專利名稱：新的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的能結(jié)合幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)的物質(zhì)及其在例如藥用組合物中的用途和用于治療由幽門螺桿菌引起的疾病的方法。
背景技術(shù)：
微生物的粘附被認(rèn)為是感染發(fā)病機(jī)理的第一步，其中感染因子的粘附素特異性，和宿主靶器官上皮細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)構(gòu)是決定病原體的宿主范圍和組織向性的主要因素(1)。
人類胃的致病幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是慢性淺表性胃炎病因?qū)W因子(2)，并且也與十二指腸潰瘍，胃潰瘍和胃腺癌的發(fā)生有關(guān)(3-7)。此微生物具有非常獨(dú)特的宿主范圍和組織向性，即它的定居需要人胃型上皮的存在(8)。在人類胃中發(fā)現(xiàn)多數(shù)這種細(xì)菌在粘膜層中，但也顯示該細(xì)菌對(duì)表層粘膜細(xì)胞的選擇性附著(8，9)。
以前曾證明幽門螺桿菌的幾種不同結(jié)合特異性。因此已有報(bào)道該細(xì)菌對(duì)多種化合物的結(jié)合如磷脂酰乙醇胺和神經(jīng)節(jié)四糖基酰基鞘氨醇(gangliotetraosylceramide)(10，11)，Leb血型決定簇(12)，硫酸類肝素(13)，GM3神經(jīng)節(jié)苷脂(14)，硫苷脂(14，15)，和乳糖基酰基鞘氨醇(lactosylceramide)(16)的結(jié)合。已有資料顯示幽門螺桿菌與人類紅細(xì)胞，粒細(xì)胞和胎盤上的大分子復(fù)合物糖鞘脂(多聚糖基?；拾贝?以唾液酸依賴性方式結(jié)合(17，18)。
除了與胃腸疾病有關(guān)外，幽門螺桿菌也與侵犯除胃腸道以外的其他器官的多種疾病有關(guān)(74)。例如已經(jīng)表明其與心臟病尤其是動(dòng)脈粥樣硬化(75)，肝臟疾病包括肝腺癌(76，77)，皮膚疾病(78)，和嬰兒猝死綜合征(79，美國(guó)專利第6083756號(hào))有關(guān)。
發(fā)明概述本發(fā)明的主要目的是提供治療由幽門螺桿菌引起的疾病的新方法。
本發(fā)明以在人類胃上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)特殊的幽門螺桿菌受體為基礎(chǔ)。在許多情況下受體是糖脂，乳糖基酰基鞘氨醇，僅在人類胃腸道中發(fā)現(xiàn)，并且在研究工作期間發(fā)現(xiàn)最小的結(jié)合表位是Galβ3GlcNAc或相似結(jié)構(gòu)Galβ3GalNAc。
因此本發(fā)明涉及包括該結(jié)合表位的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，或它們的類似物或衍生物。
本發(fā)明的目的之一是提供用于治療由幽門螺桿菌引起的疾病的藥用組合物。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)在生產(chǎn)用于治療因幽門螺桿菌存在所致疾病的藥用組合物中的用途。
本發(fā)明的另一目的是提供用于治療由幽門螺桿菌存在引起的疾病的方法。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)在鑒定細(xì)菌粘附素中的用途。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)為治療目的和如體外測(cè)定等非醫(yī)療目的而用于抑制幽門螺桿菌結(jié)合的用途。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)作為鑒定其他能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)的引導(dǎo)(lead)化合物的用途。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)在食物材料中/或作為營(yíng)養(yǎng)添加劑的用途。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)或上述細(xì)菌粘附素用于生產(chǎn)抗幽門螺桿菌疫苗的用途。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)在診斷幽門螺桿菌感染中的用途。
本發(fā)明的另一目的是上述能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)在幽門螺桿菌分型中的用途。
發(fā)明詳述如上述本發(fā)明涉及特殊的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)。在形成本發(fā)明的工作中將一系列大量的不同幽門螺桿菌菌株用35S-甲硫氨酸代謝性標(biāo)記并檢測(cè)時(shí)薄層板上分離的一組不同的天然糖鞘脂的結(jié)合。將兩種明顯不同的結(jié)合特異性用放射自顯影重復(fù)檢測(cè)。如前面詳細(xì)描述的，幽門螺桿菌結(jié)合乳糖苷?；拾贝?，神經(jīng)節(jié)三糖基酰基鞘氨醇和神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝?16)。最初在人類物質(zhì)中檢測(cè)到的唯一結(jié)合活性是對(duì)人類胎糞中非-酸性級(jí)的四糖基酰基鞘氨醇區(qū)中化合物的結(jié)合。
人類胃上皮細(xì)胞的糖鞘脂組成目前仍不十分清楚。但是，在最近對(duì)人類胃腸道的粘膜細(xì)胞和粘膜下組織的糖鞘脂的研究中(55)，報(bào)道了胃底和胃竇粘膜富含硫苷脂。在薄層板上遷移的主要非-酸性糖鞘脂為半乳糖苷?；拾贝?，乳糖苷?；拾贝?，酰基鞘氨醇三己糖(globotrraosylceramide)和紅細(xì)胞糖苷脂，而遷移的主要神經(jīng)節(jié)苷脂為GM3，GM1和GD3。帶有植物鞘氨醇和羥基脂肪酸的幽門螺桿菌結(jié)合型乳糖苷酰基鞘氨醇在人類胃上皮細(xì)胞中也已鑒定出(16)。
此外，血型Cad-激活的神經(jīng)節(jié)苷脂(GalNAcβ4(NeuAcα3)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)已經(jīng)在人胃底部鑒定出(56)，而在幽門區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)(57)，表明人胃的不同區(qū)域糖鞘脂的差異表達(dá)。
由于對(duì)人類胃組織接觸受限，本發(fā)明者開始集中精力于人胎糞中檢測(cè)到的結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂，胎糞是新生兒初次的無(wú)菌糞便且主要由正在發(fā)育的胃腸道排出的粘膜細(xì)胞組成。分離后，將此結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂用質(zhì)譜法，質(zhì)子NMR波譜和甲基化分析鑒定為Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基?；拾贝?。乳四糖基?；拾贝嫉慕M織分布是非常局限的。直至最近僅在人的胎糞中(45)，在已事先切除了的一個(gè)ad modum BillrothII的小腸中(46)，在正常人胃粘膜和人胃癌組織中鑒定出的乳四糖基?；拾贝?58)。但是，“正常的”粘膜，在最新報(bào)道的5例中4例是從由于十二指腸潰瘍或胃潰瘍而行竇切除術(shù)獲得的。使用單克隆抗體K-21經(jīng)免疫組織化學(xué)研究證明，Galβ3GlcNAc-序列在非分泌個(gè)體的胃粘膜淺表層(有小凹的上皮)選擇性表達(dá)(59)，與組織切片幽門螺桿菌結(jié)合的定位一致(8，9)。利用結(jié)合Galβ3GlcNAc-序列的多克隆抗體經(jīng)免疫組織化學(xué)研究顯示，乳四糖基酰基鞘氨醇存在于Ole(a-b-)血型的非分泌個(gè)體的人類空腸和回腸刷狀緣細(xì)胞中，也存在于一例Ole(a+b+)血型的非分泌個(gè)體中(60)。
在研究中分析的66個(gè)幽門螺桿菌分離物中，發(fā)現(xiàn)57個(gè)菌株(86％)表達(dá)乳四糖基?；拾贝冀Y(jié)合特異性，而9個(gè)菌株是陰性的。在幽門螺桿菌分離物中觀察到的乳四糖基?；拾贝冀Y(jié)合特征的高度流行證明它是這種胃致病菌的保守特性，并且可以因此代表重要的毒力因素。
將乳四糖基?；拾贝冀Y(jié)合特異性的生物學(xué)關(guān)系進(jìn)一步用幽門螺桿菌對(duì)從人類胃靶上皮細(xì)胞上分離的非-酸性糖鞘脂的四糖基酰基鞘氨醇區(qū)域的結(jié)合證明。通過對(duì)酰基鞘氨醇聚糖酶水解獲得的過甲基化的四糖進(jìn)行質(zhì)子NMR波譜，和氣相色譜-質(zhì)譜分析，證明結(jié)合活性級(jí)分包含乳四糖基酰基鞘氨醇。具有結(jié)合活性的乳四糖基酰基鞘氨醇僅發(fā)現(xiàn)于被分析的7例個(gè)體中的一例，此事實(shí)意味著盡管感染幽門螺桿菌并且相關(guān)的慢性胃炎是非常普遍的，但是那些感染者僅有一個(gè)小級(jí)分發(fā)展成任何進(jìn)一步的后果例如消化性潰瘍或胃腺癌(7)。因此理論推測(cè)乳四糖基?；拾贝荚谖干掀ぜ?xì)胞中的存在是感染發(fā)展成嚴(yán)重后果如消化性潰瘍或胃癌，所必需的輔助因子之一。
從人胎糞中分離的有結(jié)合活性的乳四糖基酰基鞘氨醇部分既含有羥化的也含有非羥化的?；拾贝?。理論上，結(jié)合可因此被限制于羥化的酰基鞘氨醇類，如對(duì)乳糖基酰基鞘氨醇的結(jié)合特異性的描述(16)。但是，從兔胸腺分離的乳四糖基?；拾贝迹环N僅由鞘氨醇和非-羥化的160和240脂肪酸構(gòu)成的?；拾贝?B.Lanne et al.待發(fā)表)，與從人胎糞中分離的乳四糖基?；拾贝?未顯示)具有相同活性，證明對(duì)乳四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合不依賴于酰基鞘氨醇組分。
用125I-標(biāo)記的細(xì)菌表面蛋白獲得的結(jié)合模式與用35S-標(biāo)記的完整細(xì)菌細(xì)胞獲得的是相同的，說明這些表面蛋白制劑可以用于結(jié)合碳水化合物的粘附素的分離和鑒定。
概括地，幽門螺桿菌對(duì)人胃粘膜細(xì)胞的粘附可能是一種多成分系統(tǒng)，其中幾種細(xì)菌粘附素識(shí)別并結(jié)合靶組織中的不同受體。本研究還鑒定了另一種結(jié)合活性化合物，即，乳四糖基?；拾贝?，是通過對(duì)薄層板上糖鞘脂的結(jié)合來(lái)檢測(cè)。此糖鞘脂的分布是局限的，并且迄今為止僅發(fā)現(xiàn)于人胃腸道中。在其他人類組織中乳四糖基?；拾贝急粠r藻糖或唾液酸取代，因此在本文使用的測(cè)定條件下不結(jié)合。
對(duì)這種結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，以及對(duì)人類胃粘膜細(xì)胞中相同化合物的鑒定，導(dǎo)致對(duì)最小結(jié)合表位，即Galβ3GlcNAc的鑒定。Galβ3GalNAc表位與Galβ3GlcNAc表位在結(jié)構(gòu)和功能上是非常相似的，并且因此它們可以互相替代。
因此本發(fā)明涉及包括至少一種具有通式1的化合物的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì) 通式1其中R1和R2是H或OH，規(guī)定當(dāng)R1是H時(shí)R2是OH，當(dāng)R1是OH時(shí)R2是H；X是單糖或寡糖殘基，優(yōu)選X是乳糖基-，半乳糖基-，多聚-N-乙酰乳糖胺基，或形成O-聚糖或N-聚糖部分的寡糖序列的一部分；Y不存在，或者Y是間隔基團(tuán)或末端結(jié)合物，象?；拾贝嫉闹惤M分或連接到Z的鍵(-O-)；Z是低價(jià)或多價(jià)的載體或者-H；n是0或1；m是等于或大于1的整數(shù)，可根據(jù)所述物質(zhì)使m大到數(shù)千或數(shù)百萬(wàn)，或從幽門螺桿菌方面考慮具有與通式1的化合物相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物。
當(dāng)通式1中R1是OH且R2是H時(shí)得到通式2的化合物，當(dāng)R1是H且R2是OH時(shí)，得到通式3的化合物。 通式2 通式3本發(fā)明也包括按照通式1，2和3的物質(zhì)，其中-O-X被-S-X，-N-X，或-C-X取代，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員知道它們是可以互換的。
本發(fā)明也涉及能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其包括或由下列組成Galβ3GlcNAc(對(duì)應(yīng)于通式1，其中R1＝OH和R2＝H)或Galβ3GalNAc(對(duì)應(yīng)于通式，1其中R1＝H和R2＝OH)，或者從幽門螺桿菌方面考慮與Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc具有相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物。
