專利名稱：利用活性氧代謝物抑制劑活化和保護細胞毒性淋巴細胞的制作方法
技術領域：
此處公開的專利涉及治療癌癥和病毒疾病的方法，其中包括對一種活性氧代謝物(MO)抑制劑單獨給藥或與其他藥劑結合給藥。給藥這些藥劑保護和活化了細胞毒性淋巴細胞，使其免遭單核細胞/巨噬細胞(MO)的有害和抑制作用，并且刺激了細胞毒性淋巴細胞的抗癌和抗病毒特性。此外，對ROM抑制劑給藥的直接作用效果是在抗原存在的情況下，抗原呈遞細胞能夠對特定淋巴細胞具有更加有效的作用。這樣的免疫刺激化合物的代表性藥劑包括細胞因子、肽、黃酮類化合物和疫苗助劑?？膳c本發(fā)明中的方法共用的另一類藥劑包括化學治療藥劑和/或抗病毒藥劑。本發(fā)明也考慮過將活性氧清除劑與上述提及的化合物連用。
可以考慮的加入的其他藥劑是刺激這些淋巴細胞的細胞毒性活性的細胞毒性淋巴細胞活化化合物，優(yōu)選地，與ROM抑制劑以協(xié)同的方式起作用。
按照介導免疫應答的成分來分，免疫體系對外來機體有兩種免疫應答體液介導的免疫應答和細胞介導的免疫應答。體液介導的免疫應答是通過抗體來介導的，而細胞介導的免疫應答與在分類上叫做淋巴細胞的細胞有關。最近，抗癌藥劑和抗病毒策略的重點是利用細胞介導的宿主免疫體系來作為一種抗癌藥劑或一種抗病毒處理和治療的方法。對免疫體系簡單敘述將有助于加深對本發(fā)明的了解。免疫應答的產(chǎn)生免疫體系是分四個階段來保護宿主細胞免遭外來機體侵害的識別階段，活化階段和效應物階段。在識別階段，免疫體系識別和發(fā)信號告知外來抗原和入侵物的存在。外來抗原可能是，例如贅生性細胞或病毒蛋白的細胞表面標記物。一旦免疫體系覺察到有外來機體入侵，作為對外來物入侵印發(fā)信號的反應就是免疫體系增生和分化。最后一個階段是效應階段，在這個階段中免疫體系的效應細胞就對檢測到的入侵物進行應答和中和。
多種有效物細胞可產(chǎn)生外來物的免疫應答。一種效應細胞，B細胞，就產(chǎn)生抗體來靶定宿主細胞面對的外來抗原。與輔助體系相結合，抗體指導摧毀含有靶定抗原的外來細胞和生物體。
另一種效應細胞是細胞毒性淋巴細胞。天然殺傷細胞(NK細胞)是一種細胞毒性淋巴細胞，它具有自發(fā)識別和破壞多種受病毒感染的細胞，以及識別和破壞那些惡性細胞類型的細胞?，F(xiàn)在對NK細胞識別靶細胞的方法知之甚少。
另一種細胞毒性淋巴細胞是T-細胞。T-細胞可分為3種亞類，每一類在免疫應答中起著不同的作用。輔助T細胞分泌細胞因子，這些細胞因子可刺激那些為產(chǎn)生有效的免疫應答必需的其他細胞增生，而抑制T細胞可負調節(jié)免疫應答。第三種T細胞是細胞毒素T細胞(CTL)，它能直接溶解在其表面有外來抗原存在的靶細胞。主要組織相容性復合體和T-細胞靶識別T-細胞是抗原特異性免疫細胞，它可對特異抗原信號產(chǎn)生應答。B-淋巴細胞以及他們產(chǎn)生的抗體也是抗原特異性的。然而，與B-淋巴細胞不同，T細胞不對游離或溶解形式的抗原產(chǎn)生應答。對于T細胞對抗原的應答，它需要抗原結合到叫做主要組織相容性復合體(MHC)的遞呈性復合體(presenting complex)上。
MHC復合體蛋白提供了一種方法，通過這種方法，T-細胞可將外來細胞與本地細胞或自身細胞區(qū)分開來。有兩種MHC，I型MHC細胞和II型MHC細胞。T輔助細胞(CD4+)絕大多數(shù)是與II型MHC蛋白，而溶細胞T-細胞(CD8+)絕大多數(shù)與I型MHC蛋白相互作用。這兩種MHC復合體都是跨膜蛋白，他們的大部分結構是在細胞的外表面。此外，這兩種MHC在細胞外部片段上都有蛋白結合裂縫。小片段蛋白，不管是本地的還是外來的都是結合到這個小結合裂縫上的，從而他們能夠在胞外環(huán)境中存在。
被稱做抗原呈遞細胞(APCs)的細胞利用MHC復合體向T-細胞展示抗原。對T-細胞識別一種抗原來講，這種抗原必須是在MHC復合體上遞呈才能被識別。這種要求就叫做MHC限制，T-細胞也正是通過這種機制來區(qū)分自身細胞和非自身細胞的。如果一種抗原沒有通過一種可識別的MHC復合體來展示，那T細胞就不會對抗原信號進行識別和作用。
對結合到可識別MHC復合體上的肽具有特異性的T-細胞能結合到這些MHC-肽復合體上，并且繼續(xù)進行到免疫應答的下一個階段。與免疫應答介導有關的細胞因子上述所列多種效應細胞間的相互作用是受到多種化學藥劑的影響的，這些化學藥劑可提高和降低所需的免疫應答。這樣的化學調節(jié)劑可由效應細胞自身產(chǎn)生，并且可對與上述化學調節(jié)劑產(chǎn)生細胞相同或不同的免疫細胞的活性產(chǎn)生影響。
引種免疫應答化學調節(jié)劑是細胞因子，這些分子可刺激免疫體系細胞組分中的增生應答。
白細胞介素-2(IL-2)是一種由T-細胞合成的細胞因子，最先發(fā)現(xiàn)的還有其在應答一種抗原的T-細胞擴增中所起的作用。(Smith，K.A.Science 2401169(1998))。眾所周知，IL-2的分泌作用對細胞毒素效應T細胞(CTLs)的完全發(fā)展是必需的，它在宿主細胞對病毒的防御上起了重要的作用。幾種研究也表明IL-2具有抗腫瘤作用，這使得它成為治療惡性腫瘤的一種很具吸引力的藥劑(seee.g.Lotze，M.T.et al，in“l(fā)nterleukin 2”，ed.K.A.Smith，AcademicPress，lnc.，San Diego，CA，p237(1988)；Rosenberg，S.，Ann.Surgery 208121(1998))。實際上，IL-2已經(jīng)用于治療遭受惡性黑素瘤、腎細胞癌，以及急性骨髓性白血病(Rosenberg，S.A.，et al.，N.Eng.J.Med.316889-897(1978)；Bukowski，R.M.，et al.，J.Clin.Oncol 7477-485(1989)；Foa，R.，etal.，Br.J.Haematol.77491-496(1990))。
另外一種在作為抗癌藥劑和抗病毒藥劑方面很有潛力的細胞因子是干擾素-α。干擾素-α(INF-α)是IFN的I型細胞因子，它已經(jīng)用于治療白血病、骨髓瘤和腎細胞癌癥。因為絕大多數(shù)的溶細胞T細胞(CTLs)可識別結合到I型MHC分子上的抗原，所以I型IFN可通過推進細胞介導的免疫應答的效應階段，這是通過提高CTL介導的殺傷效率來實現(xiàn)的。同時，I型IFN也可通過防止II型MHC限制性輔助T細胞的活化來抑制免疫應答的識別階段。IL-12、IL-15以及其他多種黃酮類化合物也能夠提高T細胞應答。組胺拮抗劑活體治療結果組胺是一種生物胺，也即在脫羧基之后擁有藥理學受體介導的生物活性的氨基酸。組胺在即發(fā)性超敏反應中的作用已經(jīng)很好的確定(Plau，M.and Lichtenstein，L.M.1982 Histamine and immuneresponses.ln Pharmacology of Histamine ReceptorsGanellin，C.R.and M.E.Parsons eds.John Wright & Sons，Bristolpp.392-435.)對H2-受體拮抗劑和拮抗劑是否可用于治療癌癥的檢驗產(chǎn)生了矛盾的結果。有些報道表明，單獨對組胺給藥抑制了體內有惡性腫瘤的宿主體內的腫瘤生長。(Burtin，Cancer Lett.12195(1981))。另一方面，又有報道說組胺可加速嚙齒類動物體內腫瘤的增長。(Nordlund，J.J.，et al.，J.lnvest.Dermatol 8128(1983))同樣的，當對組胺受體拮抗劑進行效果檢測的時候也得到矛盾的結果。一些研究報告說組胺受體拮抗劑抑制了嚙齒類動物和人體內的腫瘤生長。(Osband，M.E.，et al.，Lancet 1(8221)636(1981))而另外的一些研究報告這樣的治療方法加速了腫瘤的生長，甚至誘導更多的腫瘤生長。(Barna，B.P.，et al.，Oncology 4043(1983))H2受體拮抗劑和IL-2協(xié)同效應盡管在對組胺單獨給藥時有矛盾結果，但最近的報道清楚的表明組胺可與細胞因子協(xié)同作用來提高NK細胞的細胞毒性。例如，通過組胺類似物進行的研究表明，組胺的協(xié)同作用是通過表達于單核細胞表面的H2-受體來發(fā)揮作用的。(Hellstrand，K.，etal.，J.lmmunol.137656(1986))。
當與細胞因子結合使用時，組胺的協(xié)同效應看來是通過對其他類型細胞介導的負調節(jié)的抑制來產(chǎn)生的，而這些其他類型細胞是與細胞毒素細胞一起存在的。當對IL-2給藥時，就可刺激細胞毒性，這是對NK細胞進行活體研究得到的確定結果。然而，在單核細胞存在時，IL-1誘導的NK細胞毒性增加受到了抑制(見美國專利號5,348,739)。
在沒有單核細胞存在的情況下，組胺對NK介導的細胞毒性沒有作用或作用很微弱。(Hellstrand，K.，et al.，J.lmmunol137656(1986)；Hellstrand，K and Hermodsson，S.，lntArch.Allergy Apll.lmmunol 92379-389(1990))然而，在單核細胞存在的情況下，相對于僅僅暴露于IL-2的NK細胞的毒力水平，同時暴露于組胺和IL-2的NK細胞具有升高的細胞毒性。因此，結合使用組胺和IL-2治療時產(chǎn)生的NK細胞協(xié)同增強作用不是組胺對NK細胞的直接作用，而是通過抑制單核細胞產(chǎn)生的抑制性信號來產(chǎn)生的。
