專利名稱：粘膜炎莫拉氏菌basb114多肽抗原及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸(本文中稱“BASB114多核苷酸”)、它們編碼的多肽(本文中稱“BASB114”或“BASB114多肽”)、重組物質(zhì)以及它們的制備方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用這種多肽和多核苷酸包括抵抗細(xì)菌感染的疫苗的方法。再一方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)某些病原體感染的診斷試驗(yàn)。
背景技術(shù)：
粘膜炎莫拉氏菌(粘膜炎布蘭漢氏球菌)是一種能經(jīng)常從人的上呼吸道分離到的革蘭氏陰性細(xì)菌。它導(dǎo)致幾種疾病，主要是嬰幼兒中耳炎和老年人肺炎。它也引起鼻竇炎和醫(yī)院內(nèi)感染，偶爾還會(huì)引起侵襲性疾病。
中耳炎從病例數(shù)量和其后遺癥來講是重要的兒童疾病。在美國(guó)年發(fā)病350萬例以上，據(jù)估計(jì)80％的兒童在3歲之前會(huì)罹患中耳炎至少一次(Klein，JO(1994)Clin.Inf.Dis.，19823)。如未得到治療或轉(zhuǎn)為慢性，會(huì)導(dǎo)致暫時(shí)(中耳積液時(shí))或永久(聽神經(jīng)損害)的聽力喪失。在嬰兒中，這種聽力喪失會(huì)導(dǎo)致說話延遲。
從患有中耳炎的兒童中耳分離的菌株主要有三種肺炎鏈球菌、非典型性流感嗜血桿菌(NTHi)和粘膜炎莫拉氏菌。它們?cè)?0％到90％的病例中存在。近期研究表明，中耳炎病例中，肺炎鏈球菌和非典型性流感嗜血桿菌均占約30％，粘膜炎莫拉氏菌約占15％(Mruphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。從中耳中也可分離到其它細(xì)菌(B型流感嗜血桿菌、釀膿鏈球菌等)，但頻度低得多(2％或更低)。
流行病數(shù)據(jù)顯示，中耳中發(fā)現(xiàn)的病原體引起中耳炎必需首先定居在上呼吸道；但是，發(fā)病還必需有其它因素(Dickinson，DP et al.(1988)J.Infect.Dis.，158205，F(xiàn)aden，HL et al.，(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100612)。這對(duì)引起細(xì)菌經(jīng)咽鼓管遷移到中耳然后開始炎癥至關(guān)重要。這些因素迄今仍不清楚。據(jù)推測(cè)，諸如病毒感染后免疫系統(tǒng)暫時(shí)性異?？赡芤鸩荒芸刂坪粑蓝ň?Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.1691312)。另一種解釋是，暴露于環(huán)境因素之下使某些兒童中更為重要的定居得以發(fā)生，而這些兒童因?yàn)橹卸谐掷m(xù)存在病原體而對(duì)中耳炎更為敏感(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。
對(duì)粘膜炎莫拉氏菌的免疫應(yīng)答知之甚少。按時(shí)從0到2歲的幼兒鼻咽分離的菌株的分析表明，他們經(jīng)常獲得和清除新菌株。這表明在細(xì)菌定居的兒童中建立了針對(duì)該細(xì)菌的有效免疫應(yīng)答(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.1691312)。
在大部分測(cè)試的成人中鑒定到了殺菌抗體(Chapman，AJ et al.(1985)J.Infect.Dis.151878)。粘膜炎莫拉氏菌不同菌株抵抗血清殺菌活性的能力存在差異一般，從患病個(gè)體中分離的菌株較僅僅攜帶該細(xì)菌的個(gè)體分離的菌株的抗性更強(qiáng)(Hol，C et al(1993)Lancet3411281，Jordan，KL et al.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)23S)。血清抗性因此可以被認(rèn)為是細(xì)菌毒力因子。中耳炎病愈后的兒童血清中可以見到調(diào)理活性。
除了OMP B1、UspA1和UspA2(Chen D.et al.(1999)，Infect.Immuno.671310)外，人體中這些不同的免疫應(yīng)答針對(duì)的抗原尚未鑒定，OMP B1是一種84kDa的蛋白，其表達(dá)受鐵調(diào)控，可以被肺炎患者血清識(shí)別(Sethi，S，et al.(1995)Infect.Immuno.631516)。
粘膜炎莫拉氏菌表面存在的一些其它膜蛋白已經(jīng)使用生化方法鑒定，或者揭示了他們?cè)谡T導(dǎo)保護(hù)性免疫中的潛在意義(綜述見Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。在小鼠肺炎模型中，針對(duì)其中的一些成員(UspA，copB)的抗體的存在有利于迅速清除肺炎感染。另一種多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守，與銅綠假單胞菌的孔蛋白具有同源性，而后者已被證實(shí)對(duì)動(dòng)物模型中的該細(xì)菌有效。
在過去幾十年中，粘膜炎莫拉氏菌的發(fā)病率有了很大的提高。這已被歸咎為多重抗生素抗性菌株的出現(xiàn)和具有較弱的免疫系統(tǒng)的人群體的增加。分離到對(duì)某些或所有標(biāo)準(zhǔn)抗生素具有抗性的菌株已不再鮮見。這種現(xiàn)象就使我們產(chǎn)生了針對(duì)這種微生物的新型抗微生物試劑、疫苗、藥物篩選方法和診斷試驗(yàn)的永不滿足的需求。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及BASB114特別是BASB114多肽和BASB114多核苷酸、重組物質(zhì)以及它們的制備方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及使用這種多肽和多核苷酸的方法，包括微生物疾病的預(yù)防與治療及其他。在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)與微生物感染有關(guān)的疾病及與這樣的感染有關(guān)的癥狀的診斷試驗(yàn)，例如檢測(cè)BASB114多核苷酸或多肽的表達(dá)或活性的試驗(yàn)。
通過閱讀下面的描述和本公開的其他部分，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易理解在本發(fā)明公開的精神和范圍之內(nèi)的各種改變和修飾。
發(fā)明詳述如下文的詳細(xì)介紹，本發(fā)明涉及BASB114多肽和多核苷酸。具體地說，本發(fā)明涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB114的多肽和多核苷酸，根據(jù)氨基酸序列同源性它與大腸桿菌外膜脂蛋白(NlpE)相關(guān)。本發(fā)明尤其涉及具有分別列于SEQ ID NO1或3和SEQ ID NO2或4的核苷酸和氨基酸序列的BASB114。應(yīng)當(dāng)理解，在后面的序列表中列舉為“DNA”的序列代表本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的舉例，因?yàn)槠胀ǖ募夹g(shù)人員知道，這樣的序列通常被用作多核苷酸，包括多核糖核苷酸。多肽在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了在這里被稱為“BASB114”和“BASB114多肽”的粘膜炎莫拉氏菌的多肽，及其在生物學(xué)、診斷、預(yù)防、臨床或治療上有用的變體，以及含有它們的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供(a)含有這樣一種氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列與SEQ IDNO2或4的氨基酸序列至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；(b)由含有如下一種多核苷酸序列的分離多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸序列分別與SEQ ID NO1或3的整個(gè)長(zhǎng)度具有至少85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；或者(c)由含有如下一種多核苷酸序列的分離多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸序列編碼這樣一種多肽，這種多肽與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；SEQ ID NO2或4中提供的BASB114多肽是來自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC 43617)的BASB114多肽。
本發(fā)明還提供BASB114多肽的一種免疫原性片段，即BASB114多肽的一個(gè)連續(xù)的部分，它與含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是說，該片段(必要時(shí)可與一種載體偶聯(lián))能夠產(chǎn)生能識(shí)別BASB114多肽的免疫應(yīng)答。這種免疫原性片段可包括諸如缺少N-末端前導(dǎo)序列和/或跨膜區(qū)域和/或C-末端錨定區(qū)域的BASB114多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的BASB114的免疫原性片段包含基本上一種多肽的所有胞外結(jié)構(gòu)域，其中該多肽與SEQ ID NO2或4在SEQ ID NO2或4的整個(gè)長(zhǎng)度上至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性。
片段是這樣一種多肽，它具有與本發(fā)明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分而不是全部完全相同的氨基酸序列。就BASB114多肽而言，片段可以是“獨(dú)立存在”，或處于一個(gè)較大的多肽中，在一個(gè)單獨(dú)的較大多肽中組成一個(gè)部分或區(qū)域，優(yōu)選是一種單個(gè)的連續(xù)區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，諸如具有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的一個(gè)部分的截短的多肽或其變體，例如包括氨基末端和或羧基末端氨基酸序列的連續(xù)殘基系列。用或在一種宿主細(xì)胞中制備的本發(fā)明的多肽的降解形式也是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是具有結(jié)構(gòu)或功能特征的片段，例如含有α螺旋和α螺旋形成區(qū)域、β折疊和β折疊形成區(qū)域、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)域、線團(tuán)和線團(tuán)形成區(qū)域、親水區(qū)域、疏水區(qū)域、α兩親性區(qū)域、β兩親性區(qū)域、柔性區(qū)域、表面形成區(qū)域、底物結(jié)合區(qū)域和高抗原性區(qū)域的片段。
更優(yōu)選的片段包括含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列具有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100個(gè)連續(xù)氨基酸；或含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列具有從SEQ ID NO2或4的氨基酸序列截短或缺失的至少15、20、30、40、50或100個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明的多肽片段可用于通過肽合成制備相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此，這些片段可用作制備本發(fā)明的全長(zhǎng)多肽的中間體。
特別優(yōu)選的是變體，其中以任何組合方式取代、缺失或添加了幾個(gè)、5-10、1-5、1-3、1-2或1個(gè)氨基酸。
本發(fā)明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是一種較大蛋白如前體或融合蛋白的一部分。通常優(yōu)選包含含有分泌或前導(dǎo)序列、前序列、能協(xié)助純化的序列如多組氨酸殘基，或能在重組制備過程中起穩(wěn)定作用的額外序列。而且，還考慮加入外源性多肽或脂類尾巴或多核苷酸序列以增加最終分子的免疫原性能力。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及遺傳工程制備的可溶性融合蛋白，這種融合蛋白含有本發(fā)明的一種多肽或其片段以及各亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的是，免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1的恒定區(qū)部分，而融合發(fā)生在鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可簡(jiǎn)單地通過引入一個(gè)切割序列而去除，這種切割序列可用血凝因子Xa切割。
而且，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，以及涉及它們?cè)谒幬锖Y選、診斷和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面還涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可在國(guó)際專利申請(qǐng)Nos.WO94/29458和WO94/22914中發(fā)現(xiàn)。
蛋白質(zhì)可通過化學(xué)方法接合，或以重組融合蛋白的形式表達(dá)，這種融合蛋白形式能比非融合蛋白在一種表達(dá)系統(tǒng)以較高水平制備。融合配體可幫助提供T輔助表位(免疫性融合配體)，優(yōu)選的是能被人識(shí)別的T輔助表位；或者能幫助蛋白比原來的重組蛋白以較高產(chǎn)量進(jìn)行表達(dá)的T輔助表位(表達(dá)增強(qiáng)子)。融合配體優(yōu)選既是一種免疫性融合配體，又是表達(dá)增強(qiáng)子配體。
融合配體包括來自流感嗜血桿菌的蛋白D和來自流感病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1(血凝素)。另一種融合配體是被稱為L(zhǎng)ytA的蛋白。優(yōu)選使用該分子的C末端部分。LytA來自肺炎鏈球菌，它合成一種N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶---LytA酰胺酶(由lytA基因編碼{《基因》43(1986)265-272頁})，后者是一種自溶素，它特異性地降解肽聚糖骨架中的某些鍵。LytA蛋白的C末端區(qū)域負(fù)責(zé)與膽堿或某些膽堿類似物如DEAE的親和性。這種特性已被用于發(fā)展能用于融合蛋白表達(dá)的大腸桿菌C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。在其氨基端含有C-LytA片段的雜合蛋白的純化已經(jīng)有介紹{《生物技術(shù)》10卷(1992)795-798頁}?？梢允褂肔ytA分子中在C末端發(fā)現(xiàn)的重復(fù)部分，從殘基178開始，例如殘基188-305。
本發(fā)明還包括前面提到的多肽的變體，即通過保守性氨基酸取代與參照物不同的多肽，其中一種殘基被另一種具有相似特征的殘基取代。典型的這種取代在如下氨基酸之間Ala、Val、Leu和Ile；Ser和Thr；酸性殘基Asp和Glu；Asn和Gln；堿性殘基Lys和Arg；或芳族殘基Phe和Tyr。
本發(fā)明的多肽可以任何合適的方式進(jìn)行制備。這種多肽包括分離的天然產(chǎn)生的多肽、重組制備的多肽、合成制備的多肽、或用這些方法的組合制備的多肽。制備這種多肽的方法在本領(lǐng)域是熟知的。
本發(fā)明的多肽更優(yōu)選來自粘膜炎莫拉氏菌，但它也優(yōu)選可獲自相同分類學(xué)屬的其他生物體。本發(fā)明的多肽還可獲自諸如相同分類學(xué)科或目的生物體。多核苷酸本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼BASB114多肽的多核苷酸，特別是編碼這里被稱為BASB114的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸包含一個(gè)編碼BASB114多肽的區(qū)域，該區(qū)域包含一個(gè)列于SEQ ID NO1或3的序列，它包括一個(gè)全長(zhǎng)的基因或其變體。
SEQ ID NO1或3中提供的BASB114多核苷酸是來自粘膜炎莫拉氏菌菌株Mc2931(ATCC 43617)的BASB114多核苷酸。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了編碼和/或表達(dá)BASB114多肽和多核苷酸特別是粘膜炎莫拉氏菌的BASB114多肽和多核苷酸的分離核酸分子，包括諸如未加工的RNAs、核酶RNAs、mRNAs、cDNAs、基因組DNAs、B-和Z-DNAs。本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案包括在生物性、診斷性、預(yù)防性、臨床或治療性有用的多核苷酸和多肽以及含有它們的組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及至少包括一個(gè)全長(zhǎng)基因的分離多核苷酸，該基因編碼一種具有SEQ ID NO2或4的推定氨基酸序列的BASB114，以及與其密切相關(guān)的多核苷酸及其變體。
在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了一種來自粘膜炎莫拉氏菌的BASB114多肽，它包括或由SEQ ID NO2或4的氨基酸序列或其變體組成。
