專利名稱：用于抑制人eg5表達(dá)的寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，其序列對(duì)應(yīng)于編碼人eg5或人eg5突變形式的核酸序列的特定部分。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備寡核苷酸的方法及其應(yīng)用。
在有絲分裂期，基于微管的紡錘體器有助于將復(fù)制的染色體等分到子細(xì)胞中。驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)的動(dòng)力蛋白是紡錘體組裝和染色體分離所需的部分力量。雙極有絲分裂紡錘體的形成涉及許多不同的動(dòng)力蛋白的活性。一種人驅(qū)動(dòng)蛋白相關(guān)的動(dòng)力蛋白是人eg5，它與有絲分裂中心體相互作用，對(duì)雙極紡錘體形成是必需的(Blangy等，Cell(1995)83，1159)。顯微注射特異性抗人eg5抗體可阻斷中心體的遷移，并引起細(xì)胞有絲分裂停滯。
阻斷雙極紡錘體形成的另一種可能是抑制eg5表達(dá)。一種特異的抑制eg5表達(dá)的方法是使用能被任選修飾以改進(jìn)其特性的反義寡核苷酸(E.Uhlmann和A.Peyman，Chemical Reviews 90，543(1990)；S.Agrawal，TIBTECH 1996，376)。據(jù)認(rèn)為反義寡核苷酸結(jié)合mRNA的特異序列，導(dǎo)致mRNA的降解和/或蛋白合成的抑制。
本發(fā)明提供對(duì)應(yīng)于eg5編碼序列的一部分的寡核苷酸或其衍生物，其中所述eg5編碼序列優(yōu)選人eg5或病原生物(如惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)(瘧疾))eg5的編碼序列。該寡核苷酸優(yōu)選對(duì)應(yīng)于eg5序列的8-100個(gè)核苷酸，特別優(yōu)選8-20個(gè)核苷酸。該寡核苷酸或其衍生物可與所述序列結(jié)合并抑制eg5蛋白的形成。已報(bào)道過(guò)人eg5序列(Blangy等，Cell(1995)83，1159)。SEQ ID NO20是人eg5編碼序列的例子。SEQ ID NO21是惡性瘧原蟲(chóng)eg5序列的例子。
優(yōu)選地，寡核苷酸具有對(duì)應(yīng)于編碼人eg5或惡性瘧原蟲(chóng)eg5的核酸序列一部分的序列。短語(yǔ)“對(duì)應(yīng)于”意指寡核苷酸的堿基序列與編碼eg5的核酸序列(如基因、cDNA、mRNA)的一部分互補(bǔ)，因而使得寡核苷酸可與eg5編碼核酸的“有義部分”雜交(結(jié)合)。這就是它為什么被稱作“反義寡核苷酸”的原因。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明寡核苷酸是反義寡核苷酸。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明寡核苷酸是核酶。核酶是切割mRNA的催化性核酸。優(yōu)選地，該核酶選自錘頭型核酶組(Vaish et s1.，Nucleic Acids Res.(1998)26，5237)。
根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸與eg5 mRNA適于雜交的部分結(jié)合并抑制eg5蛋白形成。例如，適合于結(jié)合eg5 mRNA并抑制表達(dá)的寡核苷酸被定向到eg5的翻譯起始區(qū)。
eg5編碼核酸序列對(duì)應(yīng)于該寡核苷酸的部分長(zhǎng)度為8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)或更多核苷酸，并且優(yōu)選地，該寡核苷酸對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)度為12或19個(gè)核苷酸的eg5編碼序列。因此，按照本發(fā)明的寡核苷酸長(zhǎng)度為10(10mer)、11(11mer)、12(12mer)、13(13mer)、14(14mer)、15(15mer)、16(16mer)、17(17mer)、18(18mer)或19(19mer)個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為12或19個(gè)核苷酸，這些寡核苷酸可以具有例如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9之一的序列或其一部分，其中SEQ ID NO.13-′CTTAAGGCAGTACCGCAGC-5’；5′CGACGCCATGACGGAATTC-3′SEQ ID NO.23′-ACCACTCTACGTCTGGTAA-5′；5′-AATGGTCTGCATCTCACCA-3′SEQ ID NO.33′-GGCAGTACCGCAGCGTCGG-5′；5′-GGCTGCGACGCCATGACGG-3′SEQ ID NO.43′-CTTAAGGCAGTA-5′；5′-ATGACGGAATTC-3′SEQ ID NO.53′-TAAGGCAGTACC-5′；5′-CCATGACGGAAT-3′SEQ ID NO.63′-GGCAGTACCGCA-5′；5′-ACGCCATGACGG-3′SEQ ID NO.73′-AGTACCGCAGCG-5′；5′-GCGACGCCATGA-3′SEQ ID NO.83′-CCGCAGCGTCGG-5′；5′-GGCTGCGACGCC-3′SEQ ID NO.93′-GCAGCGTCGGTT-5′；5′-TTGGCTGCGACG-3′.
特別優(yōu)選修飾寡核苷酸以改進(jìn)其特性，例如增加其對(duì)核酸酶的抗性或使其對(duì)核酸酶有抗性、提高其對(duì)互補(bǔ)eg5編碼核酸(如mRNA)的結(jié)合親和性、或增加細(xì)胞對(duì)其的攝取。
因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及具有上述特定序列的寡核苷酸，此外，與“天然”DNA相比，該寡核苷酸具有一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾，其中“天然”DNA由通過(guò)核苷間磷酸二酯橋連接的“天然”核苷，即脫氧腺苷(腺嘌呤+β-D-2’-脫氧核糖)、脫氧鳥(niǎo)苷(鳥(niǎo)嘌呤+β-D-2’-脫氧核糖)、脫氧胞苷(胞嘧啶+β-D-2’-脫氧核糖)和胸苷(胸腺嘧啶+β-D-2’-脫氧核糖)，組成。寡核苷酸可具有一或多個(gè)同類型的修飾和/或不同類型的修飾；每一種類型的修飾都可獨(dú)立于其它類型，從已知用于修飾寡核苷酸的修飾中選取。
本發(fā)明還涉及所述寡核苷酸的衍生物，例如它們的鹽，特別是它們的生理耐受鹽。例如Remingtons Pharmaceuticals Science(1985)，MackPublishing Company，Easton，PA(第1418頁(yè))中描述了鹽及生理耐受鹽。衍生物還涉及有一個(gè)或多個(gè)修飾(例如在特定的核苷酸位置和/或在特定的核苷間橋處)的修飾寡核苷酸，寡核苷酸類似物(例如聚酰胺-核酸(PNA)、磷酸單酯核酸(PHONAs＝PMENAs)，寡核苷酸嵌合物(例如由DNA和PNA部分組成或由DNA和PHONA部分組成))。衍生物還涉及對(duì)應(yīng)于正?；蛱烊籩g5的等位基因和/或突變體形式(例如人eg5(例如相對(duì)于SEQ IDNO.20)的等位基因和/或突變體和惡性瘧原蟲(chóng)eg5(例如相對(duì)于SEQ IDNO.21)的等位基因和/或突變體)的寡核苷酸。
化學(xué)修飾的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并描述在例如E.Uhlmann和A.Peyman，Chemical Reviews 90(1990)543；“Protocols forOligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties & Synthesisand Analytical Techniques，S.Agrawal編，Humana Press，Totowa，USA1993；S.T.Crooke，F(xiàn).Bennet，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.36(1996)107-129；J.Hunziker和C.Leuman(1995)Mod.Synt.methods，7，331-417。
例如，與天然DNA相比，核苷間磷酸二酯橋、β-D-2’-脫氧核糖單位和/或天然核苷堿基(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶)能被分別修飾或替代。與由天然DNA組成的相同序列的寡核苷酸相比，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可以有一個(gè)或多個(gè)修飾，其中每個(gè)修飾位于特定的核苷間磷酸二酯橋和/或特定的β-D-2’-脫氧核糖單位和/或特定的天然核苷堿基位置。