不被特定機制所限制，人們認為單核細胞對細胞毒性的抑制性效應是由活性氧代謝物如單核細胞產(chǎn)生的H2O2產(chǎn)生的。過氧化氫可在細胞內產(chǎn)生。此外，過氧化氫可被定位在MO表面的酶來催化?，F(xiàn)在認為兩種來源的過氧化氫有助于細胞間過氧化氫的集中。
已經(jīng)證明粒細胞可抑制體內II-2誘導的NK細胞毒性?？磥碓诳朔＜毎閷У囊种粕?，H2受體參預了轉導組胺協(xié)同作用。例如，組胺對粒細胞介導的、NK細胞依賴型抗體的細胞毒性可為H2拮抗劑雷尼替丁阻斷，且為H2受體拮抗劑dimaprit模擬。相對于組胺和IL-2對單核細胞介導的NK細胞抑制作用的完全或接近完全消除相比，這樣的處理只是部分的去除粒細胞介導的NK細胞抑制。(U.S.PatentNumber 5,348,739；Hellstrand，K.，et al.，Histaminergicregulation of antibody dependent cellular cytotoxicity ofgranulocytes，monocytes and natural killer cells.，JLeukoc.Biol 55392-397(1994))正如上述實驗所表明的，應用組胺和細胞因子的治療是有效的抗癌和抗病毒策略。美國專利號為5,348,739的專利公開報道說在接種黑素瘤細胞系之前就給藥以組胺和IL-2的小鼠可受到保護免遭肺轉移病灶。已經(jīng)證明，單劑量對組胺給藥可延長靜脈接種單純皰疹病毒(HSV)的動物的存活時間，并且觀察到對組胺和IL-2結合治療可對動物存活時間具有協(xié)同效應。(Hellstrand，K.，et al.，Role ofhistamine in natural killer cell-dependent protection againstherpes simplex virus type 2 infection inmice.，Clin.Diagn.Lab.lmmunol.2277-280(1995))。
上述結果表明，結合應用組胺和IL-2的策略是治療惡性腫瘤和病毒感染的有效方式。
現(xiàn)在，幾種免疫細胞刺激化合物在作為有效的抗癌和抗病毒藥物方面的治療潛力在變小，這要歸因于免疫系統(tǒng)的負調節(jié)體系。相應的，我們需要能夠將免疫細胞刺激化合物的治療潛力最大化的方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及促進活化和保護細胞毒性淋巴細胞的方法和組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種方法，這種方法包括鑒別一個患者是否需要增強細胞毒性淋巴細胞的活力，以及包括在MO存在的情況下，對患者給藥以能夠有效的活化和保護細胞毒性淋巴細胞功能的diphenylionodonium(DPI)。
在另一個實施方案中的方法進一步包括對一種細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物給藥。在這個實施方案的不同方面。這些組合物可以是疫苗助劑、疫苗、肽、細胞因子或黃酮類化合物。疫苗助劑可以從一組化合物中來篩選，這組化合物包括卡介苗(BCG)桿菌、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)、分支桿菌71KD細胞壁結合蛋白、微乳MF59、多聚(lactide-co-glycolides)微粒(PLG)、以及免疫刺激復合體(ISCOMS)。疫苗也可從一組藥劑中篩選，這個組由流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、腸炎沙門氏菌疫苗、乙肝疫苗、Boretella bronchiseptica疫苗、結核病疫苗、同種異基因癌癥疫苗和自體癌癥疫苗組成。本發(fā)明也考慮了多種細胞因子和黃酮類化合物的應用。細胞因子可從包括IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IFN-α，IFN-β，或IFN-γ在內的組中篩選。黃酮類化合物可選自包括黃酮乙酸和呫噸酮-4-乙酸在內的組。這些化合物對成人的每日劑量是1000-600,000U/kg。
本發(fā)明的另一種實施方案考慮了能夠有效抑制細胞間過氧化氫的產(chǎn)生和釋放的化合物，這些化合物可從包括組胺、二鹽酸組胺、磷酸組胺、血清素、dimaprit、可樂定、妥拉唑林、impromadine、4-甲基組胺、倍他唑、組胺同源化合物組成的組中選擇。在本發(fā)明的一個方面，這些化合物以0.05至50mg每劑量給藥成人。在這個發(fā)明的一個方面，這些化合物每劑給藥量為1-500ug/kg患者體重。
本發(fā)明的另一種實施方案考慮了在一個小時之內分別給藥細胞毒性淋巴細胞活化化合物和ROM抑制性化合物。另一實施方案考慮了在24小時內分別給藥細胞毒性淋巴細胞活化性和保護性化合物和ROM抑制性化合物。
本發(fā)明的方法進一步考慮了一種實施方案，在這種實施方案中以有效劑量的細胞間過氧化氫清除劑給藥。在這個實施方案的一個方面，這些清除劑選自包括過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶，抗壞血酸過氧化物酶在內的組。在這個實施方案的另一方面，過氧化氫酶對成年人給藥的劑量為約0.05-50mg/天，并且這些化合物可以單獨和結合給藥。在上述討論的化合物之外，本發(fā)明還考慮以多種化學治療藥物給藥。在一個實施方案中，化學治療藥物是抗癌藥物，他們選自包括環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、雌莫司汀、iphosphamide、潑尼莫司汀、白消胺、tiottepat、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶，長春花堿，長春新堿，長春地辛、依托泊苷，替尼泊苷、放線菌素D(Dactinomucin)doxorubin、(dunorubicine)、表柔比星、博來霉素、nitomycin、順鉑、卡鉑、丙卡巴肼、amacrine、咪托蒽醌、它莫西芬、nilutamid、和aminoglutemide在內的組中?？梢赃x用這些藥物的傳統(tǒng)劑量給藥。在另一實施方案中。給藥的化學治療藥物是抗病毒藥物，他們選自包括碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷(acycloguanosine)、溴乙烯基脫氧尿苷、利巴韋林，trisodium phosphophonoformate、金剛烷胺、金剛乙胺、(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺苷、4’，6’-二氯黃烷、AZT、3’-(疊氮-3’-脫氧胸苷)、更昔洛韋、didanosine(2’，3’-二脫氧肌苷或ddI)、zalcitabine(2’，3’-二脫氧胞苷或ddc)、二脫氧腺苷(ddA)、nevirapine、HIV蛋白酶抑制劑、以及其他病毒蛋白酶抑制劑在內的組中?？梢詰眠@些藥物的傳統(tǒng)劑量給藥。
圖表簡述

圖1-保護CD3ε+T細胞免遭DPI的氧化抑制。此處描述的淋巴細胞和MO是取自外周血液中。用培養(yǎng)基(對照，開環(huán))或IL-2(100U/ml，閉環(huán))處理MO和淋巴細胞的混合物16小時。培育后，淋巴細胞用CD3ε和CD69抗體進行標記。數(shù)據(jù)結果顯示了CD69在可存活T細胞(CD3ε)(左)中的表達，以及具有細胞程序性死亡減少的前傾擴散特征和增加的邊角擴散特征的T細胞百分數(shù)(右)。當在CD56+中檢測CD69表達時也獲得了同樣的結果。NK細胞與MO共培育29.5％(對照)或79.0％(1000nM DPI)的NK細胞獲得了對IL-2作出應答的CD69抗原。在沒有MO存在的情況下的T細胞或NK細胞培育中，DPI沒有增加IL-2誘導的CD69表達(未給出)。這個結果是三個類似實驗的代表數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及利用對ROM抑制性化合物，如diphenylionodinium單獨給藥或與其他輔助藥物結合給藥來治療來治療癌癥和病毒性疾病。ROM抑制性化合物是指能夠抑制ROM產(chǎn)生和釋放的化合物和組合物。ROM抑制性化合物這個名詞進一步包括ROM清除劑。對多種藥物給藥的結果是活化和保護了細胞毒性淋巴細胞免遭單核細胞/巨噬細胞的破壞和抑制性效應，并且刺激了這些細胞的抗癌和抗病毒特性。此外，在有疫苗組合物的情況下對ROM抑制性化合物給藥可使得在單核細胞存在的情況下提高淋巴細胞的分裂增生。本發(fā)明也考慮了在添加有其他的細胞毒性淋巴細胞活化化合物藥物的情況下給藥。細胞毒性淋巴細胞是擁有細胞毒性能力的淋巴細胞，如NK細胞和細胞毒性T細胞(CTLs)。細胞毒性淋巴細胞這個名詞也包括非細胞毒性細胞，如可輔助具有細胞毒性能力的淋巴細胞活化的輔助T細胞。細胞毒性淋巴細胞活化化合物，包括那些具有免疫刺激特性，其中優(yōu)選的是可與ROM抑制性化合物協(xié)同作用的化合物。這樣的免疫刺激性化合物的代表化合物包括細胞因子、肽、黃酮類化合物、一般抗原、疫苗和疫苗助劑?？膳c本發(fā)明的方法聯(lián)合使用的其他化合物包括化學治療藥物和/或抗病毒藥物。本發(fā)明中的方法在治療腫瘤疾病和病毒性疾病方面是有效的。
