Hyperfilm，Amersham Life Science)?？寡宓米訬IBSC(UK)，并以NIBSC推薦的稀釋液使用。單向放射免疫擴散(SRID)分析將得自流感病毒感染的PER.C6細胞的上清中血凝素的濃度，通過前述單向放射免疫擴散(SRID)分析測定(Wood等，1997)。使用標準的NIBSC(UK)抗原和抗血清試劑進行這項分析。噬斑測定將全部1ml的10倍系列稀釋的病毒上清接種于在6孔平板中生長達到95％鋪滿的MDCK細胞上。在35℃1小時后，將細胞用PBS洗兩次，并用3ml瓊脂糖混合物(1.2ml 2.5％瓊脂糖，1.5ml 2×MEM，30ul 200mM L-Glutamine，24ul胰蛋白酶-EDTA，250ulPBS)覆蓋。然后將細胞在35℃在潮濕的10％CO2大氣環(huán)境中溫育將近3天，并對病毒噬斑進行觀測記錄。病毒感染性分析(TCID50)感染性病毒的滴定是在MDCK細胞上進行的。簡而言之，將細胞以4×104個細胞/孔的密度，種植于96孔平板的補加2mM L-Glutamin的DMEM中。24小時后，將細胞在含有4ug/ml濃度的胰蛋白酶-EDTA的培養(yǎng)基中，用100ul的10倍系列稀釋的培養(yǎng)上清感染，一式四份。在感染2小時后，將細胞單層在PBS中洗兩次，并在含有胰蛋白酶的培養(yǎng)基中在35℃溫育7天。然后在HA分析中測試取自這些培養(yǎng)物中的上清。根據(jù)Karber(1931)的方法計算TCID50效價。β-丙酸內(nèi)酯流感病毒滅活為滅活病毒以獲得用于從PER.C6細胞中生產(chǎn)疫苗的全滅活的病毒，使用β-丙酸內(nèi)酯進行本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的突變。β-丙酸內(nèi)酯是一種非常有效的廣泛用于滅活病毒的制劑，其突變作用是本領(lǐng)域熟知的。其修飾病毒基因組和宿主細胞基因組的核酸堿基，并阻斷之后的復(fù)制。根據(jù)用于制備全滅活的在含胚卵上制備的流感疫苗的方案，將相當于接近400ug的HA/毒株數(shù)量的病毒滅活，并用于最后的疫苗配方。簡而言之，將1體積的0.3M的磷酸鈉緩沖液加入9體積的流感病毒制品中。將1體積的10％β-丙酸內(nèi)酯(NewallDesign，UK)加入100體積的磷酸鹽緩沖的病毒制品中，并在20C溫育24小時，從而進行滅活病毒。病毒的滅活通過噬斑分析測定，在任何滅活的批次中檢測不到噬斑(數(shù)據(jù)未示出)。實施例2APER.C6細胞建庫和預(yù)培養(yǎng)使用PER.C6細胞系(保藏在應(yīng)用微生物學研究中心的歐洲動物細胞保藏中心，保藏號No.96022940)，或其衍生物(見WO 97/00326所述)。將細胞系通過兩層細胞庫系統(tǒng)建庫。將選擇的細胞系在研究用主細胞庫(rMCB)中庫存，貯存在不同的位置。從這個rMCK中如下制備工作細胞庫(rWCB)將1安瓿rMCB解凍，并將細胞增殖直至存在足夠的細胞，通過使用干冰冷凍細胞。將含有1ml(1-2×106個細胞/ml)rMCB的500安瓿貯存于液氮冷凍儀氣相中。將1安瓿含有5×106PER.C6細胞的WCB在37°水浴中解凍。將細胞迅速移至50ml試管中，并通過加入補加1×L-Glutamin的9ml懸浮培養(yǎng)基ExCell525(JRH Biosciences)而重懸浮。在臺式離心機中以1000rpm離心3分鐘后，將細胞以3×105個細胞/ml終濃度重懸浮，并在37℃，在10％CO2情況下，在T80組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。在2-3天后，將細胞以3×105/ml的密度種植于490cm2組織培養(yǎng)滾瓶中(Coming Coster公司)，并在1rpm持續(xù)滾動下培養(yǎng)。實施例2B作為流感病毒A的允許細胞系的PER.C6細胞由于未知人體PER.C6細胞維持流感病毒感染和復(fù)制的能力，因此要核實與Madin Darby犬腎(MDCK)細胞系相比，PER.C6細胞是否是流感病毒感染允許的，MDCK細胞系作為陽性對照。
在感染前1天，將2×105MDCK細胞/孔種植于6孔平板中。24小時后，將每孔4×105個種植的PER.C6細胞和MDCK細胞用H1N1毒株A/Puerto Rico/8/34(效價3.6×107pfu/ml)(得自Dr.E.Class，Leiden大學醫(yī)學中心，荷蘭)感染。在0.1-10pfu/細胞范圍內(nèi)的各種感染復(fù)數(shù)(moi’s)下進行感染。在37℃溫育大約2小時后，除去接種物，并用新鮮培養(yǎng)基置換。在感染24和48小時后，進行檢測流感病毒感染的直接免疫熒光測定。實驗示出PER.C6是流感病毒感染允許的，陽性細胞百分率是依賴于moi的并與MDCK相當(

圖1)。實施例3用于增殖流感病毒A的PER.C6核實流感病毒的復(fù)制和增殖是否可以由PER.C6支持。在感染當天，將PER.C6細胞以2×105個細胞/ml的密度，終體積為40ml種植于490cm2的組織培養(yǎng)滾瓶中，所述組織培養(yǎng)滾瓶中存在5ug/ml胰蛋白酶-EDTA(Gibco-BRL)。將細胞模擬接種或用H3N2毒株A/Shenzhen/227/95(效價1.5×106pfu/ml)(得自Dr.E.Class，Leidn大學醫(yī)學中心，荷蘭)感染。moi為10-4和10-3pfu/細胞。在37℃溫育1小時后，將細胞以1500rpm離心除去接種物并將細胞重懸浮于補加5ug/ml胰蛋白酶-EDTA的新鮮培養(yǎng)基中。從感染后第1天至第6天，每天收集1.3ml的細胞懸浮液。將上清在-80℃貯存并用于血細胞凝集分析。將細胞沉淀用于直接免疫熒光測定和碘化丙錠染色。實施例4PER.C6對不同流感病毒毒株的允許性為進一步研究PER.C6對各種流感病毒毒株增殖的允許性，用得自國際生物學標準和對照學會(NIBSC，UK)的H1N1疫苗株A/Beijing/262/95及其重排列的X-127進行感染。在感染當天，將PER.C6細胞以1×106個細胞/ml的密度，終體積為50ml種植于490cm2的組織培養(yǎng)滾瓶中。在存在5ug/ml胰蛋白酶-EDTA情況下用5微升(10-4稀釋度)和50微升(10-3稀釋度)病毒接種細胞。為證明是否確實需要胰蛋白酶，通過在不存在該蛋白酶情況下接種5微升疫苗株A/Beijing/262/95而進行再次感染。在37℃保溫1小時后，將細胞以1500rpm離心除去接種物并將細胞重懸浮于新鮮培養(yǎng)基+5ug/ml胰蛋白酶-EDTA中。在感染后第2天和第4天將更多的胰蛋白酶加入樣品中。從感染后第1天至第6天，每天收集1.3ml的細胞懸浮液。將上清在-80℃貯存并用于血細胞凝集分析和進一步的感染；將細胞沉淀用于直接免疫熒光測定。上述免疫熒光測定和血細胞凝集分析的結(jié)果分別示于圖4和圖5，證明了病毒的有效復(fù)制和釋放。實施例5在PER.C6細胞上增殖的病毒的感染性核實在PER.C6中生長的病毒是否是感染性的，及對此細胞系的適應(yīng)性是否可以提高病毒產(chǎn)量。所用的病毒上清得自用毒株A/Beijing/262/95及其重排列的X-127(稀釋度10-3)感染的PER.C6，并是在感染后第6天收獲的。在感染的當天，將PER.C6以大約1×106個細胞/ml的密度，終體積50ml種植于490cm2的組織培養(yǎng)滾瓶中。