按照本發(fā)明可使用Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc本身，或與幽門螺桿菌具有相同或更好結(jié)合活性的它們的任何天然或合成生產(chǎn)的類似物或衍生物。也有可能使用物質(zhì)例如乳四糖，乳四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)或神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝?Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer)，包括結(jié)合位點(diǎn)Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc，或從幽門螺桿菌方面考慮具有相同或更好結(jié)合活性的它們的任何天然或合成生產(chǎn)的類似物或衍生物?？梢詢?yōu)選使該最小結(jié)合表位，或它們的類似物或衍生物位于該物質(zhì)的非還原末端。
優(yōu)選使用乳四糖或神經(jīng)節(jié)四糖，或者單獨(dú)或者以多價(jià)形式。
本發(fā)明能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)也可以由載體組成或者包括載體其中一或多種上述物質(zhì)已經(jīng)被附著于載體上。
本發(fā)明能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)也可以由微團(tuán)組成或者包括微團(tuán)其中含有一或多種上述物質(zhì)。此類微團(tuán)的例子之一是含有例如數(shù)種乳四糖分子的脂質(zhì)體。
也可以將本發(fā)明能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)偶聯(lián)至多糖上，例如多聚乳糖胺鏈或其偶聯(lián)物，或偶聯(lián)至抗生素，優(yōu)選具有抗幽門螺桿菌作用的抗生素。
本發(fā)明的物質(zhì)因此可以是糖鏈的部分或糖結(jié)合物或含有其它已知幽門螺桿菌結(jié)合表位的糖基化合物的混合物，具有不同的糖序列和構(gòu)象，象Lewisb[Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAc]或NeuNAcα3Galβ4Glc/GlcNAc。同時(shí)使用幾種結(jié)合物質(zhì)可能對(duì)治療有利。
可以將本發(fā)明的物質(zhì)偶聯(lián)至抗生素，優(yōu)選青霉素類抗生素。本發(fā)明的物質(zhì)將抗生素定靶在幽門螺桿菌上。這類偶聯(lián)是有利于治療的，因?yàn)榭褂拈T螺桿菌治療需要的抗生素量更少，這導(dǎo)致抗生素的副作用更低。偶聯(lián)物的抗生素部分目標(biāo)是殺滅或減弱細(xì)菌，但是偶聯(lián)物也可具有下述抗粘附作用。
已知幽門螺桿菌能結(jié)合幾種寡糖序列。由特定菌株進(jìn)行的結(jié)合中的一部分可以代表許多不會(huì)導(dǎo)致癌癥或嚴(yán)重疾病的共生作用。關(guān)于與癌癥-型糖表位的結(jié)合的現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明本發(fā)明的物質(zhì)能防止更多的病理性相互作用，在此過程中，可能使一些致病性較小的幽門螺桿菌結(jié)合其他受體結(jié)構(gòu)。因此在預(yù)防涉及幽門螺桿菌的疾病時(shí)對(duì)細(xì)菌總的去除可能不是必需的。在預(yù)防多種幽門螺桿菌致病菌株時(shí)致病性較小的細(xì)菌甚至具有微生態(tài)調(diào)節(jié)作用。
也認(rèn)識(shí)到幽門螺桿菌在其表面含有Galβ3GlcNAc-序列，其至少在某些菌株中是可被本發(fā)明描述的細(xì)菌結(jié)合的非-巖藻糖基化形式。本發(fā)明的物質(zhì)也可以防止幽門螺桿菌相互結(jié)合并以此方式在例如建群過程中抑制細(xì)菌。
本發(fā)明能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)可以是例如，糖脂，糖蛋白或新糖蛋白。它也可以是包括至少兩個(gè)寡糖鏈的寡聚分子。
為治療由于患者胃腸道中存在幽門螺桿菌引起的疾病，可使用本發(fā)明的物質(zhì)抗-粘附，即抑制幽門螺桿菌與患者胃上皮上的受體結(jié)合。當(dāng)給予本發(fā)明的物質(zhì)或藥用組合物時(shí)，它將與該受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)菌，并且胃腸道中的全部或部分細(xì)菌然后將結(jié)合本發(fā)明的物質(zhì)而不是胃上皮表面的受體。然后細(xì)菌通過腸道并附著于本發(fā)明的物質(zhì)上排出患者體外，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)患者健康的影響減弱。優(yōu)選地使用的物質(zhì)是包括結(jié)合位點(diǎn)Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc的可溶性化合物，例如乳四糖，乳四糖基酰基鞘氨醇，神經(jīng)節(jié)四糖或神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝嫉目扇苄灶愃莆?。也可能，并經(jīng)常優(yōu)選地，也可能將本發(fā)明的物質(zhì)附著在載體上。當(dāng)使用載體時(shí)，可以將本發(fā)明的物質(zhì)的幾種分子附著于同一載體上，以此改進(jìn)抑制效果。
按照本發(fā)明也可能治療由于幽門螺桿菌存在引起的其它疾病，例如肝臟疾病，心臟病或嬰兒猝死綜合征。
按照本發(fā)明，有可能將本發(fā)明所述物質(zhì)，任選與載體一起，摻入適于治療因患者胃腸道存在幽門螺桿菌所致疾病的藥用組合物中，或?qū)⒈景l(fā)明的物質(zhì)用于治療這類疾病的方法中?？筛鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的疾病有慢性淺表性胃炎，十二指腸潰瘍，胃潰瘍，和胃腺癌。
本發(fā)明的藥用組合物還可以包括其他物質(zhì)，例如惰性賦形劑，或可藥用的佐劑，載體，防腐劑等等，這些是在本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。
進(jìn)而，可以將本發(fā)明的物質(zhì)與其他藥物，如用于治愈胃病的藥物包括質(zhì)子泵抑制劑或胃pH調(diào)節(jié)藥物(奧美拉唑(omeprazole)，蘭索拉唑(lansoprazole)，雷尼替丁(ranitidine)等)和用于抗幽門螺桿菌的抗生素一起給藥。
本發(fā)明的物質(zhì)或藥用組合物可以以任何合適的方式給藥，但優(yōu)選使用口服給藥。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療”既涉及為治愈或減輕疾病進(jìn)行的治療，也涉及為預(yù)防疾病發(fā)展而進(jìn)行的治療。治療可以以急性方式或者慢性方式進(jìn)行。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“患者”，涉及任何按照本發(fā)明需要治療的人類或非人類哺乳動(dòng)物。
此外，通過篩選與本發(fā)明的物質(zhì)結(jié)合的序列，可用本發(fā)明的物質(zhì)鑒定一種或多種粘附素。該序列可以是例如，蛋白質(zhì)或糖類。結(jié)合糖類的蛋白質(zhì)可以是凝集素或結(jié)合糖類的酶。篩選可通過例如親和層析或親和交聯(lián)方法進(jìn)行。
而且，可使用特異結(jié)合人組織中Galβ3GlcNAc或Galβ3GalNAc的物質(zhì)并因此防止幽門螺桿菌的結(jié)合。這種物質(zhì)的例子包括特異于Galβ3GlcNAc的單克隆抗體K-21，和其他抗體或結(jié)合該結(jié)構(gòu)的凝集素，或能夠裂解β3連接的半乳糖的β-半乳糖苷酶或乳-N-糖苷酶，可從寡糖鏈末端釋放Galβ3GlcNAc的內(nèi)糖苷酶。而且，結(jié)合Galβ3GlcNAc的粘附素或尤其是其結(jié)合部分可被用于抑制幽門螺桿菌與受體Galβ3GlcNAc的結(jié)合。當(dāng)用于人體時(shí)，該結(jié)合物質(zhì)應(yīng)適合于這樣的使用，例如人源化的抗體或來(lái)源于人的重組糖苷酶，其是非-免疫原性的并能夠裂解本發(fā)明所述物質(zhì)末端的一或多個(gè)單糖殘基。但在胃腸道中，對(duì)源于例如食物的多種天然凝集素和糖苷酶是耐受的。
而且，在可能將本發(fā)明的物質(zhì)作為模板用來(lái)生產(chǎn)適合于幽門螺桿菌預(yù)防接種的疫苗，例如上述情況。
而且，本發(fā)明的物質(zhì)可用于診斷幽門螺桿菌感染所致疾病。
而且，本發(fā)明所述物質(zhì)可為非醫(yī)療目的而用于抑制幽門螺桿菌的結(jié)合，如在體外分析系統(tǒng)中，如可用于鑒定其它能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)。
而且，可能在鑒定其他能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)時(shí)使用本發(fā)明的物質(zhì)作為引導(dǎo)化合物。
而且，可用本發(fā)明的物質(zhì)進(jìn)行幽門螺桿菌分型。
最后，也可能在用于人類和動(dòng)物的食物材料或營(yíng)養(yǎng)組合物中使用本發(fā)明的物質(zhì)，例如在食物，牛奶，酸乳，或其它奶制品，飲料組合物和嬰兒配方食物中。本文描述的營(yíng)養(yǎng)組合物或食物材料并非天然人乳。優(yōu)選將本發(fā)明的物質(zhì)用作功能性或?qū)嵱眯?functional)食物的一部分，該功能性食物有利于人或動(dòng)物的健康，因?yàn)樗鼈円种苹蜃钄嘤拈T螺桿菌與靶細(xì)胞或組織結(jié)合。本發(fā)明的物質(zhì)可以特定食物或功能性食物組合物的一部分。功能性食物可以含有其它可被控制食物的權(quán)威如美國(guó)食品和藥品管理局接受的已知食物成分。也可將本發(fā)明的物質(zhì)用作營(yíng)養(yǎng)添加劑，優(yōu)選作為食物或飲料添加劑來(lái)生產(chǎn)功能性食物或功能性飲料。食物或食物添加劑還可通過使奶?；蚱渌麆?dòng)物在其乳汁中大量天然產(chǎn)生本發(fā)明的物質(zhì)來(lái)產(chǎn)生。這可通過使動(dòng)物在其乳汁中過表達(dá)合適的糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成?？蛇x擇并飼養(yǎng)特殊種系或種屬的家養(yǎng)動(dòng)物以獲得更大產(chǎn)量的本發(fā)明的物質(zhì)。本發(fā)明的物質(zhì)和尤其用于營(yíng)養(yǎng)組合物或營(yíng)養(yǎng)添加劑的本發(fā)明物質(zhì)也可通過微生物如細(xì)菌或酵母來(lái)生產(chǎn)。
本發(fā)明的物質(zhì)尤其可作為嬰幼兒食物或營(yíng)養(yǎng)組合物的一部分使用，優(yōu)選作為嬰兒配方食物的一部分?！皨雰号浞绞澄铩北疚囊仓柑囟ǖ膵雰号浞绞澄锶绲鞍踪|(zhì)水解型配方，用于低出生體重嬰兒的配方或隨后的配方。許多嬰兒是用特殊的配方代替天然人乳來(lái)喂養(yǎng)。配方可能缺乏的人乳中特定的以乳糖為基礎(chǔ)的寡糖，尤其是延長(zhǎng)類型如乳-N-四糖，Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc，和其衍生物。嬰兒配方可以是干粉并用水重建成可被嬰幼兒食用的最終食物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，嬰兒食物旨在使用與天然人乳中乳-N-四糖的濃度(約0.05-5g/L，更優(yōu)選0.1-0.5g/L)相似的濃度。
已知乳-N-新四糖和對(duì)-乳-N-己糖Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc來(lái)自人乳并因此認(rèn)為是嬰兒食物的安全添加劑或成分。幽門螺桿菌尤其易感染嬰兒或幼兒，并考慮到其隨后導(dǎo)致的疾病而預(yù)防其感染是明智的。也已知幽門螺桿菌可引起嬰兒猝死綜合征，但用于根治細(xì)菌的強(qiáng)抗生素治療可能對(duì)嬰幼兒極為不適合。
當(dāng)將本發(fā)明的物質(zhì)用于診斷或分型時(shí)，例如可以將它包括在例如探針或測(cè)試棒中，任選構(gòu)成試劑盒的組成部分。當(dāng)將此探針或測(cè)試棒與包含幽門螺桿菌的標(biāo)本接觸時(shí)，細(xì)菌將與探針或測(cè)試棒結(jié)合并且因此能從標(biāo)本上分離以進(jìn)一步分析。
糖鞘脂命名法遵循IUPAC-IUB Commission在生化命名法(BiochemicalNomenclature)中的建議(CBN for LipidsEur.J.Biochem.(1977)79，1121，J.Biol.Chem.(1982)257，3347-3351，and J.Biol.Chem.(1987)262，13-18)。
設(shè)想Gal，Glc，GlcNAc，GalNAc，NeuNAc和NeuGc是D-構(gòu)型，F(xiàn)uc為L(zhǎng)-構(gòu)型，并且所有的糖以吡喃糖形式存在。
而且，乳四糖，Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc也已知為乳-N-四糖。
在用于脂肪酸和堿的shorthand命名法中，冒號(hào)前的數(shù)字指碳鏈長(zhǎng)度，且冒號(hào)后的數(shù)字指分子中雙鍵的總數(shù)。帶有2-羥基的脂肪酸命名為縮寫前加前綴h，例如h160。對(duì)長(zhǎng)鏈堿而言，d指二羥基，t指三羥基。因此d181指鞘氨醇(1，3-二羥基-2-氨基十八烯)，t180植物鞘氨醇(1，3，4-三羥基-2-氨基十八烯)。
盡管說明書，實(shí)施例和權(quán)利要求書中僅提及幽門螺桿菌，但是其他非常相似的螺桿菌種類也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明用以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述，但決不打算用其限制本發(fā)明的范圍。