在考慮治療遭受多種腫瘤性疾病和病毒疾病個體方面，本發(fā)明尋求能夠刺激和提高細胞介導的免疫性的方法來達到治療的目的。細胞介導的免疫性(CMI)包括細胞毒性淋巴細胞介導的對外來藥劑的免疫應答。CMI應答不同于抗體介導的體液免疫性，因為在CMI中的活性藥劑是細胞毒性淋巴細胞，而不是抗體蛋白。
細胞介導的免疫性(CMI)是通過細胞毒性淋巴細胞，如NK細胞和/或T細胞(CTLs)識別和破壞在其表面展示有外來抗原的細胞的方式作用的。在本發(fā)明中，外來抗原可以是腫瘤性細胞或受病毒感染的細胞。這樣，CMI的職責是消滅體外侵入的細胞。例如，CMI是可以靶定病毒感染的細胞，而不是防止病毒感染細胞。不同于能有效防止病毒感染的體液免疫性，細胞介導的免疫性首要的機制是對已經(jīng)存在的病毒感染的防御。該機制對于腫瘤疾病進行的斗爭而言也很關鍵的。因此，在細胞毒性淋巴細胞活性提高方面，本發(fā)明特別適于對腫瘤疾病和病毒性疾病進行的斗爭。
正如上面所討論的，免疫系統(tǒng)包含有多種不同的細胞類型，每種細胞都用于保護機體免遭外來入侵。為了達到這個目的，免疫系統(tǒng)的某些細胞可產(chǎn)生活性氧代謝物(ROM)，例如過氧化氫，ghypalhous酸、以及羥基自由基。按照以前的觀察，自體單核細胞/巨噬細胞(MO)可有效抑制一種細胞毒性淋巴細胞，人天然殺傷(NK)細胞的活化，應答于體內細胞因子刺激(如IL-2或IFN-α)。(可參見，H，K.，etal.，Scand.J.Clin.Lab lnvest.57193-202(1997))。抑制性信號是通過MO產(chǎn)生的過氧化氫和其他活性氧代謝物(ROM)來傳遞的。(SeeHellstrand，K.，et al.，J.lmmunol.，1534940-4947(1994)；Hansson，M.，et al.，J.lmmunol.15642-47(1996))。已經(jīng)證明，添加可降低過氧化氫濃度的過氧化氫清除劑和/或添加可抑制過氧化氫釋放的化合物，如組胺或H2受體拮抗劑，這兩種方法都可去除MO的抑制性效應。
現(xiàn)在認為，T細胞是對多種細胞因子，如INF-α和IL-2的抗腫瘤特性負責的重要效應細胞，這在實驗腫瘤模型和人腫瘤疾病中也觀察到了。(Sabzevari，H.，et al.，Cancer Res.534933-4937，(1993)；Hakansson，Al.，et al.，Br.J.caneer，74670-676，(1996)；Wersall and Mellstedt，Med.Oncol.，1269-77，(1995))。本發(fā)明部分涉及到一些方法，這些方法包括將可降低ROM濃度的化合物與一或多種引起T細胞活化或刺激的T細胞活化化合物結合使用。本發(fā)明通過給藥影響ROM的化合物、T細胞活化化合物、和/或抗癌和抗病毒化合物，提供了多種方法來治療腫瘤性紊亂和病毒感染，這些方法是通過提高T細胞數(shù)量和特異性活性的方式來進行的。
在本領域中，已知有多種能夠激活和刺激細胞毒性淋巴細胞活性的細胞毒性淋巴細胞激活化合物。劑量、給藥途徑和使用方法以及對這些藥劑給藥都是按照傳統(tǒng)的方式，這些在本領域中是眾所周知的。一般來講，已經(jīng)證明，白細胞介素、細胞因子和黃酮類化合物能夠刺激細胞毒性淋巴細胞的活性。合適的化合物是選自包括IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、INF-α、INF-β、INF-γ以及黃酮乙酸、呫噸酮-4乙酸以及其類似物和衍生物。
某些疫苗和疫苗助劑也可認為是細胞毒性淋巴細胞活化化合物。此處考慮的化合物包括從已免疫或種痘的個體得到的多種疫苗和疫苗助劑，它們可輔助已給藥的抗原來誘導快速的、強有力的、持久的細胞毒性淋巴細胞介導的免疫應答。說明性的疫苗包括流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、腸炎沙門菌疫苗、乙肝疫苗、Boretellabronchiseptica疫苗、結核病疫苗，以及多種抗癌性治療藥物，如同種異基因癌癥疫苗和自體癌癥疫苗，這都是在本領域中已知的。
本發(fā)明還指導對這些疫苗助劑的使用。這些藥劑包括卡介苗(BCG)桿菌、百日咳菌外毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)、分支桿菌71KD細胞壁結合蛋白、微乳MF59、從可生物降解的多聚物聚(lactide-co-glycolides)(PLG)制備的微粒、30-40KD籠樣結構的免疫刺激復合體(ISCOMS)(它由助劑uil A的糖苷分子、膽固醇和抗原能夠整合其中的磷脂組成的)，以及本領域中已知的其他合適化合物。這樣的化合物可以以能在已免疫的個體內引起有效免疫應答的足夠劑量給藥。
本發(fā)明考慮和公開了多種不同細胞毒性淋巴細胞活化化合物。這些化合物可用于形成細胞毒性淋巴細胞活化組合物，這可能是本發(fā)明激活患者細胞毒性淋巴細胞的一個步驟。本發(fā)明也考慮到將細胞毒性淋巴細胞活化化合物和細胞毒性淋巴細胞活化組合物相互通用。對這些藥物的劑量、給藥途徑和使用方式以及歲這些藥物的給藥可按照傳統(tǒng)的方法，這在本領域中是眾所周知的。
名詞‘活性氧代謝物抑制劑’包括多種不同的化合物。NADPH抑制劑、H2受體抑制劑、以及其他在本領域中已知具有H2受體拮抗劑活性的其他化合物也適于在本發(fā)明中應用。這些合適化合物的包括diphenylionodonium(DPI)、組胺、與組胺和血清素具有相似化學結構、但不負面影響H2受體活性的化合物。合適的化合物是選自由diphenylionodonium(DPI)、組胺、dimaprit、可樂定、妥拉唑啉、IMPROZODINE、倍他唑、組胺同源化合物、H2受體拮抗劑、8-羥基-DPAT、ALK-3、BMY7378、NAN190、LISURIDE、d-LSD、FLESOXINAN、DHE、MDL72832、5-CT、DP-5-CT、IPSAPIRONE、WB4101、麥角胺、丁螺環(huán)酮、METERGOLINE、SPIROXATRINE、PAPP、SDZ(-)21009以及BUTOTANINE組成的組中。
在本領域中，多種可有效催化細胞間過氧化氫降解的過氧化氫清除劑也是已知的。適合的化合物是選自由過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶、維生素E、SELEN、谷胱甘肽以及抗壞血酸組成的組。
對上述化合物的給藥可在體內或體外的方式進行。當在體外給藥時，需要選用無菌、無毒的給藥途徑。在體內給藥時，上述化合物給藥可通過皮下、靜脈內、肌肉間、眼內、口、經(jīng)黏膜、或經(jīng)皮等路徑有利的進行，例如通過注射或通過控制釋放機制?？刂漆尫艡C制的示例包括多聚體、凝膠、微球體、脂質體、片劑、膠囊、栓劑、唧筒、注射器、眼內嵌入物(ocular insert)、經(jīng)皮膚制劑、洗劑、乳劑、經(jīng)鼻噴劑、親水膠、微囊、吸入劑以及膠態(tài)藥物傳遞體系。
本發(fā)明中的化合物是以藥物學上可接受的形式和基本上無毒的劑量給藥的。本發(fā)明對給藥化合物的多種形式進行了考慮。這些化合物可在含有或不含有表面活性劑如羥丙基纖維素的水溶液中給藥。對分散體溶液也進行了考慮，例如那些利用甘油、脂質聚乙烯乙二醇和油的分散體溶液。也在制劑中添加了抗微生物的藥物。可注射制劑包括無菌水溶液或分散體溶液，或在使用前可稀釋或懸浮在無菌環(huán)境中的粉劑。載體，如含有水、乙醇多羥基化合物、植物油等的溶劑或分散體溶液也可添加到本發(fā)明的化合物中。包衣，如卵磷脂和表面活性劑可用于維持組合物特有的流動性。也可添加等張因子如糖和氯化鈉，也可添加旨在延緩活性化合物的吸收的藥劑，如硬脂酸單鈉和明膠。無菌注射液的制備是按照本領域中的技術人員熟知的方法來制備的，并且在儲存和/或使用前進行過濾。無菌粉劑可通過對溶液或懸浮液進行真空干燥或冷凍干燥來制備。持續(xù)釋放制劑或配方也在本發(fā)明的考慮之列。在本發(fā)明中的組合物中所使用的藥劑都是藥物學上可接受的，并且是以基本上無毒的劑量給藥。
雖然對這些化合物進行的實驗中是選用的單一濃度，但我們應該明白在臨床上可以對這些化合物長時間的給藥以復合劑量。一般來講，這些化合物給藥的時間可長達大約一個星期，甚至可將時間延長至一個月或一年。在一些情況下，對這些化合物的給藥可以間斷，然后在以后的時間里繼續(xù)。這些化合物的每日劑量可分為多次給藥，也可是單獨一次給藥。
此外，本發(fā)明中的化合物可以是單獨給藥，或者是作為一個組合物(結合)給藥。如果單獨給藥，那這些化合物應該是以時間上相近的方式給藥，例如在24小時之內，這樣細胞因子或其他化合物對細胞毒性淋巴細胞的活化就可得到加強。較為特別的，這些化合物可在一小時內單獨給藥。給藥方式可以是局部或系統(tǒng)的注射或輸注。其他的給藥方法也可能是合適的。