將細胞用100ul和1ml的病毒上清，在存在5ug/ml胰蛋白酶-EDTA的情況下接種。為確定胰蛋白酶是否是確實需要的，用100ul的毒株A/Beijing/262/95，在沒有蛋白酶的情況下接種而再次感染。在37℃溫育大約1小時后，將細胞以1500rpm離心除去接種物并將細胞重懸浮于±5ug/ml胰蛋白酶-EDTA的新鮮培養(yǎng)基中。在感染后第2天和第4天，將更多的胰蛋白酶加入樣品中。從感染后第1天至第6天，每天收集1.3ml的細胞懸浮液。將上清在-80℃貯存并用于血細胞凝集分析；將細胞沉淀用于直接免疫熒光測定。用上述免疫熒光測定和血細胞凝集分析獲得的結(jié)果，分別示于圖6和圖7。所得數(shù)據(jù)示出了生長于PER.C6中的病毒的感染性以及病毒產(chǎn)量提高。實施例6在PER.C6上存在流感病毒的細胞表面受體人流感病毒A和B毒株在含胚卵中的增殖通常導(dǎo)致受體結(jié)合變體的選擇，該變體在HA分子的暴露和功能重要的區(qū)域中的HA球狀頭部的遠端部分存在氨基酸取代。由于這些突變，適應(yīng)含胚卵的毒株與最初的人病毒在其抗原性和免疫原性活性，以及其毒力方面有所不同。分離自MDCK細胞的人流感病毒通常存在一種HA蛋白，其與最初的臨床樣品的病毒上存在的HA蛋白相同。近來的研究(Govorkova 1999)闡明了在含胚卵中選擇變體的分子學基礎(chǔ)，及在MDCK細胞中沒有這種變體選擇現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)所有分離自MDCK細胞的人流感病毒A和B毒株，均與存在于細胞表面受體中的寡糖中的α-2，6唾液酸-半乳糖鍵高度親和性和特異性結(jié)合，而其在含胚卵中生長的對應(yīng)物示出與攜帶寡糖(Sia2-3Gal)的細胞表面受體中的α-2，6唾液酸-半乳糖鍵的親和性提高。使用特異性凝集素表明只有含有Sia2-3Gal的受體在雞胚細胞的表面存在，而MDCK細胞表達Sia2-6Gal和Sia2-3Gal。PER.C6細胞表面上Sia2-6Gal和Sia2-3Gal組分的表達是通過FACS分析研究的，使用兩種不同的洋地黃毒苷(DIG)標記的凝集素特異識別Sia2-6Gal鍵的Sambuca nigra凝集素(SNA)，和特異識別Sia2-3Gal鍵的Maackia amurensis凝集素(MAA)。圖8A示出SNA和MAA凝集素的識別作用及其與糖基化位點的結(jié)合。另外，圖8A示出FITC標記的抗DIG抗體和DIG標記的凝集素之間的相互作用模式，其識別細胞表面存在的受體的糖基化骨架中特異的唾液酸鍵。這兩種凝集素均取自多糖鑒別試劑盒(Boehringer-La Roche)。
實驗是在懸浮的PER.C6細胞和粘附的MDCK和CHO細胞上進行的。MDCK和CHO細胞使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco-BRL)從固體支持物中釋放。然后將細胞懸浮液用Mem-5％FBS洗一次，并在此培養(yǎng)基中在37℃溫育1小時。在用PBS洗(Gibco-BRL)后，將細胞在結(jié)合培養(yǎng)基(Tris緩沖鹽水，pH7.5，0.5％BSA，和各1mM的MgCl2，MnCl2，和CaCl2)中，以大約為106個細胞/ml的濃度重懸浮。將細胞等分在室溫用DIG凝集的凝集素SNA和MAA溫育1小時。1小時后，將用凝集素處理的細胞用PBS洗，并在室溫用FITC標記的抗DIG抗體(Boehringer-Mannheim)另外溫育1小時。最后，將細胞用PBS洗并使用FAC-分選設(shè)備(Becton Dickinson)通過熒光激活的細胞分選加以分析。圖8B所示的結(jié)果表明PER.C6細胞被這兩種凝集素染色，示出存在Sia2-6Gal以及Sia2-3Gal受體。
在相同的實驗中，將MDCK細胞用作這兩個唾液酸化的受體的陽性對照物，而CHO細胞由于不存在α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，所以這些倉鼠細胞中的糖基化酶作為Sia2-6Gal組分的陰性對照物。上面一組示出用SNA凝集素的結(jié)果，下面一組示出用MAA凝集素的結(jié)果。從這些結(jié)果中可以證明PER.C6細胞表達細胞表面蛋白，所述蛋白在其多糖鏈中具有Sia2-6Gal和Sia2-3Gal鍵。實施例7不同濃度的胰蛋白酶-EDTA對PER.C6細胞的存活性，對在PER.C6細胞中流感病毒的產(chǎn)生，及對其衍生的球狀HA蛋白的作用由于細胞培養(yǎng)中流感病毒增殖對胰蛋白酶的絕對需求，因此對不同濃度的胰蛋白酶-EDTA對PER.C6細胞的存活性，及在用一些流感病毒毒株感染后PER.C6細胞中病毒復(fù)制的作用加以研究。用流感病毒毒株A/Sydney/5/97，在存在低濃度的胰蛋白酶的情況下感染在感染當天，將PER.C6細胞以1×106個細胞/ml的密度種植于490cm2的組織培養(yǎng)滾瓶中，所述滾瓶中存在終濃度為0.5，1，2，3，和5ug/ml的胰蛋白酶-EDTA。這些胰蛋白酶濃度不干擾細胞的生長特性及其存活性(數(shù)據(jù)未示出)。將細胞模擬感染或用在PER.C6中生長的流感病毒A/Sydney/5/97感染，moi為10-4pfu/細胞。病毒的產(chǎn)生通過上述直接免疫熒光測定(數(shù)據(jù)未示出)，血細胞凝集分析，單向放射免疫擴散(SRID)和噬斑分析加以監(jiān)測。實驗結(jié)果示于圖9，示出當使用1ug/ml濃度的胰蛋白酶時，通過SRID測定的HA含量以及以HAU表示的病毒的生物活性是最高的。圖9還示出通過使用噬斑分析，每ml最高數(shù)目的噬斑形成單位(pfu)是在細胞在含有2ug/ml胰蛋白酶的培養(yǎng)基中生長的樣品中觀測到。用流感病毒毒株B/Harbin/7/94感染在感染當天，將PER.C6細胞以1×106個細胞/ml的密度種植于490cm2的組織培養(yǎng)滾瓶中，所述滾瓶中存在1-5ug/ml范圍內(nèi)不同濃度的胰蛋白酶-EDTA。將細胞用在PER.C6中生長的病毒B/Harbin/7/94感染，moi為10-3pfu/細胞。病毒的產(chǎn)生通過直接免疫熒光測定，血細胞凝集和噬斑分析進行監(jiān)測，如圖10所示。在第2天，PER.C6的感染能力隨著胰蛋白酶的濃度而提高。然而在第3天，當存在1，2.5或5ug/ml胰蛋白酶時，感染的細胞的百分率沒有明顯差異。在沒有胰蛋白酶的情況下(0ug/ml)，檢測不到流感病毒感染。在最后收獲那天(感染后第4天)，通過血細胞凝集分析測定的病毒的生物活性沒有明顯不同。令人感興趣地，在取自感染后第3天和第4天的樣品中進行的感染性分析示出病毒的產(chǎn)生中的差異。當使用2.5-5(第3天)和1ug/ml(第4天)濃度的胰蛋白酶時，在第3天和第4天獲得最高效價。用流感病毒重排列的X-127感染在感染當天，將PER.C6細胞以1×106個細胞/ml的密度種植于T25組織培養(yǎng)瓶中，所述培養(yǎng)瓶中存在0-7.5ug/ml范圍內(nèi)不同濃度的胰蛋白酶-EDTA。將細胞用在PER.C6中生長的病毒X-127(在雞卵中重排列的毒株A/Beijing/262/95)感染，moi為10-4和10-3pfu/細胞。病毒生長通過直接免疫熒光測定，血細胞凝集和噬斑分析進行監(jiān)測。如圖11和圖12所示，HAU效價與樣品相同，不依賴于使用的胰蛋白酶濃度和初始moi。另外，在通過噬斑分析測定的感染性效價中未觀測到明顯不同。