使用這里提供的信息，例如SEQ ID NO1或3列出的多核苷酸序列，本發(fā)明的編碼BASB114多肽的多核苷酸可使用標(biāo)準(zhǔn)的克隆和篩選方法獲得，例如使用那些用于從細(xì)菌中克隆和測(cè)序染色體DNA片段的方法以粘膜炎莫拉氏菌作為起始物質(zhì)，接著獲得一個(gè)全長(zhǎng)克隆。例如，為獲得本發(fā)明的一種多核苷酸序列，例如SEQ ID NO1或3中給出的多核苷酸序列，通常使用一種來自部分序列的放射性標(biāo)記的寡核苷酸，優(yōu)選17-mer或更長(zhǎng)，對(duì)大腸桿菌或其他合適宿主中的粘膜炎莫拉氏菌的染色體DNA克隆文庫進(jìn)行篩選。攜帶與探針相同DNA的克隆接著用嚴(yán)緊雜交條件進(jìn)行區(qū)分。通過用根據(jù)原來的多肽或多核苷酸序列設(shè)計(jì)的測(cè)序引物對(duì)這樣用雜交方法鑒定的單個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，就有可能在兩個(gè)方向延伸多核苷酸序列，從而確定全長(zhǎng)的基因序列。這種測(cè)序常規(guī)使用諸如由質(zhì)?？寺≈苽涞淖冃缘碾p鏈DNA來進(jìn)行。合適的技術(shù)見Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)。(具體見雜交篩選1.90和變性雙鏈DNA模板測(cè)序13.70)。也可應(yīng)用直接的基因組DNA測(cè)序來獲得全長(zhǎng)的基因序列。為說明本發(fā)明，SEQ ID NO1或3列出的每個(gè)多核苷酸都從來自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文庫中發(fā)現(xiàn)。
而且，SEQ ID NO1或3中列出的每個(gè)DNA序列都含有一個(gè)編碼如下蛋白的開放閱讀框，該蛋白含有SEQ ID NO2或4中列出的氨基酸殘基數(shù)目，其推導(dǎo)的分子量可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的氨基酸殘基的分子量數(shù)值進(jìn)行計(jì)算。
SEQ ID NO1的多核苷酸位于SEQ ID NO1的起始密碼子的核苷酸1和從核苷酸508開始的終止密碼子之間，編碼SEQ ID NO2的多肽。
SEQ ID NO3的多核苷酸位于SEQ ID NO1的起始密碼子的核苷酸1和從核苷酸505開始的末位密碼子之間，編碼SEQ ID NO4的多肽。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，該核苷酸包括或由以下組成(a)一種多核苷酸序列，它與SEQ ID NO1或3分別在SEQ ID NO1或3的整個(gè)長(zhǎng)度上至少有85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，最優(yōu)選至少97-99％的同一性或完全相同；或(b)一種編碼一種多肽的多核苷酸序列，該多肽與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2或4的整個(gè)長(zhǎng)度上具有至少85％的同一性，更優(yōu)選至少90％的同一性，更優(yōu)選至少95％的同一性，更優(yōu)選至少97-99％的同一性或100％完全相同。
編碼本發(fā)明的一種多肽的多核苷酸，包括來自除粘膜炎莫拉氏菌以外的種類的同源物或同源進(jìn)化物，可通過一種包括以下步驟的方法來獲得在嚴(yán)緊雜交條件下(例如使用45-65℃的溫度范圍，SDS的濃度為0.1-1％)用一種標(biāo)記的或可檢測(cè)的探針對(duì)合適的文庫進(jìn)行篩選，其中探針包含或由SEQ ID NO1或3的序列或其一個(gè)片段組成，并分離含有所說多核苷酸序列的全長(zhǎng)基因和/或基因組克隆。
本發(fā)明提供一種在其整個(gè)長(zhǎng)度上與SEQ ID NO1或3的編碼序列(開放閱讀框)相同的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供單獨(dú)的成熟多肽或其片段的編碼序列以及與另一個(gè)編碼序列在一個(gè)閱讀框內(nèi)的成熟多肽或其片段的編碼序列，另一個(gè)編碼序列的例子為編碼一種前導(dǎo)或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白的序列。本發(fā)明的多核苷酸也可含有至少一種非編碼序列，包括但不限于，諸如至少一種非編碼的5’和3’序列，例如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列、終止信號(hào)(例如rho-依賴和非rho-依賴的終止信號(hào))、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Kozak序列、穩(wěn)定mRNA的序列、內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號(hào)。多核苷酸序列也可包含編碼額外氨基酸的額外編碼序列。例如，可以編碼一種能促進(jìn)融合多肽純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是一種6組氨酸肽，由pQE載體提供(Qiagen，Inc.)，見Gentz等《美國(guó)科學(xué)院院刊》86821-824，(1989)中的介紹；或是一種HA肽尾巴(Wilson等，《細(xì)胞》37767(1984)；兩種標(biāo)記序列都可用于純化與它們?nèi)诤系亩嚯?。本發(fā)明的多核苷酸還包括但不限于，包含一種結(jié)構(gòu)基因和其天然相連的控制基因表達(dá)的序列。
編碼SEQ ID NO2或4的BASB114多肽的核苷酸序列可以與SEQID NO1或3的核苷酸1至828所含的多肽編碼序列相同。另外，它可以是這樣一種序列，即由于遺傳密碼豐余(簡(jiǎn)并性)也編碼SEQ IDNO2或4的多肽。
用于此處，“編碼一種多肽的多核苷酸”一詞涉及包括一種編碼本發(fā)明的多肽的序列的多核苷酸，本發(fā)明的多肽具體說是一種細(xì)菌多肽，更具體說是粘膜炎莫拉氏菌BASB114多肽，它具有SEQ ID NO2或4所列的氨基酸序列。該詞還涉及這樣一種多核苷酸，它包括編碼該肽的一個(gè)單一的連續(xù)區(qū)域或非連續(xù)區(qū)域(例如被整合的噬菌體、整合的插入序列、整合的載體序列、整合的轉(zhuǎn)座子序列或因RNA編輯或基因組DNA重排所打斷的多核苷酸)以及另外的區(qū)域，這種另外的區(qū)域也可含有編碼和/或非編碼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及這里介紹的多核苷酸的變體，這種變體能編碼具有SEQ ID NO2或4的推定氨基酸序列的多肽的變體。本發(fā)明的多核苷酸的片段可用于諸如合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
更加特別優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼BASB114變體的多核苷酸，該變體具有在SEQ ID NO2或4中幾個(gè)、少數(shù)、5至10、1至5、1至3、2、1或沒有氨基酸被以任何組合方式取代、修飾、缺失和/或添加的BASB114多肽的氨基酸序列。在它們中尤其優(yōu)選的是并不改變BASB114多肽的特性和活性的沉默取代、添加和缺失。
本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案是與編碼具有SEQ ID NO2或4列出的氨基酸序列的BASB114多肽的多核苷酸在其整個(gè)長(zhǎng)度上至少有85％相同的多核苷酸；以及與這種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。就此而言，特別優(yōu)選的是在整個(gè)長(zhǎng)度上至少有90％的同一性的多核苷酸，而在這些特別優(yōu)選多核苷酸中，至少有95％的同一性的多核苷酸更為優(yōu)選，而且在這些至少有95％的同一性的多核苷酸中，至少有97％相同的多核苷酸更優(yōu)選，同樣在它們中，至少有98％和至少有99％相同的多核苷酸尤其更加優(yōu)選，其中至少有99％相同的多核苷酸更優(yōu)選。
優(yōu)選的實(shí)施方案是編碼基本上保留了SEQ ID NO1或3的DNA編碼的成熟多肽的相同生物功能或活性的多肽的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的特定優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明提供能與BASB114多核苷酸序列例如SEQ ID NO1或3的多核苷酸序列雜交，尤其是在嚴(yán)緊條件下雜交的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及能與這里提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列。就此而言，本發(fā)明特別涉及能在嚴(yán)緊條件下與這里介紹的多核苷酸雜交的多核苷酸。用于此處，“嚴(yán)緊條件”和“嚴(yán)緊雜交條件”的意思是雜交只發(fā)生在序列之間至少有95％優(yōu)選至少有97％相同時(shí)。嚴(yán)緊雜交條件的一個(gè)具體例子是在42℃在一種溶液中溫育過夜，該溶液包括50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml的變性剪切鮭精DNA，接著在0.1x SSC中在約65℃時(shí)洗滌雜交支持物。雜交和洗滌條件是眾所周知的，并在Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)中特別是11章中舉例。溶液雜交也可用本發(fā)明提供的多核苷酸序列進(jìn)行。
本發(fā)明還提供含有或由這樣一種多核苷酸序列組成的多核苷酸，該多核苷酸序列通過用一種探針在嚴(yán)緊雜交條件下篩選一種合適的文庫并分離所述多核苷酸序列來獲得，其中文庫含有SEQ ID NO1或3列出的多核苷酸序列的完整基因，而探針具有SEQ ID NO1或3列出的所說多核苷酸序列的序列?？捎糜讷@得這樣一種多核苷酸的片段包括諸如本文的其他部分詳細(xì)介紹的探針和引物。
如本發(fā)明在這里的其他部分對(duì)多核苷酸試驗(yàn)的討論，例如，本發(fā)明的多核苷酸可用作RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針來分離編碼BASB114的全長(zhǎng)cDNAs和基因組克隆，并分離與BASB114基因具有高同一性特別是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因組克隆。這種探針一般具有至少15個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)，這種探針優(yōu)選具有至少30個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)，也可具有至少50個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。特別優(yōu)選的探針具有至少20個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)，并少于至少30個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。
BASB114基因的編碼區(qū)可通過使用SEQ ID NO1或3提供的DNA序列合成一種寡核苷酸探針進(jìn)行篩選來分離。然后使用與本發(fā)明的基因序列互補(bǔ)的標(biāo)記寡核苷酸篩選一種cDNA、基因組DNA或mRNA文庫，來確定該探針雜交的文庫成員。
對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，有幾種方法是可以使用和熟知的，可以用來獲得全長(zhǎng)DNAs或延伸短的DNAs，例如以cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法為基礎(chǔ)的方法(見諸如Frohman等，《美國(guó)科學(xué)院院刊》858998-9002，1988)。這種技術(shù)的最近修改，例如MarathonTM技術(shù)(Clontech Laboratories Inc.)，明顯簡(jiǎn)化了對(duì)較長(zhǎng)cDNAs的尋找。在MarathonTM技術(shù)中，cDNAs用從一種選擇的組織中抽提的mRNA制備，并在每個(gè)末端連上一種“接頭”。然后使用基因特異的和接頭特異的寡核苷酸組合進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)來擴(kuò)增“丟失”的DNA的5’末端。然后使用“巢式”引物重復(fù)PCR反應(yīng)，巢式引物即設(shè)計(jì)來與擴(kuò)增產(chǎn)物的內(nèi)部退火的引物(通常為與接頭序列的3’退火的一種接頭特異性引物和與所選擇的基因序列的5’退火的一種基因特異性引物)。然后用DNA測(cè)序?qū)υ摲磻?yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過將產(chǎn)物直接與已有的DNA連接產(chǎn)生一個(gè)完整的序列，或者使用設(shè)計(jì)5’引物的新序列信息進(jìn)行一個(gè)單獨(dú)的全長(zhǎng)PCR，來構(gòu)建一個(gè)全長(zhǎng)的DNA。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可用作諸如發(fā)現(xiàn)疾病特別是人疾病的治療和診斷的研究試劑和物質(zhì)，如同這里與多核苷酸試驗(yàn)有關(guān)的討論。
本發(fā)明的多核苷酸是衍生自SEQ ID NO1或3序列的寡核苷酸，它們可用于這里介紹的方法，但更優(yōu)選用于PCR，用來確定這里鑒定的多核苷酸是否全部或部分能在細(xì)菌或感染組織中轉(zhuǎn)錄。應(yīng)當(dāng)理解，這種序列也可用于診斷感染的階段和所獲得病原體的感染類型。
本發(fā)明也提供編碼這樣一種多肽的多核苷酸，這種多肽是一種成熟蛋白加上另外的氨基或羧基末端氨基酸、或成熟多肽內(nèi)部的氨基酸(例如，當(dāng)成熟形式含有一個(gè)以上的多肽鏈時(shí))。這種序列可在將一種蛋白從前體加工成成熟形式時(shí)起作用，可允許蛋白運(yùn)輸，可延長(zhǎng)或縮短蛋白的半壽期，或可便于蛋白用于試驗(yàn)或制備時(shí)的操作。通常在體內(nèi)時(shí)，另外的氨基酸可通過細(xì)胞酶從成熟蛋白上加工除去。
對(duì)于本發(fā)明的每一種和所有的多核苷酸，都提供一種與之互補(bǔ)的多核苷酸。這些互補(bǔ)多核苷酸優(yōu)選與它們互補(bǔ)的每一種多核苷酸完全互補(bǔ)。
一種含有多肽的成熟形式與一種或多種原序列融合的前體蛋白可能是該多肽的無活性形式。當(dāng)除去原序列時(shí)，這種無活性的前體一般被激活。在活化前，一些或所有的原序列可被除去。這種前體一般被稱為蛋白原。
核苷酸除了用標(biāo)準(zhǔn)的A、G、C、T/U表示外，“N”也可用來描述本發(fā)明的特定多核苷酸?！癗”指4種DNA或RNA核苷酸的任何一個(gè)都可出現(xiàn)在DNA或RNA序列的該指定位點(diǎn)，但優(yōu)選N不是一種核酸，當(dāng)它與相鄰的核苷酸位置組合在一起，當(dāng)按正確的閱讀框閱讀時(shí)，在該閱讀框中產(chǎn)生一種成熟前的終止密碼子。
總而言之，本發(fā)明的多核苷酸可編碼一種成熟蛋白、一種成熟蛋白加一種前導(dǎo)序列(它可被稱為一種前蛋白)、含有一種或多種非前蛋白的前導(dǎo)序列的原序列的成熟蛋白的前體、或原蛋白的前體前原蛋白，其具有一種前導(dǎo)序列和一種或多種原序列，它們通常在產(chǎn)生多肽的活性和成熟形式的加工過程中被除去。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供本發(fā)明的多核苷酸在治療性或預(yù)防性目的特別是遺傳免疫方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的多核苷酸在遺傳免疫方面的應(yīng)用優(yōu)選使用一種合適的傳遞方法，例如直接將質(zhì)粒DNA注射進(jìn)肌肉(Wolff等《人類分子遺傳學(xué)》(1992)1363，Manthorpe等，《人類基因治療》(1983)4419)；將DNA與特異性蛋白載體復(fù)合后進(jìn)行傳遞(Wu等，《生物化學(xué)雜志》(1989)26416985)，將DNA與磷酸鈣共沉淀(Benvenisty&Reshef，《美國(guó)科學(xué)院院刊》(1986)839551)；將DNA用各種形式的脂質(zhì)體包裹(Kaneda等，《科學(xué)》(1989)243375)；粒子轟擊(Tang等，《自然》(1992)356152，Eisenbraun等《DNA與細(xì)胞生物學(xué)》(1993)12791)以及使用克隆的逆轉(zhuǎn)錄載體進(jìn)行體內(nèi)感染(Seeger等，《美國(guó)科學(xué)院院刊》815949)。載體、宿主細(xì)胞、表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的載體、用本發(fā)明的載體進(jìn)行了遺傳工程改造的宿主細(xì)胞以及通過重組技術(shù)制備本發(fā)明的多肽。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可用于使用來自本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)物的RNAs制備這樣的蛋白。
本發(fā)明的重組多肽可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法由含有表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程宿主細(xì)胞進(jìn)行制備。因此，在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)、用這種表達(dá)系統(tǒng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞以及用重組技術(shù)制備本發(fā)明的多肽。