本發(fā)明也考慮了將細胞毒性淋巴細胞活化化合物與ROM產(chǎn)生或釋放抑制化合物、ROM清除劑、抗癌化合物、以及抗病毒化合物結合給藥。劑量、給藥途徑和使用方法，以及對這些藥劑的給藥都是以傳統(tǒng)方法，這些在本領域中是熟知的。例如，在一個實施方案中，將IL-2和IL-12相結合來活化細胞性淋巴細胞群，在一個可選方案中，疫苗或者是佐劑用于活化T細胞群。在另一個實施方案中，在治療過程中是DPI與組胺結合給藥來抑制從單核細胞中產(chǎn)生和釋放過氧化氫。本發(fā)明也考慮了對多種ROM抑制劑化合物結合給藥，這些化合物包括過氧化氫清除劑如過氧化氫酶和抗壞血酸過氧化物酶。本發(fā)明進一步考慮利用上述所有化合物的結合來找出一種有效的方式，這樣可刺激細胞毒性淋巴細胞對腫瘤性疾病和/或病毒性疾病的抵抗。
所有的化合物制劑都是以劑量單位形式提供的，這樣就可將劑量一致，并且簡化了給藥。每個劑量單位形式含有預先確定劑量的活性成分，這個預先確定的劑量是通過計算得出來的，這個劑量的活性成分可與一定量的藥物上可接受的載體結合產(chǎn)生所需要效果。因此，這樣的計量就定義為特定化合物的有效劑量。
通過本領域中一般技術人員已知的技術就可以確定優(yōu)選的化合物劑量范圍。IL-2、IL-12或IL-15可以大約1000-600,000U/kg/天(18MIU/m2或1mg/m2/天)的劑量給藥。更優(yōu)選的劑量為大約3,000-200,000U/kg/天，甚至更優(yōu)選的劑量是大約5,000-100,000U/kg/天。
INF-α、INF-β、INF-γ也可以大約1000-600,000U/kg/天的劑量給藥，更優(yōu)選的劑量為大約3,000-200,000U/kg/天，甚至更優(yōu)選的劑量是大約5,000-100,000U/kg/天。
黃酮類化合物可以1-100,000mg/天的劑量給藥，更優(yōu)選的劑量是5-10,000mg/天，甚至更優(yōu)選的是劑量是大約50-1,000mg/天。
本發(fā)明中的化合物的一般給藥劑量在此處所列的范圍之內。例如，IL-2一般的單獨給藥劑量為大約300,000U/kg/天。INF-α一般給藥劑量為45,000U/kg/天。IL-12在臨床實驗上的劑量是0.5-1.5μg/kg/天(Motzer，et al.，Clin.CancerRes.4(5)1183-1191(1998))。IL-1β在癌癥患者身上的使用劑量是0.005-0.2μg/kg/天(Triozzi，etal.，J.Clin.Oncol.13(2)482-489(1995))。IL-15的使用劑量是25-400ug/kg/天。(Cao，et al.，Cancer Res 58(8)1695-1699(1998))。
也可對疫苗和疫苗助劑以與那些化合物相適應的劑量給藥來活化細胞毒性淋巴細胞。通過那些本領域中的一般技術人員熟知的技術就可以很容易的確定每種藥劑的合適劑量。對這些藥劑的合適劑量的確定要部分建立在患者對藥劑的可耐受性和治療效率之上，對這種可耐受性和效力的檢測是利用與確定合適的化學治療劑量相似的方法來進行的。
可有效抑制細胞間過氧化氫形成和釋放的化合物，或過氧化氫清除劑，能以有效劑量大約為0.05-10mg/天的劑量給藥，更優(yōu)選的劑量是大約0.1-8mg/天，甚至更優(yōu)選的劑量是大約0.5-5mg/天。此外，這些化合物可以1-100微克/千克患者體重(1-100mg/kg)的劑量給藥。然而，在每種情況下，這些劑量要依賴于給藥化合物的活性。前述的劑量對NADPH抑制劑如DPI、組胺、H2受體拮抗劑、其他細胞間過氧化氫產(chǎn)生或釋放抑制劑或過氧化氫清除劑是合適和有效的。對特定宿主的合適劑量可很容易的通過本領域中的一般技術人員熟知的經(jīng)驗技術確定。
本發(fā)明考慮了一種方法來確定患者是否需要增強的細胞毒性淋巴細胞活性和提高患者循環(huán)血液ROM抑制性化合物濃度至一個最佳的、有益的和治療性的水平，這樣就可以提供更加有效的細胞毒性淋巴細胞刺激性。在治療期內，這樣的水平可通過在一天的時間內重復注射本發(fā)明中的化合物來得到。
患有癌癥的患者經(jīng)常有循環(huán)血組胺水平降低的癥狀。(Burtin etal.Decreased blood histamine levels in subjects with solidmalignant tumors，Br.j.Cancer 47367-372(1983))。因此，將血液組胺濃度提高至有益濃度的方法可應用于癌癥和抗病毒的治療中，而這些癌癥和抗病毒治療是建立在組胺與一些藥劑之間的協(xié)同效應之上的，而這些藥劑又是可增強細胞毒性效應細胞介導的細胞毒性的。按照這種策略，T細胞活性就可增強。例如，通過將H2拮抗劑與藥劑結合給藥，可以提高細胞毒性T淋巴細胞的細胞毒性活性，這種H2激動劑如組胺，可將循環(huán)組胺提高至足夠增強與H2受體激動劑協(xié)同作用的藥劑的活性。
在本發(fā)明的一個實施方案中，循環(huán)血ROM抑制性化合物，如DPI或H2受體拮抗劑的有益水平是通過以0.05-10mg/天的劑量給藥ROM抑制化合物獲得的。在另外一種實施方案中，ROM抑制性化合物的有益血水平是通過給藥以1-100毫克/千克患者體重(1-100g/kg)的劑量來獲得的。在另一個實施方案中，在長達52個星期的治療期內，有1-4個星期的治療期是每天注射多次ROM抑制性化合物。是在另外一個實施方案中，ROM抑制性化合物的給藥時間是1-2個星期，在這段時間里進行每天幾次的多次注射(multiple injection)。這樣的給藥可以每幾個星期重復一次，這樣的治療時間可長達52個星期或更長的時間。此外，給藥的頻率是可變的，這要視患者對治療的耐受程度和治療的效果來定。例如，這樣的給藥可每星期或每天三次，持續(xù)時間可達24個月。
本發(fā)明的一個實施方案考慮了在多種癌癥或腫瘤性疾病治療中的應用。本發(fā)明可抵抗的惡性疾病包括的，但并不局限于原發(fā)或轉移性惡性腫瘤疾病、血液惡性疾病如急性和慢性骨髓性白血病、急性和慢性淋巴性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、特發(fā)性巨球蛋白血癥、毛細胞白血病、骨髓發(fā)育不良綜合癥、原發(fā)性脾大性紅細胞增多癥以及特發(fā)性血小板增多癥。
本發(fā)明中的方法可單獨使用，也可與其他抗癌治療結合使用。當與化學治療方法結合使用時，ROM抑制性化合物和細胞毒性淋巴細胞活化化合物是與一種或多種化學治療藥物結合使用的。劑量、給藥途徑和給藥方法以及對這些藥劑的給藥可按照本領域中熟知的傳統(tǒng)方式進行。在癌癥治療中應用的代表性化合物包括環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、雌莫司汀、iphosphamide、潑尼莫司汀、白消胺、tiottepat、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶，長春花堿，長春新堿，長春地辛、依托泊苷，替尼泊苷、放線菌素D(Dactinomucin)doxorubin、(dunorubicine)、表柔比星、博來霉素、nitomycin、順鉑、卡鉑、丙卡巴肼、amacrine、咪托蒽醌、它莫西芬、nilutamid、和aminoglutemide。應用這些化合物來治療惡性疾病的方法已經(jīng)很好的建立起來。此外，其他癌癥治療化合物也可與本發(fā)明中的化合物結合使用。
本發(fā)明考慮了對多種病毒性疾病的治療。下文所列的僅僅是本發(fā)明中的化合物能夠有效治療的一些病毒性疾病部分示例。其中有多種由單純皰疹病毒或帶狀皰疹病毒引起的皰疹疾病，這些皰疹包括菌部皰疹生殖器皰疹、唇皰疹、包皮皰疹、herpes progenitalis、herpesmenstrualis、herpetic keratitis、皰疹腦炎、眼帶狀皰疹以及帶狀皰疹病毒。本發(fā)明對上述疾病都能進行有效的治療。
本發(fā)明的另一方面表明其在對引起腸道疾病，如輪狀病毒導致的疾病，的病毒進行的抵抗方面是有效的。
在另一方面，本發(fā)明可有效的抵抗多種血液感染。例如黃熱病，登革熱、埃博拉病毒、Crimean-Congo出血性熱、漢坦病毒疾病、單核細胞增多癥和HIV/AIDS。
本發(fā)明的另一方面涉及多種引起肝炎的病毒。這些病毒的一個具有代表性的群體包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。
還是在另一方面，本發(fā)明有效抵抗了病毒感染引起的呼吸道疾病。示例包括鼻病毒感染(普通的感冒)、腮腺炎、風疹、水痘、B型流感、呼吸道合胞病毒感染、麻疹、急性發(fā)熱性咽炎、咽結膜性熱以及急性呼吸性疾病。
本發(fā)明的另一方面考慮和對多種癌癥相關的病毒的處理方法，這些病毒包括成人T細胞白血病/淋巴瘤(HTLVS)、鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤(EBV)、宮頸癌、肝細胞癌。
在進一方面，本發(fā)明在治療病毒介導的腦炎方面是有效的，這些腦炎包括St Louis腦炎、Western腦炎、以及脾傳性腦炎。