附圖簡(jiǎn)述在下面的實(shí)施例中，參考了附圖，它們是
圖1顯示35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌與薄層色譜分離的糖鞘脂的結(jié)合。圖1(A)顯示用茴香醛試劑檢測(cè)到的糖鞘脂。圖1(B)和圖1(C)顯示與放射性標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株17875結(jié)合后用放射自顯影檢測(cè)到的糖鞘脂。泳道1＝人A型血紅細(xì)胞的非-酸性糖鞘脂，泳道2＝狗小腸的非-酸性糖鞘脂，泳道3＝豚鼠小腸的非-酸性糖鞘脂，泳道4＝小鼠糞便的非-酸性糖鞘脂，泳道5＝黑-白大鼠小腸上皮細(xì)胞的非-酸性糖鞘脂，泳道6＝人胎糞的非-酸性糖鞘脂，泳道7＝人O型血紅細(xì)胞的酸性糖鞘脂，泳道8＝兔胸腺的酸性糖鞘脂，泳道9＝小牛腦的神經(jīng)節(jié)苷脂，泳道10＝人腎上腺樣瘤的酸性糖鞘脂。(A)左測(cè)的標(biāo)示指鏈中糖殘基的數(shù)目。
圖2顯示從人胎糞中分離的過甲基化幽門螺桿菌結(jié)合型糖鞘脂的質(zhì)譜圖。質(zhì)譜上方是代表?；拾贝碱愋偷暮?jiǎn)化化學(xué)式，其中鞘氨醇和羥基240脂肪酸。
圖3顯示人胎糞中糖鞘脂的質(zhì)子NMR譜的差向異構(gòu)區(qū)。在探測(cè)溫度30℃時(shí)收集4000次掃描。在5.04ppm處的大分散樣信號(hào)是儀器假象，在4.93ppm處也有未鑒定的不純物。
圖4顯示幽門螺桿菌與在薄層板上分離的純的糖鞘脂的結(jié)合。泳道1＝乳三糖基?；拾贝迹镜?＝乳四糖基?；拾贝迹镜?＝H51型糖鞘脂，泳道4＝Lea-5糖鞘脂，泳道5＝Leb-6糖鞘脂，泳道6＝X-5糖鞘脂，泳道7＝Y(jié)-6糖鞘脂，泳道8＝B61型糖鞘脂。圖4A表示用茴香醛進(jìn)行的化學(xué)檢測(cè)，圖4B表示通過結(jié)合35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌獲得的放射自顯影照片。
圖5顯示幽門螺桿菌與寡糖乳糖和乳四糖預(yù)共保溫的效果。圖5A是用茴香醛染色的薄層色譜圖，圖5B顯示與乳糖共保溫的幽門螺桿菌的結(jié)合，圖5C顯示與乳四糖共保溫的幽門螺桿菌的結(jié)合。泳道1＝神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝?，泳道2＝乳四糖基酰基鞘氨醇，泳道3＝新乳四糖基?；拾贝?。
圖6顯示用茴香醛檢測(cè)的分離的糖鞘脂的薄層色譜(圖6A)和用35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株002結(jié)合獲得的放射自顯影照片(圖6B)。泳道1＝人胎糞的乳四糖基?；拾贝迹镜?＝人胎糞的非酸性糖鞘脂，泳道3＝A(Rh+)p血型個(gè)體的人胃非酸性糖鞘脂，泳道4＝A(Rh+)p血型個(gè)體的人胃非酸性糖鞘脂。帶中糖殘基的數(shù)示于左側(cè)。
圖7顯示幽門螺桿菌與人胃上皮細(xì)胞上非酸性糖鞘脂的結(jié)合。泳道1＝狗小腸的參考非酸性糖鞘脂，泳道2＝小鼠糞便參考非酸性糖鞘脂，泳道3＝人胎糞的非酸性參考糖鞘脂，泳道4-8＝五例人胃中(表III中1-5例)上皮細(xì)胞的非酸性糖鞘脂(80μg/泳道)。圖7A顯示用茴香醛進(jìn)行的化學(xué)檢測(cè)，圖7B表示通過35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌的結(jié)合獲得的放射自顯影照片。帶中糖殘基的數(shù)示于左側(cè)。
圖8是薄層色譜圖，顯示從表III中例4和例5的胃上皮細(xì)胞獲得的含四糖基酰基鞘氨醇的級(jí)分(A)，4-II(B)和5-II(C)級(jí)分的500MHz質(zhì)子NMR波譜中的差向異構(gòu)區(qū)。泳道1＝例4的胃上皮中總的非酸性糖鞘脂，泳道2＝例4的4-I級(jí)分，泳道3＝例4的4-II級(jí)分，泳道4＝例5的胃上皮中總的非酸性糖鞘脂，泳道5＝例5的5-I級(jí)分，泳道6＝例5的5-II級(jí)分。帶中糖殘基數(shù)示于左側(cè)。
圖9表示過甲基化寡糖經(jīng)?；拾贝季厶敲杆夂笾貥?gòu)的離子色譜圖。Run A＝紅細(xì)胞糖苷脂，乳四糖基酰基鞘氨醇和乳新四糖基?；拾贝嫉膮⒖蓟旌衔?，run B＝表III例4的胃上皮的四糖基酰基鞘氨醇，run C＝表III例5的胃上皮的四糖基?；拾贝肌⒖蓟旌衔?runA)的寡糖已明示。
圖10表示用高溫氣相色譜-EI質(zhì)譜儀獲得的下列物質(zhì)的質(zhì)譜圖從參考糖鞘脂經(jīng)?；拾贝季厶敲杆獬龅倪^甲基化寡糖(I和II)，來(lái)自表III例4的胃上皮的四糖基?；拾贝技?jí)分(III)，和來(lái)自表III例5的胃上皮的四糖基?；拾贝技?jí)分(IV)。
圖11表示乳四糖基?；拾贝技缺唤Y(jié)合唾液酸的幽門螺桿菌菌株CCUF17874識(shí)別(B)也被缺乏唾液酸結(jié)合能力的菌株CCUG17875識(shí)別(C)。
圖12表示結(jié)合幽門螺桿菌(圖12A)，和結(jié)合型Lea-5糖鞘脂(B)，Leb-6的糖鞘脂(C)和去巖藻糖基化的B61型糖鞘脂(D)的乳四糖基?；拾贝嫉淖畹湍芰繕?gòu)象異構(gòu)體。
圖13表示乳四糖基酰基鞘氨醇和神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝嫉淖畹湍芰繕?gòu)象異構(gòu)體的分子模型，其顯示通過僅改變Glcβ1Cer雙面夾角可出現(xiàn)相同的末端二糖。在乳四糖基酰基鞘氨醇和神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝贾挟a(chǎn)生跨Glcβ1Cer鍵(φ，ψ和θ)具有不同雙面夾角的所有可能的最低能量構(gòu)象，隨后成對(duì)比較每種構(gòu)象異構(gòu)體，表明獲得了兩對(duì)異構(gòu)體，其中這兩種糖鞘脂的末端二糖具有相同的方向。在第一對(duì)中，乳四糖基?；拾贝?A)跨Glcβ1Cer鍵的雙面夾角是51，-179和67，而對(duì)神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝级?B)同樣的角是51，180和177。該構(gòu)象在(A)中通過Glc的2-OH和長(zhǎng)鏈堿的3-O間的分子內(nèi)氫鍵來(lái)穩(wěn)定，而該構(gòu)象在(B)中指延長(zhǎng)部分。在第二對(duì)中，乳四糖基?；拾贝?C)跨Glcβ1Cer鍵的雙面夾角是13，-90和-59，而對(duì)神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝级?D)同樣的角是53，-173和-64。乳四糖基?；拾贝贾蠫lc的2-OH與脂肪酸的2-OH和長(zhǎng)鏈堿的NH之間形成氫鍵，而神經(jīng)節(jié)四糖基酰基鞘氨醇具有與Galβ1Cer晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的同樣的Glcβ1Cer構(gòu)象。GlcNAc/GalNAc中乙酰氨基的甲基碳原子用黑色顯示。
實(shí)施例實(shí)施例中使用的縮寫如下CFU＝集落形成單位；Hex＝己糖；HexN＝N-乙酰己糖胺EI＝電離作用。
在實(shí)施例中，幽門螺桿菌與糖鞘脂的結(jié)合用在薄層色譜(Chromatogram)中35S-標(biāo)記的細(xì)菌與糖鞘脂的結(jié)合來(lái)檢測(cè)。經(jīng)常檢測(cè)到兩種不同的結(jié)合特異性；一方面幽門螺桿菌與乳糖?；拾贝迹窠?jīng)節(jié)三糖基?；拾贝己蜕窠?jīng)節(jié)四糖基?；拾贝冀Y(jié)合，另一方面，與人胎糞中非酸性四糖基?；拾贝歼x擇性結(jié)合。分離后者一種結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂，并根據(jù)質(zhì)譜分析，質(zhì)子NMR波譜分析，和降解研究鑒定為Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基?；拾贝?。從7例人類個(gè)體的一例獲得幽門螺桿菌與胃上皮細(xì)胞非酸性糖鞘脂部分的四糖基?；拾贝紖^(qū)域的結(jié)合，在此部分中存在乳四糖基?；拾贝纪ㄟ^對(duì)酰基鞘氨醇聚糖酶處理產(chǎn)生的過甲基化四糖進(jìn)行質(zhì)子NMR波譜和氣相色譜-EI質(zhì)譜分析來(lái)確認(rèn)。在66個(gè)幽門螺桿菌分離物中57個(gè)(86％)檢測(cè)出乳四糖基酰基鞘氨醇結(jié)合特性的表達(dá)。
材料與方法細(xì)菌菌株，培養(yǎng)條件和標(biāo)記-使用的細(xì)菌，及其來(lái)源，在說明書最后部分的表I中描述。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中使用四種菌株，17857型菌株(從CultureCollection，University of Goteborg，(CCUG)，Sweden獲得)，和臨床分離物002，032和306，均做平行試驗(yàn)。
將菌株貯存在-80℃含有15％甘油(按體積)的胰蛋白酶大豆肉湯中，并首先在GAB-CAMP瓊脂(19)上以潮濕的(98％)微需氧空氣(5-7％O2，8-10％CO2，85％N2)于37℃培養(yǎng)48-72小時(shí)。為進(jìn)行標(biāo)記，將菌落接種于GAB-CAMP，或Brucella，瓊脂平板上并且向平板上噴灑用0.5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的pH7.3的50μCi[35]S-甲硫氨酸(Amersham，UK)。在微需氧條件下于37℃培養(yǎng)12-36小時(shí)后將細(xì)胞刮下，用PBS洗滌三次，并在PBS中重懸成1×108CFU/ml。
或者，將菌落接種(1×105CFU/ml)于添加了熱滅活的胎牛血清(Seralab，Goteborgs Termometerfabrik，Sweden)和50μCi[35]S-甲硫氨酸的Ham’s F12培養(yǎng)基(Gibco BRL，UK)中。將培養(yǎng)瓶在37℃微需氧條件下振搖保溫24小時(shí)。檢測(cè)培養(yǎng)瓶等份試樣中尿素酶-，氧化酶-，和過氧化氫酶-活性并經(jīng)相差顯微鏡檢測(cè)以確保球菌形式含量很低。經(jīng)離心收獲細(xì)菌，用PBS洗滌兩次后，將細(xì)胞在PBS中重懸至1×108CFU/ml。
兩種標(biāo)記方法得到每100個(gè)幽門螺桿菌大約1cpm比活性的懸液。
細(xì)菌表面蛋白的提取—提取步驟前，將幽門螺桿菌菌株(表I中帶*所示)在5％馬血瓊脂中于37℃微需氧條件下培養(yǎng)2-3天，收獲并用PBS洗滌一次。將細(xì)菌細(xì)胞用1M LiCI的PBS溶液于45℃保溫2小時(shí)以便制備粗提物(20)。離心后，將上清用PBS透析過夜。用考馬斯亮藍(lán)G-250染料的酸性溶液(Bio-Rad，Richmond，UK)判定提取物的蛋白質(zhì)濃度為300-1500μg/ml。從每個(gè)提取物中取出大約100μg蛋白質(zhì)的等分試樣，并用[125]I經(jīng)Iodogen方法(21)標(biāo)記，使比活性為2-5×103cpm/μg。
薄層色譜-在玻璃-或鋁支持的硅膠60HPTLC板(Merck，Darmstadt，Germany)上，用氯仿/甲醇/水(體積比60∶35∶8)或含0.02％CaCl2的氯仿/甲醇/水(體積比60∶40∶9)作為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行薄層色譜。用茴香醛(22)或間苯二酚試劑(23)完成化學(xué)檢測(cè)。
色譜結(jié)合分析—如(24)所描述的進(jìn)行色譜結(jié)合分析。將糖鞘脂(20-80μg/泳道)混合物或純化合物(1-4μg/泳道)在鋁支持的硅膠60HPTLC板上分離。將干燥的色譜浸入含0.5％(w/v)多聚異丁基異丁烯酸酯的二乙醚/正己烷(按體積1∶5)(Aldrich Chem.Comp.Inc.，Milwaukee，WI)中1分鐘。干燥后，為封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)將色譜包被。先試驗(yàn)不同的包被條件，例如1％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)的PBS(溶液1)，2％明膠(w/v)的PBS(溶液2)，2％牛血清白蛋白(w/v)的PBS(溶液3)，2％牛血清白蛋白(w/v)和0.1％(w/v)Tween20的PBS(溶液4)，或2％牛血清白蛋白(w/v)和0.2％(w/v)脫氧膽酸的PBS(溶液5)。用溶液4獲得了最一致的結(jié)果，隨后將其用作標(biāo)準(zhǔn)條件。包被在室溫下進(jìn)行2小時(shí)。此后將35S-標(biāo)記的細(xì)菌(用PBS稀釋成1×10g CFU/ml和1-5×106cpm/ml)或125I-標(biāo)記的細(xì)菌表面蛋白(用溶液4稀釋成大約2×106cpm/ml)懸液輕輕噴灑在色譜上并于室溫保溫2小時(shí)。用PBS洗滌6次，干燥后，使用XAR-5x-線膠片(Eastman Kodak，Rochester，NY)，將薄層板在室溫下或在-70℃進(jìn)行放射自顯影3-120小時(shí)。
糖鞘脂制制劑參考糖鞘脂—從本說明書最后部分的表II中提供的來(lái)源，用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得酸性和非酸性糖鞘脂部分(25)。使總糖鞘脂級(jí)分乙?；⑶以诠杷嶂现貜?fù)進(jìn)行色譜而將各個(gè)糖鞘脂分離。純化的糖鞘脂用質(zhì)譜法(26)，質(zhì)子NMR波譜(27-30)，和降解研究(31，32)鑒定。