為進(jìn)行本發(fā)明的多肽的重組制備，宿主細(xì)胞可通過遺傳工程改造來整合表達(dá)系統(tǒng)或其部分或本發(fā)明的多核苷酸。將多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可通過多種標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)介紹的方法來完成，例如Davis等《分子生物學(xué)基本方法》(1986)和Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、載體轉(zhuǎn)染(transvection)、顯微注射、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、劃痕接種、轟擊導(dǎo)入和感染。
合適宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞如鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、大腸桿菌、鏈霉菌、藍(lán)細(xì)菌、枯草芽孢桿菌、粘膜炎莫拉氏菌、流感嗜血桿菌和粘膜炎莫拉氏菌的細(xì)胞；真菌細(xì)胞如克魯維氏酵母、糖酵母等酵母、白色假絲酵母和曲霉等擔(dān)子菌的細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2和草地夜蛾Sf9的細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞如裸子植物或被子植物的細(xì)胞。
多種表達(dá)系統(tǒng)可用于制備本發(fā)明的多肽。這種載體包括染色體型、游離型、病毒型衍生載體，例如由細(xì)菌質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母游離體、插入元件、酵母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病毒、微小RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和甲型病毒衍生的載體或由它們的組合物衍生的載體，例如由質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件衍生的載體，如粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)物可含有調(diào)節(jié)以及引起表達(dá)的控制區(qū)域。就這個(gè)方面一般來說，任何適合于維持、增殖或表達(dá)多核苷酸和/或在一種宿主中表達(dá)一種多肽的系統(tǒng)或載體都可用于表達(dá)。合適的DNA序列可通過任何熟知的和常規(guī)的技術(shù)插入到表達(dá)系統(tǒng)中，例如Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(上文)中列出的技術(shù)。
在真核細(xì)胞重組表達(dá)系統(tǒng)中，為使翻譯蛋白分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)層中、周質(zhì)間或胞外環(huán)境中，可將合適的分泌信號(hào)整合到表達(dá)的多肽中。這些信號(hào)對(duì)多肽來說可以是內(nèi)源性的，或者也可以是異源性的。
本發(fā)明的多肽可通過熟知的技術(shù)從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，這些技術(shù)包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。更優(yōu)選將金屬離子親和層析(IMAC)用于純化。熟知的用于蛋白重新折疊的技術(shù)可用于當(dāng)多肽在胞內(nèi)合成、分離和/或純化過程中變性時(shí)活性構(gòu)象的再生。
表達(dá)系統(tǒng)也可是一種重組的活微生物，例如一種病毒或細(xì)菌。目標(biāo)基因可插入到活的重組病毒或細(xì)菌的基因組中。接種和體內(nèi)感染這種活的載體將導(dǎo)致抗原的體內(nèi)表達(dá)和免疫應(yīng)答誘導(dǎo)。用于此目的的病毒和細(xì)菌是諸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金絲雀禽痘病毒)、甲病毒(辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒)、腺病毒、腺伴隨病毒、微小RNA病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒)、皰疹病毒(水痘帶狀皰疹病毒等)、李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、奈瑟氏菌、BCG。這些病毒和細(xì)菌可以是毒性的、或用各種方法減毒來獲得一種活疫苗。這種活疫苗也是本發(fā)明的一個(gè)部分。
診斷、預(yù)測(cè)、血清分型和突變?cè)囼?yàn)本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的BASB114多核苷酸和多肽用作診斷試劑。在真核細(xì)胞特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤其是人細(xì)胞中檢測(cè)BASB114多核苷酸和/或多肽可為診斷疾病、疾病階段或感染生物體對(duì)藥物的應(yīng)答提供一種診斷方法。真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞，特別是那些感染或懷疑感染了含有BASB114基因或蛋白的生物體的細(xì)胞，可在核酸或氨基酸水平通過多種熟知的技術(shù)以及這里提供的方法進(jìn)行檢測(cè)。
用于預(yù)測(cè)、診斷或其他分析的多肽和多核苷酸可獲自假定感染和/或感染個(gè)體的機(jī)體物質(zhì)。來自任何這些來源的多核苷酸尤其是DNA或RNA可直接用于檢測(cè)，或者可在分析前使用PCR或其他任何擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA特別是mRNA、cDNA和基因組DNA也可以相同方式使用。使用擴(kuò)增方法，通過對(duì)生物體的所選多核苷酸的基因型進(jìn)行分析，可對(duì)感染性或個(gè)體中存在的定居生物體的種類和菌株進(jìn)行鑒定。缺失和插入可通過擴(kuò)增產(chǎn)物與一種選自相關(guān)生物體的參考序列的基因型相比的大小變化進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選與相同屬的不同種或相同種的不同株進(jìn)行比較。點(diǎn)突變可通過將擴(kuò)增DNA與標(biāo)記的BASB114多核苷酸序列進(jìn)行雜交來鑒定。對(duì)于DNA或RNA來說，通過DNase或RNase消化分別可將非常或明顯匹配的序列與匹配不佳或明顯錯(cuò)配的雙體區(qū)分開來，或者通過檢測(cè)融解溫度或復(fù)性動(dòng)力學(xué)的差異進(jìn)行區(qū)分。多核苷酸序列差異也可通過多核苷酸片段在凝膠中與一種參考序列相比的電泳遷移的改變來檢測(cè)。這可使用或不使用變性試劑。多核苷酸差異也可通過直接的DNA或RNA測(cè)序來檢測(cè)。見諸如Myers等，《科學(xué)》2301242(1985)。特殊位置的序列改變也可通過核酸酶保護(hù)試驗(yàn)如RNase、V1和S1保護(hù)試驗(yàn)或化學(xué)裂解方法來顯示。見諸如Cotton等《美國(guó)科學(xué)院院刊》854397-4401(1985)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以構(gòu)建一系列含有BASB114核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針，來對(duì)諸如遺傳突變、血清型、分類或鑒定進(jìn)行有效的篩選。平行技術(shù)方法是眾所周知的，具有通用性，可用來解決分子遺傳學(xué)中的多種問題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳變異(見諸如Chee等《科學(xué)》274610(1996)。
因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，它包括(a)本發(fā)明的一種多核苷酸，優(yōu)選SEQ ID NO1或3的核苷酸序列或其片段；(b)與(a)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(c)本發(fā)明的一種多肽，優(yōu)選SEQ ID NO2或4的多肽或其片段；或(d)針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體，優(yōu)選針對(duì)SEQ ID NO2或4的多肽的抗體。
在任何這樣一種試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可優(yōu)選含有一種基本組分。這種試劑盒可用于疾病或?qū)膊〉囊赘行缘脑\斷或其他。
本發(fā)明還涉及將本發(fā)明的多核苷酸用作診斷試劑。對(duì)本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選SEQ ID NO1或3的與一種疾病或致病性相關(guān)的突變形式的檢測(cè)，可提供一種診斷手段，這種診斷手段可增加或限定由于該多核苷酸的低表達(dá)、過量表達(dá)或表達(dá)改變而引起的一種疾病的診斷、疾病過程的預(yù)測(cè)、疾病階段、或疾病的易感性的確定。在這樣的多核苷酸中帶有突變的生物體特別是感染性生物體可通過各種技術(shù)例如這里任何地方介紹的技術(shù)在多核苷酸水平進(jìn)行檢測(cè)。
來自在本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽中帶有突變或多態(tài)性(等位突變)的生物體的細(xì)胞也可用來使用多種技術(shù)在多核苷酸或多肽水平進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)行諸如血清學(xué)分型。例如，RT-PCR可用來檢測(cè)RNA中的突變。優(yōu)選將RT-PCR與自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)如GeneScan結(jié)合起來進(jìn)行使用。RNA、cDNA或基因組DNA也可用于相同的目的---PCR。例如，與編碼BASB114多肽的多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物可用來鑒定和分析突變。
本發(fā)明進(jìn)一步提供從5’和/或3’末端除去1、2、3或4個(gè)核苷酸的引物。這些引物可與其他材料一起用于擴(kuò)增從個(gè)體獲得的一種樣品如機(jī)體物質(zhì)中分離的BASB114 DNA和/或RNA。這些引物可用于擴(kuò)增從感染個(gè)體中分離的一種多核苷酸，這樣，該多核苷酸可隨后通過各種技術(shù)來闡明多核苷酸序列。通過這種方法，可檢測(cè)多核苷酸序列中的突變，并用于診斷和/或預(yù)測(cè)感染或其階段或過程，或進(jìn)行感染因子的血清學(xué)分型和/或分類。
本發(fā)明進(jìn)一步提供診斷疾病，優(yōu)選是細(xì)菌感染，更優(yōu)選是由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染的方法，這包括在從個(gè)體獲得的樣品如一種機(jī)體物質(zhì)中檢測(cè)具有SEQ ID NO1或3序列的多核苷酸的表達(dá)水平的提高。BASB114多核苷酸表達(dá)的增加或減少可使用本領(lǐng)域任何已知的用于多核苷酸定量的方法進(jìn)行檢測(cè)，例如擴(kuò)增、PCR、RT-PCR、RNase保護(hù)、Northern印跡、分光光度和其他雜交方法。
此外，根據(jù)本發(fā)明的用于檢測(cè)BASB114多肽與正常對(duì)照組織樣品相比過量表達(dá)的診斷試驗(yàn)可用來檢測(cè)例如一種感染的存在?？捎脕頊y(cè)定BASB114多肽在來自一種宿主如一種機(jī)體物質(zhì)中的水平的試驗(yàn)技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的。這種試驗(yàn)方法包括放射免疫試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、Western印跡、抗體夾心試驗(yàn)、抗體檢測(cè)和ELISA試驗(yàn)。
本發(fā)明的多核苷酸可用作多核苷酸列陣優(yōu)選是高密度列陣或載網(wǎng)的組分。這些高密度列陣對(duì)于診斷和預(yù)測(cè)目的特別有用。例如，各含一種不同基因并進(jìn)一步含有本發(fā)明的多核苷酸的一套點(diǎn)可用于探針檢測(cè)，例如使用雜交或核酸擴(kuò)增，使用來自或衍生自一種機(jī)體樣品的探針，來檢測(cè)一種特別的寡核苷酸序列或相關(guān)序列在一個(gè)個(gè)體中的存在。這種存在可說明一種病原體尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在，并可用來診斷和/或預(yù)測(cè)疾病或疾病過程。優(yōu)選的是一種含有多種SEQ IDNO1或3的核苷酸序列的變體的載網(wǎng)。含有編碼SEQ ID NO2或4的多肽序列的多核苷酸序列的多種變體的載網(wǎng)也是優(yōu)選的。
抗體本發(fā)明的多肽和多核苷酸或其變體或者表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原來制備分別針對(duì)這種多肽或多核苷酸的抗體?！懊庖咛禺愋浴笔侵缚贵w對(duì)本發(fā)明多肽的親和力顯著高于對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的其它相關(guān)抗體的親和力。
在本發(fā)明的特定優(yōu)選實(shí)施方案中，提供針對(duì)BASB114多肽或多核苷酸的抗體。
針對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸制備的抗體可通過使用傳統(tǒng)的方法獲得，即將本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸、或它們之一或兩者的攜帶表位的片段、它們之一或兩者的類似物、或表達(dá)它們之一或兩者的細(xì)胞給藥于一種動(dòng)物，優(yōu)選是一種非人類的動(dòng)物。本領(lǐng)域任何能提供用連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)制備的抗體的技術(shù)都可以使用。例子包括各種技術(shù)，例如Kohler，G.和Milstein，C.《自然》256495-497(1975)；Kozbor等《今日免疫學(xué)》472(1983)；Cole等《單克隆抗體和癌癥治療》，AlanR.Liss，Inc.(1985)的77-96頁。
制備單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專利No.4,946,778)可修改來制備針對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因鼠或其他生物體或動(dòng)物如其他哺乳動(dòng)物也可用來表達(dá)對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸免疫特異的人源化抗體。
另外，噬菌體顯示技術(shù)可用來從含有抗BASB114的人淋巴細(xì)胞的PCR擴(kuò)增的V-基因文庫或天然文庫中選擇對(duì)本發(fā)明的多肽具有結(jié)合活性的抗體基因(McCafferty等(1990)《自然》348552-554；Marks等(1992)《生物技術(shù)》10779-783)。這些抗體的親和性也可通過諸如鏈置換技術(shù)進(jìn)行提高(Clackson等，(1991)《自然》352628)。
上面介紹的抗體可用來分離或鑒定能夠表達(dá)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的克隆，來通過諸如親和層析純化這些多肽或多核苷酸。
這些抗體以及其他針對(duì)BASB114多肽或BASB114多核苷酸的抗體可用來治療感染，特別是細(xì)菌感染。
多肽變體包括抗原性、表位性或免疫性等價(jià)的變體，它們組成了本發(fā)明的一個(gè)特別的方面。
抗體或其片段優(yōu)選通過修飾，使之在個(gè)體中具有較小的免疫原性。例如，如果個(gè)體是人，抗體可更優(yōu)選是一種“人源化”的抗體，其中雜交瘤來源抗體的互補(bǔ)決定區(qū)被移植到人單克隆抗體中，例如Jones等(1986)《自然》321，522-525或Tempest等(1991)《生物技術(shù)》9，266-273中的介紹。
拮抗劑和激動(dòng)劑---試驗(yàn)和分子本發(fā)明的多肽和多核苷酸還可用來評(píng)價(jià)小分子底物與配體在諸如細(xì)胞、無細(xì)胞抽提物、化學(xué)文庫和天然產(chǎn)物混合物中的結(jié)合。這些底物和配體可以是天然底物和配體，或者可以是結(jié)構(gòu)或功能模擬物，見諸如Coligan等《當(dāng)代免疫學(xué)方法》1(2)5章(1991)。
篩選方法可通過一種直接或間接與候選化合物連接的標(biāo)記簡(jiǎn)單地測(cè)量候選化合物與多肽或多核苷酸、或者攜帶多肽或多核苷酸的細(xì)胞或膜、或者多肽的融合蛋白的結(jié)合。此外，篩選方法可包括與一種標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。而且，這些篩選方法可檢測(cè)候選化合物是否導(dǎo)致一種由多肽或多核苷酸的活化產(chǎn)生的信號(hào)，這可使用與含有多肽或多核苷酸的細(xì)胞適宜的檢測(cè)系統(tǒng)來進(jìn)行。活化的抑制劑一般在存在一種已知激動(dòng)劑的情況下進(jìn)行試驗(yàn)，并觀察候選化合物對(duì)激動(dòng)劑活化作用的影響。組成型活性多肽和/或組成型表達(dá)的多肽和多核苷酸可根據(jù)需要，在沒有一種激動(dòng)劑或拮抗劑的情況下，用于逆轉(zhuǎn)激動(dòng)劑或抑制劑的篩選方法，這可通過檢測(cè)候選化合物是否導(dǎo)致多肽或多核苷酸的活化的抑制來進(jìn)行。而且，篩選方法可簡(jiǎn)單地包括以下步驟，將一種候選化合物與含有本發(fā)明的一種多肽或多核苷酸的溶液混合，形成一種混合物；檢測(cè)混合物中BASB114多肽和/或多核苷酸的活性；將混合物中BASB114多肽和/或多核苷酸的活性與一種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。融合蛋白如這里介紹的Fc部分與BASB114多肽制備的融合蛋白也可用于高通量的篩選試驗(yàn)，用來鑒定本發(fā)明的多肽的拮抗劑以及系統(tǒng)發(fā)育和/或功能上相關(guān)的多肽(見D.Bennett等《分子識(shí)別雜志》852-58(1995)和K.Johanson等《生物化學(xué)雜志》270(16)9459-9471(1995))。