本發(fā)明中的方法可單獨或與其他抗病毒治療方法結合使用。當與其他抗病毒化學治療法結合使用時，可對ROM抑制性化合物和細胞毒性淋巴細胞活化化合物與一種或多種抗病毒藥物結合給藥。計量、給藥途徑和使用方法以及對這些藥劑的給藥都是應用本領域中眾所周知的方法。在抗病毒化學治療中應用的代表性化合物包括碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷(acycloguanosine)、溴乙烯基脫氧尿苷、利巴韋林，trisodium phosphophonoformate、金剛烷胺、金剛乙胺、(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺苷、4’，6’-二氯黃烷、AZT、3’-(疊氮-3’-脫氧胸苷)、更昔洛韋、didanosine(2’，3’-二脫氧肌苷或ddI)、zalcitabine(2’，3’-二脫氧胞苷或ddc)、二脫氧腺苷(ddA)、nevirapine、HIV蛋白酶抑制劑、以及其他病毒蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶抑制劑。
本發(fā)明還考慮將抗癌和抗病毒藥物的結合物與ROM抑制性化合物結合給藥。
雖然沒有意圖來限制本發(fā)明，但是我們認為本發(fā)明中的方法是通過改變抗原呈遞機制來提高細胞毒性淋巴細胞活性的。一種理論認為，同時是抗原呈遞細胞(APC)的單核細胞/巨噬細胞向T細胞的抗原呈遞受到了抑制。這種抑制可能是由來產(chǎn)生ROM的MO代謝途徑產(chǎn)生的，而ROM又抑制了MO抗原呈遞代謝途徑，在MO群體中產(chǎn)生了互斥抗原呈遞或ROM產(chǎn)生狀態(tài)。MO抗原傳遞的一個結果是T細胞在沒有傳遞過來的抗原和ROM存在的情況下保持休眠狀態(tài)。
按照這種理論，ROM產(chǎn)生和釋放抑制性化合物，如組胺的給藥的作用就是通過增加抗原的呈遞來提高T細胞的活性。在有益濃度的組胺存在下，單核細胞產(chǎn)生的ROM具有一個開啟的分子開關，從而造成對ROM產(chǎn)生的負調節(jié)。在上述的互斥代謝狀態(tài)假說中，對ROM產(chǎn)生的負調節(jié)導致隨后抗原呈遞途徑的增加，從而導致了抗原呈遞的增加。相應的，在基于抗原的T-細胞活化劑，如疫苗存在的情況下，對組胺給藥將降低ROM的生產(chǎn)和增加抗原的傳遞，從而將有助于提高T細胞活性。
在另外一種理論中，對ROM抑制劑給藥可去除ROM誘導的細胞毒性淋巴細胞抑制作用，導致細胞毒性淋巴細胞活性提高。
下面討論的例子應用了本發(fā)明的學說，表明單核細胞/巨噬細胞(MO)，尤其是MO衍生的活性氧代謝物(ROMs)有效的抑制了人細胞毒性淋巴細胞的活化，即使是在體外對細胞毒性淋巴細胞活化化合物如INF-α或IL-2給藥之后。此外，結果顯示當將ROM抑制性化合物添加到淋巴細胞和MO的混合物中時，ROM抑制性化合物對細胞毒性淋巴細胞給予了保護。
為了確定本發(fā)明中的多種化合物對T細胞群的效應，我們對那些可在成人細胞毒性淋巴細胞表面誘導表達的多種細胞毒性淋巴細胞的表達進行了研究。觀察結果顯示，在無ROM抑制性化合物存在的情況下，MO明顯抑制了細胞因子誘導的細胞毒性淋巴細胞活化，這個結果是通過CD69或其他標記物與代表性細胞因子如IL-2或INF-α共培育之后的結果來反映的。然而，添加這樣的ROM抑制性化合物有效的逆轉了我們觀察到的MO抑制效應。我們也做了一些額外的工作，研究了組胺在人細胞毒性淋巴細胞對預防體外流感病毒的多價疫苗增殖應答上的效應。在這些實驗中，對組胺的給藥表明，在抗原和單核細胞存在的情況下，它增強了淋巴細胞的增殖。示例通過提及下列旨在例示本發(fā)明的示例，會更易于理解本發(fā)明的一些特定方面，但本發(fā)明并不將其范圍局限于特定的示例實施方案。
通過應用多種可導致細胞毒性淋巴細胞刺激和/或活化的細胞毒性淋巴細胞活化化合物，本發(fā)明中的方法可用于增強對細胞毒性淋巴細胞群的活化和保護。ROM抑制性化合物如DPI，在下文中有討論。
為了證明這些化合物的活化和保護特性，我們將淋巴細胞(包括NK細胞和T細胞)和單核細胞從捐贈的血中分離開，并且檢驗了當他們暴露于多種細胞毒性淋巴細胞活化化合物如IL-2和/或INF-α、疫苗、疫苗助劑或其他免疫刺激化合物、多種ROM抑制性化合物如DPI、組胺，以及多種過氧化氫清除劑如過氧化氫酶時的活化特性。
從sweden Sahlgren’s Hospital血液中心的健康供體中獲得了新鮮制備的LEUCOPACK形式的外周靜脈血，以此來研究在MO和ROM抑制劑存在和不存在的情況下，細胞毒性淋巴細胞的活化特性。將血液(65ml)與92.5ml Iscove’s培養(yǎng)基、35ml 6％的Dextran(KabiPharmacia，Stockholm，Sweden)以及7.5ml檸檬酸右旋糖(ACD)(Baxter，Deerfield，lllinois)混合。在室溫下培育15分鐘后，上清液在Ficoll-Hypaque(Lymphoprep，Myegaard，Norway)上小心分層。經(jīng)過室溫下轉速為380g離心15分鐘后，在分界面處收集單核細胞(MNC)，在PBS緩沖液中沖洗兩次，重新懸浮在添加有10％人AB+血清的Iscove’s培養(yǎng)基中。在對細胞進一步分離的過程中，將細胞懸浮液保存在硅化試管(Vacuette，Greiner，Stockholm)中。
通過利用對最初由yasaka和他的合作者描述的逆流離心淘選(CCE)技術(Yasaka，T.et al.，J.lmmunol.，1271515)做了修改之后的CCE技術將MNC進一步分離為淋巴細胞和單核細胞(MO)，其中對CCE所做的修改Hansson等(J.lmmunol.，15642(1996))已有描述。簡單的講，將MNC重新懸浮在含有0.05％BSA和含有利用氯化鈉緩沖溶液配制的0.015％EDTA的淘選緩沖溶液，然后將其在BeckmanJ2-21超速離心機中離心，轉子為JE-68B型轉子，轉速為2100rpm。以18毫升/分鐘的流速獲得了MO含量大于90％的部分。以14-15毫升/分鐘的流速回收了富含NK細胞(CD3-/56+表型)和T細胞(CD3+/56+)的淋巴細胞部分。這部分含有小于3％的MO，其組成為CD3ε+/56-NK細胞(45-50％)、CD3ε+/56-T細胞(35-40％)、CD3ε+/56-細胞(5-10％)以及CD3ε+/56+細胞(1-5％)，這是通過血細胞得來的數(shù)據(jù)。在一些實驗中，使用包被有抗CD56-的dynabead(Dynal A/S，Os/O，Norway)來獲得純化的T細胞淋巴細胞制劑，上述的Hansson等在這方面有詳述。
在上述的分級分離之后，將T細胞和NK細胞的淋巴細胞混合物置于下述的多種實驗條件中，并且通過作為活化標記的特定細胞表面蛋白的出現(xiàn)來對其活化進行檢測。
通過定位在細胞表面的特定蛋白可對淋巴細胞進行檢測。不同的細胞表面蛋白定位在不同淋巴細胞和處于不同活化階段的淋巴細胞表面上。已經(jīng)將這些蛋白歸類為CD類或‘分化簇’，并且他們可用做多種不同類型細胞的標記物。對不同表面蛋白特異的標記抗體結合到CD標記的表面，這樣他們就可用于鑒別不同類型的T細胞和他們各自的活化階段。
在下面描述的實驗中，CD3、CD4、CD8、CD69和CD56(一種NK細胞標記物)可檢測我們所需的細胞毒性淋巴細胞。CD3組抗體對在所有外周T細胞上表達的標記物是特異的。CD4組抗體特異于II型MHC限制性T細胞，而II型MHC限制性T細胞又叫做輔助T細胞。CD8組抗體識別定位于I型MHC限制性T細胞之上，而I型MHC限制性T細胞又叫做CTLs或溶細胞T細胞。CD69細胞識別活化的T細胞和其他活化的免疫細胞。最后，CD65組抗體可識別在NK細胞表面的異源二聚物。
在下面描述的實驗中，流動血細胞記數(shù)可用來鑒別T細胞的多種亞群。流氏細胞儀使得研究人員能通過多種標記探針在大范圍內區(qū)分各個亞群。在這些實驗中，CD3標記物是用來檢測T細胞亞群的，而CD4和CD8標記物可用來將T細胞亞群進一步分為輔助T細胞和CTLs。在存在組胺和T細胞活化化合物和不存在組胺和T細胞活化化合物的情況下，就可通過CD69 T細胞活化標記來確定MO暴露引起的效應。利用流氏細胞儀就在一個淋巴細胞離子通道閘門中對不同標記物的表達進行估計(as described in Hellstrand，K.，etal.Cell.lmmunol.13844-54(1991))。
前面的使用方法是用于實驗中來報告細胞群表面抗原的。將一百萬個細胞與適當?shù)漠惲蚯杷釤晒馑?FITC)和藻紅蛋白(PE)共軛單克隆抗體在冰上進行30分鐘的共培育(Becton &Dickinson，Stockholm，Sweden；1μl/106cells)。用PBS將細胞沖洗兩次，然后沖洗懸浮在500ul的無菌過濾PBS中，通過連有已配備了Lysys II軟件程序(Becton & Dickenson)的FACSort的流氏細胞儀來進行分析。淋巴細胞是呈前傾角和直角散射的。將流速調整為小于200細胞xs-1，并且如果沒有特別聲明的話，每個樣品至少要分析5000個細胞。示例1