例如，本發(fā)明涉及寡核苷酸，其包含一個(gè)或多個(gè)修飾，并且其中每個(gè)修飾獨(dú)立地選自a)用修飾的核苷間橋替代位于核苷3’和/或5’末端的核苷間磷酸二酯橋，b)用脫磷酸橋(dephospho bridge)替代位于核苷3’和/或5’末端的磷酸二酯橋，c)用另一個(gè)單位替代糖磷酸酯主鏈中的糖磷酸酯單位，d)用修飾的糖單位替代β-D-2’-脫氧核糖單位，e)用修飾的核苷堿基替代天然的核苷堿基，f)與影響寡核苷酸性質(zhì)的分子偶聯(lián)，g)與2’5’-連接的寡腺苷酸或其衍生物偶聯(lián)，任選通過(guò)適當(dāng)?shù)慕宇^進(jìn)行該偶聯(lián)，和h)在寡核苷酸3’和/或5’末端引入3’-3’和/或5’-5’倒位。
寡核苷酸化學(xué)修飾的更詳細(xì)的實(shí)例有a)用修飾的核苷鍵替代位于核苷3’和/或5’末端的核苷間磷酸二酯橋，其中修飾的核苷間橋選自例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR1R1’-氨基磷酸酯、boranophosphate、磷酸-(C1-C21)-O-烷基酯、磷酸-[(C6-C12)-芳基-(C1-C21)-O-烷基]酯、磷酸(C1-C8)-烷基酯((C1-C8)-alkyl-phosphonate)和/或磷酸(C6-C12)芳基酯((C6-C12)arylphosphonate)橋和(C7-C12)-α-羥甲基-芳基(例如在WO 95/01363中公開(kāi)的)，其中(C6-C12)-芳基、(C6-C20)-芳基和(C6-C14)-芳基任選被鹵素、烷基、烷氧基、硝基或氰基取代，并且其中R1和R1’相互獨(dú)立地是氫、(C1-C18)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C14)-芳基-(C1-C8)-烷基，優(yōu)選氫、(C1-C8)-烷基，優(yōu)選(C1-C4)-烷基和/或甲氧基乙基，或R1和R1’與攜帶它們的氮原子一起，形成5元到6元的雜環(huán)，該雜環(huán)還能再包含從O、S和N選取的雜原子，b)用脫磷酸橋(脫磷酸橋描述于例如Uhlmann，E.和Peyman，A.，“Methods in Molecular Biology”，第20卷，“Protocols forOligonucleotides and Analogs”，S.Agrawal編，Humana Press，Totowa1993，第16章，355ff)替代位于核苷3’和/或5’末端的磷酸二酯橋，其中脫磷酸橋是例如formacetal、3’-thioformacetal、甲基羥胺、肟、亞甲基二甲基亞肼基(methylenedimethyl-hydrazo)、二亞甲基砜(dimethylenesulfone)和/或甲硅烷基；c)用另一個(gè)單位替代糖磷酸酯主鏈(糖磷酸酯主鏈由糖磷酸酯單位組成)中的糖磷酸酯單位(β-D-2’-脫氧核糖和核苷間磷酸二酯橋一起形成糖磷酸酯單位)，其中另一個(gè)單位例如適于構(gòu)造-“嗎啉代衍生”的寡聚物(例如描述于E.P.Stirchak等，Nucleic AcidsRes.17(1989)6129中的)，即例如用嗎啉代衍生單位替代；-聚酰胺核酸(“PNA”)(例如描述于P.E.Nielsen等，Bioconj.Chem.5(1994)3和EP 0672677 A2中的)；即例如用PNA主鏈單位(如2-氨基乙基甘氨酸)替代；-磷酸單酯核酸(“PHONA”)(例如描述于Peyman等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35(1996)2632-2638和EP 0739898 A2中的)；即例如用PHONA主鏈單位替代；d)用修飾的糖單位替代β-D-2’-脫氧核糖單位，其中修飾的糖單位選自例如β-D-核糖、α-D-2’-脫氧核糖、L-2’-脫氧核糖、2’-F-2’-脫氧核糖、2’-O-(C1-C6)-烷基核糖(優(yōu)選的2’-O-(C1-C6)烷基核糖是2’-O-甲基核糖)、2’-(C2-C6)-鏈烯基核糖、2’-[O-(C1-C6)-烷基-O-(C1-C6)-烷基]核糖、2’-NH2-2’-脫氧核糖、β-D-木呋喃糖(β-D-xylo-furanose)、α-阿拉伯呋喃糖、2，4-雙脫氧-β-D-赤型己吡喃糖(2，4-dideoxy-β-D-erythro-hexo-pyranose)和碳環(huán)(例如描述于Froehler，J.Am.Chem.Soc.114(1992)8320)和/或開(kāi)鏈糖類似物(例如描述于Vandendriessche等，Tetrahedron 49(1993)7223)和/或雙環(huán)糖類似物(例如描述于M.Tarkov等，Helv.Chim.Acta 76(1993)481)；
e)用修飾的核苷堿基替代天然核苷堿基，其中修飾的核苷堿基選自例如尿嘧啶、次黃嘌呤、5-(羥甲基)尿嘧啶、N2-二甲基鳥(niǎo)苷、假尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、2，4-二氨基嘌呤、8-氮嘌呤(8-azapurine)、取代的7-脫氮嘌呤(7-deazapurine)(優(yōu)選7-脫氮-7-取代的和/或7-脫氮-8-取代的嘌呤)或天然核苷堿基的其它修飾(例如修飾的核苷堿基描述于EP 0 710 667 A2和EP 0 680 969 A2)；f)與影響寡核苷酸性質(zhì)的分子偶聯(lián)，其中寡核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(有利地)影響寡核苷酸性質(zhì)(例如寡核苷酸穿過(guò)細(xì)胞膜或進(jìn)入細(xì)胞的能力，對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性，對(duì)eg5編碼靶序列的親和力，寡核苷酸的藥物動(dòng)力學(xué)，當(dāng)寡核苷酸與eg5編碼靶序列雜交時(shí)反義寡核苷酸/核酶或與寡核苷酸偶聯(lián)的分子分別進(jìn)攻eg5編碼靶序列的能力，例如結(jié)合和/或交聯(lián)的能力)的分子偶聯(lián)，其中能與寡核苷酸偶聯(lián)的分子的例子有聚賴氨酸、嵌入劑(如嵌二萘、啞啶、吩嗪或菲啶)、熒光劑(例如熒光素)、交聯(lián)劑(如補(bǔ)骨脂素或疊氮硫酸原黃素)、親脂分子(如(C12-C20)-烷基)、脂質(zhì)(如1，2-雙十六烷基外消旋甘油(1，2-dihexadecyl-rac-glycerol))、類固醇(如膽固醇或睪酮)、維生素(如維生素E)、聚或寡聚乙二醇，優(yōu)選通過(guò)磷酸基團(tuán)(例如三甘醇磷酸酯和己甘醇磷酸酯)、磷酸(C2-C18)-烷基二酯和/或O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)烷基連接到寡核苷酸上，這些分子可在該序列的5’末端和/或3’末端和/或內(nèi)部與例如核苷堿基偶聯(lián)，以產(chǎn)生寡核苷酸偶聯(lián)物；制備該寡核苷酸偶聯(lián)物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并描述于例如Uhlmann，E.和Peyman，A.，Chem.Rev.90(1990)543，M.Manoharan，“Antisense Research and Applications”，Crooke和Lebieu編，CRC Press，Boca Raton，1993，第17章，p.303ff，和EP-A 0 552 766；g)與2’5’-連接的寡腺苷酸偶聯(lián)，優(yōu)選通過(guò)適宜的接頭分子來(lái)進(jìn)行，其中2’5’-連接的寡腺苷酸選自例如2’5’連接的三腺苷酸、2’5’連接的四腺苷酸、2’5’連接的五腺苷酸、2’5’連接的六腺苷酸或2’5’連接的七腺苷酸分子及其衍生物，2’5’連接的寡腺苷酸衍生物是例如蛹蟲(chóng)草菌素(2’5’-連接的3’-脫氧腺苷酸)，并且適宜接頭的例子是三甘醇，并且2’5’-連接的寡腺苷酸的5’-末端必須有磷酸、雙磷酸或三磷酸殘基，其中一個(gè)或更多的氧原子能被例如硫原子替代，其中優(yōu)選用磷酸或硫代磷酸殘基替代；和h)在寡核苷酸3’-和/或5’-末端引入3’-3’和/或5’-5’倒位，其中此類化學(xué)修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并描述于例如M.Koga等，J.Org.Chem.56(1991)3757，EP 0464638 EP 0 593 901中。
用另一個(gè)單位(例如可以是PNA主鏈單位或PHONA主鏈單位)對(duì)糖磷酸酯主鏈中糖磷酸酯單位的替代，優(yōu)選用例如PNA單位或PHONA單位替代核苷酸，所述PNA單位或PHONA單位已包含天然核苷堿基和/或修飾的核苷堿基，例如來(lái)自尿嘧啶、次黃嘌呤、5-(羥甲基)尿嘧啶、N2-二甲基鳥(niǎo)苷、假尿嘧啶、5-(羥甲基)尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、假尿嘧啶、二氫尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、2，4-二氨基嘌呤、8-氮嘌呤、取代的7-脫氮嘌呤(優(yōu)選7-脫氮-7-取代的和/或7-脫氮-8-取代的嘌呤)或天然核苷堿基的其它修飾(修飾的核苷堿基描述于例如EP 0 710 667 A2和EP 0 680 969 A2)。
描述于EP 0 710 667 A2、EP 0 680 969 A2、EP 0 464 638、EP 0593 901、WO 95/01363、EP 0 672 677 A2、EP 0 739 898 A2和EP 0 552766中的寡核苷酸修飾在此并入本文作為參考。