能夠與本發(fā)明的一種多肽結(jié)合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗體也可用于設(shè)計(jì)檢測(cè)加入的化合物對(duì)細(xì)胞中mRNA和/或多肽產(chǎn)生的影響的篩選方法。例如，可以設(shè)計(jì)一種ELISA試驗(yàn)，使用單克隆和多克隆抗體，按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，測(cè)量多肽的分泌或細(xì)胞結(jié)合水平。這可用來發(fā)現(xiàn)能抑制或增強(qiáng)多肽在合適的操作細(xì)胞或組織中產(chǎn)生的試劑(分別也被稱為拮抗劑或激動(dòng)劑)。
本發(fā)明還提供一種篩選化合物的方法，用來鑒定能夠增強(qiáng)(激動(dòng)劑)或阻斷(拮抗劑)BASB114多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是能夠抑菌和/或殺菌的化合物。這種篩選方法可使用高通量技術(shù)。例如，為篩選激動(dòng)劑或拮抗劑，將一種合成反應(yīng)混合物、一種細(xì)胞組分如膜、細(xì)胞包膜或細(xì)胞壁、或者它們的任何制備物、包括BASB114多肽和一種標(biāo)記底物或這種多肽的配體，在一種可能是BASB114激動(dòng)劑或拮抗劑的候選分子存在或不存在的條件下，進(jìn)行溫育。候選化合物激動(dòng)或拮抗BASB114多肽的能力反映于標(biāo)記配體的結(jié)合降低或這種底物的產(chǎn)物的產(chǎn)生減少。無效結(jié)合即不誘導(dǎo)BASB114多肽的效果的分子很可能是優(yōu)秀的拮抗劑。根據(jù)情況，結(jié)合良好并增加產(chǎn)物由底物產(chǎn)生的速率、增加信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或增加化學(xué)通道活性的的分子即是激動(dòng)劑。根據(jù)情況，產(chǎn)物由底物產(chǎn)生、信號(hào)傳導(dǎo)或化學(xué)通道活性的速率或水平的檢測(cè)可通過使用一種報(bào)告系統(tǒng)來增強(qiáng)。可用于此目的報(bào)告系統(tǒng)包括但不限于比色、標(biāo)記底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物、一種對(duì)BASB114多核苷酸或多肽的變化應(yīng)答的報(bào)告基因以及本領(lǐng)域熟知的結(jié)合試驗(yàn)。
BASB114激動(dòng)劑試驗(yàn)的另一個(gè)例子是一種競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)，該試驗(yàn)將BASB114和一種可能的激動(dòng)劑與BASB114結(jié)合分子、重組BASB114結(jié)合分子、天然底物或配體、或底物或配體的模擬物組合在一起，在合適的條件下進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)。BASB114可進(jìn)行標(biāo)記，例如用放射活性或比色化合物標(biāo)記，使結(jié)合到一種結(jié)合分子上或轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的BASB114分子的數(shù)目可以精確測(cè)定，來評(píng)價(jià)可能的拮抗劑的作用。
可能的拮抗劑包括能與本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽結(jié)合并因而抑制或壓制其活性或表達(dá)的小有機(jī)分子、肽、多肽以及抗體及其他?？赡艿霓卓箘┮部梢允沁@樣的小有機(jī)分子、肽、多肽如密切相關(guān)的蛋白或抗體，它們結(jié)合在結(jié)合分子的相同位點(diǎn)，例如一種結(jié)合分子，但不誘導(dǎo)BASB114誘導(dǎo)的活性，從而通過阻止BASB114多肽和/或多核苷酸結(jié)合來抑制BASB114多肽和/或多核苷酸的活化或表達(dá)。
可能的拮抗劑包括這樣的小分子，它們結(jié)合和占據(jù)多肽的結(jié)合位點(diǎn)，因而阻止其與細(xì)胞結(jié)合分子結(jié)合，從而抑制正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小有機(jī)分子、肽或肽樣分子。其他可能的拮抗劑包括反義分子(見Okano，《神經(jīng)化學(xué)雜志》56560(1991)；《寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑》CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988)，對(duì)這些分子的介紹)。優(yōu)選的可能的拮抗劑包括與BASB114及其變體有關(guān)的化合物。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及遺傳工程的可溶性融合蛋白，這種蛋白包括本發(fā)明的一種多肽或其片段以及各種亞類免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重鏈或輕鏈恒定區(qū)的各種部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG特別是IgG1重鏈的恒定區(qū)部分，其中融合發(fā)生于鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，F(xiàn)c部分可通過以下方法簡(jiǎn)單地除去引入一個(gè)切割序列，該序列可用血液凝集因子Xa。而且，本發(fā)明涉及通過遺傳工程制備這些融合蛋白的方法，并涉及將其用于藥物篩選、診斷和治療。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面還涉及編碼這種融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可見于國(guó)際專利申請(qǐng)Nos.WO94/29458和WO94/22914。
這里提供的每個(gè)多核苷酸序列可用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)抗菌化合物。編碼蛋白通過表達(dá)可用作篩選抗菌藥物的靶。此外，編碼所編碼蛋白的氨基末端區(qū)域或相應(yīng)mRNA的SD或其他翻譯促進(jìn)區(qū)域的多核苷酸序列可用于構(gòu)建反義序列來控制目標(biāo)編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明還提供將本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動(dòng)劑或拮抗劑用于干擾一種病原體或多種病原體與一種對(duì)感染繼發(fā)癥敏感的真核生物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物宿主之間的最初生理相互作用。具體地說，本發(fā)明的分子可用于抑制細(xì)菌具體說是革蘭氏陽性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌粘附于真核生物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物的深埋裝置的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或粘附于傷口的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；阻斷真核生物優(yōu)選是哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)菌BASB114蛋白之間的細(xì)菌性粘附，后者介導(dǎo)組織損傷；和/或阻斷不管是深埋裝置植入還是其他外科技術(shù)引起的感染的正常致病過程。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供BASB114激動(dòng)劑和拮抗劑，優(yōu)選是抑菌或殺菌性激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明的拮抗劑和激動(dòng)劑可用于例如阻止、抑制和/或治療疾病。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽的模擬表位。模擬表位是一種肽序列，與天然肽足夠相似(序列上或結(jié)構(gòu)上)，它能被識(shí)別天然肽的抗體識(shí)別，或在與一種合適載體偶聯(lián)時(shí)能夠產(chǎn)生識(shí)別天然肽的抗體。
肽模擬表位可通過添加、缺失或取代所選擇的氨基酸用于特別的目的。因此，肽可被修飾以易于與一種蛋白載體連接。例如，對(duì)于某些化學(xué)結(jié)合方法，需要含有一個(gè)末端半胱氨酸。此外，對(duì)于肽與一種蛋白載體結(jié)合，需要包含一個(gè)遠(yuǎn)離肽結(jié)合末端的疏水末端，使肽的未結(jié)合的游離末端保持與載體蛋白表面的相互作用。從而使肽具有一種構(gòu)象，這種構(gòu)象與肽在整個(gè)天然分子結(jié)構(gòu)中具有的構(gòu)象非常相似。例如，肽可被修改來具有一個(gè)N末端半胱氨酸和一個(gè)C末端疏水的酰胺化的尾巴。另外，可以進(jìn)行一種或多種氨基酸的D立體異構(gòu)體的添加或取代，來制備一種有用的衍生物，用來例如增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性。
此外，肽模擬表位可通過諸如噬菌體顯示技術(shù)(EP 0552267B1)使用能與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體來鑒定。這種技術(shù)產(chǎn)生大量的模擬天然肽的結(jié)構(gòu)的肽序列，這些肽序列因此能夠結(jié)合抗天然肽的抗體，但可能不足以與天然多肽具有明顯的序列同源性。
疫苗本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在個(gè)體特別是哺乳動(dòng)物優(yōu)選是人中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，這種方法包括用BASB114多核苷酸和/或多肽或其片段或變體接種個(gè)體，它們足以產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)個(gè)體不被感染，特別是細(xì)菌感染，尤其是粘膜炎莫拉氏菌感染。本發(fā)明還提供產(chǎn)生這種免疫應(yīng)答以延緩細(xì)菌復(fù)制的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，包括給予這種個(gè)體一種指導(dǎo)BASB114多核苷酸和/或多肽表達(dá)或其片段或變體表達(dá)的核酸載體、序列或核酶，來在體內(nèi)表達(dá)BASB114多核苷酸和/或多肽表達(dá)或其片段或變體，從而誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答，例如產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括諸如產(chǎn)細(xì)胞因子T細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞，來保護(hù)所述個(gè)體，優(yōu)選是人免于患病，而不管這種疾病是已經(jīng)在個(gè)體中存在還是不存在?；蚪o藥的一個(gè)例子是將其作為顆?；蚱渌镔|(zhì)的包被物來促進(jìn)其進(jìn)入所需的細(xì)胞。這種核酸載體可包括DNA、RNA、核酶、修飾的核酸、DNA/RNA雜合體、DNA蛋白復(fù)合物或RNA-蛋白復(fù)合物。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面涉及一種免疫組合物，該組合物在導(dǎo)入個(gè)體優(yōu)選是人時(shí)，能夠誘導(dǎo)一種免疫應(yīng)答，即在該個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)BASB114多核苷酸和/或由其編碼的多肽的免疫應(yīng)答。其中組合物包含重組的BASB114多核苷酸和/或由其編碼的多肽；和/或包含能夠編碼和表達(dá)所述BASB114多核苷酸、由其編碼的多肽或本發(fā)明的其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫應(yīng)答可用于治療或預(yù)防目的，并且可采用抗體免疫和/或細(xì)胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫。
因此，BASB114多肽或其片段可與輔助蛋白或化學(xué)半分子融合，輔助蛋白或化學(xué)半分子能夠或不能自身產(chǎn)生抗體，但能夠使第一種蛋白穩(wěn)定，并產(chǎn)生一種融合的或修飾的蛋白，后者具有抗原性和/或免疫原性，優(yōu)選是保護(hù)性。這樣的融合重組蛋白優(yōu)選進(jìn)一步含有一種抗原性輔助蛋白，例如來自流感嗜血桿菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或β-半乳糖苷酶或其他任何能夠穩(wěn)定蛋白并促進(jìn)其制備和純化的大輔助蛋白。而且，輔助蛋白在對(duì)接受該蛋白的生物體的免疫系統(tǒng)提供一種標(biāo)準(zhǔn)刺激時(shí)，可用作一種佐劑。輔助蛋白可連接在第一種蛋白的氨基端或羧基端。
在本發(fā)明的疫苗組合物中，BASB114多肽和/或多核苷酸或其片段、模擬表位(mimotope)、或變體可以存在于一種載體中，如上述活細(xì)菌載體等活重組載體。
BASB114多肽的無生命載體也是合適的，例如細(xì)菌外膜囊泡(vesicle)或“小泡(bleb)”。OM小泡衍生自革蘭氏陰性細(xì)菌雙層膜的外膜，已在多種革蘭氏陰性細(xì)菌包括C.trachomatis和C.psittaci中報(bào)導(dǎo)(Zhou，L等，1998，F(xiàn)EMS微生物通訊，163223-228)。據(jù)報(bào)導(dǎo)產(chǎn)生小泡的細(xì)菌病原體的非限制性實(shí)例也包括百日咳博德特氏菌、布氏疏螺旋體、馬爾他布魯氏菌、羊布魯氏菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、淋病奈瑟氏菌、粘膜炎莫拉氏菌、銅綠假單胞菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。
小泡的優(yōu)勢(shì)是以天然構(gòu)象提供外膜蛋白，因此在疫苗中特別有用。小泡也可以通過工程改造細(xì)菌以改變外膜上一個(gè)或多個(gè)分子的表達(dá)而用于疫苗。因此，例如可以引入或上調(diào)(如通過改變啟動(dòng)子)BASB114多肽等所需的免疫原性蛋白在外膜的表達(dá)。另一種方式或者進(jìn)一步，不相關(guān)(如非保護(hù)性抗原或免疫優(yōu)勢(shì)但可變的蛋白)或有害(如LPS等毒性分子，或自身免疫應(yīng)答的潛在誘導(dǎo)物)的外膜分子的包括可以被下調(diào)。這些方式以下詳述。
BASB114基因的非編碼旁側(cè)區(qū)含有基因表達(dá)中重要的調(diào)控元件。這種調(diào)控既存在于轉(zhuǎn)錄水平又存在于翻譯水平。這些區(qū)域(無論是基因開放閱讀框的上游還是下游)的序列可以通過DNA測(cè)序獲得。這種序列信息可以確定潛在的調(diào)控基元，如不同的啟動(dòng)子元件、終止子序列、可誘導(dǎo)序列元件、阻遏物、負(fù)責(zé)相轉(zhuǎn)變的元件，核糖體結(jié)合序列、具有參與調(diào)控的潛在二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及其它類型的調(diào)控基元或序列。該序列是本發(fā)明的另一方面。
該序列信息允許調(diào)節(jié)BASB114基因的天然表達(dá)?；虮磉_(dá)的上調(diào)也可通過改變啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合序列、潛在阻遏物或操縱基因元件或任何其它有關(guān)元件。同樣，表達(dá)的下調(diào)可以通過類似的調(diào)控實(shí)現(xiàn)?；蛘?，通過改變相轉(zhuǎn)變序列，基因的表達(dá)可以置于相轉(zhuǎn)變控制之下，或者可以與這種調(diào)控解偶聯(lián)。另一種途徑是，該基因的表達(dá)可以置于一個(gè)或多個(gè)允許調(diào)節(jié)表達(dá)的可誘導(dǎo)元件的控制之下。這種調(diào)節(jié)的實(shí)例包括但不限于通過溫度轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)，加入選定碳水化合物或其衍生物等誘導(dǎo)底物、痕量元素、維生素、輔因子、金屬離子等。
