專利名稱：Dna病毒感染的治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗病毒治療，尤其涉及預防和治療DNA病毒感染，如皰疹病毒感染。
皰疹病毒是DNA病毒，其在蛋白質結構中具有中央DNA核心。DNA帶有復制病毒的遺傳密碼。病毒必須感染活細胞以復制。有許多病毒蛋白已被良好地表征，包括作為抗病毒化學治療最終的靶的重要的酶。這些包括DNA復制所必需的DNA聚合酶和胸苷激酶。病毒DNA的復制對于病毒感染性是必需的。已知感染病毒在它們的復制過程中能夠改變活細胞的天然離子平衡。
EP-A-0442 744公開了某種糖苷治療單純皰疹病毒和水痘帶狀皰疹病毒的用途。在本PCT申請的優(yōu)先權日之后公開的WO 00/10574公開了袢利尿劑在反轉錄病毒的治療中的用途，在該例中是治療HIV感染。我們現在出乎意料地發(fā)現，與單獨給予袢利尿劑或糖苷相比，糖苷和袢利尿劑的組合施用給出增強的效果。
根據本發(fā)明的一個方面，提供了治療組合物，其在病毒感染的治療中有用，其包含袢利尿劑和強心苷的協(xié)同組合。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療病毒感染的方法，所述方法包括施用袢利尿劑和強心苷以發(fā)揮協(xié)同作用。
袢利尿劑可以選自多種已有的試劑。優(yōu)選地，袢利尿劑是呋塞米、布美他尼、依他尼酸或托拉塞米中的一種或多種。根據我們的研究，袢利尿劑通過改變細胞離子濃度、細胞離子平衡、細胞離子環(huán)境和電勢來介導其抗病毒作用。
呋塞米是鄰氨基苯甲酸(anthrilic acid)衍生物，化學名為4-氯-N-糠基-5-氨磺酰鄰氨基苯甲酸。它在中性pH下幾乎不溶于水，然而在堿性中隨意溶解。呋塞米通過抑制氯離子跨細胞膜轉運而發(fā)揮其生理作用。呋塞米是作用時間短的袢利尿劑。其用于治療由于肝功能衰竭、腎功能衰竭或心力衰竭引起的水腫，并治療高血壓。呋塞米的生物利用度在60％到70％之間，主要通過濾過和分泌以未改變的藥物被排泄。呋塞米作用于Na+/K+/2Cl-共轉化子(cotransformer)。對于其利尿作用，其主要作用在腎中的亨勒袢的升枝。袢利尿劑顯著促進K+排泄，使細胞內缺鉀。這可能導致長期全身使用呋塞米的顯著并發(fā)癥，即低血清鉀。我們認為正是該作用使袢利尿劑作為抗DNA病毒的試劑有用。
最近的證據提示，呋塞米的主要生物轉化產物是葡糖苷酸。呋塞米廣泛結合于血漿蛋白，主要是白蛋白。在健康個體中，血漿濃度在1-400mcg/ml的范圍內，91-99％結合。在治療濃度，未結合部分為2.3-4.1％。呋塞米的最終半衰期約為2小時，主要在尿中排泄。
強心苷可以是地高辛、洋地黃毒苷、甲地高辛、毛花苷C、海蔥次苷、k毒毛花苷、黃夾次苷和毒毛花苷G中的一種或多種。洋地黃物種的植物(例如紫花洋地黃(digitalis purpura)、毛花洋地黃(digitalis lanata))含有強心苷，如已知共同屬于洋地黃的地高辛和洋地黃毒苷。其他含有與洋地黃糖苷化學上相關的強心苷的植物經常也被稱為洋地黃。因此術語洋地黃用于命名整個糖苷家族；糖苷由兩部分組成，糖和強心苷。毒毛花苷G來自于非洲植物旋花羊角拗(Strophanthus gratus)，并且以靜脈內形式出現(口服不吸收)，由于其更好的溶解性，它被許多實驗室用于糖苷的研究。其作用方式實質上與地高辛相同。
在化學上，地高辛稱為(3b，5b，12b)-3-[O-2，6-雙脫氧-b-D-riob-己吡喃糖基-(1″4)-O-2，6-雙脫氧-b-D-ribo-己吡喃糖基-(1″4)-2，6-雙脫氧-b-D-ribo-己吡喃糖基]氧]-12，14-二羥基-卡-20-22)-烯內酯((3b，5b，12b)-3-[O-2，6-dideoxy-b-D-riob-hexopyranosyl-(1″4)-O-2，6-dideoxy-b-D-ribo-hexopyranosyl-(1″4)-2，6-dideoxy-b-D-ribo-hexopyranosyl]oxy)-12，14-dihydroxy-card-20-22)-enolide)。其分子式為C41H64O14，其分子量為780.95。地高辛以無氣味的白色晶體存在，在高于230℃時熔化和分解。該藥在水和醚中幾乎不溶解；微溶于稀(50％)乙醇和氯仿中；在吡啶中隨意溶解。
由于地高辛對于某些患者特別容易產生副作用，所以總是應該小心選擇藥物劑量，并隨患者的臨床癥狀進行調節(jié)。