在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，寡核苷酸序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)核苷間磷酸二酯橋被修飾；優(yōu)選地，用核苷間硫代磷酸酯橋和/或核苷間磷酸(C6-C12)芳基酯橋，優(yōu)選磷酸α-羥芐基酯(α-hydroxybenzylphosphonate)橋，替代一個(gè)或多個(gè)核苷間磷酸二酯橋，其中該芐基優(yōu)選用例如硝基、甲基和鹵素取代。在全硫代磷酸寡核苷酸中，所有的核苷間磷酸二酯橋都被硫代磷酸酯修飾。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及如下寡核苷酸，其中并非所有核苷間磷酸二酯橋都用硫代磷酸酯(核苷間硫代磷酸酯橋)統(tǒng)一修飾。優(yōu)選地，至少一個(gè)核苷間橋有不同類型的修飾或不被修飾。本發(fā)明特別涉及另外包含至少一種其它類型修飾的寡核苷酸。
在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，寡核苷酸序列內(nèi)部一個(gè)或多個(gè)核苷酸(β-D-2’-脫氧核糖和/或核苷堿基)被修飾；優(yōu)選地，用2’-O-(C1-C6)烷基-核糖，優(yōu)選2’-O-甲基核糖，替換β-D-2’-脫氧核糖，且/或用8-氮嘌呤、7-脫氮-7-取代的嘌呤和/或7-脫氮-8-取代的嘌呤(嘌呤腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤)替換核苷堿基。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及并非所有核苷酸都被統(tǒng)一修飾的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含額外的至少一種其它類型修飾的寡核苷酸。
在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，用PNA主鏈單位，優(yōu)選2-氨基乙基甘氨酸單位，替代糖磷酸酯主鏈中的一個(gè)或多個(gè)糖磷酸酯單位。優(yōu)選地，被替代的糖磷酸酯單位至少在某種程度上連接在一起。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及并非所有糖磷酸酯單位都被統(tǒng)一替代的寡核苷酸。特別是，本發(fā)明涉及嵌合寡核苷酸，例如由一個(gè)或多個(gè)PNA部分和一個(gè)或多個(gè)DNA部分組成的。對(duì)該嵌合寡核苷酸，例如下述修飾模式的非限制性例子是有可能的DNA-PNA，PNA-DNA，DNA-PNA-DNA，PNA-DNA-PNA，DNA-PNA-DNA-PNA，PNA-DNA-PNA-DNA。對(duì)于由DNA部分和PHONA部分組成的嵌合分子，類似的模式是可能的，例如DNA-PHONA，PHONA-DNA，DNA-PHONA-DNA，PHONA-DNA-PHONA，DNA-PHONA-DNA-PHONA和PHONA-DNA-PHONA-DNA。另外，理所當(dāng)然，包含三種不同部分(如DNA部分、PHONA部分和PNA部分)的嵌合分子是有可能的。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含額外的至少一種其它類型修飾的寡核苷酸。
在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，寡核苷酸在其3’-末端和/或其5’-末端連接(C12-C18)烷基殘基(優(yōu)選C16烷基殘基)，三甘醇?xì)埢蚣焊蚀細(xì)埢?，這些殘基優(yōu)選通過(guò)磷酸基團(tuán)連接寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及并非兩個(gè)末端(3’和5’末端)都被(均一)修飾的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含另外的至少一種其它類型修飾的寡核苷酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸序列內(nèi)部?jī)H特定位置被修飾(例如部分修飾的寡核苷酸)。部分修飾的寡核苷酸在某些文獻(xiàn)中也稱為為最小修飾的寡核苷酸。在序列內(nèi)部修飾可位于特定位置(在特定的核苷酸，特定的核苷，特定的核苷堿基，特定的核苷間橋)處。
在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，僅用修飾的核苷間橋(如硫代磷酸酯橋和/或磷酸α-羥芐基酯橋)替代某些磷酸二酯橋來(lái)制備部分修飾的寡核苷酸。特別地，本發(fā)明包含這類僅一定程度修飾的寡核苷酸。
特別地，本發(fā)明涉及如下寡核苷酸，其中5’-末端和/或3’-末端的1-5個(gè)末端核苷酸單位通過(guò)修飾位于相應(yīng)核苷5’-和/或3’-末端的核苷間橋，優(yōu)選用硫代磷酸酯橋和/或磷酸α-羥芐基酯橋替代核苷間磷酸二酯橋，而被保護(hù)。特別優(yōu)選地，通過(guò)修飾位于相應(yīng)核苷5’-和/或3’-末端的核苷間橋來(lái)保護(hù)寡核苷酸3’-末端的1-5個(gè)末端核苷酸單位。任選地，還通過(guò)修飾位于相應(yīng)核苷的5’-和/或3’-末端的核苷間橋來(lái)保護(hù)寡核苷酸5’-末端的1-5個(gè)末端核苷酸單位。任選地，寡核苷酸可能在其它位置還包含修飾。
而且，本發(fā)明涉及如下寡核苷酸，其中至少一個(gè)內(nèi)部嘧啶核苷和/或位于該嘧啶核苷(有嘧啶堿基如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶的核苷)5’-末端和/或3’-末端的核苷間橋被修飾，優(yōu)選通過(guò)用硫代磷酸酯橋和/或磷酸α-羥芐基酯橋替代核苷間磷酸二酯橋來(lái)進(jìn)行。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)修飾位于相應(yīng)核苷5’-和/或3’-末端的核苷間橋來(lái)保護(hù)寡核苷酸5’-末端和/或3’-末端的1-5個(gè)末端核苷酸單位，并且其中還有至少一個(gè)內(nèi)部的嘧啶核苷和/或位于該嘧啶核苷5’-末端的和/或位于該嘧啶核苷3’-末端的核苷間橋被修飾。
部分修飾的寡核苷酸的原理在A.Peyman，E.Uhlmannn，Biol.Chem.Hoppe-Seyler，377(1996)67-70和EP 0 653 439中有描述。該文獻(xiàn)在此并入本文作為參考。在這里，5’-末端/或和3’-末端的1-5個(gè)末端核苷酸單位被保護(hù)，例如，位于相應(yīng)核苷酸3’-和/或5’-末端的核苷間磷酸二酯橋用例如核苷間硫代磷酸酯橋替代。此外，優(yōu)選至少一個(gè)內(nèi)部嘧啶核苷(或核苷酸，分別地，)位置被修飾；優(yōu)選嘧啶核苷的3’-和/或5’-核苷間橋被例如核苷間硫代磷酸酯橋修飾/替代。部分修飾的寡核苷酸顯示特別有優(yōu)勢(shì)的性質(zhì)；例如它們顯示與最小修飾有關(guān)的極高程度的核酸酶穩(wěn)定性。它們也有非反義效果顯著降低的傾向，這常常與使用全硫代磷酸寡核苷酸相關(guān)(Stein和Krieg(1994)Antisense Res.Rev.Dev.4，67)。部分修飾的寡核苷酸也顯示比全硫代磷酸更高的結(jié)合親和性。
本發(fā)明特別涉及部分/最少修飾的寡核苷酸。
SEQ ID NO.103-′C*T*T*A A G G C*A G T*A C*C G*C A G*C-5′， (K3)5′-C G A C*G*C*C*A*T G A*C G G A A*T*T*C-3′；SEQ ID NO.113′-A*C*C*A C*T C*T A C*G T*C*T G G*T A*A-5′，(K4)5′-A*AT*GGT*C*TG*CAT*CT*CA*C*C*A-3′；SEQ ID NO.123′-G*G*C*A G*T A C*C G C*A G*C G T*C G*G-5′， (K6)5′-G*G C*T G C*G A*C G C*C A T*G A*C*G*G-3′；SEQ ID NO.133′-C*T*T*A A G G*C A G*T*A-5′，5′-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3′；SEQ ID NO.143′-T*A*A G G C*A G*T A*C*C-5′，5′-C*C*A T*G A*C G G A*A*T-3′；SEQ ID NO.153′-G*G*C A G*T A C*C*G C*A-5′，5′-A*C G*C*C A T*G A C*G*G-3′；SEQ ID NO.163′-A*G*T A C*C G*C A G*C*G-5′，5′-G*C*G A C*G C*C A T*G*A-3′；SEQ ID NO.173′-C*C*G*C A G*C G T*C G*G-5′，5′-G*G C*T G C*G A C*G*C*C-3′；SEQ ID NO.18 3′-G*C*A G C*G T*C G G*T*T-5′，5′-T*T*G G C*T G C*G A*C*G-3′.