用流感病毒毒株A/Sydney/5/97在存在高濃度胰蛋白酶的情況下感染PER.C6為測試胰蛋白酶的濃度提高對細胞的存活性和病毒復(fù)制的作用，將PER.C6細胞以1×106個細胞/ml的密度種植于滾瓶中，所述滾瓶中存在0-12.5ug/ml范圍內(nèi)不同濃度的胰蛋白酶-EDTA。將細胞模擬感染或用PER.C6生長的病毒A/Sydney/5/97病毒感染，moi為4×10-5pfu/細胞。如上所述測定所得批次中存在的HAU。重要地，圖13所示的數(shù)據(jù)清晰地示出胰蛋白酶的濃度直至10ug/ml也不影響細胞的存活性。另外，當使用2.5-5ug/ml濃度的胰蛋白酶時，在感染后第4天通過HAU測定的病毒的生物活性較高。另外，測定TCID50(圖14A)及進行噬斑分析(數(shù)據(jù)未示出)。在這些噬斑分析，感染性效價(TCID50)，及HA裂解和通過Western印跡分析測定的數(shù)量(大約10ug/ml)中未發(fā)現(xiàn)明顯不同，如圖14B所示。實施例8在中空纖維灌流生物反應(yīng)器系統(tǒng)中在PER.C6細胞上生產(chǎn)流感病毒通過使用3L(總體積)生物反應(yīng)器研究在懸浮生長的PER.C6細胞中生產(chǎn)流感病毒的規(guī)模，所述反應(yīng)器中含有在無血清培養(yǎng)基中2L體積的細胞懸浮液，其沒有動物或人衍生的蛋白質(zhì)(ExCell 525，JRH Biosciences)。
在大約3×106個細胞/ml的密度進行流感病毒感染。將細胞用PER.C6培養(yǎng)的A/Sydney/5/97病毒接種，moi為10-4pfu/細胞。每天取5-10ml細胞懸浮液樣品，進行一般細胞計數(shù)，以確定細胞的存活性，進行葡萄糖濃度測定，直接免疫熒光測定，血細胞凝集分析和感染性分析。這些實驗結(jié)果示于圖15。
為研究HA蛋白的存在和狀況，使用得自NIBSC的兩種不同的抗HA抗體進行Western印跡。也可以進行上述SRID分析。示于圖16中的兩種Western印跡結(jié)果示出在這種生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的流感病毒批次產(chǎn)生的HA含量估計為15ug/ml，這是通過SRID分析證實的。產(chǎn)生的HA在亞單位組成和與參考的亞型特異性抗血清的免疫反應(yīng)性方面，可與參考的NIBSC HA相比。實施例9在15L生物反應(yīng)器中用A/Sydney/5/97感染PER.C6，隨后進行特異性下游加工(DSP)將懸浮生長的PER.C6細胞在37℃，在15L生物反應(yīng)器中空纖維灌流系統(tǒng)中溫育，所述生物反應(yīng)器中空纖維灌流系統(tǒng)中具有10L無血清ExCell 525培養(yǎng)基(JRH Biosciences)中的細胞懸浮液。在35℃以大約3.3×106個細胞/ml的細胞密度，在含有5ug/ml胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)的培養(yǎng)基中，進行流感病毒感染。將細胞用PER.C6中培養(yǎng)的A/Sydney/5/97病毒(傳代數(shù)3)接種，moi為10-4pfu/細胞。用含有胰蛋白酶-EDTA的無血清ExCell 525培養(yǎng)基，在感染后的前24小時持續(xù)進行灌流。在感染后2天，將細胞用含有葡萄糖，必需氨基酸和額外的谷氨酰胺的補料分批溶液培養(yǎng)82ml50m/v％葡萄糖/L懸浮液(NPBI，荷蘭)，50×必需氨基酸，無Gln(Gibco-BRL-Life Technologies)，和200mM谷胺酰胺(Gibco-BRL-Life Technologies)。每天取10ml細胞懸浮液樣品，以進行標準細胞計數(shù)(結(jié)果示于圖17，左側(cè))，葡萄糖濃度測定(結(jié)果示于圖17，右側(cè))，直接免疫熒光(圖18)，血細胞凝集分析(圖19)和感染性分析(數(shù)據(jù)未示出)。另外，對HA蛋白通過Western印跡分析進行研究，并與NIBSC標準HA對照物比較(圖20)。在最后收獲全部細胞懸浮液那天(感染后92小時)，使用PowerfugeTM分離系統(tǒng)(Carr，JM Separations)，根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)，以持續(xù)20000g的流量進行細胞碎片澄清。然后將澄清的上清使用具有500kD截斷值的中空纖維膜萃取柱濃縮20倍(A/G Technology，JM Separations)。圖21所示結(jié)果示出在通過血細胞凝集和感染性分析測定的通過中空纖維濃縮后的活流感病毒的定量回收是非常顯著的。實施例10PER.C6中生長的流感病毒的免疫原性及其衍生的疫苗為測定PER.C6中生長的流感病毒的免疫原性，設(shè)計一種在雪貂體內(nèi)研究和攻擊模式。使用兩批三價全滅活流感疫苗(由A/Sydney/5/97，A/Beijing/262/95和B/Harbin/7/94組成)，含有各15μg這3個毒株中的HA。第一批得自能育的雞卵，第二批得自PER.C6細胞。如下所述進行三價全滅活的PER.C6衍生的流感疫苗的生產(chǎn)，純化，滅活和配制。A/Sydney/5/97，A/Beijing/262/95和B/Harbin/7/94流感毒株在PER.C6上的生長在3個單獨的3L中空纖維補料分批生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，生產(chǎn)所有三種流感病毒，所述反應(yīng)器中含有體積為2L的細胞懸浮液。加入以下溶液進行分批補料一次加入總體積為96ml的含有50m/v％葡萄糖(NPBI)，50×無Gln的必需氨基酸(Gibco-BRL-LifeTechnologies)，200mM谷氨酰胺(Gibco-BRL-Life Technologies)和7.5m/v％NaHCO3(Merck)的溶液。在含有5μg/ml胰蛋白酶-EDTA的無血清的ExCell 525培養(yǎng)基中，以1.8×106-2.6×106個存活細胞/ml的細胞密度，進行流感病毒感染。將PER.C6細胞用PER.C6中生長的A/Sydney/5/97，A/Beijing/262/95和B/Harbin/7/94病毒接種，moi為10-4(A/Sydney/5/97)或10-3(A/Beijing/262/95和B/Harbin/7/94)pfu/細胞。在病毒生產(chǎn)期間，每天取10ml樣品，以進行標準細胞和存活性計數(shù)，葡萄糖濃度測定，直接免疫熒光測定和血細胞凝集分析。圖22(得自A/Sydney/5/97感染的PER.C6細胞)示出在用病毒感染后總細胞計數(shù)和存活細胞計數(shù)(上左側(cè))，葡萄糖消耗(上右側(cè))，在直接免疫熒光測定中陽性細胞百分率(下左側(cè))和HAU’s(下右側(cè))。圖23(得自A/Beijing/262/95感染的PER.C6細胞)示出在用病毒感染后總細胞計數(shù)和存活細胞計數(shù)(上左側(cè))，葡萄糖消耗(上右側(cè))，在直接免疫熒光測定中陽性細胞百分率(下左側(cè))和HAU’s(下右側(cè))。圖24(得自B/Harbin/7/94感染的PER.C6細胞)示出在用病毒感染后總細胞計數(shù)和存活細胞計數(shù)(上左側(cè))，葡萄糖消耗(上右側(cè))，在直接免疫熒光測定中陽性細胞的百分率(下左側(cè))和HAU’s(下右側(cè))。將含有病毒的濃縮物貯存于-80℃，直至DSP。