上述改變可以通過幾種不同方式導(dǎo)入。改變參與基因表達(dá)的序列可以通過體內(nèi)隨機(jī)誘變?nèi)缓筮x擇所需表型來實(shí)現(xiàn)。另一種途徑是分離目標(biāo)區(qū)域，通過隨機(jī)誘變或定點(diǎn)置換、插入或缺失誘變改變之。改變的區(qū)域可以通過同源重組重新導(dǎo)入細(xì)菌基因組，基因表達(dá)的效果可以被評(píng)價(jià)。另一種途徑是，目標(biāo)區(qū)域的序列知識(shí)可以用于置換或缺失天然調(diào)控序列的全部或部分。這種情況下，分離和改變目標(biāo)調(diào)控區(qū)，以包括來自其它基因的調(diào)控元件，來自不同基因的調(diào)控元件的組合，合成調(diào)控區(qū)，或任何其它調(diào)控區(qū)，或缺失野生型調(diào)控序列的選定部分。這些改變的序列可以通過同源重組被重新導(dǎo)入細(xì)菌基因組中。可以用于上調(diào)基因表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括來自粘膜炎莫拉氏菌或淋病奈瑟氏菌的啟動(dòng)子proA，proB，lbpB，tbpB，p110，1st，hpuAB；來自M.Catarrhalis的TbpB；來自流感嗜血桿菌的p1，p2，p4，p5，p6，lpD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。
在一個(gè)實(shí)例中，基因表達(dá)可以通過將其啟動(dòng)子換成較強(qiáng)的啟動(dòng)子(通過分離該基因的上游序列，體外修飾該序列，通過同源重組再導(dǎo)入基因組中)加以改變。上調(diào)的表達(dá)可以在細(xì)菌以及來自該細(xì)菌的外膜囊泡中實(shí)現(xiàn)。
在一個(gè)實(shí)例中，上述途徑可以用來產(chǎn)生疫苗應(yīng)用中性能改進(jìn)的重組細(xì)菌菌株。這些可以是減毒菌株，選定抗原的表達(dá)增加的菌株，干預(yù)免疫應(yīng)答的基因敲除(或表達(dá)降低)的菌株，免疫優(yōu)勢(shì)蛋白的表達(dá)改變的菌株，外膜囊泡的脫落改變的菌株，但不限于此。
因此，本發(fā)明也提供BASB114基因的改變的上游區(qū)，這些改變的區(qū)域也含有異源調(diào)控元件，其改變位于外膜蛋白的BASB114蛋白的表達(dá)水平。本發(fā)明這方面的上游區(qū)包括BASB114基因的上游序列。上游區(qū)始于BASB114基因的上游，通常延伸至ATG起始密碼子上游不到約1000bp處。在基因位于多順反子序列(操縱子)中時(shí)，上游區(qū)可以剛好始于目的基因之前，或操縱子第一個(gè)基因之前。優(yōu)選，本發(fā)明這方面的改變上游區(qū)含有位于ATG上游500到700bp位置處的異源啟動(dòng)子。
因此，本發(fā)明提供在改變的細(xì)菌小泡中的BASB114多肽。本發(fā)明也提供能夠產(chǎn)生基于非生命膜的小泡載體的修飾宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供含有BASB114基因的核酸載體，所述基因具有含有異源調(diào)控元件的改變上游區(qū)。
本發(fā)明還提供制備本發(fā)明的宿主細(xì)胞和細(xì)菌小泡的方法。
本發(fā)明也提供含有本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及免疫調(diào)節(jié)DNA序列如Sato，Y.《科學(xué)》273352(1996)中介紹的DNA序列的組合物，特別是疫苗組合物，以及方法。
本發(fā)明還提供在粘膜炎莫拉氏菌感染的動(dòng)物模型的這種遺傳免疫實(shí)驗(yàn)中所用的多核苷酸結(jié)構(gòu)物中使用所介紹的多核苷酸或其特殊片段的方法，其中多核苷酸或其特殊片段已經(jīng)顯示編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的非可變區(qū)。這種實(shí)驗(yàn)可特別用于鑒定能夠激發(fā)預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的蛋白表位?？梢韵嘈牛@種方法將能夠用于隨后由成功地抵抗或清除了感染的動(dòng)物的必需的器官，制備有特殊價(jià)值的單克隆抗體，用于發(fā)展哺乳動(dòng)物特別是人的治療細(xì)菌性感染特別是奈瑟氏菌感染的預(yù)防性試劑或治療性試劑。
本發(fā)明還包括疫苗制劑，這種制劑包括本發(fā)明的一種免疫原性重組多肽和/或多核苷酸以及一種合適的載體，例如一種可藥用載體。因?yàn)槎嚯暮投嗪塑账峥赡茉谖钢袝?huì)被打斷，它們都優(yōu)選經(jīng)腸道外給藥，包括諸如皮下、肌肉、靜脈或皮內(nèi)，適用于腸道外給藥的制劑包括水和非水的無菌注射溶液，它們可含有抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和能夠使制劑與個(gè)體的體液優(yōu)選是血液等滲的溶劑，以及可包含懸浮劑或增稠劑的水和非水無菌懸液。制劑可置于單劑量或多劑量的容器內(nèi)，例如密封的安瓶和小瓶，并可貯存于冷凍干燥的環(huán)境，只需在使用前加入無菌的液體載體。
本發(fā)明的疫苗制劑也可包括佐劑系統(tǒng)，用來增強(qiáng)制劑的免疫原性。優(yōu)選佐劑系統(tǒng)優(yōu)先引發(fā)TH1型應(yīng)答。
免疫應(yīng)答大體上可分為兩個(gè)典型的種類，即體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(一般分別用其保護(hù)作用的抗體和細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制來區(qū)分)。這些應(yīng)答種類被稱為TH1型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
典型的TH1型免疫應(yīng)答的特征是產(chǎn)生抗原特異的單元型限制的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和自然殺傷型細(xì)胞應(yīng)答。在小鼠中，TH1型應(yīng)答的特征通常是產(chǎn)生IgG2a亞型的抗體，而在人中，它們的對(duì)應(yīng)物是IgG1型抗體。TH2型免疫應(yīng)答的特征是產(chǎn)生廣譜的免疫球蛋白同種型，在小鼠中包括IgG1、IgA和IgM。
可以想象得到，這兩種類型的免疫應(yīng)答之后的驅(qū)動(dòng)力是細(xì)胞因子。高水平的TH1型細(xì)胞因子優(yōu)先誘導(dǎo)針對(duì)所給抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的TH2型細(xì)胞因子優(yōu)先誘導(dǎo)針對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH1和TH2型免疫應(yīng)答的區(qū)分不是絕對(duì)的。事實(shí)上，一個(gè)個(gè)體可以支持一種被描述為TH1優(yōu)勢(shì)或TH2優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答。但是，通常方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆中的介紹來考慮細(xì)胞因子的家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)，TH1和TH2細(xì)胞淋巴因子的不同分泌模式導(dǎo)致不同的功能特性?！睹庖邔W(xué)年鑒》7卷，145-173頁)。通常，TH1型應(yīng)答與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)。其他通常直接與TH1型免疫應(yīng)答誘導(dǎo)有關(guān)的細(xì)胞因子如IL-12不由T細(xì)胞產(chǎn)生。相反，TH2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有關(guān)。
已知特定的疫苗佐劑特別適合于刺激TH1或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。疫苗接種或感染后免疫應(yīng)答的TH1∶TH2平衡的最佳指標(biāo)通常包括在體外用抗原再刺激后直接測(cè)量T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TH1或TH2細(xì)胞因子，和/或測(cè)量抗原特異的抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1型佐劑是在體外用抗原再刺激時(shí)優(yōu)先刺激分離的T細(xì)胞群體產(chǎn)生高水平的TH1型細(xì)胞因子和促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞和與TH1型同種型相關(guān)的抗原特異的免疫球蛋白應(yīng)答產(chǎn)生的佐劑。
能夠優(yōu)先刺激TH1細(xì)胞應(yīng)答的佐劑在國(guó)際專利申請(qǐng)No.WO94/00153和WO95/17209中介紹。
3 De-O-酰化單磷酰類脂A(3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這可由GB2220211(Ribi)知道。它在化學(xué)上是3 De-O?；瘑瘟柞ｎ愔珹與4、5或6?；湹幕旌衔?，并由Ribi Immunochem，Montana制造。3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹的一種優(yōu)選形式在歐洲專利0 689 454(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公開。
3D-MPL顆粒優(yōu)選小到足以通過一個(gè)0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過濾除菌(歐洲專利0689454)。
3D-MPL以每劑10μg-100μg，優(yōu)選是20-25μg的范圍存在，而抗原通常以每劑2-50μg的范圍存在。
另一個(gè)優(yōu)選的佐劑包含QS21，它是一種來自Quillaja SaponariaMolina的莖的Hplc純化的無毒組分。它可選用來與3 De-O-?；瘑瘟柞ｎ愔珹(3D-MPL)混合，并可與一種載體一起使用。
制備QS21的方法在美國(guó)專利No.5,057,540中公開。
含有QS21的非反應(yīng)性的佐劑制劑在以前已有介紹(WO96/33739)。含有QS21和膽甾醇的這種制劑在與抗原一起配制時(shí)已顯示是成功的TH1刺激佐劑。
優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的進(jìn)一步的佐劑包括免疫調(diào)節(jié)性的寡核苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO 96/02555中的公開。
不同TH1刺激性佐劑如上文所介紹的佐劑的組合也被認(rèn)為是能提供一種優(yōu)先刺激TH1型細(xì)胞應(yīng)答的佐劑。例如，QS21可與3D-MPL組合配制。OS21∶3D-MPL的比率通常為1∶10至10∶1，優(yōu)選為1∶5至5∶1，并且通常為大約1∶1。優(yōu)選的最佳組合范圍是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。
根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物還優(yōu)選含有一種載體。載體可以是一種水包油乳劑，或一種鋁鹽如磷酸鋁或氫氧化鋁。
水包油乳劑優(yōu)選包含一種可代謝的油，例如角鯊烯、α-生育酚和Tween 80。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物中的抗原與QS21和3D-MPL在這樣一種乳劑中組合。另外，該水包油乳劑可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。
在對(duì)人給藥時(shí)，疫苗中QS21和3D-MPL的范圍是每劑1μg-200μg，例如10-100μg，優(yōu)選是10μg-50μg。水包油通常含有2至10％的角鯊烯、2至10％的α-生育酚和0.3至3％的Tween 80。在以更穩(wěn)定的乳劑形式提供時(shí)，角鯊烯α-生育酚Tween 80的比例優(yōu)選相同或少于1。還可包含1％水平的Span85。在某些情況下，本發(fā)明的疫苗優(yōu)選進(jìn)一步含有一種穩(wěn)定劑。
非毒性的水包油乳劑優(yōu)選在一種水載體中含有一種非毒性的油如角鯊?fù)榛蚪酋徬?、一種乳化劑如Tween 80。水載體可以是例如磷酸緩沖鹽水。
WO 95/17210中介紹了一種特別強(qiáng)有力的佐劑制劑，它含有在一種水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本發(fā)明還提供一種多價(jià)的疫苗組合物，它含有本發(fā)明的疫苗制劑以及其他抗原，特別是對(duì)治療癌癥、自身免疫疾病和相關(guān)病癥有用的抗原。這樣一種多價(jià)疫苗組合物可包括一種如前所述的TH1誘導(dǎo)型佐劑。
雖然本發(fā)明對(duì)特定的BASB114多肽和多核苷酸進(jìn)行了介紹，但應(yīng)當(dāng)理解它們覆蓋了天然產(chǎn)生的多肽和多核苷酸以及含有添加、缺失或取代的相似多肽和多核苷酸，這些添加、缺失或取代基本上不影響重組多肽或多核苷酸的免疫原特征。
組合物、試劑盒和給藥在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面，提供含有用于對(duì)一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)多細(xì)胞生物體給藥的BASB114多核苷酸和/或BASB114多肽的組合物。
本發(fā)明還涉及含有這里討論的多核苷酸和/或多肽或它們的激動(dòng)劑或拮抗劑的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸可與一種非無菌或無菌載體或用于細(xì)胞、組織或生物體的載體，例如一種適用于對(duì)個(gè)體給藥的藥用載體組合使用。這種組合物包括例如一種介質(zhì)添加劑或一種治療有效劑量的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及一種可藥用載體或賦形劑。這種載體可包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。制劑應(yīng)適合于給藥模式。本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷和藥用包裝和試劑盒，它們含有一種或多種容器，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的上面提到的成分。
本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨(dú)或與其他化合物例如治療性化合物一起使用。
藥用組合物可通過任何有效、傳統(tǒng)的方式進(jìn)行給藥，包括諸如通過局部、口、肛門、陰道、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)途徑及其他途徑進(jìn)行給藥。
在用于治療或預(yù)防時(shí)，活性試劑可以一種可注射的組合物的形式給藥于個(gè)體，例如以無菌水分散物優(yōu)選是等滲的形式給藥。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供藥用組合物，它包含一種治療有效劑量的多肽和/或多核苷酸例如本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸的可溶形式、激動(dòng)劑或拮抗劑或小分子化合物、以及一種可藥用載體或賦形劑。這種載體包括但不限于鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它們的組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥用包裝和試劑盒，它們含有一種或多種容器，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的上面提到的成分。本發(fā)明的多肽、多核苷酸和其他化合物可單獨(dú)或與其他化合物例如治療性化合物一起使用。
組合物應(yīng)采用一種給藥途徑，例如通過一種全身性或經(jīng)口途徑。全身性給藥的優(yōu)選形式包括注射，通常通過靜脈注射。其他的注射途徑例如皮下、肌肉或腹膜都可以采用。全身性給藥的其他方法包括使用滲透劑如膽鹽或梭鏈孢酸或其他去污劑經(jīng)粘膜和皮膚給藥。此外，如果本發(fā)明的一種多肽或其他化合物可配制成一種腸溶或一種膠囊制劑，經(jīng)口途徑也可以使用。這些化合物的給藥也可經(jīng)表皮和/或局部，以藥膏、帖膏、凝膠、溶液、粉末等形式使用。
為對(duì)哺乳動(dòng)物特別是人進(jìn)行給藥，活性試劑的每日劑量水平應(yīng)從0.01mg/kg至10mg/kg，通常為1mg/kg左右。在任何情況下，醫(yī)生應(yīng)確定最適合于個(gè)體的實(shí)際劑量，并根據(jù)年齡、體重和特殊個(gè)體的應(yīng)答而不同。當(dāng)然，在個(gè)體情況時(shí)，可以使用更高或更低的劑量范圍，這些也都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
所需的劑量范圍依賴于所選擇的肽、給藥途徑、制劑的性質(zhì)、用藥者病癥的性質(zhì)以及醫(yī)師的判斷。但合適的劑量為每kg0.1-100μg的范圍。
疫苗組合物一般采用注射形式。傳統(tǒng)的佐劑可用來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。疫苗接種的合適單位劑量為0.5-5μg/kg的抗原，這樣的劑量?jī)?yōu)選給藥1-3次、間隔1-3周。對(duì)于指定的劑量范圍，本發(fā)明的化合物在給藥于合適的個(gè)體時(shí)，不會(huì)觀察到毒副作用。
但考慮到可以使用不同的化合物以及不同給藥途徑可產(chǎn)生不同的效果，所需的劑量有廣泛的變化。例如，口服途徑比靜脈注射需要更高的劑量。這些劑量水平的變化可按照本領(lǐng)域熟知的方法使用標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化實(shí)踐途徑進(jìn)行調(diào)整。