如(16)中所描述，用無(wú)水肼處理Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(表II中編號(hào)2)產(chǎn)生Galβ3GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer(表II中編號(hào)3)。
人胎糞—將在Obstetric Clinic，Sahlgrenska University Hospital，Goteborg出生的17個(gè)足月新生兒胎糞混合。僅收集出生后24小時(shí)內(nèi)排出的第一次糞便，凍干后，貯存在-70℃。如(25)描述的從混合物(干重23.3g)中分離非酸性糖鞘脂。簡(jiǎn)言之，將凍干物在Soxhlet裝置上分兩步用氯仿和甲醇(按體積分別2∶1，和1∶9)提取。將混合的提取物進(jìn)行弱堿甲醇分解和透析，隨后用硅酸柱(Mallinckrodt Chem.Work，St.Louis)分離。在DEAE-纖維素柱(DE-23，Whatman)上層析獲得酸性和非酸性糖脂部分。為從非酸性糖脂中除去堿-穩(wěn)定的磷脂，將此部分乙?；?24)并在第二硅酸柱上分離，隨后去乙酰化和透析。最后在DEAE-纖維素-和硅酸柱上純化后獲得262mg非酸性糖鞘脂。
結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂的分離用兩步法進(jìn)行。首先，將240mg非酸性糖鞘脂級(jí)分在2.2×30cm硅柱(YMC SH-044-10，10μm微粒；SkandinaviskaGenetec，Kungsbacka，Sweden)上經(jīng)HPLC分離。將柱在氯仿/甲醇/水(按體積65∶25∶4)(溶劑A)中平衡并用溶劑A中氯仿/甲醇/水(按體積40∶40∶12，溶劑B)的線性梯度洗脫。將柱首先用溶劑A洗脫2分鐘，然后在5分鐘內(nèi)將溶劑B在溶劑A中的百分比從0％升至50％，從50％至80％用140分鐘，從80％至100％用10分鐘，在100％保持23分鐘。取2ml級(jí)分用薄層色譜分析，并且對(duì)茴香醛染色陽(yáng)性級(jí)分進(jìn)一步用色譜結(jié)合分析檢測(cè)幽門螺桿菌的結(jié)合。將結(jié)合幽門螺桿菌的級(jí)分收集入試管78-88，將這些部分混合后獲得14.2mg。
將此物質(zhì)乙?；M(jìn)一步在YMC SH-044-10柱上進(jìn)行HPLC分離。將在氯仿中平衡的柱在氯仿中氯仿/甲醇(按體積95∶5)(溶劑C)的線性梯度用流速2ml/min洗脫。在氯仿中溶劑C的百分比從0％升至20％用10分鐘，從20％至100％用70分鐘，在100％保持10分鐘。去乙?；?，將每1ml的級(jí)分用薄層色譜上茴香醛染色分析，并且檢測(cè)含糖鞘脂的級(jí)分結(jié)合幽門螺桿菌的活性。將大多數(shù)結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂收集入試管62，并將此級(jí)分(2.4mg)用于結(jié)構(gòu)分析。
人胃上皮細(xì)胞—從因肥胖癥而進(jìn)行選擇性外科手術(shù)的患者胃底區(qū)獲得胃組織(10×10cm小塊)。用0.9％NaCl(w/v)洗滌后，將粘膜細(xì)胞輕輕刮下，保存在-70℃。將物質(zhì)凍干，如(25)所述分離酸性和非酸性糖鞘脂。有兩例從非粘膜物上也分離到糖鞘脂?；颊叩难?，從每個(gè)組織標(biāo)本上分離的糖鞘脂的量列于說明書最后部分表III中。
將表III例4的非酸性糖鞘脂(2.9mg)在1.0×25cm硅膠柱(Kromasil-Sil，10μm微粒，Skandinaviska Genetec)上用氯仿/甲醇/水(按體積65∶25∶4至40∶40∶12)的梯度在180分鐘內(nèi)，以流速2ml/min用HPLC分離。將每個(gè)級(jí)分的等分試驗(yàn)用茴香醛作為染色劑進(jìn)行薄層色譜分析。將四糖基?；拾贝际占朐嚬?2-17。試管12-14也含有在薄層色譜上在三糖基?；拾贝歼w移率區(qū)域的化合物，將這三個(gè)級(jí)分混合后得到0.2mg物質(zhì)(指4-I級(jí)分)。將試管15-17中的部分分別匯總得到0.5mg四糖基?；拾贝?指4-II級(jí)分)。
例5的10.0mg非酸性糖基酰基鞘氨醇部分的分離用與上述相同的系統(tǒng)，使用氯仿/甲醇/水(按體積60∶35∶8至40∶40∶12)的梯度分離。試管11中所收集的部分(指5-I部分)含有三糖基?；拾贝己退奶腔；拾贝?0.1mg)，而在試管12和13中僅獲得四糖基?；拾贝?。后兩部分混合得到0.3mg(指5-II部分)。
EI質(zhì)譜法—質(zhì)譜法之前，如(33)描述的用固體NaOH在二甲基亞砜和碘甲烷中將糖鞘脂過甲基化。使用光束(beam)技術(shù)(34)，將從人胎糞中分離的四糖基?；拾贝荚赩G ZAB 2F/I-IF質(zhì)譜儀(VG Analytical，Manchester，UK)上分析。分析的條件列于復(fù)現(xiàn)光譜的插圖說明中。將從人胃粘膜細(xì)胞來(lái)源的四糖基酰基鞘氨醇用同樣技術(shù)在JEOL SX102A質(zhì)譜儀(JEOL，Tokyo，Japan)上分析。分析條件為電子能量70eV，俘獲電流300μA，加速電壓10kV。溫度以15℃/min上升，起始溫度為150℃。
降解研究—將人胎糞中過甲基化的糖鞘脂水解，還原并乙?；?31，32)，將獲得的部分過甲基化的糖醇-和氨基己糖醇乙酸酯在Trio-2四極(quadrupole)質(zhì)譜儀(VG Masslab，Altrincham，UK)上進(jìn)行氣相色譜-EI質(zhì)譜分析。Hewlett Packed 5890A氣相色譜儀上裝有進(jìn)樣柱注射器(on-columninjector)和15m×0.25mm熔化的硅毛細(xì)管柱，DB-5(J&W Scientific，RancoCordova，CA)，膜厚0.25μm。將樣品在70℃(1min)注入進(jìn)樣柱(on-column)內(nèi)并將柱內(nèi)溫度以50℃/min速度從70℃升至170℃，以8℃/min速度從170℃升至260℃。質(zhì)譜條件為電子能量40eV，俘獲電流200μA。通過對(duì)比停留時(shí)間和對(duì)比從參考糖鞘脂獲得的部分過甲基化的醛糖醇乙酰酯的質(zhì)譜鑒定成分。
質(zhì)子NMR波譜—在Varian VXR 300(Varian，Palo Alto，CA)上于7.05T(300MHz)和JEOL Alpha-500(JEOL，Tokyo，Japan)上于11.75T(500MHz)獲得質(zhì)子NMR波譜。數(shù)據(jù)用NMR1(NMRi，Syracuse，NY)脫機(jī)處理。將氘交換的糖鞘脂部分溶解于二甲基亞砜-d6/D2O(按體積98∶2)中，在30℃用0.4Hz的數(shù)字分辨記錄波譜。給出相對(duì)于四甲基硅的化學(xué)位移(shift)。
可溶性寡糖的抑制—為檢測(cè)可溶性糖可能的結(jié)合抑制，將35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株002和032用不同濃度(0.05mg/ml，0.1mg/ml和0.2mg/ml)的乳四糖(Accurate Chem.&Sci.Corp.，Westbury，NY)PBS或乳糖(J.T. baker Chem.Co.，Phillipsburg，NJ)PBS在室溫下保溫1小時(shí)。此后如上所述進(jìn)行色譜結(jié)合分析，分別使用神經(jīng)節(jié)四糖基酰基鞘氨醇，乳四糖基?；拾贝己蛥⒖继乔手M(jìn)行色譜。
構(gòu)建分子模型—列于表II中的各種糖鞘脂的最低能量構(gòu)象用Biograf分子成模程序(Molecular Simulations Inc.，Waltham，MA)在SiliconGraphics4D/3STG工作站上使用Deriding-II分子力場(chǎng)(force field)(35)計(jì)算。用電荷(charge)平衡方法(36)產(chǎn)生電荷并且將距離依賴的介電常數(shù)ε＝3.5r用于Coulomb相互作用。此外使用特殊的氫原子成鍵其中Dhb設(shè)置為-4kcal/mol(35)。
人胃上皮中四糖基?；拾贝嫉孽；拾贝季厶敲柑幚?使用Hansson等(37)的方法進(jìn)行酶解。簡(jiǎn)言之，將例4的4-II部分，例5的5-II部分，人紅細(xì)胞的參考紅細(xì)胞糖苷脂(38)，人胎糞的參考乳四糖酰基鞘氨醇，和參考乳新四糖基?；拾贝?將人紅細(xì)胞的唾液基-乳新四糖基?；拾贝加猛僖好柑幚慝@得，參考39)100μg溶解在100μl含有120μg膽酸鈉的0.05M醋酸鈉緩沖液，pH5.0中，并經(jīng)短暫超聲處理。此后，加入1mU水蛭(Macrobdella decora)?；拾贝季厶敲?Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)并將混合物于37℃保溫24小時(shí)。加入氯仿/甲醇/水至終比例8∶4∶3(按體積)來(lái)終止反應(yīng)。將因此得到的含有寡糖的上相與?；拾贝己腿ノ蹌┰赟ep-Pak C18柱(cartridge)(Waters，Milford，MA)上分離。含有寡糖的洗脫物在氮?dú)夂驼婵障赂稍?，此后?33)描述的過甲基化。
過甲基化寡糖的高溫氣相色譜和氣相色譜-EI質(zhì)譜分析—分析條件基本同于(40)描述的。毛細(xì)管氣相色譜在Hewlett-Packard 5890A氣相色譜儀上進(jìn)行，使用0.03μm交聯(lián)PS264(Fluka，Buchs，Switzerland)包被的熔凝氧化硅柱(10m×0.25mmi.d.)，用氫氣作為載氣。將過甲基化的寡糖溶解于乙酸乙酯中，于70℃(1min)將1μl樣品注入進(jìn)樣柱中。使用兩步溫度程序；70℃至200℃以50℃/min升溫，隨后以10℃/min升至350℃。
氣相色譜-EI質(zhì)譜法在連于JEOL SX-102A質(zhì)譜儀的Hewlett-Packard5890-II氣相色譜儀上進(jìn)行。色譜條件和毛細(xì)管柱同于氣相色譜分析，質(zhì)譜條件為界面溫度350℃，離子源溫度330℃，電子能70eV，俘獲電流300μA，加速電壓10kV，掃描的質(zhì)子范圍100-1600，總循環(huán)時(shí)間1.4秒，分辨率1000，離子源區(qū)的壓力10-5Pa。
結(jié)果與參考糖鞘脂混合物的結(jié)合—用薄層色譜分離多種已知的糖鞘脂混合物，它們代表各種不同的糖序列。
結(jié)果如圖1所示，其顯示35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌或125I標(biāo)記的細(xì)菌表面蛋白與薄層色譜分離的糖鞘脂的結(jié)合。圖1(A)顯示用茴香醛試劑檢測(cè)到的糖鞘脂。如圖1(B)和圖1(C)所示，放射性標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株17875結(jié)合后用放射自顯影僅見到少量選擇性結(jié)合帶。用放射性標(biāo)記的細(xì)菌表面蛋白得到同樣的結(jié)合模式(未顯示)。將糖鞘脂在鋁支持的硅膠60HPTLC板上，使用氯仿/甲醇/水(按體積60∶35∶8)作溶劑系統(tǒng)分離，如“材料與方法”中描述的進(jìn)行結(jié)合分析。圖1B中的放射自顯影是用2％BSA和0.1％Tween20的PBS包被薄層色譜后獲得的，而圖1C中的放射自顯影是包被緩沖液只含有2％BSA的PBS時(shí)獲得的。所示泳道含有下列糖鞘脂人A型血紅細(xì)胞的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道1)；狗小腸的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道2)；豚鼠小腸的非-酸性糖鞘脂，20μg(泳道3)；小鼠糞便的非-酸性糖鞘脂，20μg(泳道4)；黑-白大鼠小腸上皮細(xì)胞的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道5)；人胎糞的非-酸性糖鞘脂，40μg(泳道6)；人O型血紅細(xì)胞的酸性糖鞘脂，40μg(泳道7)；兔胸腺的酸性糖鞘脂，20μg(泳道8)；小牛腦的神經(jīng)節(jié)苷脂，40μg(泳道9)；人腎上腺樣瘤的酸性糖鞘脂，40μg(泳道10)。放射自顯影12小時(shí)。
在泳道2(乳四糖酰基鞘氨醇)，泳道3(神經(jīng)節(jié)三糖基酰基鞘氨醇)和泳道4(神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝?中的結(jié)合經(jīng)判定對(duì)應(yīng)于前面(16)中詳細(xì)描述的幽門螺桿菌的“乳糖基?；拾贝冀Y(jié)合特異性”和“神經(jīng)節(jié)結(jié)合特異性”。
此外，檢測(cè)幽門螺桿菌與在人胎糞非酸性糖鞘脂部分中四糖基酰基鞘氨醇區(qū)域內(nèi)能發(fā)生遷移的成分的選擇性結(jié)合(圖1B，泳道6)。后一種結(jié)合活性僅在包被緩沖液含有去污劑(Tween20或脫氧膽酸)時(shí)檢測(cè)，如圖1所示。隨后使用溶液4(20％牛血清白蛋白和0.1％Tween20的PBS)作為標(biāo)準(zhǔn)包被方法。有結(jié)合活性的人胎糞的四糖基酰基鞘氨醇用HPLC分離，并在降解后用質(zhì)譜分析，質(zhì)子NMR波譜分析，和氣相色譜-EI質(zhì)譜分析來(lái)鑒定，如下人胎糞中結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)—從240mg總的非酸性糖鞘脂中分離有結(jié)合活性的四糖基?；拾贝肌Ｌ烊惶乔手旌衔锝?jīng)HPLC得到14.2mg四糖基?；拾贝?。此四糖基?；拾贝疾糠质菑?fù)合的混合物，除結(jié)合幽門螺桿菌的化合物外它包含至少三種其他糖鞘脂。將此四糖基酰基鞘氨醇部分乙?；⑦M(jìn)一步用HPLC分離，產(chǎn)生2.4mg純的有結(jié)合活性的糖鞘脂。在制備過程中每一步都用薄層色譜上放射標(biāo)記的幽門螺桿菌的結(jié)合監(jiān)測(cè)。