在所有這三種情況中，葡萄糖消耗和PER.C6細胞的存活性和總細胞計數(shù)是可比的。通過直接免疫熒光分析測定的這三種病毒的生產(chǎn)水平也是相似的。盡管在不同的毒株之間HAU和感染性效價不同，但PER.C6持續(xù)復(fù)制測試的所有流感病毒。
在收獲全部批次當天(在感染后第3或4天)，將病毒上清在臺式離心機中，以2000rpm離心澄清，并使用具有750kD截斷值的中空纖維膜萃取柱(A/G Technology，JM Separations)，根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)通過超濾濃縮10倍。流感病毒是通過兩個相繼的密度離心步驟從濃縮的上清中純化的25-70％封閉蔗糖梯度(在27K 1.5小時)，隨后持續(xù)25-70％蔗糖梯度(在23K 4小時)。將病毒條帶在大約50ml的磷酸鹽緩沖液中稀釋，并最后在超離心機中以24000rpm沉淀。將病毒沉淀溶解于1.5-2.3ml磷酸鹽緩沖液中，等分，并在-80℃冷凍。
配制滅活的流感疫苗是基于“免疫活性的”HA蛋白的數(shù)量(在微生物中)，通過SRID分析測定(Wood等，1977)。進行定性批次中HA含量的測試。同時使用基于Lowry的DC-蛋白分析試劑盒(Biorad)，根據(jù)生產(chǎn)者建議的步驟測定蛋白質(zhì)總量。發(fā)現(xiàn)HA組成了病毒制品的總蛋白質(zhì)含量的大約20-30％。實施例11在雞卵中和在PER.C6上產(chǎn)生的滅活疫苗的體內(nèi)免疫原性雪貂和小鼠是研究流感病毒感染的兩個充分確定的動物模型，并已經(jīng)用于確定流感疫苗的效力和免疫原性。使用小鼠模型測試系統(tǒng)，將由PER.C6和雞卵衍生的三價疫苗的免疫原性，通過血細胞凝集抑制分析接種動物的血清加以對比，所述三價疫苗含有A/Sydney/5/97，A/Beijing/262/95和B/Harbin/7/94。使用雪貂感染模型，免疫是在用A/Sydney/5/97攻擊后產(chǎn)生的。在MDCK細胞上回收病毒及利用血清進行血細胞凝集抑制分析，用于對比兩個疫苗的免疫原性和效力。存小鼠中進行體內(nèi)研究將90個雌性Balb/C小鼠分成9組，每組10只小鼠。在第0天收集最多100μl的血液。分離血清并貯存于-20℃。然后將每只小鼠根據(jù)表1所示用適當?shù)囊呙缃臃N。在第28天，取另外100μl血液。將血清貯存于-20℃。將每只小鼠根據(jù)表1所示再接種。在第42天，取100μl血液樣品，并將所有小鼠處死。分離血清并在-20℃冷凍。對取自第0，28和42天的血清樣品進行血細胞凝集抑制(HI)分析。每天對在雞卵和細胞中生長的病毒并列進行所有這些分析。
表I小鼠中的免疫原性測試
在雪貂中進行體內(nèi)分析將18個雌性雪貂(白化變種或臭鼬)如下分成3組，每組6只第1組通過肌內(nèi)(IM)注射接受雞卵衍生的測試疫苗，將動物用A/Sydney/5/97攻擊。第2組IM接受PER.C6衍生的測試疫苗，將動物用A/Sydney/5/97攻擊。第3組只接受測試疫苗稀釋劑，并用A/Sydney/5/97攻擊。在第0天和第28天施用測試疫苗。在第56天，將所有雪貂均用0.5ml的A/Sydney/5/97攻擊病毒經(jīng)鼻內(nèi)感染，TCID50為103。對鼻腔進行洗滌，并從第57-63天每天監(jiān)測一次雪貂的炎癥細胞計數(shù)，溫度和體重。在第63天將所有的動物處死。分離血清并貯存于-20℃。將鼻腔洗滌樣品貯存于冰上，使用錐蟲藍排出分析計數(shù)鼻腔洗滌回收的細胞。
得自鼻腔洗滌樣品的病毒效價是通過測定在MDCK細胞上回收的病毒而確定的。將Spearman和Karber(1931)的計算公式用于計算TCID50。對取自第0天，28天，56天和63天的血清樣品進行血細胞凝集抑制分析。從這個實驗中可以論證PER.C6衍生的測試疫苗是有效的。實施例12來自PER.C6上生產(chǎn)的流感病毒的HA蛋白的特性為研究PER.C6細胞中HA的糖基化，產(chǎn)生一批未裂解的HA(HA0)。將PER.C6細胞用病毒A/Sydney/5/97(在PER.C6上傳代數(shù)為5)，在含有終濃度為5μg/ml的胰蛋白酶-EDTA的ExCell 525培養(yǎng)基中感染。Moi為1，0.1和0.01pfu/細胞。在35℃溫育1小時后，將細胞用PBS洗兩次以除去胰蛋白酶，并在35℃在10％CO2條件下，在沒有胰蛋白酶的情況下溫育過夜。在第2天，收集細胞懸浮液并離心(500g)，將細胞沉淀用培養(yǎng)基洗兩次。將病毒上清在-80℃冷凍，并將其樣品用于所述的Western印跡分析中，以研究未裂解的HA蛋白的存在與否。
未裂解的HA蛋白(HA0)由兩個亞單位組成HA1和HA2，它們通過二硫鍵連接。由于這種二硫鍵可以通過用DTT還原而破壞，因此HA1和HA2可以在還原凝膠上分離并觀測，隨后用識別亞單位的抗血清進行Western印跡。如果HA蛋白只由HA0組成，將觀測到與HA1亞單位和遷移最快的HA2亞單位相比通過SDS/PAGE凝膠遷移較慢的一個條帶。示于圖25的結(jié)果提示當與得自NIBSC(UK)的雞卵衍生的陽性參照物相比時，在PER.C6中主要存在未裂解的HA0。為證實檢測的條帶確實是未裂解血細胞凝集素，將HA0樣品用在2.5-10μg/ml范圍內(nèi)不同濃度的胰蛋白酶，在培養(yǎng)基中在37℃消化過夜。然后將消化的蛋白質(zhì)在還原條件下加樣于SDS/PAGE凝膠上，隨后使用如圖14所述相同抗血清進行Western印跡分析。如圖26A所示，可以達到HA0裂解，證實未裂解的HA蛋白是在PER.C6上產(chǎn)生的?；谶@些結(jié)果，產(chǎn)生了一種使用流感HA0作底物，確定培養(yǎng)基中胰蛋白酶活性的分析方法。胰蛋白酶活性分析為確定存在于產(chǎn)生流感病毒的培養(yǎng)基中的胰蛋白酶是否仍具有活性，研制了一種胰蛋白酶活性分析方法。這種分析方法是基于測定胰蛋白酶裂解與流感疫苗生產(chǎn)最相關(guān)的底物HA0的酶促活性。
確定在用流感病毒B/Harbin/7/94接種的PER.C6(moi為10-3/10-4pfu/細胞)培養(yǎng)物中，胰蛋白酶在整個生產(chǎn)期間是否保留活性。為此，將在感染后第1，2和3天取的10μl上清，用于在37℃過夜裂解68ng由流感病毒A/Sydney/5/97病毒的HA0組成的底物。在消化后，將蛋白酶抑制劑(完全蛋白酶抑制劑混合物，BoehringerMannheim)加入具有150mM DTT(Fluka)的3×Laemli緩沖液中，至終濃度為1×。將樣品加樣于10％Tris-HCl SDS/PAGE凝膠中(Biorad)進行實驗。如述進行Western印跡。結(jié)果示于圖26B，表明在用流感病毒B/Harbin/7/94接種的PER.C6培養(yǎng)物中，胰蛋白酶在整個生產(chǎn)期間保留活性，因為培養(yǎng)上清能完全裂解HA0。實施例13用N-糖苷酶F消化HA0流感病毒HA蛋白是一種糖蛋白，含有3-9個N-連接的糖基化寡糖位點。位點的數(shù)目取決于病毒毒株。這些位點的位置是通過HA基因的核苷酸序列確定的，而且因為流感病毒的基因組是通過易錯RNA聚合酶復(fù)制的，因此產(chǎn)生糖基化位點的添加或除去的突變高頻率發(fā)生。