序列數(shù)據(jù)庫、有形介質(zhì)中的序列以及算法多核苷酸和多肽序列組成了有價(jià)值的信息來源，用來確定它們的二維和三維結(jié)構(gòu)以及進(jìn)一步鑒定相似同源的序列。這些方法可很方便地通過下述步驟來進(jìn)行，即將它們存入計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，然后將數(shù)據(jù)存入一個(gè)已知的大分子結(jié)構(gòu)程序或使用熟知的搜索工具如GCG程序包搜索一個(gè)序列數(shù)據(jù)庫。
本發(fā)明還提供分析特征序列或鏈特別是基因序列或編碼蛋白序列的方法。優(yōu)選的序列分析的方法包括諸如序列同源性分析方法如同一性和相似性分析、DNA、RNA和蛋白結(jié)構(gòu)分析、序列排列、進(jìn)化分析、序列基元分析、開放閱讀框確定、核酸堿基召喚、密碼子使用分析、核酸堿基整理、和序列層析峰分析。
本發(fā)明提供了一種以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的方法，用于進(jìn)行同源性鑒定。此方法包括以下步驟提供在一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的含有本發(fā)明的一種多核苷酸序列的第一個(gè)多核苷酸序列，將所述第一個(gè)多核苷酸與至少一種第二個(gè)多核苷酸或多肽序列比較，來確定同源性。
本發(fā)明提供了一種以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的方法，用于進(jìn)行同源性鑒定。所述方法包括以下步驟提供在一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的含有本發(fā)明的一種多肽序列的第一個(gè)多肽序列，將所述第一個(gè)多肽序列與至少一種第二個(gè)多核苷酸或多肽序列比較，來確定同源性。
本申請(qǐng)書中引用的所有出版物和參考文獻(xiàn)，包括但不限于專利和專利申請(qǐng)，在這里都全文引入作為參考，如同它們各自都特別地和個(gè)別地在此全文列出。本申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的任何專利申請(qǐng)也以與上面對(duì)出版物和參考所介紹的相同方式在此全文引入作為參考。
定義“同一性”如同本領(lǐng)域所熟知的，是兩種或多種多肽序列或兩種或多種多核苷酸序列之間的相關(guān)性，根據(jù)具體情況，可通過序列比較來確定。在本領(lǐng)域，“同一性”還指多肽或多核苷酸序列之間序列相關(guān)的程度，根據(jù)具體情況，可通過這些序列的鏈的匹配來確定?！巴恍浴笨墒褂靡阎姆椒ǚ奖愕赜?jì)算，包括但不限于(《計(jì)算分子生物學(xué)》，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988；《生物計(jì)算機(jī)信息和基因組計(jì)劃》Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯，HumanaPress，New Jersey，1994；《分子生物學(xué)中的序列分析》von Heine，G.，Academic Press，1987；和《序列分析引物》Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.，《SIAM J.Applied Math》481073(1988)。測(cè)定同一性的方法被設(shè)計(jì)來給出檢測(cè)序列之間的最大匹配。而且，測(cè)定同一性的方法在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中編碼。用來測(cè)定兩種序列之間的同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.等《核酸研究》12(1)387(1984)、BLASTP、BLASTN(Altschul，S.F.等《分子生物學(xué)雜志》215403-410(1990)以及FASTA(Pearson和Lipman《美國(guó)科學(xué)院院刊》852444-2448(1988)。BLAST程序家族可從NCBI和其他來源獲得(《BLAST手冊(cè)》Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等《分子生物學(xué)雜志》215403-410(1990)。著名的Smith Waterman算法也可用來測(cè)定同一性。
多肽序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物學(xué)雜志》48443-453(1970)比較矩陣Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62《美國(guó)科學(xué)院院刊》8910915-10919(1992)缺口補(bǔ)償8缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償2使用這些參數(shù)的程序可以從Genetics Computer Group，Madison WI以“缺口”程序的形式獲得。上述參數(shù)是多肽比較的缺省參數(shù)(對(duì)末端缺口無補(bǔ)償)。
多核苷酸序列比較的參數(shù)包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物學(xué)雜志》48443-453(1970)
比較矩陣匹配＝+10，不匹配＝0缺口補(bǔ)償50缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償3來源Genetics Computer Group，Madison WI的“缺口”程序。上述參數(shù)是核酸比較的缺省參數(shù)。
多核苷酸和多肽的“同一性”的優(yōu)選含義根據(jù)情況在下面(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸實(shí)施方案進(jìn)一步包括含有如下核苷酸序列的分離多核苷酸，該核苷酸序列與SEQ ID NO1或3的參考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1或3的參考序列相同，或者與參考序列相比，可包括一定數(shù)量的核苷酸改變，其中這種改變可以選自至少一個(gè)核苷酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中，其中核苷酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO1或3中的總核苷酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQID NO1或3的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改變的數(shù)目，xn是SEQ ID NO1或3中的核苷酸總數(shù)，y對(duì)50％來說是0.50，對(duì)60％來說是0.60，對(duì)70％來說是0.70，對(duì)80％來說是0.80，對(duì)85％來說是0.85，對(duì)90％來說是0.90，對(duì)95％來說是0.95，對(duì)97％來說是0.97，對(duì)100％來說是1.00，而·是乘法運(yùn)算的符號(hào)，對(duì)xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。編碼SEQ ID NO2或4的多肽的多核苷酸的改變可能在該編碼序列中產(chǎn)生無義、錯(cuò)義或移碼突變，因此改變后的多核苷酸編碼的多肽會(huì)發(fā)生變化。
例如，本發(fā)明的多核苷酸序列可以與SEQ ID NO1或3的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的核苷酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個(gè)核苷酸缺失、置換(包括轉(zhuǎn)換和顛換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多核苷酸序列的5′或3′末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的核苷酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中。核苷酸改變的數(shù)量如下確定SEQ ID NO1或3中的總核苷酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ IDNO1或3的總核苷酸數(shù)中減除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn為核苷酸改變數(shù)量，xn為SEQ ID NO1或3的總核苷酸數(shù)，y值在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，依此類推，·為乘法運(yùn)算的符號(hào)，其中若xn和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xn中減除。
(2)多肽實(shí)施方案進(jìn)一步包括含有如下多肽序列的分離多肽，該多肽序列與SEQ ID NO2或4的參考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多肽序列可以與SEQ IDNO2或4的參考序列相同，或者與參考序列相比，可包括一定數(shù)量的氨基酸改變，其中所述改變選自至少一個(gè)氨基酸缺失、取代(包括保守性或非保守性取代)或插入，而且所述改變可發(fā)生在參考多肽序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何地方、分別散布在參考序列的氨基酸中或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參考序列中，并且所述氨基酸改變的數(shù)目如下確定SEQ ID NO2或4中的總氨基酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ IDNO2或4的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為SEQ ID NO2或4中的氨基酸總數(shù)，y對(duì)50％來說是0.50，對(duì)60％來說是0.60，對(duì)70％來說是0.70，對(duì)80％來說是0.80，對(duì)85％來說是0.85，對(duì)90％來說是0.90，對(duì)95％來說是0.95，對(duì)97％來說是0.97，對(duì)100％來說是1.00，而·是乘法運(yùn)算的符號(hào)，若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。
例如，本發(fā)明的多肽序列可以與SEQ ID NO2或4的參照序列相同，即同一性為100％，或者與參照序列相比包括一定數(shù)量的氨基酸改變，因此同一性小于100％。這種改變可以選自至少一個(gè)氨基酸缺失、置換(包括保守和非保守置換)或插入，其中所述改變可以發(fā)生在參照多肽序列的氨基或羧基末端或兩個(gè)末端之間的任何位置，分別散布在參照序列的氨基酸之間，或者以一個(gè)或多個(gè)毗連群散布在參照序列中。同一性百分?jǐn)?shù)一定時(shí)氨基酸改變的數(shù)量如下確定SEQ IDNO2或4中的總氨基酸數(shù)乘以相應(yīng)同一性百分?jǐn)?shù)(除以100)，然后將其結(jié)果從SEQ ID NO2或4的總氨基酸數(shù)中減除，或者na≤xa-(xa·y)其中na為氨基酸改變數(shù)量，xa為SEQ ID NO2或4的總氨基酸數(shù)，y值在70％時(shí)為0.70，在80％時(shí)為0.80，在85％時(shí)為0.85，依此類推，而·是乘法運(yùn)算的符號(hào)，其中若xa和y的結(jié)果不是整數(shù)，則將其四舍五入取最近的整數(shù)，再從xa中減除。
“個(gè)體”在用于此處指示一種生物體時(shí)，是指一種多細(xì)胞真核生物，包括但不限于后生動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、卵生動(dòng)物、?？?、猿、靈長(zhǎng)動(dòng)物和人。
“分離的”表示“通過人工”改變其天然狀態(tài)，即如果“分離的”組合物或物質(zhì)在自然界中存在，則它已經(jīng)從其原始環(huán)境改變或取出或者已經(jīng)取出并改變。例如，在本文中使用該術(shù)語時(shí)，在活動(dòng)物體內(nèi)存在的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但已經(jīng)與天然狀態(tài)下共存的物質(zhì)分開的同樣多核苷酸或多肽就是“分離的”。而且，一種多核苷酸或多肽在通過轉(zhuǎn)化、遺傳操作或任何其他重組方法導(dǎo)入一種生物體時(shí)，即使它仍然存在于所述生物體中，它也是“分離”的，該生物體可以是活的或死的。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，它可以是修飾或非修飾的RNA或DNA，包括單鏈和雙鏈區(qū)域。
“變體”指不同于參照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸變體的核苷酸序列與參照多核苷酸不同。變體核苷酸序列的變化可能改變或不改變由參照多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改變可能導(dǎo)致參照序列編碼的多肽中氨基酸的置換、添加、缺失、融合和截短。一般多肽變體的氨基酸序列與參照多肽不同。通常，差異有限，因此參照多肽和變體的序列在總體上是極其近似的，在許多區(qū)域是相同的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以有任何組合形式的一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失的區(qū)別。置換或插入的氨基酸殘基可以是或不是遺傳密碼編碼的氨基酸。多核苷酸或多肽的變體可以是天然存在的，如等位變體，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽變體可以通過誘變技術(shù)或直接合成制備。
“疾病”是指任何由細(xì)菌感染導(dǎo)致或與之有關(guān)的疾病，包括諸如嬰幼兒中耳炎、老年人肺炎、鼻竇炎、醫(yī)院內(nèi)感染和侵襲性疾病、伴有聽力喪失的慢性中耳炎、中耳積液、聽神經(jīng)損害、說話延遲、上呼吸道感染和中耳炎癥。
實(shí)施例下面的實(shí)施例使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的和常規(guī)的，除非它們?cè)谄渌胤皆敿?xì)介紹。實(shí)施例是說明性的，不能限制本發(fā)明。
實(shí)施例1粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC 43617中BASB114基因的DNA測(cè)序A粘膜炎莫拉氏菌菌株中的BASB114SEQ ID NO1的BASB114基因來自粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617。BASB114多核苷酸序列的翻譯結(jié)果示于SEQ ID NO。
B粘膜炎莫拉氏菌43617菌株中的BASB114BASB114基因的序列在粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617中驗(yàn)證。為此，含有編碼成熟粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的BASB114的基因區(qū)域的質(zhì)粒DNA(見實(shí)施例2A)被用作PCR模板。該材料然后進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)DNA擴(kuò)增，使用引物pTLZF5′TGA CAA TTA ATCATC GGC TCG-3′[SEQ ID NO5]和反向pTLZ RV.2 5′GGC TGA AAATCT TCT CTC ATC C-3′[SEQ ID NO6]。然后使用Big Dyes試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增子進(jìn)行DNA測(cè)序(Applied biosystems)，在ABI 373/A DNA測(cè)序儀上按照廠商要求的條件分析。結(jié)果，得到了多核苷酸序列SEQ IDNO3和推測(cè)的多肽序列SEQ ID NO4。這些序列不包括信號(hào)序列，因?yàn)樾盘?hào)序列已從質(zhì)粒中除去。
使用DNASTAR軟件包的MegAlign程序進(jìn)行SEQ ID NO1和3的多核苷酸序列比較，并顯示在

圖1中；同一性的成對(duì)比較表明兩個(gè)BASB114多核苷酸基因序列成熟蛋白編碼區(qū)是100％相同的。使用相同的MegAlign程序，進(jìn)行了SEQ ID NO4的多肽序列比較；并顯示在圖2中；同一性的成對(duì)比較表明兩個(gè)BASB114蛋白序列成熟蛋白編碼區(qū)是100％相同的實(shí)施例2表達(dá)重組BASB114的質(zhì)粒的構(gòu)建ABASB114的克隆將EcoRI和SalI限制位點(diǎn)分別插入正向MC-Lip6-Fn/t-RI(5′-AGGCAG AGG GAA TTC ATG AAT ATG AAA TCA TCA TTA GTA C-3′，SEQ ID NO7)和反向MC-Lip6RCh/t-Sal(5′-AGG CAG AGG GTC GACTTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGG ATT GAC CAA AAG CAGGGT GTG-3′，SEQ ID NO8)擴(kuò)增引物，它們?cè)试SPCR產(chǎn)物定向克隆至大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pTLZ2中，使得BASB114蛋白可以表達(dá)成C末端含有(His)6親和層析標(biāo)志的融合蛋白。BASB114 PCR產(chǎn)物使用硅膠基自旋柱(QiaGen)按照廠商說明由擴(kuò)增產(chǎn)物中純化。為了產(chǎn)生克隆所需的EcoRI和SalI末端，純化的PCR產(chǎn)物用EcoRI和SalI限制酶按照廠商(Life Technologies)說明依次消化完全。