其中“*”表示核苷間橋修飾的位置；優(yōu)選地，“*”是核苷間硫代磷酸酯橋。
本發(fā)明具體實(shí)施方案的另一個(gè)例子涉及部分修飾的寡核苷酸，其中核苷被修飾，例如核苷堿基被修飾和/或β-D-2’脫氧核糖單位被修飾。優(yōu)選地，用2’-O-(C1-C6)-烷基核糖替代β-D-2’-脫氧核糖；特別優(yōu)選用2’-O-甲基核糖替代(用2’-O-甲基核糖核苷替代β-D-2’-脫氧核糖核苷)。
按照本發(fā)明，除了一種類型的修飾外，寡核苷酸也可以有其它類型的修飾。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含特定位置的修飾核苷間橋和特定位置核苷的其它修飾，優(yōu)選β-D-2’-脫氧核糖的替代。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，核苷間修飾是用硫代磷酸酯橋替代磷酸二酯橋，并且β-D-2’-脫氧核糖的修飾是被2’-O-甲基核糖替代；在這種情況下，寡核苷酸是嵌合寡核苷酸，其由修飾的和未修飾的DNA和RNA部分組成，包含2’-O-甲基核糖核苷、β-D-2’-脫氧核糖核苷、以及核苷間磷酸二酯橋和硫代磷酸酯橋。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中提供了具有一個(gè)或多個(gè)(C12-C18)-烷基殘基，優(yōu)選在其3’-和/或5’-末端有C16-烷基殘基，的寡核苷酸。如EP 0 552 766 A2(EP 0 552 766 A2在此并入本文作為參考)所描述的，例如(C12-C18)-烷基殘基可作為磷酸二酯或作為O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-烷基的3’-磷酸二酯結(jié)合。優(yōu)選的是具有結(jié)合到其3’-和/或5’-末端的C16-烷基殘基的寡核苷酸。
本發(fā)明也涉及如下寡核苷酸，其中其3’-和/或5’-末端連接到低聚乙二醇?xì)埢?，?yōu)選三甘醇或己甘醇，特別優(yōu)選經(jīng)磷酸二酯(三或己甘醇磷酸酯)連接。當(dāng)然，該寡核苷酸也可以包含其它的修飾。
在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，寡核苷酸通過(guò)接頭與2’5’-連接的寡腺苷酸-5’-(硫代)磷酸相連接。例如，該接頭是低聚乙二醇磷酸酯，優(yōu)選三甘醇磷酸酯，四甘醇磷酸酯或己甘醇磷酸酯殘基。2’5’-連接的寡腺苷酸優(yōu)選作為5’-羥基官能團(tuán)被磷酸或硫代磷酸殘基取代的四或五腺苷酸，通過(guò)其2’-末端連接。已知2’5’-寡腺苷酸誘導(dǎo)RNase L切割靶mRNA(Torrence等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1993)90，1300)。2’5’寡腺苷酸的作用是活化核糖核酸酶L(RNase L)，然后后者降解eg5 mRNA。能引入從核苷酸類似物蛹蟲(chóng)草菌素衍生的例如2’5’-連接的3’-脫氧腺苷酸，而不是2’5’-連接的腺苷酸。在這種情況下，與靶核酸互補(bǔ)的寡核苷酸部分優(yōu)選在特定位置用2’-O-(C1-C6)-烷基核糖核苷(優(yōu)選2’-O-甲基核糖核苷)或PNA修飾。
本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及用非天然的或修飾的核苷堿基，優(yōu)選8-氮嘌呤和/或7-脫氮-7-取代的嘌呤和/或7-脫氮-8-取代的嘌呤(例如在EP 0 171 066和EP 0 680 969中描述的)，分別替代一個(gè)或多個(gè)天然核苷堿基。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸可在3’-和/或5’-末端顯示3’3’和/或5’5’-倒位，例如在EP 0 464 638和EP 0 593 901中描述的。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及用WO 95/01363所述的磷酸α-羥芐基酯橋替代一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯橋。
在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中寡核苷酸包含糖磷酸酯主鏈的修飾，優(yōu)選用PNA單位進(jìn)行的修飾。
其它形式的修飾也是有可能的，例如DNA-PNA-DNA，PNA-DNA。類似的修飾模式對(duì)PHONA/DNA嵌合物也是可能的。這些修飾模式也能與任何其它類型的修飾聯(lián)合，當(dāng)然，對(duì)本發(fā)明其它寡核苷酸而言相似模式的修飾也是可能的。
上述具體寡核苷酸——特定序列、特定位置處特定類型的修飾(特定的“修飾模式”)——僅僅是本發(fā)明不同實(shí)施方案的例子。本發(fā)明不局限于這些具體的寡核苷酸。序列和修飾模式的其它組合也是可能的。
根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸分別特異地抑制靶蛋白(其是eg5)或是靶序列(編碼eg5的核酸，優(yōu)選eg5 mRNA)的表達(dá)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸特異地抑制eg5的表達(dá)。與未處理的表達(dá)相比，這導(dǎo)致eg5蛋白水平的降低。例如，通過(guò)在mRNA和/或蛋白水平上確定根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸對(duì)eg5表達(dá)的影響，與相同寡核苷酸對(duì)β肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響相比，來(lái)證明該特異性。在用根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸處理時(shí)僅eg5 mRNA和/或eg5蛋白的水平下降，而β肌動(dòng)蛋白(一種持家基因)mRNA和/或β肌動(dòng)蛋白的水平保持不變。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸能有效地抑制eg5在人細(xì)胞中表達(dá)和/或具有在脊椎動(dòng)物中抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力。優(yōu)選地，與未治療個(gè)體相比，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸降低受治療患者腫瘤中eg5 mRNA和/或蛋白的水平。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸降低脊椎動(dòng)物中腫瘤體積，例如與未處理小鼠相比或與處理前的同一動(dòng)物腫瘤體積相比減低小鼠中的腫瘤體積。
本發(fā)明也涉及制備根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的方法。制備方法包含化學(xué)合成寡核苷酸。優(yōu)選采用已知用于寡核苷酸合成的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如按照Caruthers(1983)Tetrahedron Letters 24，245的亞磷酰胺方法、H-磷酸酯方法(Todd等(1957)J.Chem.Soc.3291)或磷酸三酯方法(Sonveaux(1986)Bioorg.Chem.14，274；Gait，M.J.“OilgonucleotideSynthesis，A practical Approach”，IRL Press，Oxford，1984)或來(lái)源于這些標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)的或不同的方法，進(jìn)行化學(xué)合成。例如，可按實(shí)施例1所述制備根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸。優(yōu)選在固相上通過(guò)縮合被適當(dāng)保護(hù)的單體(例如核苷)合成以在這些單體間形成核苷間橋，來(lái)合成根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸。本發(fā)明涉及例如制備寡核苷酸或其衍生物的方法，其中帶有3’-或2’-末端磷(V)基團(tuán)和游離的5’-羥基或巰基基團(tuán)的核苷酸單位與另一個(gè)在3’-位置帶有磷(III)或磷(V)基團(tuán)的核苷酸單位或其活化衍生物反應(yīng)，并任選使用保護(hù)基團(tuán)，保護(hù)基團(tuán)可暫時(shí)引入寡核苷酸中以保護(hù)其它官能團(tuán)并在合成后除去，從固相上切割下來(lái)的寡核苷酸可任選地轉(zhuǎn)化成生理上耐受的鹽。為合成修飾的寡核苷酸，可在一定程度上改變標(biāo)準(zhǔn)方法。這些改變是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且例如在Agrawal S.“Protocols for oligonucleotides and analogs”(1993，Human Press Inc.，Totowa，New Jersey)中已有描述。修飾的寡核苷酸的制備在EP 0 710 667，EP 0 680 969，EP 0 464 638，EP 0 593901，WO 95/01363，EP 0 672 677，EP 0 739 898和EP 0 552 766中也有描述。上述文獻(xiàn)中描述的制備修飾寡核苷酸的方法在此并入本文作為參考。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及抑制eg5表達(dá)和/或調(diào)控eg5編碼核酸表達(dá)的方法，其中將根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸與編碼eg5的核酸(例如mRNA，cDNA)接觸，并且該寡核苷酸與該編碼eg5的核酸雜交。
因此，本發(fā)明也涉及一種方法，其中寡核苷酸與編碼eg5的核酸(例如mRNA，cDNA)相接觸，方式是例如用已知方法將寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞，例如將所述寡核苷酸或其制劑與細(xì)胞孵育，該制劑可以包含吸收攝取增強(qiáng)劑，如lipofectin、lipofectamine、cellfectin或聚陽(yáng)離子(例如聚賴氨酸)。例如，寡核苷酸預(yù)先與cellfectin室溫孵育例如30分鐘，再與細(xì)胞一起孵育約5小時(shí)或更少時(shí)間以將該寡核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及寡核苷酸的用途，優(yōu)選作為反義寡核苷酸(寡核苷酸與編碼eg5的mRNA結(jié)合)或作為核酶(結(jié)合編碼eg5的mRNA并切割該mRNA)的用途。在本發(fā)明另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，可使用寡核苷酸誘導(dǎo)RNAse H切割編碼eg5的mRNA，從而導(dǎo)致eg5表達(dá)的降低。
本發(fā)明涉及寡核苷酸在抑制兩極有絲分裂紡錘體形成中的用途，并因此涉及寡核苷酸在抑制細(xì)胞增殖，特別是腫瘤生長(zhǎng)，中的用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明寡核苷酸在用作藥物中的用途，并涉及本發(fā)明寡核苷酸在制備藥物組合物中的用途。具體地，可在如下藥物組合物使用該寡核苷酸，所述藥物組合物用于預(yù)防和/或治療與eg5表達(dá)相關(guān)的或能通過(guò)抑制eg5表達(dá)而治療的疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含寡核苷酸和/或其生理耐受鹽以及可藥用賦形劑或輔助物質(zhì)的藥物組合物。