EI質(zhì)譜分析—也研究了人胎糞中過甲基化的有結(jié)合活性的糖鞘脂的質(zhì)譜，以及用于說明的簡(jiǎn)化的通式，其代表具有d181-h240?；拾贝嫉姆N類。結(jié)果如圖2所示。質(zhì)譜上方是用于說明的代表具有鞘氨醇和羥基240脂肪酸的酰基鞘氨醇類型的簡(jiǎn)化通式。分析條件為樣品量16μg，電子能45eV，俘獲電流500μA和加速電壓8kV。起始溫度250℃，溫度以6℃/min上升。產(chǎn)生的質(zhì)譜在300℃記錄。
過甲基化糖鞘脂的質(zhì)譜由氧鎓離子主導(dǎo)，由于誘發(fā)?；拾贝嫉臄嗔旬a(chǎn)生糖序列，離子碎片(fragmention)。除了immonium離子外其他離子碎片豐度非常低，并且在由于堿的α-斷裂使植物鞘氨醇作為長(zhǎng)鏈堿離子時(shí)才出現(xiàn)。
在m/z1298和1326時(shí)發(fā)現(xiàn)由丟失長(zhǎng)鏈堿基部分形成的immonium離子。這些離子給出的關(guān)于糖和脂肪酸組分的數(shù)目和類型的信息，并在本例中證明了存在與h220和h240脂肪酸結(jié)合的一個(gè)N-乙酰己糖胺，三個(gè)己糖。
在m/z219和187(219減去32)，464，668和872時(shí)看到的糖序列離子證明糖鞘脂是帶有Hex-HexN-Hex-Hex糖序列的四糖基?；拾贝?。在m/z945(944+1)時(shí)的離子碎片支持此觀點(diǎn)，此碎片由整個(gè)糖鏈和部分脂肪酸組成。1型鏈(Hexβ-3HexN)用m/z182時(shí)離子碎片的缺失顯示，此碎片在4-取代基HexN時(shí)是主導(dǎo)離子(41，42)。在m/z 228時(shí)密集的離子碎片是來(lái)自HexN內(nèi)部的二級(jí)碎片，因?yàn)樵趍/z260處沒有發(fā)現(xiàn)末端HexN。
分子區(qū)域是微弱的。但是，分別在m/z1548，1550和1578處發(fā)現(xiàn)相當(dāng)于d181-240，d181-h220和d181-h240酰基鞘氨醇的[M-H]+離子。也看到分子離子上糖鏈末端部分的丟失也已顯示(解釋在d181-h240?；拾贝碱悇e下方)。在m/z1342和1370處的離子可能是分別由于t180長(zhǎng)鏈堿，t180-h 220和t180-h240?；拾贝贾袃蓚€(gè)羥基間斷裂引起。
關(guān)于?；拾贝冀M分的進(jìn)一步的信息通過m/z548-722處一系列離子碎片提供，表明混合物種類范圍從d181-160至t180-h240。從相關(guān)的酰基鞘氨醇離子，immonium離子，和分子離子判斷，主導(dǎo)?；拾贝挤N類為d181-240，d181-h240，t180-h220和t180-h240。
因此，過甲基化的糖鞘脂的質(zhì)譜證明糖鏈帶有Hex-HexN-Hex-Hex序列，和既結(jié)合羥基又結(jié)合非羥基脂肪酸的d181和t180長(zhǎng)鏈堿，大體上含22和24個(gè)碳原子。
降解研究—通過降解過甲基化的四糖基酰基鞘氨醇獲得糖殘基間的結(jié)合位點(diǎn)，即將樣品進(jìn)行酸水解，隨后還原和乙酰化。通過氣相色譜-EI質(zhì)譜法對(duì)得到的部分甲基化的醛糖醇乙酸酯進(jìn)行分析。因此獲得的重構(gòu)離子色譜具有四個(gè)糖峰(未顯示)。2，3，4，6四甲基-半乳糖醇的乙酸酯鑒定出一個(gè)末端半乳糖，而4，6二甲基-2-N-甲基-乙酰氨基-山梨醇(3-取代的-N-乙酰葡糖胺)的存在指示有一條1型鏈。另兩個(gè)峰，2，4，6-三甲基-半乳糖醇乙酸酯和2，3，6-三甲基山梨醇乙酸酯被分別鑒定為3-取代的半乳糖和4-取代的葡萄糖。
結(jié)合質(zhì)譜分析的數(shù)據(jù)，可推斷出帶有Gal1-3GlcNAc1-3Gal1-4Glc1序列的糖鏈。
質(zhì)子NMR波譜檢查—此后對(duì)人胎糞的糖鞘脂進(jìn)行300MHz質(zhì)子NMR波譜研究，結(jié)果如圖3所示。在探測(cè)溫度30℃時(shí)收集4000次掃描。在5.04ppm處信號(hào)的大分散是儀器假象，在4.93ppm處也有未鑒定的不純物。
質(zhì)子NMR波譜的差向異構(gòu)區(qū)含有5個(gè)大的3-雙重峰(doublet)(J1，2≈8Hz)。經(jīng)常是，由于酰基鞘氨醇頭部基團(tuán)不同，葡萄糖差向異構(gòu)質(zhì)子信號(hào)(4.20ppm，J1，2＝7.2Hz)被分成兩個(gè)信號(hào)。在4.28ppm(J1，2＝7.2Hz)出現(xiàn)Gal(i4差向異構(gòu)質(zhì)子，其表示3-位取代基。在4.79ppm(J1，2＝8.0Hz)處觀察到內(nèi)部的GlcNAcβ差向異構(gòu)其N-乙酰氨基甲基質(zhì)子在1.82ppm共振。最后，在4.15ppm(J1，2＝6.6Hz)發(fā)現(xiàn)表示1與3鍵合的末端Gal(3信號(hào)。因此所有的差向異構(gòu)化學(xué)位移與已發(fā)表的乳四糖基酰基鞘氨醇的結(jié)果是相同的(45)。除主要化合物外，在4.67和4.47ppm處用β-雙重峰表示少量不純物，似乎符合在未分化的鼠白血病細(xì)胞乳神經(jīng)節(jié)四糖基酰基鞘氨醇雜合體結(jié)構(gòu)(44)。
綜合所有數(shù)據(jù)，人胎糞中結(jié)合幽門螺桿菌的糖鞘脂的結(jié)構(gòu)被確定為Galβ3GlcNACβ3Galβ4Glcβ1Cer，即乳四糖基?；拾贝?，以前從同樣來(lái)源的以前已經(jīng)被鑒定過(45)。以前僅發(fā)現(xiàn)羥基脂肪酸，在本例中主要的?；拾贝碱悇e(d181-240，d181-h240，t180-h220和t180-h240)與之不同于。
在薄層色譜上與異受體(isoreceptor)的對(duì)比—用薄層色譜結(jié)合分析檢測(cè)結(jié)構(gòu)與乳四糖基?；拾贝加嘘P(guān)的大量純糖鞘脂的幽門螺桿菌結(jié)合活性。結(jié)果總結(jié)于表II和圖4。圖4中的泳道是下列物質(zhì)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳三糖基酰基鞘氨醇)，4μg(泳道1)；Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基酰基鞘氨醇)，4μg(泳道2)；FucαGalβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(H51型糖鞘脂)，4μg(泳道3)；Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(Lea-5糖鞘脂)，4μg(泳道4)；Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(Leb-6糖鞘脂)，4μg(泳道5)；Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(X-5糖鞘脂)，4μg(泳道6)；Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(Y-6糖鞘脂)，4μg(泳道7)；Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(B61型糖鞘脂)，4μg(泳道8)。
圖4A表示用茴香醛進(jìn)行的化學(xué)檢測(cè)，圖4B表示通過35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株032結(jié)合獲得的放射自顯影照片。將糖鞘脂在鋁支持的硅膠60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(體積比60∶35∶8)作為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離，如“材料與方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作為包被緩沖液進(jìn)行結(jié)合分析。放射自顯影12小時(shí)。
唯—有結(jié)合活性的糖鞘脂是乳四糖基?；拾贝?編號(hào)2)，而實(shí)驗(yàn)的所有置換反應(yīng)都使該結(jié)合性喪失。因此，不能耐受末端半乳糖2-位上添加α-巖藻糖(表II的編號(hào)4)，3位上添加α-N-乙醇酰神經(jīng)氨酸(編號(hào)11)或α-半乳糖(編號(hào)8)，或N-乙酰葡糖胺4位上添加α-巖藻糖(編號(hào)5)。沒有獲得與GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer糖鞘脂(編號(hào)1)的結(jié)合，說明Galβ3GlcNAcβ-部分的重要性。主要由N-乙酰葡糖胺次末端的2位乙酰氨基參與相互作用，因?yàn)槿コ瞬糠?編號(hào)3)則完全喪失結(jié)合力。
對(duì)薄層色譜上結(jié)合的抑制—通過在對(duì)懸液的色譜結(jié)合分析前將放射標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株17875與游離的乳四糖(0.1mg/ml)PBS或乳糖(0.2mg/ml)PBS在室溫下保溫1小時(shí)，可檢測(cè)可溶性寡糖干擾薄層板上幽門螺桿菌與糖鞘脂結(jié)合的能力。結(jié)果如圖5所示，圖5A是用茴香醛染色的薄層色譜圖，圖5B顯示與乳糖保溫的幽門螺桿菌的結(jié)合，圖5C顯示與乳四糖保溫的幽門螺桿菌的結(jié)合。泳道是Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer(神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝?，4μg(泳道1)；Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(乳四糖基?；拾贝?，4μg(泳道2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(新乳四糖基?；拾贝?，4μg(泳道3)。將糖鞘脂在鋁支持的硅膠60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(體積比60∶35∶8)作為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離，如“材料與方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作為包被緩沖液進(jìn)行結(jié)合分析。放射自顯影12小時(shí)。
因此，與乳四糖(0.1mg/ml)保溫可抑制幽門螺桿菌與乳四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合，而與乳糖保溫沒有抑制作用。
幽門螺桿菌與人胃的糖鞘脂的結(jié)合完整人類胃壁的非酸性糖鞘脂—為檢測(cè)靶組織中對(duì)細(xì)菌有結(jié)合活性的糖鞘脂的表達(dá)，研究幽門螺桿菌與從人整個(gè)胃壁上分離的糖鞘脂結(jié)合，結(jié)果如圖6所示，其顯示用茴香醛檢測(cè)的分離的糖鞘脂的薄層色譜(圖6A)和用35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株002的結(jié)合獲得的放射自顯影照片(圖6B)。各泳道是人胎糞的乳四糖基?；拾贝迹?μg(泳道1)；人胎糞的非酸性糖鞘脂，40μg(泳道2)；血型A(Rh+)p個(gè)體人胃的非酸性糖鞘脂，40μg(泳道3)；血型A(Rh+)p個(gè)體人胃的非酸性糖鞘脂，40μg(泳道4)。將糖鞘脂在鋁支持的硅膠60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(體積比60∶35∶8)作為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離，如“材料與方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作為包被緩沖液進(jìn)行結(jié)合分析。放射自顯影5小時(shí)。帶中糖殘基數(shù)示于左側(cè)。
這些非酸性部分的四糖基?；拾贝紖^(qū)域主要是紅細(xì)胞糖苷脂(例如圖6A泳道4)，至少在人小腸(46)和大腸(47)，紅細(xì)胞糖苷脂是從非上皮基質(zhì)衍生而來(lái)。未獲得與這些部分的結(jié)合(例如圖6B，泳道4)。但是，當(dāng)使用從血型A(Rh+)p個(gè)體胃中分離的非酸性糖鞘脂部分時(shí)(48)，其缺乏使乳糖基?；拾贝枷蚣t細(xì)胞三糖基?；拾贝嫁D(zhuǎn)變的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(49)，因而缺乏紅細(xì)胞糖苷脂(圖6A，泳道3)，此時(shí)檢測(cè)到幽門螺桿菌在四糖基酰基鞘氨醇區(qū)域的結(jié)合(圖6B，泳道3)。此例中的組織在消化性潰瘍疾病外科手術(shù)后獲得。由于有限的可獲得量，不可能分析此有結(jié)合活性的四糖基?；拾贝嫉幕瘜W(xué)特征。
人胃上皮細(xì)胞的糖鞘脂—接下來(lái)發(fā)明者檢測(cè)了幽門螺桿菌與從人胃上皮細(xì)胞分離的糖鞘脂的結(jié)合。因?yàn)樵谡Ｍ饪剖中g(shù)中很少切下非惡性幽門組織，所以糖鞘脂從因肥胖而進(jìn)行外科手術(shù)的患者胃底區(qū)標(biāo)本分離，盡管胃此區(qū)組織學(xué)不同于經(jīng)常發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌的幽門區(qū)(50，51)。
總體上，從7個(gè)個(gè)體粘膜刮取物分離糖鞘脂，并且在兩例中也從非粘膜殘余物中分離到糖鞘脂。由于材料量有限，僅測(cè)試了幽門螺桿菌菌株002和032與這些部分的結(jié)合。
在薄層色譜上遷移的酸性糖鞘脂部分中主要化合物為硫苷脂和GM3。獲得幽門螺桿菌未與這些主要酸性糖鞘脂結(jié)合(未顯示)。觀察到細(xì)菌未與非上皮基質(zhì)的糖鞘脂結(jié)合。