為了確定DPI和組胺是否能夠抑制MO中ROM的自發(fā)釋放，我們進行了化學發(fā)光檢測來對ROM(超氧離子)進行特異性定量。我們利用Hellstrand，K等在J Immunol 153期4940-4947(1994)頁上的文章中和Lundqvist與Dahlgren在Free Radic.Biol.Nod第20期785-792頁(1996)上的文章中描述過的方法來檢測淘選過的MO中自發(fā)性等點發(fā)光增強細胞外超氧離子生成。在DPI濃度為10nM時，我們觀察到細胞外超氧離子的釋放降低了4倍還要多，在對從三個血液捐贈者身上采取的血樣進行的三個實驗中，我們也觀察到了相似的結果。相似的是，在模型實驗中，組胺(50uM)抑制的細胞外超氧離子濃度要高出他的濃度5倍多。而相同摩爾濃度的ranitidine可將組胺產(chǎn)生的效果完全拮抗。示例2MO能夠降低分子氧濃度并產(chǎn)生ROM(呼吸爆發(fā))，這兩種情況可以是自發(fā)的和在對特定可溶的或顆粒藥劑刺激的應答時產(chǎn)生(seeKlebanolff，S.J.，Adv.Host Def.Mech.1111-151(1982))。在研究從對IL-2作出應答的T細胞和NK細胞上獲得的CD69時，我們將DPI，一種NADPH氧化酶活性抑制劑(Miesel，R.，etal.，F(xiàn)ree.Radic.Biol 2075-81(1996))，添加到淋巴細胞和MO的混合物中。利用培養(yǎng)基或IL-2(100U/ml)對MO和淋巴細胞混合物進行6個小時的處理。培育后，將淋巴細胞用CD3ε和CD69標記。數(shù)據(jù)結果顯示了CD69在活T細胞(CD3ε)中的表達，也顯示了具有減少的前傾散射和增加的邊角散射死亡特征的T細胞的百分數(shù)。在檢查CD69細胞在CD56+中表達時也獲得了相似的結果。NK細胞與含有29.5％(對照)或79％(DPI 1000nM)NK細胞的MO共培育，而所用的NK細胞在對IL-2作出應答時可獲得CD69抗原。在沒有MO存在下溫孵T細胞或NK細胞中，DPI沒有增加IL-2誘導的CD69表達。DPI顯著的逆轉了MO誘導的T細胞(圖1)和NK細胞(未出示)抑制。MO也產(chǎn)生了活性氮中間物，其中氧化氮(NO)是其最終效應分子，并且DPI也是NO合成酶的抑制劑(Miesel，R.，etal.，F(xiàn)ree.Radic.Biol 2075-81(1996))。為了研究MO中NO誘導是否有助于觀察T細胞和NK細胞對IL-2的無反應性，我們選用了NO合成酶抑制劑N-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA)來進行實驗。在使用濃度足以抑制MO中NO合成的情況下(Hansson，M，et al.，Jlmmunol.15642-47(1996))，這種化合物并沒有影響MO誘導的T細胞和NK細胞抑制。過氧化氫酶，一種過氧化氫清除劑，在濃度超過50U/ml時，就能顯著的逆轉T細胞和NK細胞中MO誘導的對IL-2誘導的CD69表達的抑制，然而，超氧化物歧化酶，一種超氧離子清除劑，在足以清除大于90％超氧離子的濃度(200U/ml)時卻沒能產(chǎn)生這樣的逆轉效用。示例3與在inter alia_T細胞(Alderson，M.R.，et al.，J ExpMod.18171-77(1995))和NK細胞(Medvedev，A.E.，et al.，Cytokine9394-404(1997))上表達的Fas受體(CD95L)作用之后，F(xiàn)as配體可引發(fā)多種類型細胞的凋亡。為了評定FasL/Fas相互作用在觀察到的氧化誘導凋亡中的作用，我們選用了一種Fas配體抑制劑，這種抑制劑可融合到人IgG1的Fc片段上，其包含有人Fas細胞外結構域(aa1-154)。FasFc-IgG1融合蛋白在一定濃度(20ug/ml)已足以減少大于60％FasL介導的、活化誘導的T細胞凋亡，但并不影響T細胞或NK細胞中MO誘導的對IL-2的無反應性或MO誘導的細胞凋亡(表1)。
表1 T細胞和NK細胞中FasL/Fas非依賴型無反應性和凋亡
A從外周血中回收淋巴細胞和MO，用表1的圖注中描述的抗CD3ε、抗CD56和抗CD69進行標記，并且利用流氏細胞儀來分析各自的表型。DPI濃度為100nM，F(xiàn)asFc-IgG1濃度為20ug/ml。B利用含有降低的前傾散射和增加的直角散射的淋巴細胞離子通道閘門，通過流氏細胞儀來檢測細胞凋亡。在三個單獨實驗中得到了相似的結果。示例4以藥物上可接的形式、以大約0.2-2.0mg或3-10μg/kg的劑量將溶解于無菌載體溶液中的DPI皮下注射入需要增強T細胞活性的患者體內，在這樣的情況下，患者往往是患有惡性疾病。伴隨的，在第1-5和8-12天時，W.IL-2，如人重組IL-2(Proleukin，Eurocetus)以27g/kg/天的劑量進行皮下注射或持續(xù)灌輸。這個劑量代表了IL-2的總劑量，這個劑量要比本領域中的熟練技術人員的給藥量低的多。
上述的方法一直重復4-6個星期，直至觀察到腫瘤疾病的真實衰退。甚至在觀察到部分或完全的應答之后，這樣的治療還可繼續(xù)。對產(chǎn)生了完全應答的患者來說，在治療周期間，這樣的治療可以有更長的時間間隔。
這樣的治療也包括周期性的提高血液DPI水平，這是通過每天注射1次、2次或更多次劑量為0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI，，并且在有規(guī)律間隔時間內持續(xù)1到2周這樣的方式來實現(xiàn)的，例如，每天注射一次、每兩周注射一次、或每周注射一次以使血液血液DPI穩(wěn)定在有益的濃度上。DPI和化學治療藥物的聯(lián)合使用DPI也可與化學治療藥物聯(lián)合使用來治療腫瘤性疾病或病毒性疾病。在旨在加快細胞毒性淋巴細胞活化和保護的化學治療前、治療中、治療后和貫穿整個化學治療過程中，通過DPI給藥可消除單核細胞介導的抑制。
用于癌癥和抗病毒治療的代表性化合物在上文有敘述。其他的癌癥和病毒性疾病治療化合物也可用在本發(fā)明之中。相似的，本發(fā)明的治療方法可有效抵抗的、因而可進行指導治療的惡性疾病和病毒性疾病在上文也有敘述。應該指出的是，對于本領域中的熟練技術人員來講，這些抗癌癥和抗病毒化合物的給藥量、給藥途徑和劑量準則都是已知的。本發(fā)明的目的直接指向提高這些化合物效率和優(yōu)化他們的治療結果。因此，我們認為，將他們的傳統(tǒng)使用方法與本發(fā)明中的化合物和使用方法相結合就足以獲得我們想要的治療效果。
已經(jīng)證明，將組胺和IL-2結合來活化NK細胞是在治療骨髓性白血病方面與傳統(tǒng)化學治療方法的有效結合。(Brune andHellstrand，Br.J.Haematology，92620-626(1996)。示例5對由于腫瘤性疾病和/或病毒性感染如乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、1型或2型單純皰疹病毒(HSV)、或其他病毒感染而需要增強細胞毒性淋巴細胞活性的患者來講說，可以通過在第1-5和8-12天時，以27g/kg/天的劑量，進行皮下注射或持續(xù)注人重組IL-2輸注的方法(ProleukinEurocetus)來治療。此外，患者還可以一個合適的給藥途徑，例如皮下注射，來以6×106U的日劑量進行干擾素給藥治療。這樣的治療也包括與IL-2和/或干擾素給藥相結合的、每天注射1次、2次或更多次劑量為0.2-2.0mg或3-10μg/kg的DPI給藥治療。
上述方法可持續(xù)4-6周，直至觀察到腫瘤衰退，或直至病毒感染有改進。甚至在第一次、第二次或隨后的癥狀完全減輕后繼續(xù)治療。對于產(chǎn)生了完全應答的患者來講，在治療周期中可給予兩次這樣的治療更長的時間間隔。
這樣的治療也包括周期性的加強患者血液DPI水平，這是通過每天注射1次、2次或更多次劑量為0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI，，并且在有規(guī)律間隔時間內持續(xù)1到2周這樣的方式來實現(xiàn)的，例如，每天注射一次、每兩周注射一次、或每周注射一次以使血液血液DPI穩(wěn)定在一個有益的濃度，如高于0.2μm/l.。
此外，干擾素給藥的頻率也是變化的，這要依賴于患者對治療的耐受程度和治療的有效性。例如，干擾素的給藥可以每周三次，或甚至每天一次的頻率持續(xù)24個月。那些本領域中的熟練技術人員對干擾素治療的變化都很熟悉，這樣就不僅可以收到好的治療效果，而且使患者舒適一些。示例6癥狀第一次、第二次、隨后的或完全的減輕的，患有AML的患者接受IL-2[35-50g(相當于6.3-9×105IU)，皮下注射，每天兩次]為期21天的治療，在3-6個星期的間隔之后重復治療，直到復發(fā)。在#1周期中，患者接受為期3周。由16mg/m2/天阿糖胞苷、40mg/天硫鳥嘌呤組成的低劑量化學治療。伴隨的，對患者每天兩次皮下注射0.2-2.0mg或3-10μg/kg藥物上可接受形式的DPI，以此將循環(huán)DPI的濃度提高到有益水平(在0.2m/l以上)。在IL2治療過程中，通過每天兩次對以ROM抑制性化合物的藥物上可接受形式存在的、劑量為0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI給藥，可持續(xù)將DPI濃度提高到一個有益的水平。然后，患者允許有3-6周的休息時間。