本發(fā)明涉及包含至少一種根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的藥物組合物，其中所述寡核苷酸可用于治療能通過(guò)抑制eg5表達(dá)而治愈的疾病，如再狹窄和癌癥。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備藥物組合物的方法，包含將一個(gè)或多個(gè)根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸及生理上可接受的賦形劑和任選的附加物質(zhì)(例如，適當(dāng)?shù)?，適合的添加劑和/或輔助劑)混合。
本發(fā)明特別涉及寡核苷酸或由此制備的藥物組合物在治療癌癥(例如抑制腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤轉(zhuǎn)移)中的用途。例如，寡核苷酸或由此制備的藥物組合物可用以治療實(shí)體瘤，例如乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、腦癌、腹部癌、結(jié)腸癌、直腸結(jié)腸癌、食管癌、胃腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、舌癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、Wilm’s腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤，和用以治療皮膚癌例如黑色素瘤，用以治療淋巴瘤和血癌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或由此制備的藥物組合物在抑制eg5表達(dá)和/或在不同類型癌癥中抑制腹水和胸腔積液的積累中的用途，所述癌癥的例子有乳腺癌、肺癌、頭部癌、頸部癌、腦癌、腹部癌、結(jié)腸癌、直腸結(jié)腸癌、食管癌、胃腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、舌癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、Wilm’s腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、皮膚癌、黑色素瘤、淋巴瘤和血癌。由于對(duì)eg5表達(dá)的抑制作用，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或由此制備的藥物組合物能提高生活質(zhì)量。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及寡核苷酸或其藥物組合物，聯(lián)合其它藥物和/或其它治療方法，例如已知的藥物和/或已知的治療方法，例如目前用于治療癌癥和/或用于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的那些，在例如治療癌癥或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移中的用途。優(yōu)選的是聯(lián)合放療和化療劑，例如順式鉑氨、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿霉素、道諾紅霉素或三苯氧胺。
寡核苷酸和/或其生理耐受鹽能單獨(dú)地或在與其它寡核苷酸(或其生理耐受鹽)的混合物中或以藥物組合物的形式，施用給動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，特別是人，其中所述藥物組合物允許局部的、經(jīng)皮膚的、腸胃外的或腸道的使用，并且所述藥物組合物包含作為活性組分的有效劑量的至少一種寡核苷酸，以及常規(guī)的可藥用賦形劑和輔助物質(zhì)。該藥物組合物通常包含約0.1-90％重量的治療活性寡核苷酸。該劑量在很寬的限度內(nèi)變動(dòng)并且在每個(gè)個(gè)體使用時(shí)被調(diào)整適應(yīng)個(gè)體情況。為治療銀屑病，優(yōu)選局部使用。對(duì)于癌癥，優(yōu)選輸注、口服和直腸給藥、或以氣霧劑鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選在對(duì)肺癌時(shí)如此，而對(duì)于糖尿病性視網(wǎng)膜病變，優(yōu)選局部、玻璃體內(nèi)和口服給藥。
藥物組合物可按照本質(zhì)上已知的方式(例如RemingtonsPharmaceutical Sciences，Mack Publ.Co.，Easton，PA(1985))，采用藥學(xué)上惰性的無(wú)機(jī)和/或有機(jī)賦形劑來(lái)制備。例如，可使用乳糖、玉米淀粉和/或其衍生物、滑石、硬脂酸和/或其鹽等制備丸劑、片劑、薄膜包衣片劑和硬明膠膠囊。用于軟明膠膠囊和/或栓劑的賦形劑的實(shí)例有脂肪、蠟、半固體的和液體的多元醇、天然油和/或硬化油等等。制備溶液和/或糖漿劑的合適賦形劑的例子有水、蔗糖、轉(zhuǎn)化糖、葡萄糖和多元醇等等。制備注射溶液的合適賦形劑有水、醇類、甘油、多元醇和植物油等等。用于微膠囊、植入物和/或rods的合適賦形劑是乙醇酸和乳酸的混合聚合物。此外，還有例如N.Weiner(Drug Develop Ind Pharm 15(1989)1523)，“Liposome Dermatics”(Springer Verlag 1992)和Hayashi(Gene Therapy 3(1996)878)中描述的脂質(zhì)體制劑。藥物組合物還可以包含能增加寡核苷酸口服利用率的制劑，例如腸道吸收的促進(jìn)劑，如甘露醇、尿素、膽鹽，如CDCA(鵝脫氧膽酸)(2％)?？梢圆捎美珉x子泳方法(ionophoretic methods)和/或電穿孔方法實(shí)施皮膚給藥。而且，可使用脂轉(zhuǎn)染試劑(lipofectins)和其它載體系統(tǒng)，例如用于基因治療的那些。能高效地將寡核苷酸導(dǎo)入到真核細(xì)胞或到真核細(xì)胞核內(nèi)的系統(tǒng)是特別合適的。藥物組合物也可以包含兩個(gè)或多個(gè)不同的寡核苷酸和/或它們生理耐受鹽，并且除了至少一種寡核苷酸外，還可包含一個(gè)或多個(gè)不同的治療活性成分。
除了活性成分和賦形劑外，藥物組合物還可包含添加劑，例如填充物、增量劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、防腐劑、甜味劑、染料、增香或芳香劑、增稠劑、稀釋劑或緩沖物質(zhì)，和溶劑和/或增溶劑和/或?qū)崿F(xiàn)緩釋效果的藥劑，以及改變滲透壓的鹽類、包衣劑和/或抗氧化劑。
實(shí)施例實(shí)施例1寡核苷酸合成用Applied Biosystems 394 DNA合成儀(Perkin Elmer AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，USA)和標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法合成寡核苷酸(ON)。偶連后，通過(guò)用Beaucage試劑硫化導(dǎo)入硫代磷酸酯鍵，隨后用乙酸酐和N-甲基咪唑加帽。從固相支持上切割下來(lái)并用濃縮氨處理以最終去保護(hù)，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化ON。在用2’-O-甲基核糖核苷亞磷酰胺替代相應(yīng)循環(huán)中的標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺制備2’-O-甲基修飾的ON。用陰離子電噴霧質(zhì)譜法(Fisons Bio-Q)分析所有的ON，這在所有情況下都證實(shí)了計(jì)算的質(zhì)量。在寡核苷酸合成的最后一步采用十六烷氧基(氰基乙氧基)-N，N-二異丙基氨基膦(hexadecyloxy(cyanoethoxy)-N，N-diisopropyl-aminophosphane)作為亞磷酸化(phosphitylating)試劑代替標(biāo)準(zhǔn)amidite，或從相應(yīng)衍生化固相支持物起始，合成C16修飾的寡核苷酸。三甘醇接頭可從Glen Research Corporation購(gòu)得。從Chem.Genes Corporation和Chemogen Corporation分別得到腺苷或蛹蟲(chóng)草菌素的2’-亞磷酰胺。按照前人所述(Uhlmann和Engels(1986)Tetrahedrin Lett.27，1023)進(jìn)行5’-磷酸或硫代磷酸殘基的導(dǎo)入。按照EP 0 672 677所描述制備PNA-DNA嵌合物。
通過(guò)如下方法進(jìn)行寡核苷酸分析a)在20％丙烯酰胺、8M脲、45μM tris-硼酸緩沖液、pH7.0中的分析性凝膠電泳，和/或b)HPLC分析Waters GenPak FAX柱，在CH3CN(400ml)、H2O(1.6升)、NaH2PO4(3.1g)、NaCl(17.53g)、PH6.8(1.5M NaCl)后，采用梯度CH3CN(400ml)、H2O(1.6升)、NaH2PO4(3.1g)、NaCl(11.7g)、PH6.8(0.1M NaCl)，和/或c)毛細(xì)管電泳采用Beckmann eCAPTM，U100P凝膠毛細(xì)管柱，長(zhǎng)65cm，內(nèi)徑100mm，視窗離一端15cm，緩沖液140μM Tris、360mM硼酸、7M尿素，和/或d)陰離子電噴霧質(zhì)譜法，在所有的情況都證實(shí)了預(yù)期質(zhì)量值。
用于按照a)、b)、c)和d)分析寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些方法描述于例如Schweitzer和Engels“Analysis ofoligonucleotides”(“Antisense-from technology to therapy”，alaboratory manual and textbook，Schlingensiepen等編，Biol.Science，第6卷(1997)第78-103頁(yè))。
制備(見(jiàn)描述)并測(cè)試下述寡核苷酸ON13-′C*T*T*A A G G C*A G T*A C*C G*C A G*C (K3)SEQ ID NO.10ON23′-A*C*C*A C*T C*T A C*G T*C*T G G*T A*A (K4) SEQ ID NO.11ON33′-A*A*G*A G*T C*A C*T C*T C*C*T A G G*C (K5) SEQ.ID NO.19ON43-′C*T*T*A A G G C*A G T*A C*C G*C A G*C-FITC-5′(K6)SEQ ID NO.10ON53′-G*G*C A G*T A C*C G*C A G C*GSEQ ID NO.22
ON63′-C*T*T*A A G G*C A G*T*ASEQ ID NO.13ON73′-T*A*A G G G*A G*T A*C*CSEQ ID NO.14ON83′-G*G*C A G*T A C*C*G C*ASEQ ID NO.15ON93′-C*A*G*T A C*C G*C A G*CSEQ ID NO.23ON103′-A*G*T A C*C G*C A G*C*G SEQ ID NO.16ON113′-C*C*G*C A G*C G T*C G*G SEQ ID NO.17ON123′-G*C*A G C*G T*C G G*T*T SEQ ID NO.18ON133′-A*A*G*A G*T C*A C*T C*T C*C*T A G G*C-Flu-5’(Vergleich 1)SEQ ID NO.19ON143′-G*G*C*A G*T A C*C G C*A G*C G T*C G*G SEQ ID NO.12ON153′-C*T*T*A A G G*C A G*T*A-FITC SEQ ID NO.13其中“★”是核苷間硫代硫酸酯橋，而FITC是熒光標(biāo)記。