在細胞水平，洋地黃通過抑制鈉轉運酶鈉鉀腺苷三磷酸酶Na/K ATPase)來發(fā)揮其主要作用；這是心肌電生理作用的直接原因，根據我們的理解，也是其抗DNA病毒活性的直接原因。由于細胞內鈣的繼發(fā)性變化，該活性也影響心肌收縮力。在很低的細胞內洋地黃濃度下，可以觀察到因洋地黃激活Na/K ATPase而具有伴有降低的心收縮效率的反作用。
優(yōu)選的組合是袢利尿劑呋塞米和強心苷地高辛。優(yōu)選的濃度為呋塞米1mg/ml，地高辛30mcg/ml。在短時間內分別施用兩種活性成分也在本發(fā)明的范圍內。
研究(包括X-射線微量分析)已經證明本發(fā)明的組合物的抗病毒DNA作用依賴于細胞內缺鉀離子。簡要地說，這些研究證明·鉀的補充將恢復DNA合成；·呋塞米和地高辛的組合使用與缺鉀具有類似的作用；·缺鉀的水平足以保持正常細胞功能；·缺鉀沒有細胞毒性作用。
因此，通過施用袢利尿劑和強心苷來改變細胞離子濃度、細胞離子平衡、細胞離子環(huán)境和電勢，可能改變細胞代謝而不損害細胞，但病毒復制得到抑制。因此，我們確認，使用袢利尿劑和強心苷，通過抑制病毒DNA復制而在防止或控制病毒復制方面有益。已經證明其對DNA病毒HSV1和HSV2、CMV、VZV和假狂犬病病毒具有抗病毒功效。其他代表性病毒為微小病毒、乳多空病毒、腺病毒、嗜肝脫氧核糖核酸病毒和痘病毒。
本發(fā)明的組合物可以外用給藥或內服給藥。局部和全身施用可能最有用?？梢允蛊渑浞竭m于緩釋。本發(fā)明的非常優(yōu)選的特征是配方組合物以局部施用。可以存在其它成分，條件是它們不破壞抗病毒活性，例如防腐劑。優(yōu)選地，本發(fā)明提供呋塞米和地高辛的組合，其為在緩沖鹽水中的局部施用配方，用于治療角膜眼感染。就我們所知，現有的獲得批準的化合物的組合用于治療病毒感染尚無先例。
本發(fā)明的優(yōu)選施用是局部濃度的袢利尿劑和強心苷用于高效治療眼的病毒感染。人角膜的復發(fā)性皰疹感染是失明的最常見病毒原因。
使用帶有，例如浸漬有袢利尿劑和強心苷的接觸鏡將是安全和有效的方法，用于產生高的細胞內濃度來預防或治療疾病。將袢利尿劑和強心苷貯存施用于眼內將是適宜的用于治療巨細胞病毒視網膜炎的方法，該疾病是導致患有艾滋病的患者失明的主要原因。
僅以舉例方式，參照以下實施例，對本發(fā)明進行描述。
使用hsv2株重復這些試驗，獲得的結果幾乎相同。
將組合物施用于不同類型的vero細胞(非洲綠猴腎細胞和BHK1細胞)，并用2型單純皰疹病毒(3345株和180株)以低、中、高的感染復數(M0I)感染。病毒復制的抑制根據以下比例評分無抑制-20％抑制 +40％抑制 ++60％抑制 +++80％抑制 ++++100％抑制 +++++T表示藥物毒性。
以下結果是使用非洲綠猴腎細胞和2型單純皰疹病毒株3345獲得的
在低的感染復數下，僅在施用30mcg/ml地高辛時，地高辛單獨施用出現最大作用(+++)。
在低和中的感染復數下，施用1mg/ml呋塞米時，呋塞米單獨施用出現最大作用(+++)。
當將袢利尿劑和強心苷同時施用于感染細胞時，使用30mcg/ml地高辛和1mg/ml呋塞米時，實現最大作用(+++++)。在低、中和高的感染復數下，hsv2復制都顯示100％抑制。
使用其他vero細胞和2型單純皰疹病毒株的組合獲得類似的結果。
本實施例證明，單獨施用呋塞米或地高辛，hsv2的復制沒有得到最大抑制。然而，呋塞米和地高辛組合完全抑制hsv2復制。
權利要求
1.袢利尿劑和強心苷在DNA病毒感染的治療中發(fā)揮協(xié)同作用的用途。
2.對于DNA病毒感染的治療有用的治療組合物，其包含袢利尿劑和強心苷的協(xié)同組合。
3.根據權利要求2的組合物，其適于局部施用。
4.根據權利要求2的組合物，其適于全身施用。
5.根據權利要求3的組合物，其包含1mg/ml袢利尿劑和30mcg/ml強心苷。
6.根據權利要求2的組合物，其適于眼內貯存施用。
7.根據前述任一權利要求的組合物，其中袢利尿劑是呋塞米。
8.帶有，例如浸漬有袢利尿劑和強心苷的接觸鏡。
全文摘要
袢利尿劑和強心苷的協(xié)同組合在DNA病毒感染的治療中有用。
文檔編號A61K45/06GK1414863SQ0081806
公開日2003年4月30日 申請日期2000年12月13日 優(yōu)先權日1999年12月30日
發(fā)明者克里斯托夫·愛德華·哈特利 申請人:亨德森莫利研究和開發(fā)有限公司