第一次限制消化后，PCR產(chǎn)物同上通過自旋柱純化以除去鹽，在第二次酶消化之前，用無菌水洗脫。消化的DNA片段在與pTLZ2質(zhì)粒連接前使用硅膠基自旋柱再次純化。
B表達(dá)載體制備為了制備連接用的表達(dá)質(zhì)粒pTLZ2，將其用EcoRI和SalI同樣消化完全，然后按照廠商說明用牛腸磷酸酶(CIP，約0.02單位/皮摩爾5′末端，Life Technologies)處理以防止自身連接。將相對(duì)制備的載體約5倍摩爾過量的消化片段用來進(jìn)行連接反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)的20μl連接反應(yīng)(約16℃，約16小時(shí))利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)使用T4 DNA連接酶(約2.0單位/反應(yīng)，Life Technologies)進(jìn)行。連接反應(yīng)(約5μl)的等分試樣按照本領(lǐng)域已知技術(shù)用來轉(zhuǎn)化電感受態(tài)JM109細(xì)胞。在約1.0毫升LB培養(yǎng)液中37℃下生長(zhǎng)約2-3小時(shí)后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板上。在選擇培養(yǎng)基中包括抗生素。平板在37℃溫育約16小時(shí)。單獨(dú)的ApR菌落用無菌牙簽挑出，“片狀”接種新鮮LB ApR平板以及約1.0ml LB ApRR培養(yǎng)液。片狀平板和培養(yǎng)液在標(biāo)準(zhǔn)溫育箱(平板)或水浴搖床上37℃溫育。
進(jìn)行全細(xì)胞PCR分析以確證轉(zhuǎn)化子含有BASB114 DNA插入物。將約1.0毫升LB Ap過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5毫升聚丙烯管中，在Beckman離心機(jī)中離心收集細(xì)胞(約3分鐘，室溫，約12000×g)。細(xì)胞沉淀重懸于約200μl無菌水中，約10μl等分試樣用于進(jìn)行終體積約50μl的PCR反應(yīng)，其中含有BASB114正向和反向擴(kuò)增引物。PCR反應(yīng)成分的終濃度基本上與實(shí)施例2中相同，但使用約5單位Taq聚合酶。開始的95℃變性步驟增加到3分鐘以確保細(xì)菌細(xì)胞的熱裂解和質(zhì)粒DNA的釋放。使用ABI 9700型熱循環(huán)儀，進(jìn)行32循環(huán)的3步熱循環(huán)，循環(huán)條件為95℃ 45秒；55-58℃ 45秒；72℃ 1分鐘，以擴(kuò)增裂解的轉(zhuǎn)化子樣品的BASB114 PCR片段。熱循環(huán)后，取約20μl反應(yīng)等分試樣通過瓊脂糖凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中的0.8％瓊脂糖)進(jìn)行分析。凝膠電泳后使用UV照射和溴化乙錠染色顯示DNA片段。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(1Kb梯度，Life Technologies)與試樣平行電泳，用于估計(jì)PCR產(chǎn)物的大小。產(chǎn)生預(yù)期PCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子鑒定為含有BASB114表達(dá)構(gòu)建體的菌株。然后分析含有表達(dá)質(zhì)粒的菌株中重組BASB114的誘導(dǎo)表達(dá)。
CPCR陽性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)分析對(duì)于以上鑒定的每一個(gè)PCR陽性轉(zhuǎn)化子，約5毫升含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)液用來自片狀平板的細(xì)胞接種，37℃振蕩(約250rpm)生長(zhǎng)過夜。過夜種子培養(yǎng)物的等分試樣(約1.0ml)接種含有約25毫升LB Ap培養(yǎng)液的125毫升燒瓶中，37℃振蕩(約250rpm)生長(zhǎng)過夜，直至培養(yǎng)物濁度達(dá)到O.D.600約為0.5，即中對(duì)數(shù)期(通常需約1.5到2.0小時(shí))。此時(shí)，約一般培養(yǎng)物(約12.5ml)被轉(zhuǎn)移到第二個(gè)125毫升燒瓶中，通過加入IPTG(無菌水中制備的1.0M原液，Sigma)至終濃度1.0mM誘導(dǎo)重組BASB114蛋白的表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)物在37℃下再振蕩溫育約4小時(shí)。誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)物樣品(約1.0毫升)在誘導(dǎo)期后取出，室溫下在離心機(jī)中離心約3分鐘收集細(xì)胞。單獨(dú)的細(xì)胞沉淀懸浮于約50μl無菌水中，然后與等體積含有2-巰基乙醇的2×Laemmli SDS-PAGE樣品緩沖液混合，置于沸水浴中約3分鐘以變性蛋白。等體積(約15μl)IPTG誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)細(xì)胞粗裂解物上樣于兩塊12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚Mini-gels，Novex)。誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)裂解物樣品與預(yù)先染色的分子量標(biāo)記(SeeBlue，Novex)在常規(guī)條件下一起電泳，使用標(biāo)準(zhǔn)SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)。電泳后，一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250(BioRad)染色，然后脫色以顯示新的BASB114 IPTG誘導(dǎo)蛋白。第二塊凝膠使用BioRad Mini-Protean II印跡裝置和Towbin甲醇(20％)轉(zhuǎn)移緩沖液在4℃下電印跡約2小時(shí)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(0.45微米孔徑，Novex)。膜的封閉和抗體溫育按照本領(lǐng)域已知技術(shù)進(jìn)行。使用單克隆抗RGS(His)3抗體，然后是輟合有HRP(QiaGen)的兔抗小鼠抗體，以確證BASB114重組蛋白的表達(dá)和身份。使用ABT不溶底物或使用Amersham ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的Hyperfilm顯示抗His抗體反應(yīng)性特征。
實(shí)施例3產(chǎn)生重組BASB114細(xì)菌菌株含有編碼粘膜炎莫拉氏菌BASB114的質(zhì)粒(pTLZ2)的大腸桿菌JM109重組表達(dá)菌株被用來產(chǎn)生純化重組蛋白的細(xì)胞群體。表達(dá)菌株在LB瓊脂平板上培養(yǎng)，平板中含有100μg/ml氨芐青霉素(Ap)以確保pTLZ2質(zhì)粒存在。為了在-80℃下冷藏，菌株在含有相同濃度的抗生素的LB培養(yǎng)液中增殖，然后與等體積含有30％(w/v)甘油的LB培養(yǎng)液混合。
培養(yǎng)基用于產(chǎn)生重組蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基為含有100μg/ml Ap的2X YT培養(yǎng)液(Difco)。向發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基加入消泡劑至0.25ml/L(Antifoam204，Sigma)。為了誘導(dǎo)BASB114重組蛋白的表達(dá)，向發(fā)酵罐中加入IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃苷)(1mM，終濃度)。
發(fā)酵含有50毫升工作體積的500毫升種子培養(yǎng)燒瓶中接種0.3毫升迅速解凍的冰凍培養(yǎng)物或來自選擇性瓊脂平板上的幾個(gè)菌落，在搖床(Innova 2100，New Brunswick Scientific)上以150rpm在37±1℃溫育約12小時(shí)。該種子培養(yǎng)物用來接種含有2X YT培養(yǎng)液和Ap、工作體積為5升的發(fā)酵罐。發(fā)酵罐(Bioflo 3000，New Brunswick Scientific)的運(yùn)行條件為37±1℃、0.2-0.4VVM通氣、Rushton葉輪250rpm。燒瓶種子培養(yǎng)物和發(fā)酵罐中的pH無需控制。發(fā)酵期間，發(fā)酵罐中的pH為6.5到7.3。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到生長(zhǎng)的中對(duì)數(shù)期時(shí)(O.D.600為約0.7單位)，向發(fā)酵罐中加入IPTG(1.0M原液，在無菌水中制備)。誘導(dǎo)細(xì)胞2-4小時(shí)，然后，使用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速離心機(jī)(Srovall Instruments)離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀保存在-20℃待用。
純化化學(xué)藥品和材料咪唑和Triton X-100均購自Merck。抑酶肽和Triton X-114獲自Sigma Chemical Company。AEBSF來自ICN-Biochemicals。所有其它化學(xué)藥品均為試劑級(jí)或更優(yōu)級(jí)別。
無BSA的Ni-NTA Superflow樹脂和Penta-His抗體獲自Qiagen。MicroBCA試驗(yàn)獲自Pierce；Amicon 3濾器獲自Millipore。透析膜(MWCO12-14000)獲自MFPI，USA。分子量標(biāo)志(BenchMarkladder)獲自Life-technologies。
實(shí)施例4由大腸桿菌中純化重組BASB114提取純化來自750毫升IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物(約4小時(shí)，OD620＝0.5)的細(xì)胞沉淀重懸于60毫升磷酸緩沖液，pH7.5，含有1mM AEBSF和1mM抑酶肽作為蛋白酶抑制劑。細(xì)胞在細(xì)胞破碎器中裂解。裂解物4℃下使用1.5％Triton X-114進(jìn)行洗滌劑分離2小時(shí)，4℃下3000g離心30分鐘。提取物加熱到37℃ 15分鐘，20℃下1000g離心10分鐘。Triton相(下相)用含有0.3M氯化鈉、0.005％Triton X-100，10％甘油(緩沖液A)的磷酸緩沖液，pH7.5稀釋到15毫升，并分批上樣到Ni-NTASuperflow樹脂(過夜溫育)。樹脂用緩沖液A洗滌。蛋白用緩沖液A洗脫，緩沖液中依次含有50mM，100mM和200mM咪唑。含有BASB114蛋白的級(jí)分合并并對(duì)含有0.1％Triton X-100的PBS緩沖液pH7.4透析。
純化的BASB114蛋白使用Micro BCA試驗(yàn)試劑定量。得到了3毫克純化蛋白，終濃度為175μg/ml。如圖3A所示，純化BASB114蛋白在SDS-PAGE分析中是一個(gè)以約30kDa(估計(jì)相對(duì)分子量)遷移的主帶。純度估計(jì)大于80％。BASB114蛋白與小鼠抗6組氨酸基元單克隆抗體有反應(yīng)(圖3B)。
實(shí)施例5產(chǎn)生重組BASB114抗血清多價(jià)抗BASB114蛋白血清通過用純化重組BASB114蛋白免疫六只小鼠產(chǎn)生。每只動(dòng)物通過皮下注射給予3次免疫，每次10μg BASB114蛋白，間隔約14天。在首次免疫之前(前血樣)和最后一次免疫后一周，由動(dòng)物取血。
抗BASB114蛋白滴度使用純化重組BASB114蛋白(4μg/孔)通過ELISA測(cè)定。該滴度定義為使用XL Fit軟件通過4參數(shù)邏輯模型計(jì)算的中點(diǎn)滴度。小鼠血清中，免疫后滴度為1∶1720。
實(shí)施例6免疫鑒定蛋白質(zhì)印跡分析粘膜炎莫拉氏菌216于36℃在Muller Hinton瓊脂平板上培養(yǎng)24小時(shí)。幾個(gè)菌落用來接種250毫升燒瓶中的50毫升BHI培養(yǎng)液。培養(yǎng)物在200rpm培養(yǎng)約5小時(shí)，直至A620為約0.6，然后收集離心。細(xì)胞濃縮10倍，4×108CFU在150微升PAGE樣品緩沖液中溶解(360mM Tris緩沖液，pH8.8，含有4％十二烷基硫酸鈉和20％甘油)。100℃溫育懸液5分鐘。溶解的細(xì)胞在4-20％聚丙烯酰胺凝膠上分離，分離的蛋白如前所述(Thebaine et al.1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA764350-4354)100伏1小時(shí)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜然后用50毫升含有3％牛血清白蛋白(BSA)的Dulbecco磷酸緩沖鹽水預(yù)處理。隨后所有溫育使用該預(yù)處理緩沖液進(jìn)行。
硝酸纖維素膜用1∶10稀釋的免疫前血清或小鼠免疫血清250微升室溫溫育2小時(shí)。硝酸纖維素膜然后用洗滌緩沖液(含有150mM氯化鈉和0.05％Tween-20的20mM Tris緩沖液，pH7.5)洗滌3次。硝酸纖維素膜用50毫升1∶500稀釋的生物素標(biāo)記綿羊抗小鼠Ig(Amersham Life Science Products)室溫溫育60分鐘。硝酸纖維素膜然后用洗滌緩沖液洗滌3次，用50毫升1∶1000稀釋的鏈親和素-過氧化物酶(Amersham)室溫溫育60分鐘。硝酸纖維素膜然后用洗滌緩沖液洗滌3次，用4-氯-1-萘酚(Sigma)各顯色10分鐘。
在莫拉氏菌216菌株中檢測(cè)到與抗血清反應(yīng)的約20kDa(相當(dāng)于BASB114預(yù)期的分子量)蛋白(圖4，箭頭所示為泳道)。
實(shí)施例8BASB114疫苗的效力提高小鼠中粘膜炎莫拉氏菌的肺清除該小鼠模型基于免疫小鼠標(biāo)準(zhǔn)鼻內(nèi)攻擊后粘膜炎莫拉氏菌肺侵入的分析。每組6只BALB/c小鼠(雌性、6周齡)用100μl相當(dāng)于10μg劑量的疫苗皮下免疫，2周后加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后一周，在麻醉下(小鼠用鹽酸氯胺酮和賽拉嗪麻醉劑麻醉，100μl麻醉劑包括0.24mg賽拉嗪(Rompun)和0.8mg鹽酸氯胺酮(Imalgene))通過向左鼻滴注50微升細(xì)菌懸液(5 105CFU/50μl)攻擊小鼠。攻擊后4小時(shí)處死小鼠，無菌取出肺，單獨(dú)勻漿。將20微升5倍系列稀釋的勻漿物涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板上，通過計(jì)數(shù)平板上生長(zhǎng)的菌落確定log10加權(quán)平均CFU/肺。計(jì)算各組中l(wèi)og10加權(quán)平均CFU/肺的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
設(shè)定差異等值(通過Brown和Forsythe測(cè)試)和常態(tài)(使用Shapiro-Wilk測(cè)試)后，通過運(yùn)用1通路ANOVA對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異使用Dunnet測(cè)試、Tukey學(xué)生氏化全距測(cè)試(HSD)和Student-Newman-Keuls測(cè)試分析。試驗(yàn)組小鼠用吸附在AlPO4上的BASB114(10μg BASB114吸附到100μg AlPO4上)或吸附在AlPO4上的粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617菌株的滅活全細(xì)胞(kwc)制劑(5 108細(xì)胞吸附到100μg AlPO4上)或無抗原的100μg AlPO4免疫。小鼠用5 105CFU粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617活細(xì)菌攻擊。攻擊后4小時(shí)計(jì)算各組中l(wèi)og10加權(quán)平均CFU/肺和標(biāo)準(zhǔn)差。假免疫小鼠攻擊后4小時(shí)具有5.41(+/-0.2)的log10 CFU/肺。與對(duì)照組相比，kwc制劑誘導(dǎo)顯著的肺清除(1.6log差異)。與對(duì)照組相比，BASB114疫苗誘導(dǎo)的肺清除差異為1.45log，這與對(duì)照明顯不同。
保藏材料含有粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株的保藏物已于1997年6月21日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(這里表示為“ATCC”)進(jìn)行保藏，保藏號(hào)為43617。該保藏物為粘膜炎布蘭漢氏球菌(Frosch和Kolle)，是一種從患有慢性支氣管炎的礦工氣管吸出物獲得的粘膜炎莫拉氏菌分離物構(gòu)建的1.5-2.9kb插入文庫的凍干物。該保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21506-508(1982)中介紹。
該粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在此被稱為“保藏菌株”或“保藏菌株的DNA”。
保藏菌株含有全長(zhǎng)的BASB114基因。
由粘膜炎莫拉氏菌DNA插入pQE30組成的載體pMC-D15于1999年2月12日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，保藏號(hào)為207105。
保藏菌株/克隆中所含的多核苷酸以及編碼的任何多肽的氨基酸序列與本文的序列描述不一致時(shí)，以前者為準(zhǔn)。