在基于細(xì)胞的測(cè)定中，測(cè)試ON1到ON12抑制REH白血病細(xì)胞增殖的有效性。ON1、ON2、ON4-ON12、ON14、ON15是針對(duì)eg5 mRNA翻譯起始區(qū)的反義寡核苷酸。ON4是ON1的5’-熒光素標(biāo)記的類似物。ON3是對(duì)比寡核苷酸。
增殖抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示于

圖1。實(shí)施例2eg5反義寡核苷酸的抗增殖活性確定REH細(xì)胞(人前B白血病細(xì)胞，DSM ACC 22)或A549腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2下培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FCS，Gibco-BRL)的OptiMEM(GibcoBRL)中。用于測(cè)定的細(xì)胞密度為約1×106/ml。寡核苷酸(0.17mM)與cellfectin(0.83mg/ml；Gibco-BRL)混合以形成復(fù)合體，提高細(xì)胞的攝取。寡核苷酸/cellfectin復(fù)合體在24孔板中在缺乏血清時(shí)與細(xì)胞孵育4小時(shí)。然后去除寡核苷酸/cellfectin復(fù)合體，加入血清至終濃度為10％。37℃在5％CO2下孵育96小時(shí)后，用Casy 1(購(gòu)自Schrfe)測(cè)量細(xì)胞密度。為此，徹底混勻每孔中的細(xì)胞并立即用Casyton按1∶100稀釋。每種情況下從具有相同寡核苷酸濃度的三個(gè)不同的孔確定細(xì)胞密度的平均值?？乖鲋郴钚缘慕Y(jié)果顯示于圖1。表1人eg5的核苷酸序列(SEQ ID NO.20)1GAATTCCGTC ATGGCGTCGC AGCCAAATTC GTCTGCGAAG AAGAAAGAGG51AGAAGGGGAA GAACATCCAG GTGGTGGTGA GATGCAGACC ATTTAATTTG101GCAGAGCGGA AAGCTAGCGC CCATTCAATA GTAGAATGTG ATCCTGTACG151AAAAGAAGTT AGTGTACGAA CTGGAGGATT GGCTGACAAG AGCTCAAGGA201AAACATACAC TTTTGATATG GTGTTTGGAG CATCTACTAA ACAGATTGAT251GTTTACCGAA GTGTTGTTTG TCCAATTCTG GATGAAGTTA TTATGGGCTA301TAATTGCACT ATCTTTGCGT ATGGCCAAAC TGGCACTGGA AAAACTTTTA351CAATGGAAGG TGAAAGGTCA CCTAATGAAG AGTATACCTG GGAAGAGGAT401CCCTTGGCTG GTATAATTCC ACGTACCCTT CATCAAATTT TTGAGAAACT451TACTGATAAT GGTACTGAAT TTTCAGTCAA AGTGTCTCTG TTGGAGATCT501ATAATGAAGA GCTTTTTGAT CTTCTTAATC CATCATCTGA TGTTTCTGAG551AGACTACAGA TGTTTGATGA TCCCCGTAAC AAGAGAGGAG TGATAATTAA601AGGTTTAGAA GAAATTACAG TACACAACAA GGATGAAGTC TATCAAATTT651TAGAAAAGGG GGCAGCAAAA AGGACAACTG CAGCTACTCT GATGAATGCA701TACTCTAGTC GTTCCCACTC AGTTTTCTCT GTTACAATAC ATATGAAAGA751AACTACGATT GATGGAGAAG AGCTTGTTAA AATCGGAAAG TTGAACTTGG801TTGATCTTGC AGGAAGTGAA AACATTGGCC GTTCTGGAGC TGTTGATAAG851AGAGCTCGGG AAGCTGGAAA TATAAATCAA TCCCTGTTGA CTTTGGGAAG901GGTCATTACT GCCCTTGTAG AAAGAACACC TCATGTTCCT TATCGAGAAT951CTAAACTAAC TAGAATCCTC CAGGATTCTC TTGGAGGGCG TACAAGAACA1001TCTATAATTG CAACAATTTC TCCTGCATCT CTCAATCTTG AGGAAACTCT1051GAGTACATTG GAATATGCTC ATAGAGCAAA GAACATATTG AATAAGCCTG1101AAGTGAATCA GAAACTCACC AAAAAAGCTC TTATTAAGGA GTATACGGAG1151GAGATAGAAC GTTTAAAACG AGATCTTGCT GCAGCCCGTG AGAAAAATGG1201AGTGTATATT TCTGAAGAAA ATTTTAGAGT CATGAGTGGA AAATTAACTG1251TTCAAGAAGA GCAGATTGTA GAATTGATTG AAAAAATTGG TGCTGTTGAG1301GAGGAGCTGA ATAGGGTTAC AGAGTTGTTT ATGGATAATA AAAATGAACT1351TGACCAGTGT AAATCTGACC TGCAAAATAA AACACAAGAA CTTGAAACCA1401CTCAAAAACA TTTGCAAGAA ACTAAATTAC AACTTGTTAA AGAAGAATAT1451ATCACATCAG CTTTGGAAAG TACTGAGGAG AAACTTCATG ATGCTGCCAG1501CAAGCTGCTT AACACAGTTG AAGAAACTAC AAAAGATGTA TCTGGTCTCC1551ATTCCAAACT GGATCGTAAG AAGGCAGTTG ACCAACACAA TGCAGAAGCT1601CAGGATATTT TTGGCAAAAA CCTGAATAGT CTGTTTAATA ATATGGAAGA1651ATTAATTAAG GATGGCAGCT CAAAGCAAAA GGCCATGCTA GAAGTACATA1701AGACCTTATT TGGTAATCTG CTGTCTTCCA GTGTCTCTGC ATTAGATACC1751ATTACTACAG TAGCACTTGG ATCTCTCACA TCTATTCCAG AAAATGTGTC1801TACTCATGTT TCTCAGATTT TTAATATGAT ACTAAAAGAA CAATCATTAG1851CAGCAGAAAG TAAAACTGTA CTACAGGAAT TGATTAATGT ACTCAAGACT1901GATCTTCTAA GTTCACTGGA AATGATTTTA TCCCCAACTG TGGTGTCTAT1951ACTGAAAATC AATAGTCAAC TAAAGCATAT TTTCAAGACT TCATTGACAG2001TGGCCGATAA GATAGAAGAT CAAAAAAAAA GGAACTCAGA TGGCTTTCTC2051AGTATACTGT GTAACAATCT ACATGAACTA CAAGAAAATA CCATTTGTTC2101CTTGGTTGAG TCACAAAAGC AATGTGGAAA CCTAACTGAA GACCTGAAGA2151CAATAAAGCA GACCCATTCC CAGGAACTTT GCAAGTTAAT GAATCTTTGG2201ACAGAGAGAT TCTGTGCTTT GGAGGAAAAG TGTGAAAATA TACAGAAACC2251ACTTAGTAGT GTCCAGGAAA ATATACAGCA GAAATCTAAG GATATAGTCA2301ACAAAATGAC TTTTCACAGT CAAAAATTTT GTGCTGATTC TGATGGCTTC2351TCACAGGAAC TCAGAAATTT TAACCAAGAA GGTACAAAAT TGGTTGAAGA2401ATCTGTGAAA CACTCTGATA AACTCAATGG CAACCTGGAA AAAATATCTC2451AAGAGACTGA ACAGAGATGT GAATCTCTGA ACACAAGAAC AGTTTATTTT2501TCTGAACAGT GGGTATCTTC CTTAAATGAA AGGGAACAGG AACTTCACAA2551CTTATTGGAG GTTGTAAGCC AATGTTGTGA GGCTTCAAGT TCAGACATCA2601CTGAGAAATC AGATGGACGT AAGGCAGCTC ATGAGAAACA GCATAACATT2651TTTCTTGATC AGATGACTAT TGATGAAGAT AAATTGATAG CACAAAATCT2701AGAACTTAAT GAAACCATAA AAATTGGTTT GACTAAGCTT AATTGCTTTC2751TGGAACAGGA TCTGAAACTG GATATCCCAA CAGGTACGAC ACCACAGAGG2801AAAAGTTATT TATACCCATC AACACTGGTA AGAACTGAAC CACGTGAACA2851TCTCCTTGAT CAGCTGAAAA GGAAACAGCC TGAGCTGTTA ATGATGCTAA2901ACTGTTCAGA AAACAACAAA GAAGAGACAA TTCCGGATGT GGATGTAGAA2951GAGGCAGTTC TGGGGCAGTA TACTGAAGAA CCTCTAAGTC AAGAGCCATC3001TGTAGATGCT GGTGTGGATT GTTCATCAAT TGGCGGGGTT CCATTTTTCC3051AGCATAAAAA ATCACATGGA AAAGACAAAG AAAACAGAGG CATTAACACA3101CTGGAGAGGT CTAAAGTGGA AGAAACTACA GAGCACTTGG TTACAAAGAG3151CAGATTACCT CTGCGAGCCC AGATCAACCT TTAATTCACT TGGGGGTTGG3201CAATTTTATT TTTAAAGAAA AACTTAAAAA TAAAACCTGA AACCCCAGAA3251CTTGAGCCTT GTGTATAGAT TTTAAAAGAA TATATATATC AGCCGGGCGC3301GTGGCTCTAG CTGTAATCCC AGCTAACTTT GGAGGCTGAG GCGGGTGGAT3351TGCTTGAGCC CAGGAGTTTG AGACCAGCCT GGCCAACGTG CGCTAAAACC3401TTCGTCTCTG TTAAAAATTA GCCGGGCGTG GTGGGCACAC TCCTGTAATC3451CCAGCTACTG GGGAGGCTGA GGCACGAGAA TCACTTGAAC CCAGAAGCGG3501GGTTGCAGTG AGCCAAAGGT ACACCACTAC ACTCCAGCCT GGGCAACAGA3551GCAAGACTCG GTCTCAAAAA TAAAATTTAA AAAAGATATA AGGCAGTACT3601GTAAATTCAG TTGAATTTTG ATATCTACCC ATTTTTCTGT CATCCCTATA3651GTTCACTTTG TATTAAATTG GGTTTCATTT GGGATTTGCA ATGTAAATAC3701GTATTTCTAG TTTTCATATA AAGTAGTTCT TTTAGGAATT C表2SEQ ID NO.21惡性瘧原蟲(chóng)的序列(部分序列；Genebank，ID Z98551)。