在第一個治療周期(#1治療周期)結尾之后，第二個治療周期(#2治療周期)開始。每天兩次對存在于無菌載體溶液中的、ROM的藥物上可接受的形式進行注射，注射方式是皮下注射，給藥劑量為0.2-2.0mg或3-10ug/kg。阿糖胞苷(16mg/m2/天)和硫鳥嘌呤(40mg/天，口服)給藥期為21天(或直至血小板記數(shù)50×109/L)。在第二個星期，患者接受每天兩次、每次注射劑量為0.2-2.0mg或3-10ug/kg的藥物上可接受形式的DPI給藥來提高DPI至一有益水平。在為期三周的化學治療的最后，患者接受為期一周的、每天兩次、每次注射劑量為0.2-2.0mg或3-10ug/kg的藥物上可接受形式的DPI給藥。然后患者接受為期3周的IL-2給藥。然后患者允許有3-6周的休息時間。
隨后，#3治療周期開始。#3治療周期與#2治療周期完全相同。
此外，這樣的治療也包括周期性的提高血液DPI水平，這是通過每天注射1次、2次或更多次劑量為0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI，，并且在有規(guī)律間隔時間內持續(xù)1到2周這樣的方式來實現(xiàn)的，例如，每天注射一次、每兩周注射一次、或每周注射一次以使血液血液DPI獲得一個有益的濃度。討論此處提供的數(shù)據(jù)表明MO抑制了細胞毒性淋巴細胞的活化。細胞毒性淋巴細胞活化的MO抑制看來是通過ROM的形成來介導的。上文討論的實驗表明，通過添加ROM抑制性化合物如DPI可逆轉細胞毒性淋巴細胞的MO抑制。這些結果表明細胞毒性淋巴細胞的活化是從MO抑制的負調節(jié)中受益的。結論雖然我們詳細敘述了一些特定的實施方案，但是對本領域中的熟練技術人員來講，這些實施方案只是來例解本發(fā)明的，而不是來限制本發(fā)明的。因此，所有的文獻也通過引用包括在內。
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權利要求
1.一種含diphenylionodonium(DPI)的組合物，可用于在單核細胞(MO)存在的情況下，活化和保護細胞毒性淋巴細胞的方法中，這些方法包括檢測一個個體是否需要增強細胞毒性淋巴細胞活性；對患者給藥以有效劑量的diphenylionodonium(DPI)以在MO存在的情況下，活化和保護細胞毒性淋巴細胞的功能。
2.權利要求1中的組合物，進一步包括可以有效劑量對患者給藥的細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物，其中，該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物是選自由疫苗助劑、疫苗、肽、細胞因子和黃酮類化合物組成的組。
3.權利要求2中的組合物，其中該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物是疫苗助劑，選自由卡介苗(BCG)芽孢桿菌、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)、分支桿菌71KD細胞壁結合蛋白、微乳MF59、多聚(lactide-co-glycolides)微粒(PLG)、以及免疫刺激復合體(ISCOMS)組成的組。
4.權利要求2中的化合物，其中細胞毒性淋巴細胞刺激性化合物是疫苗，選自由流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、腸炎沙門氏菌疫苗、乙肝疫苗、Boretella bronchiseptica疫苗、結核病疫苗、同種異基因癌癥疫苗和自體癌癥疫苗組成的組。
5.權利要求2中的組合物，其中的細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物是細胞因子，選自由IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IFN-α，IFN-β，或IFN-γ組成的組。
6.權利要求2中的組合物，其中的細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物是黃酮類化合物，選自由黃酮乙酸和呫噸酮-4-乙酸組成的組。
7.權利要求2中的組合物，其中該細胞毒性淋巴細胞的日給藥劑量是1000-600,000U/kg。
8.權利要求1中的組合物，進一步包括有效劑量的一些化合物，這些化合物可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)的產(chǎn)生和釋放，這些化合物選自由組胺、二鹽酸組胺、磷酸組胺、血清素、dimaprit、可樂定、妥拉唑林、impromadine、4-甲基組胺、倍他唑、組胺同源化合物組成的組。
9.權利要求8中的組合物，其中該有效劑量為0.05-50mg/劑。
10.權利要求8中的組合物，其中該有效劑量為1-500μg/kg患者體重。
11.權利要求1中的組合物，其中給藥該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物，以及給藥有效劑量的可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)的化合物在1小時之內進行。
12.權利要求1中的組合物，其中給藥該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物，以及給藥有效劑量的可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)的化合物在24小時之內進行。
13.權利要求8中的組合物，其中該細胞間活性氧代謝物是過氧化氫。
14.權利要求13中的組合物，進一步包括有效劑量的細胞間過氧化氫清除劑。
15.權利要求14中的組合物，其中的清除劑是選自由過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶組成的組。
16.權利要求14中的組合物，其中該過氧化氫清除劑的給藥劑量為0.05-50mg/天。
17.權利要求14中的組合物，其中該有效劑量的DPI、該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物和該過氧化氫清除劑是分別給藥的。
18.權利要求1中的組合物，進一步包括化學治療藥物。
19.權利要求18中的組合物，其中的化學治療藥物包括抗癌藥物，它是選自一個組中，這個組是由環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、雌莫司汀、iphosphamide、潑尼莫司汀、白消胺、tiottepat、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶，長春花堿，長春新堿，長春地辛、依托泊苷，替尼泊苷、放線菌素D(Dactinomucin)doxorubin、dunorubicine、表柔比星、博來霉素、nitomycin、順鉑、卡鉑、丙卡巴肼、amacrine、咪托蒽醌、它莫西芬、nilutamid、和aminoglutemide組成。
20.權利要求18中的組合物，其中的化學治療藥物包括抗病毒藥物，這些抗病毒藥物是選自一個組，這個組是由碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷(acycloguanosine)、溴乙烯基脫氧尿苷、利巴韋林，trisodium phosphophonoformate、金剛烷胺、金剛乙胺、(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺苷、4’，6’-二氯黃烷、AZT、3’-(疊氮-3’-脫氧胸苷)、更昔洛韋、didanosine(2’，3’-二脫氧肌苷或ddI)、zalcitabine(2’，3’-二脫氧胞苷或ddc)、 二脫氧腺苷(ddA)、nevirapine、HIV蛋白酶抑制劑、以及其他病毒蛋白酶抑制劑組成。
21.權利要求18中的組合物，其中的藥劑包括該DPI、該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物，以及該與單獨藥劑相結合的化學治療藥物。
22.用來在單核細胞(MO)存在的情況下活化和保護細胞毒性淋巴細胞的方法，它包括檢測一個個體是否需要增強細胞毒性淋巴細胞活性；以及對患者給藥以有效劑量的diphenylionodonium(DPI)以在MO存在的情況下，活化和保護細胞毒性淋巴細胞的功能。
23.權利要求22中的方法，進一步包括對個體給藥以有效劑量的細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物，該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物是選自由疫苗助劑、疫苗、肽、細胞因子和黃酮類化合物組成的組。
24.權利要求23中的方法，其中該細胞毒性淋巴細胞刺激性化合物是疫苗助劑，選自由卡介苗(BCG)芽孢桿菌、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)、分支桿菌71KD細胞壁結合蛋白、微乳MF59、多聚(lactide-co-glycolides)微粒(PLG)、以及免疫刺激復合體(ISCOMS)組成的組。
25.權利要求23中的方法，其中細胞毒性淋巴細胞刺激性化合物是疫苗，選自由流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、腸炎沙門氏菌疫苗、乙肝疫苗、Boretella bronchiseptica疫苗、結核病疫苗、同種異基因癌癥疫苗和自體癌癥疫苗組成的組。