然后對HA上存在的寡糖鏈的組分和結(jié)構(gòu)，通過宿主細胞提供的生物合成的陣列和微調(diào)糖基化酶確定。由于HA的糖基化在毒力和疫苗效力中起重要作用，因此對在流感病毒感染的PER.C6上生產(chǎn)的HA的性質(zhì)加以研究。根據(jù)生產(chǎn)者提供的方案，用N-糖苷酶F消化A/Sydney/5/97未裂解的HA0蛋白，以除去預(yù)期存在于A/Sydney/5/97 HA多肽上的7個寡糖。將流感病毒A/Sydney/5/97用1％的Triton X-100(Merck)裂解。將蛋白酶抑制劑加入相當于68ngHA的這種裂解的病毒等分中，至終濃度為1×(完全蛋白酶抑制劑混合物，Boehringer Mannheim)。將此樣品在存在100mM NaPO4pH7，10mM EDTA(J.T.Baker)，1％SDS(J.T.Baker)和1％B-巰基乙醇(Merck)的情況下溫育。在室溫下溫育10分鐘。將樣品用100mMNaPO4pH7，10mM EDTA(J.T.Baker)，0.625％NP-40和1％B-巰基乙醇(Merck)稀釋5倍。將稀釋液的40μl用于糖苷酶-F消化。為此，加入2μl 1U/μL的糖苷酶-F(N-糖苷酶F，Boehringer)，并在37°溫育最少16小時。然后加入具有150mM DTT(Fluka)的3×Laemli緩沖液，至終濃度為1×。將樣品在7.5％SDS/PAGE凝膠上進行實驗。如下進行SDS-PAGE和Western印跡。簡而言之，將印跡在室溫用封閉液(補加1％兔血清(Rockland)的TBST中5％脫脂奶粉，Biorad)封閉30分鐘，隨后用TBST洗3次。然后，將印跡用抗A/Sydney/5/97 HA抗血清(98/768 NIBSC)在室溫溫育過夜，所述抗血清在具有5％兔血清(Rockland)的1％BSA/TBST中稀釋500倍。將印跡再用TBST洗8次。最后將印跡用在封閉液中稀釋6000倍的HRP標記的-兔抗綿羊抗血清在室溫溫育1小時。在用TBST洗8次后，用ECL(Amersham Pharmacia Biotech)觀測綴合蛋白質(zhì)的復(fù)合物，并在膠片(Hyperfilm，Amersham Life Science)曝光。如圖27所示，用糖苷酶-F處理明顯使蛋白質(zhì)的大小降低為大約28-30kD，每個寡糖喪失大約4kD。用*表示的蛋白質(zhì)條帶是去糖基化的HA0，其遷移類似于將HA0裂解為HA1和HA2亞單位獲得的HA1亞單位產(chǎn)物(右側(cè)泳道)。實施例14用Accutase裂解HA0對用非哺乳動物的或重組的蛋白質(zhì)代替哺乳動物產(chǎn)生的胰蛋白酶-EDTA的可能性進行研究。近年來，來自無脊椎動物的一種蛋白酶和膠原酶的混合物(AccutaseTM，PAA)，可以通過常規(guī)細胞培養(yǎng)獲得。由于其來源于無脊椎動物，因此Accutase沒有朊病毒，細小病毒和潛在的可以污染胰蛋白酶-EDTA溶液的其它組分。目前還沒有關(guān)于Accutase中存在的蛋白酶類型的信息。使用Western印跡分析研究HA0的裂解。將一種常量的HA0蛋白用系列稀釋的Accutase在37℃消化過夜，所述HA0蛋白是用A/Sydney/5/97在沒有胰蛋白酶的情況下moi為1pfu/細胞而感染PER.C6獲得的。作為陽性對照，使用等量的用100ng胰蛋白酶-EDTA消化的HA0。然后將消化的蛋白質(zhì)加以于10％SDS-PAGE凝膠上，在還原條件下進行Western印跡分析。如圖28所示，用2μl Accutase處理可以完全裂解HA0；使用0.2μl只觀測到部分裂解。
這些結(jié)果提示在流感病毒復(fù)制和產(chǎn)生期間用Accutase處理，可以代替在流感病毒感染PER.C6期間的胰蛋白酶-EDTA。實施例15對PER.C6細胞上流感病毒進行電子顯微鏡檢對用流感病毒毒株A/Sydney/5/97感染的PER.C6細胞，以及對含有上清和蔗糖純化物的病毒，進行透射電鏡研究，以確定在PER.C6上產(chǎn)生的這種流感病毒的表型。所有使用的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。圖29示出病毒生活周期在最后階段是通過芽殖并從胞質(zhì)膜中釋放包膜的毒粒而代表的。檢測相當于HA和NA病毒蛋白的噬菌體刺突，其裝飾在毒粒的外圍。此圖還示出流感病毒的多態(tài)性特征。實施例16用多種流感病毒A和B毒株感染PER.C6使用PER.C6作為生產(chǎn)流感疫苗的平臺的方法，要求PER.C6支持廣泛的不同亞型流感毒株的生長。
將在T25燒瓶和/或在6孔平板中ExCell 525培養(yǎng)基中生長的PER.C6細胞的靜態(tài)懸浮培養(yǎng)物，用圖30A所示的16種不同的流感病毒毒株，以106個細胞/ml的細胞密度感染。這些毒株包含一些H3N2，H1N1，B型和禽類毒株。在存在5μg/ml胰蛋白酶的情況下進行感染。病毒得自NIBSC(UK)用雞卵傳代的野生型或重排列的毒株。用由NIBSC推薦的病毒稀釋液在綿羊中進行感染，對所述綿羊施用不同毒株。通過免疫熒光測定(數(shù)據(jù)未示出)和pfu分析中上清液的效價(圖30B)，觀測到所有測試病毒均能在PER.C6上增殖。
這些結(jié)果示出甚至通常在含胚卵上難以生產(chǎn)的流感毒株(用*表示的)如A/Johannesburg/33/94，B/Beijing/184/93和A/Duck/Singapore-Q/F119-3/97，也能在人PER.C6細胞上復(fù)制和產(chǎn)生。實施例17在PER.C6上生產(chǎn)I型單純皰疹病毒(HSV-1)，II型單純皰疹病毒(HSV-2)和麻疹病毒對除了流感病毒和腺病毒之外的其它病毒如I型單純皰疹病毒(HSV-1)，II型單純皰疹病毒(HSV-2)和麻疹病毒是否也能在PER.C6上復(fù)制進行測試。衍生自這些在PER.C6中生長的病毒的疫苗和在人體中產(chǎn)生中和作用以對野生型感染有防護作用的疫苗，是從PER.C6生長的病毒中生產(chǎn)的。得自ATCC并用于感染PER.C6細胞的毒株見表2所示。表2得自ATCC及用于感染PER.C6細胞的單純皰疹病毒和麻疹病毒毒株
為測試得自ATCC的HSV-1和HSV-2及麻疹病毒是否能在PER.C6上復(fù)制和生產(chǎn)，將傳代數(shù)為46的細胞以105個細胞/孔種植于根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知方法用聚-L-賴氨酸包被的labtekchambers中。將猴衍生的Vero細胞(得自ATCC)培養(yǎng)至傳代數(shù)為137，并用作陽性對照，以2.5×104個細胞/孔的密度種植。在第0天，當具有PER.C6的孔是60％鋪滿及具有Vero細胞的孔是80％鋪滿時，將細胞用不同moi感染(10-3，10-2，10-1和1TCID50/細胞)。在感染后隔天將細胞固定，并使用FITC綴合的類型特異性單克隆抗體，使用一種試劑盒(Imagen單純皰疹病毒(HSV)I型和II型(Dako)，和FITC綴合的抗HA和麻疹病毒基質(zhì)蛋白的抗體(麻疹I(lǐng)FA試劑盒，Light diagnostics))，根據(jù)生產(chǎn)者建議的程序進行免疫熒光測定?？寡逯苯涌笻SV-1和HSV-2和麻疹病毒抗原。