然后研究幽門螺桿菌與從7例中5例人胃的上皮細(xì)胞分離的非酸性糖鞘脂部分的結(jié)合，結(jié)果如圖7A所示，其顯示用茴香醛進(jìn)行的化學(xué)檢測(cè)。在7例中之一檢測(cè)到四糖基酰基鞘氨醇區(qū)域幽門螺桿菌的結(jié)合，如圖7B所示。圖中泳道1-3是下列組織的參考非酸性糖鞘脂狗小腸的，40μg(泳道1)；小鼠糞便的，20μg(泳道2)；人胎糞的，40μg(泳道3)，泳道4-8是五例人胃中(表III中1-5例)上皮細(xì)胞的非酸性糖鞘脂(80μg/泳道)。圖7A顯示用茴香醛的化學(xué)檢測(cè)，(B)表示通過35S-標(biāo)記的幽門螺桿菌菌株032結(jié)合獲得的放射自顯影照片。將糖鞘脂在鋁支持的硅膠60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(體積比60∶35∶8)作為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離，如“材料與方法”中描述的使用2％BSA和0.1％Tween20的PBS作為包被緩沖液進(jìn)行結(jié)合分析。放射自顯影12小時(shí)。帶中糖殘基數(shù)示于左側(cè)。
此外，如先前報(bào)道描述的(16)，在一例中發(fā)現(xiàn)在二糖基?；拾贝紖^(qū)域發(fā)生遷移的有結(jié)合活性的化合物。將含有有結(jié)合活性的四糖基酰基鞘氨醇(例4)部分，和一個(gè)未結(jié)合部分(例5)用HPLC分離，并將從每例中分離的四糖基?；拾贝加悯；拾贝季厶敲杆猥@得的過甲基化四糖，然后進(jìn)行1H-NMR波譜，EI質(zhì)譜法，和氣相色譜-EI質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果如圖8所示，其為薄層色譜圖，顯示從表III中例4和例5胃上皮細(xì)胞獲得的含四糖基酰基鞘氨醇的級(jí)分(A)，以及4-II(B)和5-II(C)級(jí)分的500MHz質(zhì)子NMR波譜的差向異構(gòu)區(qū)。薄層色譜上各泳道是例4的胃上皮總的非酸性糖鞘脂，80μg(泳道1)；例4的4-I部分，4μg(泳道2)；例4的4-4-II部分，4μg(泳道3)；例5的胃上皮總的非酸性糖鞘脂，80μg(泳道4)；例5的5-I部分，4μg(泳道5)；例5的5-II部分，4μg(泳道6)。將糖鞘脂在玻璃支持的硅膠60HPTLC板上用氯仿/甲醇/水(體積比60∶35∶8)作為溶劑系統(tǒng)進(jìn)行分離，并用茴香醛染色。帶中糖殘基數(shù)示于左側(cè)。對(duì)于質(zhì)子NMR波譜，在探測(cè)溫度30℃時(shí)，分別從0.5mg(4-II)和0.3mg(5-II)樣品收集4000次掃描。
人胃上皮細(xì)胞的四糖基?；拾贝疾糠值馁|(zhì)子NMR波譜—從例4分離的4-II部分的質(zhì)子NMR波譜(圖8B)主要為紅細(xì)胞糖苷脂，其差向異構(gòu)信號(hào)出現(xiàn)在4.81ppm(Galα)，4.52ppm(GalNAcβ)，4.26ppm(Galβ)和4.20/4.27ppm(Glcβ)。但是在GalαH1信號(hào)基礎(chǔ)上的小峰說明在此部分中也存在另一種糖鞘脂。此信號(hào)與乳四糖?；拾贝嫉腉lcNAcβ H-1是一致的，其他潛在的信號(hào)淹沒在紅細(xì)胞糖苷脂共振譜中。但是，紅細(xì)胞三糖基酰基鞘氨醇的GalαH-1也具有非常相似的化學(xué)位移。準(zhǔn)確的化學(xué)位移隨溫度和其他因素而改變。為解決此問題發(fā)明者對(duì)比了在相同條件下400MHz時(shí)乳四糖基-，紅細(xì)胞四糖基-，和紅細(xì)胞三糖基?；拾贝嫉膮⒖疾ㄗV。也制備了乳四糖基?；拾贝己图t細(xì)胞四糖基?；拾贝嫉膮⒖蓟旌衔锊⒃?00MHz時(shí)分析。這些對(duì)比清晰顯示，在4.79ppm處的信號(hào)屬于來(lái)自乳四糖基酰基鞘氨醇的N-乙酰葡糖胺的β-差向異構(gòu)質(zhì)子。當(dāng)分析例4中更早期洗脫的含四糖基?；拾贝嫉募?jí)分(4-I)時(shí)證實(shí)了這一點(diǎn)。這里發(fā)現(xiàn)半乳糖有兩個(gè)不重疊的α-差向異構(gòu)信號(hào)，一個(gè)對(duì)應(yīng)于紅細(xì)胞四糖基?；拾贝純?nèi)部GalαH1(4.81ppm)，另一個(gè)對(duì)應(yīng)于紅細(xì)胞三糖基酰基鞘氨醇末端GalαH1(4.78ppm)(未顯示)。
與紅細(xì)胞三糖基-和紅細(xì)胞四糖基?；拾贝嫉腘-乙酰氨基半乳糖相比，乳四糖?；拾贝嫉拇嬖谝矔?huì)使N-乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)生不同的甲基信號(hào)(52)。乳四糖酰基鞘氨醇中GalNAc的甲基信號(hào)在1.85ppm處，GlcNAc的甲基信號(hào)在1.82ppm處，這與我們的參考波譜相同并且與(53)中報(bào)道的值非常一致。從甲基信號(hào)的強(qiáng)度估計(jì)4-II部分含有大約5％乳四糖?；拾贝?。
例5早期洗脫的含有四糖基?；拾贝嫉募?jí)分(5-I)既含有紅細(xì)胞三糖基?；拾贝家埠屑t細(xì)胞四糖基?；拾贝?，如分別在4.81和4.78ppm處的α-差向異構(gòu)信號(hào)所示(未顯示)。更晚洗脫的含有四糖基?；拾贝嫉募?jí)分(5-II)(如圖8C所示)，在4.65ppm處也含有對(duì)應(yīng)于乳新四糖?；拾贝嫉腉lcNAcβ的β-雙重峰(53)。此糖鞘脂的N-乙酰氨基葡萄糖在1.82ppm處有甲基信號(hào)，與以前的乳新四糖基?；拾贝嫉臄?shù)據(jù)一致(52)。
人胃上皮細(xì)胞的四糖基?；拾贝疾糠值腅I質(zhì)譜分析—分別從例4和例5中4-II和5-II部分的過甲基化衍生物進(jìn)行EI質(zhì)譜分析獲得的質(zhì)譜(未顯示)非常相似。在兩個(gè)質(zhì)譜中，在m/z260和228(260減去32)的離子是顯著的，證明是末端HexN，在m/z219沒發(fā)現(xiàn)表示末端Hex的離子。末端HexN-Hex以m/z464處的離子表示。在m/z945(944+1)處的離子碎片，含有整個(gè)糖鏈和部分脂肪酸，證明是HexN-HexHex-Hex糖序列。
從?；拾贝疾糠郑琲mmonium離子，和分子離子的相對(duì)離子碎片強(qiáng)度，證明4-II部分中主要的?；拾贝挤N類是d181-160，d181-h240和d181-h241，而在5-II部分中主要有d181-160，d181-220，d181-240，d181-241，和d181-h240酰基鞘氨醇。
因此，用質(zhì)譜法僅鑒定了這兩種樣品中主要的化合物，即紅細(xì)胞糖苷脂，但不能分辨用質(zhì)子NMR實(shí)驗(yàn)顯示的這些級(jí)分中的次要化合物。但是，通過將色譜方法與質(zhì)譜法組合獲得的高分辨率允許對(duì)這些次要化合物進(jìn)行鑒定，如下面部分所述。
人胃上皮細(xì)胞的過甲基化四糖的高溫氣相色譜-EI質(zhì)譜分析—將例4的4-II部分和例5的5-II部分用?；拾贝季厶敲杆猓⑨尫诺乃奶沁^甲基化并用氣相色譜和氣相色譜-EI質(zhì)譜法分析。結(jié)果總結(jié)于圖9和10。每個(gè)色譜峰分解為α-和β-構(gòu)象異構(gòu)體。
圖9表示用酰基鞘氨醇聚糖酶水解釋放的過甲基化寡糖重構(gòu)的離子色譜圖。Run A是紅細(xì)胞糖苷脂，乳四糖基?；拾贝己腿樾滤奶腔；拾贝嫉膮⒖蓟旌衔?，run B是從表III例4來(lái)源的胃上皮細(xì)胞的四糖基?；拾贝?，run C是從表III例5來(lái)源的胃上皮細(xì)胞的四糖基酰基鞘氨醇。分析條件如“材料與方法”部分所描述。參考混合物(run A)的寡糖已經(jīng)被標(biāo)記。
圖10表示用高溫氣相色譜-EI質(zhì)譜分析獲得的下列物質(zhì)的質(zhì)譜圖酰基鞘氨醇聚糖酶從參考糖鞘脂釋放的過甲基化寡糖(I和II)，表III例4的胃上皮細(xì)胞的四糖基酰基鞘氨醇部分(III)，和表III例5的胃上皮細(xì)胞的四糖基?；拾贝疾糠?IV)。分析條件參看“材料與方法”。標(biāo)示RunA-C指圖10所示總離子色譜的各部分。通式解釋與參考圖譜一同顯示。
例4中結(jié)合幽門螺桿菌的胃上皮細(xì)胞的四糖被分成兩個(gè)峰，如圖9，runB所示。主峰以與參考紅細(xì)胞糖苷脂的糖組分相同的保留時(shí)間洗脫，而小峰以參考乳四糖基?；拾贝嫉奶墙M分的保留時(shí)間洗脫。
例5中未結(jié)合的胃上皮細(xì)胞的四糖(圖9，run C)也被分成兩個(gè)峰，主峰以與參考紅細(xì)胞糖苷脂相同的糖組分的保留時(shí)間洗脫。而此例中小峰以參考乳新四糖基酰基鞘氨醇的糖組分的保留時(shí)間洗脫。
為進(jìn)一步證實(shí)例4中結(jié)合幽門螺桿菌的和例5中未結(jié)合的四糖基?；拾贝疾糠值牟町?，獲得過甲基化寡糖的質(zhì)譜(圖10)。兩例的主峰質(zhì)譜與標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞糖苷脂一致(未顯示)。但是，例4結(jié)合幽門螺桿菌的次要四糖的譜(圖10，III)，和例5未結(jié)合者(圖10，IV)顯示出某些相異性。
在兩個(gè)圖譜中m/z187(219減去32)，219，432(464減去32)，464和668處觀察到能證實(shí)末端Hex-HexN-Hex糖序列的離子碎片。但是，在例5晚期洗脫峰質(zhì)譜中在m/z182處離子碎片明顯，而在例4晚期洗脫峰質(zhì)譜中缺乏此離子。在m/z182處的離子碎片是2型糖鏈Galβ4GlcNAcβ特有的(41，42)，但最近證實(shí)它僅發(fā)現(xiàn)于離子源溫度設(shè)置為超過280℃時(shí)(54)。
如在參考乳新四糖基?；拾贝嫉馁|(zhì)譜中一樣(圖10，II)，例5中糖的質(zhì)譜中在m/z432(464減去32)處離子碎片也很明顯，表明從Galβ4GlcNAcβ-鏈中比從Galβ3GlcNAcβ鏈中去除甲醇更容易，最可能從C2-C3去除。
例4中的糖在m/z228處產(chǎn)生強(qiáng)離子碎片。此離子在乳四糖?；拾贝紖⒖嘉锏馁|(zhì)譜中也是明顯的(圖10，I)，并可能產(chǎn)生于內(nèi)部的GlcNAc，因?yàn)樵趍/z260處未觀察到離子。
結(jié)論是，通過例4和例5的四糖基?；拾贝贾羞^甲基化寡糖的氣相色譜和氣相色譜-EI質(zhì)譜分析確認(rèn)了這些部分的質(zhì)子NMR譜結(jié)果。這兩部分的主要化合物被鑒定為紅細(xì)胞四糖，而次要成分是不同的。在例4結(jié)合幽門螺桿菌的情況下，此次要成分被鑒定為乳四糖，而例5的未結(jié)合者為新乳四糖。
在幽門螺桿菌分離物中乳四糖?；拾贝冀Y(jié)合的頻率—乳四糖基?；拾贝冀Y(jié)合特性的表達(dá)頻率通過分析表I中所列的66種幽門螺桿菌分離物與薄層色譜上糖鞘脂的結(jié)合來(lái)估計(jì)。為進(jìn)行結(jié)合分析，從貯存培養(yǎng)物培養(yǎng)細(xì)菌，并用色譜結(jié)合分析來(lái)檢測(cè)與人胎糞中乳四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合。陽(yáng)性結(jié)合表示與圖1B中泳道6所觀察到的模式相同。將未能結(jié)合的菌株從貯存狀態(tài)再培養(yǎng)兩次，用色譜結(jié)合試驗(yàn)再分析，即連續(xù)三次檢測(cè)到菌株未結(jié)合才認(rèn)為是不結(jié)合。用這些標(biāo)準(zhǔn)，分析的66個(gè)分離物中的9個(gè)(表I中菌株15，65，176，198，239，269，271，272和BH000334)不結(jié)合，而57個(gè)分離物(86％)表達(dá)乳四糖基?；拾贝冀Y(jié)合能力。
討論用紅細(xì)胞和唾液進(jìn)行血清學(xué)分型證明例4的血型為Ale(a+b-)非分泌型，與此個(gè)體胃粘膜中結(jié)合幽門螺桿菌的未取代型乳四糖基?；拾贝嫉拇嬖谑且恢碌摹５?，通過與針對(duì)Leb決定簇的單克隆抗體的結(jié)合，在此個(gè)體中分離的非酸性糖鞘脂部分以及其他的人胃標(biāo)本中非酸性部分發(fā)現(xiàn)大量Leb-6糖鞘脂(未顯示)。這表明，人胃粘膜中Lewis血型抗原的表達(dá)與紅細(xì)胞或唾液中Lewis抗原的表達(dá)是無(wú)關(guān)的，正如以前在其他的人組織，例如泌尿道上皮組織(61，62)和大腸(47，63)中證明的那樣。
由于非分泌者中十二指腸潰瘍的發(fā)病率逐漸增高，而此個(gè)體為非分泌型，這變得十分有趣(64-66)。最近一項(xiàng)研究(67)證實(shí)，不分泌與對(duì)幽門螺桿菌感染的易感性的增高無(wú)關(guān)。但是，分泌者的狀態(tài)可以決定建群的結(jié)果，即，非分泌者發(fā)生消化性潰瘍的傾向增加可能是由于這些個(gè)體胃上皮細(xì)胞表面能結(jié)合幽門螺桿菌的乳四糖酰基鞘氨醇的存在。
在本研究的實(shí)驗(yàn)條件下，在人胃上皮細(xì)胞分離的酸性級(jí)分中，幽門螺桿菌識(shí)別乳四糖基?；拾贝?，但不結(jié)合被暫時(shí)鑒定為硫苷脂的糖鞘脂和GM3神經(jīng)節(jié)苷脂。幽門螺桿菌與乳四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合不受生長(zhǎng)條件改變的影響，因?yàn)榧?xì)菌在瓊脂上和肉湯中生長(zhǎng)時(shí)都獲得了結(jié)合。而且，將細(xì)菌培養(yǎng)12小時(shí)和120小時(shí)都檢測(cè)到與乳四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合。