26.權利要求23中的方法，其中的細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物是細胞因子，選自由IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IFN-α，IFN-β，或IFN-γ組成的組。
27.權利要求23中的方法，其中的細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物是黃酮類化合物，選自由黃酮乙酸和呫噸酮-4-乙酸組成的組。
28.權利要求23中的方法，其中該細胞毒性淋巴細胞的日給藥劑量是1000-600,000U/kg。
29.權利要求22中的方法，進一步包括有效劑量的一些化合物，這些化合物可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)的產(chǎn)生和釋放，這些化合物選自由組胺、二鹽酸組胺、磷酸組胺、血清素、dimaprit、可樂定、妥拉唑林、impromadine、4-甲基組胺、倍他唑、組胺同源化合物組成的組。
30.權利要求29中的方法，其中該有效劑量為0.05-50mg/劑。
31.權利要求29中的方法，其中該有效劑量為1-500μg/kg患者體重。
32.權利要求22中的方法，其中給藥該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物，以及給藥有效劑量的可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)的化合物在1小時之內進行。
33.權利要求22中的方法，其中給藥該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物，以及給藥有效劑量的可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)的化合物在24小時之內進行。
34.權利要求29中的方法，其中該細胞間活性氧代謝物是過氧化氫。
35.權利要求24中的方法，進一步包括有效劑量的細胞間過氧化氫清除劑。
36.權利要求35中的方法，其中的清除劑是選自由過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和抗壞血酸過氧化物酶組成的組。
37.權利要求35中的方法，其中該過氧化氫清除劑的給藥劑量為0.05-50mg/天。
38.權利要求35中的方法，其中該有效劑量的DPI、該細胞毒性淋巴細胞刺激性化合物和該過氧化氫清除劑是分別給藥的。
39.權利要求22中的方法，進一步包括化學治療藥物。
40.權利要求39中的化合物，其中的化學治療藥物包括抗癌藥物，它是選自一個組中，這個組是由環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、雌莫司汀、iphosphamide、潑尼莫司汀、白消胺、tiottepat、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶，長春花堿，長春新堿，長春地辛、依托泊苷，替尼泊苷、放線菌素D(Dactinomucin)doxorubin、dunorubicine、表柔比星、博來霉素、nitomycin、順鉑、卡鉑、丙卡巴肼、amacrine、咪托蒽醌、它莫西芬、nilutamid、和aminoglutemide組成。
41.權利要求39中的方法，其中的化學治療藥物包括抗病毒藥物，這些抗病毒藥物是選自一個組，這個組是由碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷(acycloguanosine)、溴乙烯基脫氧尿苷、利巴韋林，trisodium phosphophonoformate、金剛烷胺、金剛乙胺、(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺苷、4’，6’-二氯黃烷、AZT、3’-(疊氮-3’-脫氧胸苷)、更昔洛韋、didanosine(2’，3’-二脫氧肌苷或ddI)、zalcitabine(2’，3’-二脫氧胞苷或ddc)、二脫氧腺苷(ddA)、nevirapine、HIV蛋白酶抑制劑、以及其他病毒蛋白酶抑制劑組成。
42.權利要求39中的方法，其中該有效劑量的DPI、該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物、該抑制細胞間過氧化氫產(chǎn)生和釋放的化合物，以及該化學治療藥物的給藥是同時進行的。
43.一種組合物，它含有在藥物學上可接受載體中的、細胞毒性淋巴細胞保護劑量的diphenylionodonium(DPI)。
44.權利要求43中的組合物，進一步包含細胞毒性淋巴細胞刺激性化合物，該細胞毒性淋巴細胞刺激性化合物是選自由疫苗助劑、疫苗、肽、細胞因子和黃酮類化合物組成的組。
45.權利要求44中的組合物，其中該化合物是疫苗助劑，選自由卡介苗(BCG)芽孢桿菌、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素(LT)、分支桿菌71KD細胞壁結合蛋白、微乳MF59、多聚(lactide-co-glycolides)微粒(PLG)、以及免疫刺激復合體(ISCOMS)組成的組。
46.權利要求44中的組合物，其中的化合物是疫苗，選自由流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、腸炎沙門氏菌疫苗、乙肝疫苗、Boretellabronchiseptica疫苗、結核病疫苗、同種異基因癌癥疫苗和自體癌癥疫苗組成的組。
47.權利要求44中的組合物，其中的化合物是細胞因子，選自由IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IFN-α，IFN-β，或IFN-γ組成的組。
48.權利要求44中的組合物，其中的化合物是黃酮類化合物，選自由黃酮乙酸和呫噸酮-4-乙酸組成的組。
49.權利要求44中的組合物，其中該細胞毒性淋巴細胞刺激性組合物的日給藥劑量是1000-600,000U/kg。
50.權利要求43中的組合物，進一步包括有效劑量的一些化合物，這些化合物可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)的產(chǎn)生和釋放，這些化合物選自由組胺、二鹽酸組胺、磷酸組胺、血清素、dimaprit、可樂定、妥拉唑林、impromadine、4-甲基組胺、倍他唑、組胺同源化合物組成的組。
51.權利要求50中的組合物，其中該化合物可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)產(chǎn)生和釋放的有效劑量為0.05-50mg/劑。
52.權利要求50中的組合物，其中該化合物可抑制細胞間活性氧代謝物(ROM)產(chǎn)生和釋放的有效劑量為1-500μg/kg患者體重。
53.權利要求43中的組合物，進一步包括化學治療藥物。
54.權利要求53中的組合物，其中的化學治療藥物包括抗癌藥物，它是選自一個組中，這個組是由環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法侖、雌莫司汀、iphosphamide、潑尼莫司汀、白消胺、tiottepat、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶，長春花堿，長春新堿，長春地辛、依托泊苷，替尼泊苷、放線菌素D(Dactinomucin)doxorubin、dunorubicine、表柔比星、博來霉素、nitomycin、順鉑、卡鉑、丙卡巴肼、amacrine、咪托蒽醌、它莫西芬、nilutamid、和aminoglutemide組成。
55.權利要求53中的組合物，其中的化學治療藥物包括抗病毒藥物，這些抗病毒藥物是選自一個組，這個組是由碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷(acycloguanosine)、溴乙烯基脫氧尿苷、利巴韋林，trisodium phosphophonoformate、金剛烷胺、金剛乙胺、(S)-9-(2，3-二羥丙基)腺苷、4’，6’-二氯黃烷、AZT、3’-(疊氮-3’-脫氧胸苷)、更昔洛韋、didanosine(2’，3’-二脫氧肌苷或ddI)、zalcitabine(2’，3’-二脫氧胞苷或ddc)、二脫氧腺苷(ddA)、nevirapine、HIV蛋白酶抑制劑、以及其他病毒蛋白酶抑制劑組成。
全文摘要
在單核細胞(MO)存在的情況下,活化和保護細胞毒性淋巴細胞的方法和組合物,包括確定一種需要增強細胞毒性淋巴細胞活性的藥劑;以及在單核細胞(MO)存在的情況下,對患者給藥以一定劑量的diphenylionodonium(DPI),可有效的活化和保護細胞毒性淋巴細胞的功能。
文檔編號A61P37/04GK1379664SQ00810484
公開日2002年11月13日 申請日期2000年7月14日 優(yōu)先權日1999年7月16日
發(fā)明者K·赫爾斯特蘭德, S·赫爾莫德松, K·R·格爾森 申請人:馬克西姆藥品公司