概括于圖31的結(jié)果示出PER.C6允許HSV-1(圖31D)和HSV-2(圖31E)和麻疹病毒(圖31A)感染。另外，動力學提示這些病毒在PER.C6上以moi依賴性方式復(fù)制。
接著對HSV-1和HSV-2和麻疹病毒是否能在PER.C6上增殖進行研究。為此，將細胞用HSV-1和HSV-2和麻疹病毒感染，對HSV-1(圖32C)和HSV-2(圖32A)而言，moi為0.01，0.1和1TCID50/細胞，對麻疹病毒(圖32B)而言，moi為0.001TCID50/細胞(傳代數(shù)為1)。在發(fā)生幾乎完全細胞病變作用時，收獲細胞和上清，迅速在液氮中冷凍，并融解。之后，將大約100μl的澄清上清隨機傳代至PER.C6(此為傳代數(shù)2)。在再一次達到幾乎完全細胞病變作用后，以相似方式進行第三次傳代(傳代數(shù)為3)。傳代數(shù)為2和3的moi是通過TCID50分析確定的。
這些實驗結(jié)果示出單純皰疹病毒I型和II型和麻疹病毒可以在PER.C6上復(fù)制，甚至在使用低如10-7的moi時也可以發(fā)生復(fù)制和增殖。實施例18篩選在PER.C6上復(fù)制的輪狀病毒為測試PER.C6是否還支持輪狀病毒的復(fù)制，將PER.C6細胞用獼猴輪狀病毒感染(MMU 18006；ATCC#VR-954，毒株SUSA792；lot#2181153)。將PER.C6細胞(傳代數(shù)41)以1×105/ml密度培養(yǎng)，將猴衍生的Vero細胞(得自ATCC，傳代數(shù)139)以2.5×104密度/ml培養(yǎng)，接著種植于Labtekchambers中，其已經(jīng)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法用聚-L-賴氨酸預(yù)包被。將細胞用獼猴輪狀病毒在有或無2μg/ml胰蛋白酶-EDTA的情況下感染，moi為1TCID50/細胞。在感染90分鐘后，將細胞用ExCell 525培養(yǎng)基洗，并在37℃在10％CO2的濕潤環(huán)境中進一步溫育。在感染后連續(xù)5天收集上清樣品，從細胞中澄清并將細胞碎片通過在臺式離心機中以2000rpm離心除去，及在特異于輪狀病毒的ELISA中分析(IDEIA輪狀病毒，Dako)。示于圖33的結(jié)果清晰示出彌猴輪狀病毒可以在PER.C6上復(fù)制。
附圖簡述圖1在免疫熒光測定后通過顯微鏡觀察的感染的細胞(陽性細胞)的百分率，及相對的在碘化丙錠染色之后通過FACS測定的死亡細胞百分率，moi為10-3和10-4。在moi為10-3時，來自感染樣品的細胞存活率很低，不能產(chǎn)生可靠的數(shù)據(jù)。
圖2在免疫熒光測定后通過顯微鏡觀察的感染的細胞的百分率。由于充分的CPE，衍生自moi為10和1的感染的感染后48小時的樣品未示出。
圖3在感染后從第1天至第6天以血細胞凝集單位(HAU)測定的病毒增殖動力學。
圖4在免疫熒光測定后通過顯微鏡觀察的感染的細胞(陽性細胞)的百分率。
圖5在感染后從第1天至第6天以血細胞凝集單位(HAU)測定的病毒增殖動力學。
圖6在免疫熒光測定后通過顯微鏡觀察的感染的細胞(陽性細胞)的百分率。
圖7在感染后從第2天至第6天以血細胞凝集單位(HAU)測定的病毒增殖動力學。
圖8在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，PER.C6細胞和MDCK細胞上存在的細胞表面受體上的Sia2-3Gal和Sia2-6Gal連鍵的表達。(A)特異識別Sia2-6Gal連鎖的Sambuca nigra凝集素(SNA)，和特異識別Sia2-3Gal連鍵的Maackia amurensis凝集素(MAA)相互作用的代表圖式。也描述了與FITC標記的抗DIG抗體相互作用的圖式，所述抗體識別結(jié)合細胞表面蛋白上寡糖鏈的DIG標記的凝集素。(B)對用DIG標記的凝集素溫育的細胞進行的FACS分析。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法用FITC標記的抗DIG抗體檢測粘附于細胞的凝集素。根據(jù)凝集素染色的細胞的熒光強度(灰色)與只用FITC-抗-DIG抗體溫育的細胞(空心的)相對比，繪制細胞計數(shù)圖。上面實驗組示出通過使用SNA凝集素獲得的FACS分析中的變換，下面實驗組示出通過使用MAA凝集素獲得的FACS分析中的變換。
圖9用A/Sydney對PER.C6進行的感染。(A)胰蛋白酶-EDTA對HAU效價的作用。(B)HA的濃度μg/ml。(C)在感染后96小時在粗提的病毒上清中測定的病毒感染性效價，以pfu/ml為單位。
圖10用B/Harbin/7/94對PER.C6進行的感染。(A)在病毒感染期間和之后存在不同濃度的胰蛋白酶-EDTA對生長動力學的作用。(B)每50μl的HAU效價，和(C)病毒感染性效價，以pfμ/ml為單位。
圖11用X-127以moi為10-3對PER.C6進行的感染。(A)胰蛋白酶-EDTA對以HAU/50μl表示的HAU的作用，和(B)在感染后5天期間病毒感染性效價，以pfu/ml為單位。
圖12用X-127以moi為10-4對PER.C6進行的感染。(A)胰蛋白酶-EDTA對以HAU/50μl表示的HAU的作用，和(B)在感染后5天期間病毒感染性效價，以pfu/ml為單位。
圖13胰蛋白酶-EDTA對(A)PER.C6細胞存活性和(B)病毒的生物學活性的作用。細胞存活性是在經(jīng)錐蟲藍染色后測定的。HAU效價如述測定并以每50μl中的值表示。
圖14在用流感病毒A/Sydney/5/97感染PER.C6后，胰蛋白酶-EDTA對病毒感染性效價和HA蛋白含量的作用。(A)通過用總共100μl的10倍系列稀釋的含有病毒的上清，在具有胰蛋白酶-EDTA(4μg/ml)的無血清培養(yǎng)基中以四份接種MDCK細胞，進行感染性分析。在7天后，對這些培養(yǎng)上清測試HA活性。感染性病毒效價根據(jù)Spearman-Karber的方法(1931)計算。(B)A/Sydney/5/97 HA蛋白的Western印跡分析。使用含有SDS的裂解緩沖液通過對蛋白質(zhì)進行破壞和變性收獲病毒蛋白。在還原條件下在10％SDS/PAGE凝膠上進行電泳。將分離的蛋白用特異性抗A/Sydney/5/97-HA抗血清探查。加樣增加數(shù)量的陽性對照A/Sydney HA抗原(左側(cè)4條泳道)，和指定的經(jīng)胰蛋白酶溫育的樣品的10μl PER.C6細胞上清(右側(cè)5條泳道)。
圖15在中空纖維灌流系統(tǒng)中PER.C6細胞的存活性，葡萄糖濃度和A/Sydney/5/97的生長動力學。
圖16在中空纖維灌流系統(tǒng)中在PER.C6細胞上增殖的流感病毒A/Sydney/5/97的定性和定量。如圖14所述對綿羊抗A/Sydney-HA抗體進行SDS-PAGE和Western印跡分析。將抗HA標記的單克隆抗體(HA探針(F7)，小鼠單克隆抗體，(Santa Cruz))以1∶1000稀釋度使用。作為二級抗體，山羊抗小鼠-HRP綴合的抗體(Biorad)，以1∶7500的稀釋度使用。
圖17在用A/Sydney/5/97病毒感染后直至92小時，在12L生物反應(yīng)器中PER.C6細胞的存活性(左側(cè))和葡萄糖濃度(右側(cè))。
圖18在12L生物反應(yīng)器中的10L細胞懸浮液中，用A/Sydney/5/97感染PER.C6。通過免疫熒光測定的病毒復(fù)制動力學，以陽性染色的細胞百分率示出。