5′TTTTTTTTTTTTTATTCCTTGGATGTTCTTGGTAGTTTAAATTTTTTATTTTTGTAGTTTTCTTCTTTTATACGTTTTAAAGCAGGGGATGCCTTTTTAGGAAATGCCCTATTTTCAATAGCTTTAATTTTTGTAGATTGAAATTTATTATTATTATTATTATTATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTATTATTTGAATAATTATTTGTTATATGAACATTTTGAACATTTATATTTCTCTTTCTTTCATATTCTTTTAAACTTGTTACACTCATATTTTCTGTATTTACATCAAATCTTTTATTATGTTGATTGTTATTTAAATAATTTAATTCTTGATATGTTTCATCTATTGGTTGTATAGGATTATCCGTTGTATTCTTATTATATAGCATATATTCATTTAAGGGTAGATTATTGTGATTAGTTTTTACATTTAATTTATTTTTATCACCTTTATTATTTATATTATGAGGTATACTACTATTCGTTGTATGATCATTTAAACTATTGTAACGAGAGTAATTATTTTCATGCGCTACAATTTTATCATCTTGAATAAGAAATTGGAAGTTTTCATCGATTTGTTCAAATACTTTACTTAAATCTATATCATGTGTTGTTGTAATTTGTTCTATCTCTTTCATCAAGGTATTTTTAACTTCCAAGTATAAATTTTGTCTTATGATATCATCATTATAAAGATAATAATTATGATGATCACCTTGATCTATTTTATTATCATCATTATAAAGATAATAATTATGATGATCACCTTGATCCATTTTATTATCATCATTATAAAGATAATTATTATGATCATGACCTTGATCCATTTTATTATCATCATTATAAAGATAATTATTATGATCATGACCTTGATCCATTTTATTATCATCATTATAAAGATAATTATTATGATCATGACCTTGATCCATTTTATTATCATCATAATTATTATTGTCACCATTTTTATTATTGTCATGATCATTTTTATTATTGTCACCATTTTTATTATTATCATGATTATTTTTATTATTATCATGATTATTTTTATTATTATCATGATTATTTTTATTATTATCATCATTTTTATTATTATCATAATTCGTGTCGTAAGTCGAATCCCTATTTAGTGATGTGATTTTCATCGGAGTAAACATATCTATGACATTCACAAACGTTTCCCTTATCCTTTGTACATCATCCTTTATATTTAGATAAAATTCATCATCCATATTTTCCATGAGATCATAACTTGATGTACTTGGAATGTCTTGTAAGTAATCTTTTTTTTTTAATATATCTATTAATTCTGCTATATACATATTACATTTGTTTAAATTTTGTTCAAATATATTATTAAAAAGTTTTATATTTTCATTAGACTTTAACATATGTATACGACGTCCCCCTTTTTGTTCTTGTGATTCTTTATTTTTATTTTGTAAAATCTTTTCAGATATAACGTTATATAACTTTCGTTTCTCTATTTTGTTTATATTAGTTTGACTTGTAAAGTTATTTATGATTTTATCAATATTTAGATTATTTGTATATAATAAATTATTATAAATATTTAAAGTATCATTTAAACATTTGCTGTGTTCCTTTTCTTCAATATAACTTTTTCTTTTTAAATAAGATAATATGTTATATAAAACAGTATGATAATTTGTTATCTTCCTTTTAATATCATTATTAATATTATTATATTCCTTTTCATCATTAATATTGCATTCAGAAAAATGTTGTATAGTATCATCTATCTTTTTTACAGAATTCATAAAAACAGATTTATAATTTTTTTTTGACTTATCATATAATTCTTTATTTAATAAATCGAACTTGTTATTCATTTTTTCATAAATATCTTCCACATTTTTATTTATAAGTAATTCAATATCTTTCAAAATATTTTCTTTAAATTCTTGTATATCTTCATTTATCATTTTTTTATAATTATTAATTATAATATTATCCTCCTTTTCAAAAACATCATATTTTTTATAAATATATTCAATGTTGTCATTCATAATCTTCTTGTCCTTATCCCAATGTATATATTTTTCATGACATTTTTTTTCTAGTAACATAAATGATTCGTTTAAAAAAATATGAAATATATTACATATACTTTTAATATATTGTATTAATGATTTTGCATTATATAACTTTTTTTCAGATTCGTGATTATCTAAATTTTGTATAATATCTTCACCTTGTCTATTTAATAATAAATCTTTTATAAATTCTTTATTCTCAGGATAATTAAATGATTCCTCTATATGGTCAAATGGCATCTCATTATTTTCTTCTTTACCATATTGTTTTTGACATGTTTTTCCTTCACCATTTTGTTTTTCACATATTATTCCTTCACCGTTTTGTTTTTCACATATTATCTCGTCACCGTTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCACCACTTTGTTTTTCACATATTATCTCTTCACCGTTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCACCACTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCACCACTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCACCACTTTGTTTTTCTTTTTTTAATCCGTTTGTATTATATACACCAATAATTGCTGGCATTTTCTGCTTGGCTTCATCACTTATATGTGGTATGTTTATTTTACATTGTGATATTTCCTTTTTAATATTTTCGGAGAGAGAAAAGTAATCATGATCATATTTTTGTAAAATATCCATATGGTCCAGTATAAAATTCAGAGTATCATTATATTTAAAATTAATGTTACTATTGAGTTCTTCAAAATGGTTAATATAATCATTGTATGATTTTTTATTTTGTACTAGATAATTTTTGGTATCATCTAAAATGAATAAGATGGTTTTACATATATCGTTTAAAAGATGATTTTCTTGATGAATATTTTTTTTTATATTTAATAGATTATCATGCATTATATTAGACATATTTGTTTTAATTTGTTGAAAAGATTTTTTTTGATTTATAAAATTTTCTTCTAAAGAATGATATTTATTTAATAAGAATTGTGTAATATATTTTTCTTCTATTATTTTTTTAATTAATATTTGATGAAATGCTTGTATATTTTTATATTTTTGAATAGTATCTTTTAAAAAGAAAAATATTTTATTTTGTAGATCATCTGTATTATCCATTTTATTTAATAAATTTTTTATTTTTTTACTTTTTTCAAATAAAATTTTTTCTTTTTCTAATAATATTTCTTTATTTTTCTTTAGACTATTTTGTATATTATTATATTCTTCTGTATCAAGATAAACACCTCTCTTTTCTCTGCTTAAATTCAGTGCATTTCTTAACTTTTCGATTTCATTATTTAAATCCTTTATTTTTAATTGTTTCGTTGTTTTTATATTTATCTCGGGTCTATTCTTAATATTCTTAGCTCGAAAGACATAATCTAAAGTGCTTAAAGTCTCATCAATACATAAAGAGGAGGGTGATATAGTGGCGACAATAAAAGTCTTCGTTTTCCCACCTAACGAATCTTGTAATAATCTGGTTAATTTAGAATCTCTGTAAGGAATATAAGATGAATTCTCAATCAACGAATTAATAACTCTACCTAAGGTTAATAAAGATTGATTTATATTACAACTTTCTTGTTGTCTAATTTTTAAAGAACCATAAGAGCTTTTCAAAGCATTTTCACTACCCGCTAAATCAACTAAATTTAATTTTCCTATTTTTGTTATACTTTCTCCTACATTATTTATATCTTTTATAATTAATGTTATAGTAAAAATCGAATGACTTCTACTCGATTTTTTATTATAAGCCGTTTCAGCTGTCCTTCTTTTTTTAATAGCTGAACATATAATATAATATATTTCTTCAAAAGAATTAATACTTTTTTCTTCTAACTTATCAACATTTAATCCTTTACTTTTATTATTACTATCTTCATATATTCGAAGTTTCATATTTTCATTTGTTGAACTTAATAAATCACATAATTCTTCATTATATATTTCTAGATAGCTAATTTTTATATTAAAATCGTACATATTCTTATCATCAAATGTTTGATACATATCATTATTCCTATTTTTATCTACACTACATTTTTGTACAACATCACAAGTAATATCTCTACTCTTTTCGTTAACTAACAAATTGTTAGGTTCTTTATTAATTTTTAAATTATTATAAATATCATTTTTATCAATATTTATTTTGTTACATAATAAATTATTATAATTATTATTAATAATATTATTATTGTTACCATTAGTTTCCTTATTTATTACATTTATATGTTCGTTATCCTTTTCATCAAATATATTCTTTTTTCCTTTAAAATGTCGAATCTTTTCTTCTTTCCTTTTATTTAATATATCGAATATTCTTTTCGTAACTCGAAATATAAGTCCAGTATCCTCATTCTCACAAAGTTCATAGCAATAGCTGATGTCGCTATTAATACTTTCATTCAAATCCACCTTTTTATTATTATCATATTGTTTCAGGTGTTCTAGTATTTTCCCTTCCATAGTATAGGTCTTACCCGTCCCGGTCTGTCCATAGCAGAACAGCGTACAATTGAATCCTTGCAAAACCTGAAGCGGCGAACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATATATATATATGTACATGTATATTTATATGTATATGTATATATATATGTATAGTTATATGTATTTTTATTTTTATTTTTATTTTTATATTTATTTTTATTTTTATATTTATTTTTATTTTTATATTTATTTTTATTTTTATATTTATATTTATATATGTGTAAAATTAACATGGGGAGCAAAGAATTTCCCATATATTTTTTTTTTTTAATCTATTTAATAAAACATTATTATGATATACGCAGAGGTGATATATACATGGTATTTATTTATTTTTTTTTATATATTTTTCATTTGTTTCGTAGGAATATTCTTTTTTTTTCTGCACATATATTTCACTATCCATATAATATCATAATACATCATGGAATAATTTATATATATATATATATATATGTATATTTTATTTTTACCTCATCTACTATTTGGTAAATATAATTATTGAACAAAGTTTTCTGATCCACATCTTTATCACATGCATAATCAAAACTATATTTTTTTTCGTATATTTCATTGTTTCTATTAATTGTTAATATAACCTCATTATTATTAATTCGAACTACCTCTTCATTATTTATATCGTTTTTTTCTTTTTCATTTAATGGTCTACACCTTACGATAACTTTTATATTTACGCAACTTGATTTATCATTATTATAAGAATTTCTGAGCATTTTACTTTTATTCAAATAAT表3序列同源性人eg5序列與惡性瘧原蟲(chóng)eg5序列的比較160human.SEQ GAATTCCGTCAT.........GGCGTC....GCAGCC.AAATTC...GTCTGCGAAGAAGPLASMO.SEQ TTTTTTTTTTTTTATTCCTTGGATGTTCTTGGTAGTTTAAATTTTTTATTTTTGTAGTTT61 120human.SEQ .........AAAGA....GGAGAAGGGGAAGAACATCCAGGTGGTGGTGAGATGCAGACCPLASMO.SEQ TCTTCTTTTATACGTTTTAAAGCAGGGGATGCCTTTTTAGGAAATGCCCTATTTTCAATA121 180human.SEQ A.TTTAATTTGGCAGAGCGGAAAGCTAGCGCCCAT.TCAATAGTAGAATGTGATCCTGTAPLASMO.SEQ GCTTTAATTTTTGTAGATTGAAATTTATTATTATTATTATTATTATTGT.TGTTGTTGTT181 240human.SEQ CGAAAAGAAGTTAGTGT.ACGAACTGGAGGATTGGCTG..ACAAGAGCTCAAGGAAAACAPLASMO.SEQ GTTGTTGTTGTTGTTGTTATTATTTGAATAATTATTTGTTATATGAACATTTTGAACATT241300human.SEQTACACTTTTGAT......ATGGTGTTTGGAGC.............ATCTACTAAAC..AGPLASMO.SEQ TATATTTCTCTTTCTTTCATATTCTTTTAAACTTGTTACACTCATATTTTCTGTATTTAC301 360human.sEQATTGA..TGTTTACCG....AAGTGTTGTTTG.....TCCAATTCTGGATGAAGTT.AT.PLASMO.SEQ ATCAAATCTTTTATTATGTTGATTGTTATTTAAATAATTTAATTCTTGATATGTTTCATC