保藏菌株的保藏是根據(jù)《國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約》的條款進(jìn)行的。在專利被授予時(shí)，該菌株即可不受限制地?zé)o條件向公眾發(fā)放。提供該保藏菌株僅為方便本領(lǐng)域技術(shù)人員，并不表明本發(fā)明的實(shí)施需要該保藏材料，如同35U.S.C.ξ112的要求。
序列信息BASB114多核苷酸和多肽序列SEQ ID NO1粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617菌株BASB114多核苷酸序列ATGAATATGAAATCATCATTAGTGCTAGTGATGCTGGCAGGCTTATCATTGAGTGCATGTAATAAAAAAGAAGAAACCGTTGTTCAGCCCAATGAACCTGTTACCGCCACAGCTGATGCTGCTGTCGTTGATGCTACCGCTACCACTGGTACGCACCAGCCTGAGGTTGCTGTTGTTGATGGTGTGGGTGTTGTATTACCACAATCAACTTATACAGGTACTTTGCCTTGTGCTGACTGCTCTGGCGTTCAAACTGACCTAACGCTTAACTCTGATGGCACATTTGTGATGAAGCAGGATTATTTGGGCAAGCCGAACGGTCAAGTAACCACTCAAGGTACTTATGACATCAATGGCGTGGATAATCAATATGTCCTACTACACCCTAATGATCATGCTGACACGCCTCCTTATTTGATTTATATGGATAAAGACAGTGTTCAATTTCGTGATTTAGAAAATGGCGAAACACCGACACCTAGCCACACCCTGCTTTTGGTCAATCCTTAASEQ ID NO2由SEQ ID NO1多核苷酸序列推導(dǎo)的粘膜炎莫拉氏菌BASB114多肽序列MNMKSSLVLVMLAGLSLSACNKKEETVVQPNEPVTATADAAVVDATATTGTHQPEVAVVDGVGVVLPQSTYTGTLPCADCSGVQTDLTLNSDGTFVMKQDYLGKPNGQVTTQGTYDINGVDNQYVLLHPNDHADTPPYLIYMDKDSVQFRDLENGETPTPSHTLLLVNPSEQ ID NO3粘膜炎莫拉氏菌ATCC43617菌株BASB114多核苷酸序列ATGAATATGAAATCATCATTAGTGCTAGTGATGCTGGCAGGCTTATCATTGAGTGCATGTAATAAAAAAGAAGAAACCGTTGTTCAGCCCAATGAACCTGTTACCGCCACAGCTGATGCTGCTGTCGTTGATGCTACCGCTACCACTGGTACGCACCAGCCTGAGGTTGCTGTTGTTGATGGTGTGGGTGTTGTATTACCACAATCAACTTATACAGGTACTTTGCCTTGTGCTGACTGCTCTGGCGTTCAAACTGACCTAACGCTTAACTCTGATGGCACATTTGTGATGAAGCAGGATTATTTGGGCAAGCCGAACGGTCAAGTAACCACTCAAGGTACTTATGACATCAATGGCGTGGATAATCAATATGTCCTACTACACCCTAATGATCATGCTGACACGCCTCCTTATTTGATTTATATGGATAAAGACAGTGTTCAATTTCGTGATTTAGAAAATGGCGAAACACCGACACCTAGCCACACCCTGCTTTTGGTCAATCCTSEQ ID NO4由SEQ ID NO3多核苷酸序列推導(dǎo)的粘膜炎莫拉氏菌BASB114多肽序列MNMKSSLVLVMLAGLSLSACNKKEETVVQPNEPVTATADAAVVDATATTGTHQPEVAVVDGVGVVLPQSTYTGTLPCADCSGVQTDLTLNSDGTFVMKQDYLGKPNGQVTTQGTYDINGVDNQYVLLHPNDHADTPPYLIYMDKDSVQFRDLENGETPTPSHTLLLVNPSEQ ID NO5TGA CAA TTA ATC ATC GGC TCGSEQ ID NO6GGC TGA AAA TCT TCT CTC ATC CSEQ ID NO7AGG CAG AGG GAA TTC ATG AAT ATG AAA TCA TCA TTA GTG CSEQ ID NO8AGG CAG AGG GTC GAC TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG AGG ATT GACCAA AAG CAG GGT GTG
序列表<110>史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司(SmithKline Beecham Biologicals SA)<120>新化合物(Nove1 compounds)<130>BM45405<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>510<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>1atgaatatga aatcatcatt agtgctagtg atgctggcag gcttatcatt gagtgcatgt 60aataaaaaag aagaaaccgt tgttcagccc aatgaacctg ttaccgccac agctgatgct120gctgtcgttg atgctaccgc taccactggt acgcaccagc ctgaggttgc tgttgttgat180ggtgtgggtg ttgtattacc acaatcaact tatacaggta ctttgccttg tgctgactgc240tctggcgttc aaactgacct aacgcttaac tctgatggca catttgtgat gaagcaggat300tatttgggca agccgaacgg tcaagtaacc actcaaggta cttatgacat caatggcgtg360gataatcaat atgtcctact acaccctaat gatcatgctg acacgcctcc ttatttgatt420tatatggata aagacagtgt tcaatttcgt gatttagaaa atggcgaaac accgacacct480agccacaccc tgcttttggt caatccttaa 510<210>2<211>169<212>PRT<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellla catarrhalis)<400>2Met Asn Met Lys Ser Ser Leu Val Leu Val Met Leu Ala Gly Leu Ser1 5 10 15Leu Ser Ala Cys Asn Lys Lys Glu Glu Thr Val Val Gln Pro Asn Glu20 25 30Pro Val Thr Ala Thr Ala Asp Ala Ala Val Val Asp Ala Thr Ala Thr35 40 45Thr Gly Thr His Gln Pro Glu Val Ala Val Val Asp Gly Val Gly Val50 55 60Val Leu Pro Gln Ser Thr Tyr Thr Gly Thr Leu Pro Cys Ala Asp Cys65 70 75 80Ser Gly Val Gln Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ser Asp Gly Thr Phe Val85 90 95Met Lys Gln Asp Tyr Leu Gly Lys Pro Asn Gly Gln Val Thr Thr Gln100 105 110Gly Thr Tyr Asp Ile Asn Gly Val Asp Asn Gln Tyr Val Leu Leu His115 120 125Pro Asn Asp His Ala Asp Thr Pro Pro Tyr Leu Ile Tyr Met Asp Lys130 135 140Asp Ser Val Gln Phe Arg Asp Leu Glu Asn Gly Glu Thr Pro Thr Pro145 150 155 160Ser His Thr Leu Leu Leu Val Asn Pro165<210>3<211>507<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>3atgaatatga aatcatcatt agtgctagtg atgctggcag gcttatcatt gagtgcatgt 60aataaaaaag aagaaaccgt tgttcagccc aatgaacctg ttaccgccac agctgatgct120gctgtcgttg atgctaccgc taccactggt acgcaccagc ctgaggttgc tgttgttgat180ggtgtgggtg ttgtattacc acaatcaact tatacaggta ctttgccttg tgctgactgc240tctggcgttc aaactgacct aacgcttaac tctgatggca catttgtgat gaagcaggat300tatttgggca agccgaacgg tcaagtaacc actcaaggta cttatgacat caatggcgtg360gataatcaat atgtcctact acaccctaat gatcatgctg acacgcctcc ttatttgatt420tatatggata aagacagtgt tcaatttcgt gatttagaaa atggcgaaac accgacacct480agccacaccc tgcttttggt caatcct507<210>4<211>169<212>PRT<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>4Met Asn Met Lys Ser Ser Leu Val Leu Val Met Leu Ala Gly Leu Ser1 5 10 15Leu Ser Ala Cys Asn Lys Lys Glu Glu Thr Val Val Gln Pro Asn Glu20 25 30Pro Val Thr Ala Thr Ala Asp Ala Ala Val Val Asp Ala Thr Ala Thr35 40 45Thr Gly Thr His Gln Pro Glu Val Ala Val Val Asp Gly Val Gly Val50 55 60Val Leu Pro Gln Ser Thr Tyr Thr Gly Thr Leu Pro Cys Ala Asp Cys65 70 75 80Ser Gly Val Gln Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ser Asp Gly Thr Phe Val85 90 95Met Lys Gln Asp Tyr Leu Gly Lys Pro Asn Gly Gln Val Thr Thr Gln100 105 110Gly Thr Tyr Asp Ile Asn Gly Val Asp Asn Gln Tyr Val Leu Leu His115 120 125Pro Asn Asp His Ala Asp Thr Pro Pro Tyr Leu Ile Tyr Met Asp Lys130 135 140Asp Ser Val Gln Phe Arg Asp Leu Glu Asn Gly Glu Thr Pro Thr Pro145 150 155 160Ser His Thr Leu Leu Leu Val Asn Pro165<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5tgacaattaa tcatcggctc g 21
<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6ggctgaaaat cttctctcat cc 22<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7aggcagaggg aattcatgaa tatgaaatca tcattagtgc 40<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8aggcagaggg tcgacttaat ggtgatggtg atggtgagga ttgaccaaaa gcagggtgtg60
權(quán)利要求
1.含有如下氨基酸序列的分離多肽，該氨基酸序列與選自SEQID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列全長(zhǎng)序列具有至少85％的同一性。
2.權(quán)利要求1的分離多肽，其中氨基酸序列與選自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列全長(zhǎng)序列具有至少95％的同一性。
3.權(quán)利要求1的分離多肽，含有選自SEQ ID NO2和SEQ IDNO4的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO2或4的分離多肽。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原活性基本上與SEQ ID NO2或4的多肽相同。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽是較大融合蛋白的一部分。
7.編碼權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽的分離多核苷酸。
8.含有編碼與SEQ ID NO2或4的氨基酸序列全長(zhǎng)序列具有至少85％的同一性的核苷酸序列的分離多核苷酸；或與該分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
9.含有與編碼SEQ ID NO2或4的多肽全部編碼區(qū)的核苷酸序列具有至少85％的同一性的核苷酸序列的分離多核苷酸；或與該分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
10.含有與SEQ ID NO1或3的全長(zhǎng)序列具有至少85％的同一性的核苷酸序列的分離多核苷酸；或與該分離多核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。
11.權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的分離多核苷酸，其中與SEQ ID NO1或3的同一性為至少95％。
12.含有編碼SEQ ID NO2或4的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸。
13.含有SEQ ID NO1或3的多核苷酸的分離多核苷酸。
14.含有編碼SEQ ID NO2、SEQ ID NO4的多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸，它可通過在嚴(yán)緊雜交條件下，用具有SEQ ID NO1或3或其片段的序列的標(biāo)記探針篩選合適的文庫獲得。
15.含有權(quán)利要求7-14任一項(xiàng)的分離多核苷酸的表達(dá)載體或重組的活微生物。
16.含有權(quán)利要求15的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞或表達(dá)一種分離多肽的該宿主細(xì)胞的亞細(xì)胞級(jí)分或膜，所述分離多肽含有與選自SEQ IDNO2和SEQ ID NO4的氨基酸序列具有至少85％的同一性的氨基酸序列。
17.生產(chǎn)權(quán)利要求1-6的多肽的方法，包括在足以產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)基中回收該多肽。
18.表達(dá)權(quán)利要求7-14任一項(xiàng)的多核苷酸的方法，包括用含有至少一種所述多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在足以表達(dá)任何一種所說多核苷酸的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
19.含有有效量的權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的多肽和可藥用載體的疫苗組合物。
20.含有有效量的權(quán)利要求7至14任一項(xiàng)的多核苷酸和可藥用載體的疫苗組合物。
21.權(quán)利要求19或20任一項(xiàng)的疫苗組合物，其中所述組合物至少含有一種另外的粘膜炎莫拉氏菌抗原。
22.對(duì)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的多肽或免疫性片段具有免疫特異性的抗體。
23.診斷莫拉氏菌感染的方法，包括鑒定在來自懷疑具有這種感染的動(dòng)物的生物樣品中存在的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽、或?qū)λ龆嚯木哂忻庖咛禺愋缘目贵w。
24.含有免疫有效量的權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的多肽的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
25.含有免疫有效量的權(quán)利要求7-14任一項(xiàng)的多核苷酸的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的用途。
26.用于治療患有粘膜炎莫拉氏菌疾病的人的治療組合物，它包括至少一種抗權(quán)利要求1-6的多肽的抗體以及合適的藥用載體。
全文摘要
本發(fā)明提供BASB114多肽和編碼BASB114多肽的多核苷酸以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)這種多肽的方法。本發(fā)明還提供診斷性、預(yù)防性和治療性的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1367790SQ00811120
公開日2002年9月4日 申請(qǐng)日期2000年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月30日
發(fā)明者J·通納德 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司