圖19在12L生物反應(yīng)器中的10L細胞懸浮液中，用A/Sydney/5/97感染PER.C6。通過血細胞凝集分析測定的病毒復(fù)制動力學，是以在病毒感染后幾天內(nèi)的HAU示出的。用*表示的線條是在如述進行PowerfugeTM澄清后獲得的HAU數(shù)。
圖20在12L生物反應(yīng)器中的10L細胞懸浮液中，用A/Sydney/5/97感染PER.C6之后進行Western印跡分析。所示是對流感病毒A/Sydney/5/97 HA多肽進行的定性和定量結(jié)果。如圖14所述進行SDS-PAGE和Western印跡。用箭頭表示不同的亞單位(HA1和HA2)和未裂解的HA0蛋白。得自NIBSC的HA作用陽性對照。
圖21在12L生物反應(yīng)器中的10L細胞懸浮液中，用A/Sydney/5/97感染PER.C6后，確定HAU和pfu/ml。感染后進行下游加工(DSP)。還示出了在中空纖維超濾后(20倍濃縮)，回收的病毒產(chǎn)量。
圖22在3L生物反應(yīng)器中的2L細胞懸浮液中，用A/Sydney/5/97感染PER.C6。提供了PER.C6細胞的存活性(上左側(cè))，葡萄糖濃度(上右側(cè))和陽性染色的細胞的百分率表示的病毒的生長動力學(下左側(cè))和HAU(下右側(cè))。
圖23在3L生物反應(yīng)器中的2L細胞懸浮液中，用A/Beijing/262/95感染PER.C6。提供了PER.C6細胞的存活性(上左側(cè))，葡萄糖濃度(上右側(cè))和陽性染色的細胞的百分率表示的病毒的生長動力學(下左側(cè))和HAU(下右側(cè))。
圖24在3L生物反應(yīng)器中的2L細胞懸浮液中，用B/Harbin/7/94感染PER.C6。提供了PER.C6細胞的存活性(上左側(cè))，葡萄糖濃度(上右側(cè))和陽性染色的細胞的百分率表示的病毒的生長動力學(下左側(cè))和HAU(下右側(cè))。
圖25未裂解的A/Sydney/5/97 HA0蛋白的Western印跡分析。陽性染色的蛋白是在用得自NIBSC的特異性抗A/Sydney抗血清如圖14所述及文中所述溫育后檢測的。
圖26(A)A/Sydney/5/97衍生的用胰蛋白酶消化的HA0蛋白的Western印跡分析。蛋白質(zhì)是在用特異性抗A/Sydney抗血清溫育后檢測的。左側(cè)的是標準裂解的A/Sydney HA，右側(cè)的是用增加數(shù)量的胰蛋白酶處理的HA0。(B)使用流感病毒A/Sydney/5/97的HA0作底物，測定流感病毒B/Harbin產(chǎn)生期間，培養(yǎng)上清中胰蛋白酶活性。HA0的裂解產(chǎn)物HA1和HA2的Western印跡分析，如圖14所述通過抗流感病毒A/Sydney/5/97 HA的特異性抗血清觀測。
圖27用N-糖苷酶F消化的A/Sydney HA0的Western印跡分析。蛋白質(zhì)是在用特異性抗A/Sydney抗血清溫育后檢測的。用*表示的蛋白質(zhì)條帶是去糖基化的產(chǎn)物。
圖28在用Accutase消化后A/Sydney/5/97 HA的Western印跡分析。蛋白質(zhì)是在用特異性多克隆抗A/Sydney-HA抗血清溫育后檢測的。左側(cè)的是在用胰蛋白酶處理之前和之后的HA0，右側(cè)的是用降低數(shù)量的Accutase消化的HA0。
圖29流感病毒A/Sydney/5/97的電子顯微鏡檢。(A)感染后72小時的PER.C6細胞。(B和C)衍生自感染的PER.C6的病毒的陰性染色。(D和E)蔗糖純化的材料的陰性染色。
圖30(A)在PER.C6細胞上測試的所有不同的流感病毒A和B毒株。(B)衍生自感染的PER.C6細胞的3種所示A和B型流感病毒的感染性效價。
圖31用除了流感病毒之外的病毒感染的PER.C6和Vero細胞的免疫熒光性。(A)在用麻疹病毒感染基礎(chǔ)上陽性染色的細胞。(B)在用HSV-1病毒感染Vero細胞基礎(chǔ)上陽性染色的細胞。(C)在用HSV-2病毒感染Vero細胞基礎(chǔ)上陽性染色的細胞。(D)用HSV-1病毒感染PER.C6基礎(chǔ)上陽性染色的細胞。(E)用HSV-2病毒感染PER.C6細胞基礎(chǔ)上陽性染色的細胞。
圖32在麻疹病毒(中間)，HSV-1(下面)和HSV-2(上面)病毒在PER.C6細胞上增殖后測定的感染性效價。
圖33在用不同moi感染PER.C6(上面)和Vero(下面)細胞后，在粗提上清中通過ELISA測定的輪狀病毒的復(fù)制情況。
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權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)用作疫苗的非腺病毒或腺病毒蛋白的病毒和/或病毒蛋白的方法，包括提供一種細胞，其具有至少一個編碼至少一種腺病毒的E1基因的基因產(chǎn)物或其功能衍生物的序列，將編碼所述病毒和/或所述病毒蛋白的核酸提供給所述細胞，將所述細胞在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)并使所述病毒和/或病毒蛋白表達，以及從所述培養(yǎng)基和/或所述細胞中收獲所述病毒和/或病毒蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細胞是人體原代細胞。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述原代細胞是通過所述E1基因的基因產(chǎn)物無限增殖化的。
4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述細胞衍生自人胚胎成視網(wǎng)膜細胞。
5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述編碼E1基因的至少一種基因產(chǎn)物的序列存在于所述人體細胞的基因組中。
6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中所述細胞不產(chǎn)生腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
7.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述細胞還包含一種編碼E2A或其功能衍生物或類似物或片段的序列。
8.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述編碼E2A或其功能衍生物或類似物或片段的序列存在于所述人體細胞的基因組中。
9.權(quán)利要求7或8任一項的方法，其中所述E2A編碼序列編碼一種溫度敏感性突變體E2A。
10.前述任一項權(quán)利要求的方法，所述人體細胞不包含其它腺病毒序列。
11.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述人體細胞能懸浮培養(yǎng)。
12.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述人體細胞可以在沒有血清的情況下培養(yǎng)。
13.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述人體細胞是保藏在ECACC中的保藏號為96022940的PER.C6，或是其衍生物。