361 420humnan.sEQTATGGGCTATA....ATTGCAC....TATCTTTGC.GTATGGC.CAAACT........GGPLASMO.SEQ TATTGGTTGTATAGGATTATCCGTTGTATTCTTATTATATAGCATATATTCATTTAAGGG421 480human.sEQ CA.....CTG.GAAAAACTTTTACAATGGA...AGGTGAAAGGTC......ACCTA....PLASMO.SEQ TAGATTATTGTGATTAGTTTTTACATTTAATTTATTTTTATCACCTTTATTATTTATATT圖1該圖總結(jié)了實(shí)施例1和2的結(jié)果圖示為寡核苷酸ON1至ON12(eg5反義)抑制REH細(xì)胞增殖的效果(百分比)■第一個(gè)實(shí)驗(yàn)◆第二個(gè)實(shí)驗(yàn)CFcellfectin對(duì)照序列表<110>Aventis Pharma Deutschland GmbH<120>用于抑制人eg5表達(dá)的寡核苷酸<130>1999/L046<140>PCT/EP00/07345<141>2000-07-21<150>19935303.4<151>1999-07-28<160>23<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>1cgacgccatg acggaattc 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>2aatggtctgc atctcacca 19<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>3ggctgcgacg ccatgacgg 19<210>4<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>4atgacggaat tc 12<210>5<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>5ccatgacgga at 12<210>6<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>6acgccatgac gg 12<210>7<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>7gcgacgccat ga 12<210>8<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>8ggctgcgacg cc 12<210>9<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>9ttggctgcga cg 12<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>10cgacgccatg acggaattc 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>11aatggtctgc atctcacca 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>12ggctgcgacg ccatgacgg 19<210>13<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>13atgacggaat tc 12<210>14<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>14ccatgacgga at 12<210>15<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>15acgccatgac gg 12<210>16<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>16gcgacgccat ga 12<210>17<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>17ggctgcgacg cc 12<210>18<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(12)<400>18ttggctgcga cg 12<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述修飾的反義寡核苷酸<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<400>19cggatcctct cactgagaa 19<210>20<211>3741<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>20gaattccgtc 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1.反義寡核苷酸或其衍生物，對(duì)應(yīng)于eg5編碼序列的一部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的反義寡核苷酸或其衍生物，對(duì)應(yīng)于eg5編碼序列的8-100個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的反義寡核苷酸或其衍生物，具有8-20個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物，對(duì)應(yīng)于人eg5和/或惡性瘧原蟲(chóng)eg5編碼序列的一部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物，具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9之一的序列，其中SEQ ID NO.1是5′-CGACGCCATGACGGAATTC-3′SEQ ID NO.2是5′-AATGGTCTGCATCTCACCA-3′SEQ ID NO.3是5′-GGCTGCGACGCCATGACGG-3′SEQ ID NO.4是5′-ATGACGGAATTC-3′SEQ ID NO.5是5′-CCATGACGGAAT-3′SEQ ID NO.6是5′-ACGCCATGACGG-3′SEQ ID NO.7是5′-GCGACGCCATGA-3′SEQ ID NO.8是5′-GGCTGCGACGCC-3′且SEQ ID NO.9是5′-TTGGCTGCGACG-3′。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物，其中，與由天然DNA組成的相同序列的寡核苷酸相比，該寡核苷酸具有一個(gè)或多個(gè)修飾，并且每個(gè)修飾位于特定的核苷間磷酸二酯橋和/或特定的β-D-2’-脫氧核糖單位和/或特定的天然核苷堿基位置。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物，其中該寡核苷酸5’-末端和/或3’-末端的1-5個(gè)末端核苷酸單位通過(guò)位于相應(yīng)核苷5’-和/或3’-末端的修飾的核苷間橋而被保護(hù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物，其中至少一個(gè)內(nèi)部嘧啶核苷和/或位于該嘧啶核苷5’-末端和/或3’-末端的核苷間橋被修飾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物，其中每個(gè)修飾都獨(dú)立地選自a)用修飾的核苷間橋替代位于核苷3’-和/或5’-末端的磷酸二酯橋，b)用脫磷酸橋替代位于核苷3’-和/或5’-末端的磷酸二酯橋，c)用另一個(gè)殘基替代糖磷酸酯主鏈中的糖磷酸酯殘基，d)用修飾的糖單位替代β-D-2’-脫氧核糖單位，e)用修飾的核苷堿基替代天然的核苷堿基，f)與影響該寡核苷酸性質(zhì)的分子偶連，g)與2’5’-連接的寡腺氨酸分子或其衍生物偶聯(lián)，任選通過(guò)適合的接頭分子來(lái)進(jìn)行此偶聯(lián)，和h)在該寡核苷酸的3’-和/或5’-末端引入3’-3’和/或5’-5’倒位。
10.通過(guò)在固相上縮合被適當(dāng)保護(hù)的單體而制備根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物的方法。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物在抑制eg5表達(dá)中的用途。
12.抑制eg5表達(dá)的方法，其中將根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物與eg5編碼核酸接觸，并且該反義寡核苷酸或其衍生物與eg5編碼核酸結(jié)合。
13.通過(guò)將根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物與生理上可接受的賦形劑和任選的附加物質(zhì)混合來(lái)制備藥物組合物的方法。
14.藥物組合物，含有至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-9之一項(xiàng)或多項(xiàng)的反義寡核苷酸或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及寡核苷酸或它的衍生物之一,其特征在于其序列對(duì)應(yīng)于編碼人eg5或其突變形式之確定部分的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及制備所述寡核苷酸的方法和它的用途。
文檔編號(hào)A61K31/712GK1367828SQ00810829
公開(kāi)日2002年9月4日 申請(qǐng)日期2000年7月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月28日
發(fā)明者E·尤爾曼, B·戈雷納, E·安格, G·戈瑟, M·施沃德?tīng)?申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物德國(guó)有限公司