與乳四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合也出現(xiàn)在babA1A2突變株中，該菌株中編碼Leb-結(jié)合粘附素的基因已失活(數(shù)據(jù)未顯示；參考68)。因此，幽門螺桿菌與Leb決定簇和乳四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合代表兩種不同的結(jié)合特異性。
Leb決定簇(Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAcβ)是基于1型二糖單位，該單位是乳四糖基酰基鞘氨醇的末端部分。但是幽門螺桿菌與Leb的相互作用取決于巖藻糖，其中至少要求在末端半乳糖的2位上為α-巖藻糖，并且通過取代N-乙酰葡糖胺4位上的α-巖藻糖而促進(jìn)相互作用(9)。相比之下，與乳四糖基酰基鞘氨醇的結(jié)合需要未取代的糖鏈，因?yàn)閷?duì)基本受體序列的所有取代經(jīng)測(cè)試都喪失相互作用。
圖12表示乳四糖基?；拾贝嫉淖畹湍芰糠肿幽Ｐ?表II中編號(hào)2，圖12A)，與Leb-6的糖鞘脂(表II中編號(hào)6，圖12C)以及兩個(gè)未結(jié)合化合物，即Lea-5的糖鞘脂(表II中編號(hào)5，圖12B)和去巖藻糖基化的B61型糖鞘脂(表II中編號(hào)8，圖12D)的對(duì)比。上圖顯示相同結(jié)構(gòu)的俯視圖。GlcβCer鍵在延長(zhǎng)的構(gòu)象中顯示。在(B)-(D)中基本乳四糖基?；拾贝冀Y(jié)構(gòu)的取代是圓點(diǎn)，巖藻糖的和GlcNAc中乙酰氨基的甲基碳原子用黑色表示。為弄清組成乳四糖基酰基鞘氨醇的結(jié)合表位的重要部分，根據(jù)乳三糖基?；拾贝?編號(hào)1)和乳四糖基酰基鞘氨醇(編號(hào)3)(其中乙酰氨基組份已經(jīng)被還原成胺)的不結(jié)合這兩個(gè)事實(shí)，表明末端二糖Galβ3GlcNAcβ3構(gòu)成所述表位。后一結(jié)構(gòu)(編號(hào)3)的不結(jié)合進(jìn)一步說明，發(fā)生結(jié)合或構(gòu)象改變必需有完整的乙酰氨基，因?yàn)榘凡辉倌芘c內(nèi)部Galβ4的2-OH基發(fā)生氫鍵相互作用。這兩種效應(yīng)的組合也是可能的。而且，乳四糖基?；拾贝寄┒薌al被Galα3(編號(hào)8)或Fucα2(編號(hào)4)延長(zhǎng)，或GlcNAc次末端被Fucα4(編號(hào)5)取代產(chǎn)生無(wú)活性的結(jié)構(gòu)，說明末端二糖Galβ3GlcNAcβ3的主要部分是直接參與與負(fù)責(zé)結(jié)合的粘附素的相互作用。
已報(bào)道幽門螺桿菌與帶有唾液酸(神經(jīng)節(jié)苷脂)的糖鞘脂結(jié)合(80)。然而，乳四糖基?；拾贝伎杀徊荒芙Y(jié)合唾液酸的菌株(如菌株CCUG17875)和以唾液依賴方式結(jié)合的菌株(如菌株CCUG17874)識(shí)別(見圖11)。而且，乳四糖基酰基鞘氨醇的末端Gal被α3連接的唾液酸取代則喪失與幽門螺桿菌的結(jié)合，如表II，編號(hào)11。因此，乳四糖基?；拾贝冀Y(jié)合幽門螺桿菌能力與神經(jīng)節(jié)苷脂的識(shí)別作用無(wú)關(guān)。
在Leb結(jié)構(gòu)中，GlcNAcβ3殘基是不可接近的，次末端Galβ3是部分不可接近的，因?yàn)樗鼈儽粌蓚€(gè)巖藻糖分子覆蓋，如圖12C左側(cè)的俯視圖所示。而且，由于幽門螺桿菌與Leb的結(jié)合受異結(jié)構(gòu)Ley抑制(9)，Leb的GlcNAcβ3殘基對(duì)于與此化合物的結(jié)合不是必需的。對(duì)Leb-6和Ley-6末端四糖部分的最低能量結(jié)構(gòu)的對(duì)比排列表明唯一差別是GlcNAcβ3殘基的約180°翻轉(zhuǎn)，因此證明在Leb結(jié)構(gòu)中GlcNAcβ3殘基的乙酰氨基組份(或者甚至更可能整個(gè)殘基)不是必需的，而在乳四糖基?；拾贝贾袆偤孟喾?。還應(yīng)注意由于兩個(gè)附加的巖藻糖單位引起的擁擠，乳四糖基?；拾贝贾心┒薌alβ3環(huán)面與Leb結(jié)構(gòu)中相應(yīng)平面間的角度接近40°，提供了關(guān)于為什么這些結(jié)構(gòu)應(yīng)被認(rèn)為是幽門螺桿菌不同受體的另一理由。
圖11表示乳四糖基酰基鞘氨醇既被結(jié)合唾液酸的幽門螺桿菌菌株CCUF17874識(shí)別(B)也被缺乏唾液酸結(jié)合能力的菌株CCUG17875識(shí)別(C)。(A)中色譜用茴香醛染色。泳道1＝人紅細(xì)胞的紅細(xì)胞糖苷脂(GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer)，泳道2＝人胎糞的乳四糖?；拾贝?Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)，泳道3＝GM3神經(jīng)節(jié)苷脂(NeuAcα3Galβ4Glcβ1Cer)，泳道4＝人粒細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂。這兩種菌株都可識(shí)別乳四糖?；拾贝?泳道2)，而菌株CCUG17874經(jīng)證實(shí)通過與人粒細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合而具有結(jié)合唾液酸的能力(泳道4)。
分子成模實(shí)驗(yàn)—乳四糖?；拾贝寂c神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝冀Y(jié)構(gòu)的交聯(lián)最近證明，幽門螺桿菌特異性結(jié)合乳三糖基?；拾贝嫉哪┒硕?。這暗示對(duì)神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝冀Y(jié)合表位的解釋，因?yàn)檫@兩種結(jié)構(gòu)(主要不同在于糖殘基2和3間的鍵)以相同的二糖序列為末端，不必考慮GalNAc(GlcNAc)的4位上有差異。結(jié)合觀察到神經(jīng)節(jié)三糖基?；拾贝己蜕窠?jīng)節(jié)四糖基酰基鞘氨醇的去-N-乙?；N類的不結(jié)合連同從前一個(gè)到后一個(gè)糖鞘脂親和性的戲劇性增加(16)，強(qiáng)烈說明神經(jīng)節(jié)四糖基酰基鞘氨醇的末端二糖也構(gòu)成結(jié)合表位。對(duì)這些乳四糖基?；拾贝己蜕窠?jīng)節(jié)四糖基?；拾贝冀Y(jié)構(gòu)的所有可能最低能量構(gòu)象異構(gòu)體的產(chǎn)生和成對(duì)對(duì)比顯示，至少兩對(duì)構(gòu)象異構(gòu)體導(dǎo)致各自末端二糖結(jié)合表位的同樣表現(xiàn)，說明同樣的細(xì)菌粘附素可能參與這兩種糖鞘脂的結(jié)合。通過觀察幽門螺桿菌只有當(dāng)薄層色譜分析(圖1)中使用其他脂類或膽酸鹽，例如Tween20或脫氧膽鹽時(shí)才結(jié)合乳四糖基?；拾贝?，而這些加入對(duì)神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合僅有有限的影響，這進(jìn)一步表明Glcβ1Cer鍵構(gòu)象的不同(圖13)。因此，在缺乏其他脂類或膽酸鹽時(shí)乳四糖基?；拾贝己芸赡芫哂胁煌趫D13所示的Glcβ1Cer鍵構(gòu)象，圖13中者結(jié)合表位對(duì)于與幽門螺桿菌的結(jié)合而言是不正確存在的。最近已經(jīng)綜述了其他脂類對(duì)糖鞘脂構(gòu)象的類似影響(73)。而且，上文已經(jīng)證實(shí)乳四糖能阻斷幽門螺桿菌與神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝嫉慕Y(jié)合(圖5)，這更支持了這條理由。
可以因此得出結(jié)論，幽門螺桿菌與神經(jīng)節(jié)四糖基?；拾贝嫉腉alβ3GlcNAcβ4表位的結(jié)合應(yīng)被視為乳四糖基酰基鞘氨醇的特異性，且其允許內(nèi)部Gal的4-取代和GlcNAcβ3殘基在4位的軸向取向。
類似物實(shí)例將四糖Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(Isosep，Tullinge，Sweden)和麥芽庚糖(Sigma，Saint Louis，USA)通過氰硼氫化物(Halina Miller-Podraza，將發(fā)表)用4-十六烷基苯胺(縮寫HDA，來(lái)自Aldrich，Stockholm，Sweden)還原胺化。用質(zhì)譜法鑒定產(chǎn)物并確定為Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA和麥芽庚糖(red)-HDA[其中“(red)-”意思是從糖的末端還原性葡萄糖和4-十六烷基苯胺(HDA)的胺基還原胺化形成的胺鍵結(jié)構(gòu)]。在上面描述的TLC-重疊(overlay)分析中化合物Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HAD與幽門螺桿菌的結(jié)合活性與乳四糖基?；拾贝继乔手南嗨?，而對(duì)照結(jié)合物麥芽庚糖(red)-HDA是完全失活的。此例顯示序列Galβ3GlcNAc的一種合成衍生物。它也表明三糖Galβ3GlcNAcβ3Gal是結(jié)合幽門螺桿菌的結(jié)構(gòu)并且在還原末端的葡萄糖對(duì)結(jié)合不是必需的(還原破壞了還原性末端Glc的吡喃環(huán)結(jié)構(gòu))。
表I
*從標(biāo)有*的菌株的細(xì)胞提取表面蛋白并用于結(jié)合分析，如上文“材料和方法”章節(jié)所述表II
表II(續(xù))
a)Galβ3GlcNAc部分有下劃線b)+表示用2ug上樣薄層板所得放射自顯影圖譜中黑色顯著加深之處-表示黑色沒有加深c)B.E.Samuelsson和K.-A.Karlsson，未公開的結(jié)果。
d)通過用無(wú)水肼處理從編號(hào)為2的人胎糞的Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ31Cer產(chǎn)生的3號(hào)糖鞘脂(另作報(bào)道)e)N.Strmberg和K.-A.Karlsson，未公開的結(jié)果。
f)將編號(hào)為7的猴腸與0.05M HCl在80℃保溫2小時(shí)而從Galα3(Fucα2)Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer產(chǎn)生的編號(hào)為8的糖鞘脂表III
a重量以mg為單位b表示為mg/g組織干重參考文獻(xiàn)1.Beachey，E.H.(1981)J.Infect.Dis.143，325-3452.Blaser，M.J.(1990)J.Infect.Dis.161，626-6333.Blaser，M.J.(1992)Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.4(suppl1)，17-194.Mégraud，F(xiàn).and Lamouliatte，H.(1992)Dig.Dis.Sci.37，769-7725.Dooley，C.P.(1993)Curr.op.Gastroenterol.9，112-1176.Eurogast Study Group(1993)Lancet 341，1359-13627.Solnick，J.V.and Tompkins，L.S.(1993)Infect.Agents Dis.1，294-3098.Bode，G.，Malfertheiner，P.and Ditschuneit，H.(1988)Scand.J.Gastroenterol.23(SUppl142)，25-399.Falk，P.，Roth，K.A.，Borén，T.，Westblom，T.U.，Gordon，J.I.and Normark，S.(1993)Proc.，Natl.Acad.Sci.90，2035-203910.Lingwood，C.A.，Huesca，M.and Kuksis，A.(1992)Infect.Immun.60，2470-247411.Gold，B.，Huesca，M.，Sheran，P.and Lingwood，C.A.(1993)INFECT.IMMUN.61，2632-263812.Borén，T.，F(xiàn)alk，P.，R0th，K.A.，Larson，G.andNormark，S.(1993)Science262，1892-189513.Ascencio，F(xiàn).，F(xiàn)tansson，L..and Wadstrm，T.(1993)J.Med.Microbiol.38，240-24414.Saitoh，T.，Natomi，H.，Zhao，W.，Okuzumi，K.，Sugano，K.，Iwamori，M.and 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權(quán)利要求
1.一種能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，包括至少一種具有通式1的化合物 通式1其中R1是H或OH且R2是H或OH，規(guī)定當(dāng)R2是OH時(shí)R1是H，當(dāng)R2是H時(shí)R1是OH；X是單糖或寡糖殘基；Y不存在，或者Y是間隔基團(tuán)或末端結(jié)合物；Z是低價(jià)或多價(jià)的載體或者-H；n是0或1；m是等于或大于1的整數(shù)，或者從幽門螺桿菌方面考慮具有與通式1的化合物相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物。
2.一種能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，包括至少一種具有通式2的化合物 通式2其中X是單糖或寡糖殘基；Y不存在，或者Y是間隔基團(tuán)或末端結(jié)合物；Z是低價(jià)或多價(jià)的載體或者-H；n是0或1；m是等于或大于1的整數(shù)，或者從幽門螺桿菌方面考慮具有與通式1的化合物相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物。