14.權(quán)利要求1-13任一項的方法，其中所述病毒和/或病毒蛋白包含一種經(jīng)過翻譯后和/或翻譯期間修飾的蛋白。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述修飾包括糖基化。
16.前述任一項權(quán)利要求的方法，其中所述病毒蛋白包含至少一種流感病毒神經(jīng)氨酸酶和/或血細胞凝集素。
17.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是腸病毒，如鼻病毒，口蹄疫病毒，或脊髓灰質(zhì)炎病毒。
18.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是皰疹病毒，如單純皰疹病毒，假狂犬病病毒或牛皰疹病毒。
19.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是正粘病毒，如流感病毒，副粘病毒，如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒。
20.權(quán)利要求1-16任一項的方法，所述病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒如人免疫缺陷病毒，或其中所述病毒是細小病毒或乳多空病毒。
21.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是輪狀病毒或冠形病毒，如傳染性胃腸炎病毒或黃病毒，如蜱傳腦炎病毒或黃熱病病毒。
22.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是披膜病毒如風疹病毒或者東方、西方或委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒。
23.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是肝炎病毒，如甲肝病毒或乙肝病毒。
24.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是疫病毒，如豬霍亂病毒或彈狀病毒，如狂犬病病毒。
25.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述病毒是布尼病毒，如漢坦病毒。
26.一種人體細胞的應(yīng)用，所述人體細胞的基因組中具有編碼腺病毒的至少一個E1蛋白或其功能衍生物，同源物或片段或至少一種用于疫苗中的病毒蛋白的序列，這種細胞不產(chǎn)生用于產(chǎn)生病毒的腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
27.權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中所述人體細胞衍生自原代細胞。
28.權(quán)利要求26或27的應(yīng)用，其中所述人體細胞是PER.C6或其功能衍生物。
29.權(quán)利要求26-28任一項的應(yīng)用，其中所述細胞在其基因組中還包含一種編碼E2A或其功能衍生物或類似物或片段的序列。
30.權(quán)利要求29的應(yīng)用，其中所述E2A是溫度敏感性的。
31.一種用于疫苗中的病毒或病毒蛋白，其可以通過權(quán)利要求1-25任一項的方法獲得或由權(quán)利要求26-30任一項的應(yīng)用獲得，所述病毒或病毒蛋白沒有任何非人哺乳動物蛋白質(zhì)物質(zhì)。
32.一種人體細胞，其基因組中具有一種編碼腺病毒的至少一種E1蛋白或其功能衍生物，同源物或片段的序列，這種細胞不產(chǎn)生腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白，并具有一種編碼病毒或至少一種非腺病毒病毒蛋白的核酸。
33.權(quán)利要求32的人體細胞，其衍生自在ECACC中保藏號為96022940的PER.C6。
34.權(quán)利要求32-33任一項的人體細胞，其基因組中還包含一種編碼E2A或其功能衍生物或類似物或片段的序列。
35.權(quán)利要求34的人體細胞，其中所述E2A是溫度敏感性的。
36.一種確定樣品中蛋白酶活性的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種病毒蛋白或病毒，這些病毒蛋白或病毒可以通過權(quán)利要求1-25任一項的方法獲得或通過權(quán)利要求26-30任一項的應(yīng)用獲得。
37.通過權(quán)利要求1-25任一項的方法或權(quán)利要求26-30任一項的應(yīng)用獲得的病毒蛋白或病毒在確定樣品中的蛋白酶活性中的用途。
38.權(quán)利要求36的試劑盒或權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述蛋白酶包括胰蛋白酶。
39.權(quán)利要求36的試劑盒或權(quán)利要求37的應(yīng)用，其中所述樣品包含培養(yǎng)物培養(yǎng)基。
40.一種在能至少部分保留病毒感染性的條件下濃縮流感病毒的方法，包括獲得來自細胞培養(yǎng)物的包含所述病毒的細胞澄清上清，并在低剪切條件下超濾所述上清。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述低剪切條件是用中空纖維獲得的。
42.權(quán)利要求40或41的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物包括體外培養(yǎng)的細胞。
43.權(quán)利要求40-42任一項的方法，其中所述超濾是用截斷值為750KD的濾膜進行的。
44.權(quán)利要求40-43任一項的方法，其中所述濃縮還包括至少部分除去分子量小于750KD的蛋白質(zhì)。
45.用權(quán)利要求40-44任一項的方法濃縮的傳染性流感病毒或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)哺乳動物病毒的新手段和方法，包括用病毒感染無限增殖化的人類細胞培養(yǎng)物，在允許病毒生長的條件下溫育用病毒感染的培養(yǎng)物以繁殖病毒，形成含有病毒的培養(yǎng)基，以及獲取含有病毒的培養(yǎng)基?？梢允斋@病毒并用于生產(chǎn)疫苗。本發(fā)明的優(yōu)點是，本發(fā)明的人類細胞可以在規(guī)定無血清條件下培養(yǎng)，并且所述細胞顯示改進的繁殖病毒的能力。具體地，提供了在培養(yǎng)的人類細胞中生產(chǎn)流感病毒的方法及其衍生的疫苗。這一方法無需使用全雞胚生產(chǎn)流感疫苗。這一方法還可以連續(xù)或分批獲取培養(yǎng)物培養(yǎng)基。因此，本發(fā)明使得可以大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)高滴度病毒。
文檔編號A61K39/21GK1433472SQ00818663
公開日2003年7月30日 申請日期2000年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月26日
發(fā)明者瑪麗亞·格拉齊亞·波, 阿方薩斯·赫拉爾杜斯·科內(nèi)利斯·瑪麗亞·烏依德阿格, 霍弗特·約翰·斯豪滕 申請人:克魯塞爾荷蘭公司