3.一種能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，包括至少一種具有通式3的化合物 通式3其中X是單糖或寡糖殘基；Y不存在，或者Y是間隔基團(tuán)或末端結(jié)合物；Z是低價(jià)或多價(jià)的載體或者-H；n是0或1；m是等于或大于1的整數(shù)，或者從幽門螺桿菌方面考慮具有與通式1的化合物相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物。
4.一種能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其包括Ga1β3GlcNAc或從幽門螺桿菌方面考慮具有與Galβ3GlcNAc相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物。
5.權(quán)利要求4的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其中該Galβ3GlcNAc，或其類似物或衍生物位于該物質(zhì)的非還原末端。
6.權(quán)利要求4的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其由Galβ3GlcNAc，或者從幽門螺桿菌方面考慮具有與Galβ3GlcNAc相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物組成。
7.一種能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其含有Galβ3GalNAc，或者從幽門螺桿菌方面考慮具有與Galβ3GlcNAc相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物。
8.權(quán)利要求7的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其中該Galβ3GalNAc，或其類似物或衍生物位于該物質(zhì)的非還原末端。
9.權(quán)利要求7的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其由Galβ3GalNAc，或者從幽門螺桿菌方面考慮具有與Galβ3GlcNAc相同或更好結(jié)合活性的它們的類似物或衍生物組成。
10.包括乳四糖的權(quán)利要求4或5的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)。
11.由乳四糖組成的權(quán)利要求4或5的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)。
12.權(quán)利要求4或5的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其包括乳四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)。
13.權(quán)利要求4或5的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其由乳四糖基?；拾贝?Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer)組成。
14.權(quán)利要求7或8的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其包括神經(jīng)節(jié)四糖基酰基鞘氨醇(Galβ3GalNAcβ4Galβ4Glcβ1Cer)。
15.由載體組成的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其中權(quán)利要求1-14所述一種或多種物質(zhì)已附著于該載體上。
16.由包含一種或多種權(quán)利要求1-15所述物質(zhì)的微團(tuán)組成的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)。
17.一種能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其包括與一種或多種多糖結(jié)合的權(quán)利要求1-16所述物質(zhì)。
18.權(quán)利要求17的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其中該多糖是多乳糖胺鏈或其結(jié)合物。
19.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，該物質(zhì)是糖脂。
20.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，該物質(zhì)是糖蛋白或新糖蛋白。
21.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，該物質(zhì)是包括至少兩個(gè)寡糖鏈的寡聚分子。
22.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，該物質(zhì)是包括至少三個(gè)寡糖鏈的寡聚分子。
23.一種能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，其包括與一種或多種有效針對(duì)幽門螺桿菌的抗生素共價(jià)結(jié)合的權(quán)利要求1-22所述物質(zhì)。
24.包括權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)的藥用組合物。
25.權(quán)利要求24的藥用組合物，其用于治療幽門螺桿菌的存在所引起的疾病。
26.權(quán)利要求24或25的藥用組合物，其用于治療患者胃腸道中幽門螺桿菌的存在所引起的疾病。
27.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的藥用組合物，其用于治療慢性淺表性胃炎。
28.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的藥用組合物，其用于治療十二指腸潰瘍。
29.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的藥用組合物，其用于治療胃潰瘍。
30.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的藥用組合物，其用于治療胃腺癌。
31.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的藥用組合物，其用于治療人胃的非-霍杰金氏淋巴瘤。
32.權(quán)利要求24或25的藥用組合物，其用于治療肝臟疾病。
33.權(quán)利要求24或25的藥用組合物，其用于治療心臟疾病。
34.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的藥用組合物，其用于治療嬰兒猝死綜合征。
35.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)在制備用于治療因幽門螺桿菌存在所致疾病的藥用組合物中的應(yīng)用。
36.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)在制備用于治療患者胃腸道中幽門螺桿菌的存在所致疾病的藥用組合物中的應(yīng)用。
37.權(quán)利要求35或36的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療慢性淺表性胃炎。
38.權(quán)利要求35或36的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療十二指腸潰瘍。
39.權(quán)利要求35或36的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療胃潰瘍。
40.權(quán)利要求35或36的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療胃腺癌。
41.權(quán)利要求35或36的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療人胃的非-霍杰金氏淋巴瘤。
42.權(quán)利要求35的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療肝臟疾病。
43.權(quán)利要求35的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療心臟疾病。
44.權(quán)利要求35或36的應(yīng)用，其中所述藥用組合物用于治療嬰兒猝死綜合征。
45.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)在抑制幽門螺桿菌的結(jié)合中的應(yīng)用。
46.權(quán)利要求45的物質(zhì)為非醫(yī)療目的而抑制幽門螺桿菌的結(jié)合的應(yīng)用。
47.權(quán)利要求46在分析系統(tǒng)中的應(yīng)用。
48.權(quán)利要求47的應(yīng)用，其中該分析系統(tǒng)用于鑒定其他能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)。
49.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)在鑒定其他能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)時(shí)作為引導(dǎo)化合物的應(yīng)用。
50.包括權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)的食物材料。
51.包括權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)添加劑。
52.權(quán)利要求50的食物材料或權(quán)利要求51的營(yíng)養(yǎng)添加劑，其中所述物質(zhì)是Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc。
53.權(quán)利要求52的食物材料，其為嬰兒配方食品的形式。
54.權(quán)利要求53的食物材料，其中所述Galβ3GlcNAcβ3Galβ4Glc以其0.1-0.5g/l的濃度使用。
55.權(quán)利要求54的食物材料，其中所述濃度是0.05-5g/l。
56.權(quán)利要求50-55中任一項(xiàng)的食物材料或營(yíng)養(yǎng)添加劑在抑制幽門螺桿菌結(jié)合中的應(yīng)用。
57.治療由于患者體內(nèi)存在幽門螺桿菌而引起的疾病的方法，其中給予患者藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)。
58.治療由于患者體內(nèi)存在幽門螺桿菌而引起的疾病的方法，其中給予患者權(quán)利要求50-55中任一項(xiàng)的食物材料。
59.權(quán)利要求57或58的方法，其中所述疾病是該患者胃腸道中存在幽門螺桿菌所致。
60.用于治療慢性淺表性胃炎的權(quán)利要求57或58的方法。
61.用于治療十二指腸潰瘍的權(quán)利要求57或58的方法。
62.用于治療胃潰瘍的權(quán)利要求57或58的方法。
63.用于治療胃腺癌的權(quán)利要求57或58的方法。
64.用于治療人胃的非-霍杰金氏淋巴瘤的權(quán)利要求57或58的方法。
65.用于治療肝臟疾病的權(quán)利要求57或58的方法。
66.用于治療心臟疾病的權(quán)利要求57或58的方法。
67.用于治療嬰兒猝死綜合征的權(quán)利要求57或58的方法。
68.權(quán)利要求2，4-6，或10-13中任一項(xiàng)的物質(zhì)用于細(xì)菌粘附素鑒定的應(yīng)用。
69.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求68鑒定的物質(zhì)用于制備抗幽門螺桿菌疫苗的用途。
70.通過使用權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求68鑒定的物質(zhì)生產(chǎn)的抗幽門螺桿菌感染的疫苗。
71.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)在診斷由于幽門螺桿菌感染引起疾病中的用途。
72.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的物質(zhì)在幽門螺桿菌分型中的用途。
全文摘要
本發(fā)明描述了包含Galβ3GlcNAc和Galβ3GalNAc的能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)，以及它們?cè)谒幱媒M合物和食物材料中的應(yīng)用，和用于治療因幽門螺桿菌存在所致的疾病的方法。也描述了該物質(zhì)用于鑒定細(xì)菌粘附，用于產(chǎn)生針對(duì)幽門螺桿菌的疫苗，用于診斷幽門螺桿菌感染，用于幽門螺桿菌分型，用于鑒定能結(jié)合幽門螺桿菌的物質(zhì)和用于抑制幽門螺桿菌結(jié)合的用途。
文檔編號(hào)A61K31/7028GK1411376SQ0081729
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2000年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月15日
發(fā)明者卡爾-安德斯·卡爾森, 艾琳·倫納德森, 蘇珊·特尼伯格, 喬納斯·安格斯特羅姆 申請(qǐng)人:A+科學(xué)投資公司