專利名稱：Lim礦化蛋白剪接變體的制作方法
背景技術：
1.發(fā)明領域一般的說，本發(fā)明涉及哺乳動物的生骨細胞以及骨和骨組織形成。具體的說，本發(fā)明涉及在體外和在體內(nèi)增強骨礦化效能的蛋白質(zhì)新家族以及編碼這些蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明提供了用于治療與骨和骨組織有關的多種病理學狀態(tài)的方法，諸如脊骨(spine)融合、骨折修復、和骨質(zhì)疏松。
2.相關技術的描述成骨細胞被認為是由多能間充質(zhì)干細胞分化而來的。成骨細胞的成熟導致細胞外基質(zhì)的分泌，從而礦化并形成骨。這種復雜過程的調(diào)控尚不太清楚，但是認為涉及一組已知為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)的信號蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)已顯示與胚胎背腹圖式、肢芽發(fā)育、和成年動物的骨折修復有關(B.L.Hogan，基因和發(fā)育(Genes&Develop.)101580，1996)。這組轉(zhuǎn)化生長因子β超家族分泌的蛋白質(zhì)在多種細胞類型中在不同分化階段具有不同活性；這些緊密相關分子的生理學活性差異尚未闡明(D.M.Kingsley，遺傳學趨勢(Trends Genet.)1016，1994)。
為了更好的認識不同BMP信號蛋白的獨特生理學作用，我們最近比較了BMP-6與BMP-2和BMP-4誘導大鼠顱蓋成骨細胞分化的潛能(Boden等人，內(nèi)分泌學(Endocrinology)1373401，1996)。我們在需要BMP或糖皮質(zhì)激素來發(fā)動分化的大鼠胎兒顱蓋第一代傳代(繼代)培養(yǎng)物中研究了這種過程。在這種膜成骨形成模型中，糖皮質(zhì)激素(GC)或BMP將發(fā)動趨向能夠分泌骨鈣蛋白(成骨細胞特異性蛋白質(zhì))的礦化骨結(jié)的分化。這種傳代培養(yǎng)物系統(tǒng)不同于經(jīng)歷自發(fā)分化的大鼠成骨細胞原代培養(yǎng)物。在這種傳代系統(tǒng)中，糖皮質(zhì)激素導致10倍誘導BMP-6 mRNA和蛋白質(zhì)的表達，它負責增強成骨細胞分化(Boden等人，內(nèi)分泌學(Endocrinology)1382920，1997)。
除了細胞外信號(諸如BMP)，細胞內(nèi)信號或調(diào)控分子也可能在導致新骨形成的級聯(lián)事件中發(fā)揮作用。一大類細胞內(nèi)調(diào)控分子是LIM蛋白質(zhì)，如此命名是因為它們具有稱為LIM結(jié)構(gòu)域的特征性結(jié)構(gòu)基元。LIM結(jié)構(gòu)域是由通過2-氨基酸間隔物連接在一起的兩個特殊鋅指組成的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)基元。有些蛋白質(zhì)只具有LIM結(jié)構(gòu)域，而其它蛋白質(zhì)具有多種其它功能性結(jié)構(gòu)域。LIM蛋白質(zhì)形成多樣性組，包括轉(zhuǎn)錄因子和細胞骨架蛋白。LIM結(jié)構(gòu)域的主要作用似乎是通過與相同或不同LIM結(jié)構(gòu)域形成二聚體或者通過結(jié)合獨特蛋白質(zhì)來介導蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
在LIM同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(即具有兩個LIM結(jié)構(gòu)域和一種同源結(jié)構(gòu)域序列的蛋白質(zhì))中，LIM結(jié)構(gòu)域作為負調(diào)控元件發(fā)揮功能。LIM同源結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)涉及細胞譜系決定的控制和分化的調(diào)控，盡管只含LIM的蛋白質(zhì)可能具有相似作用。只含LIM的蛋白質(zhì)還涉及細胞增殖的控制，因為編碼這種蛋白質(zhì)的幾種基因與致癌染色體易位有關。
人和其它哺乳動物易患需要骨修復和/或再生過程的疾病或損傷。例如，能夠刺激天然骨修復機制由此縮短治愈骨折所需時間的新治療方案將改進骨折治療。在另一個實例中，遭受全身性骨紊亂(諸如骨質(zhì)疏松)的個體將受益于能夠?qū)е氯硇孕鹿切纬傻闹委煼桨?。這些治療方案將降低由骨質(zhì)流失引起骨折的發(fā)病率，而骨質(zhì)流失是這種疾病的特征。
至少為了這些原因，已經(jīng)研究了細胞外因子(諸如BMP)以用于在體內(nèi)刺激新骨形成。盡管使用BMP和其它細胞外信號分子獲得了早期成功，但是它們的應用也引起大量缺點。例如，增強新骨形成需要較大劑量的純化BMP，由此增加了這種治療方法的費用。而且，細胞外蛋白質(zhì)在導入宿主動物后易于降解。另外，因為它們通常具有免疫原性，所以始終存在激發(fā)針對所用蛋白質(zhì)的免疫應答的可能性。
出于這些考慮，需要使用細胞內(nèi)信號分子誘導新骨形成的有用治療方案?，F(xiàn)在，基因療法領域的進展有可能將構(gòu)成骨形成過程一部分的細胞內(nèi)信號的編碼核苷酸片段導入生骨前體細胞(即涉及骨形成的細胞)或外周血白細胞。骨形成的基因療法具有大量潛在優(yōu)點(1)生產(chǎn)成本較低；(2)由于能夠長期表達細胞內(nèi)信號，所以與細胞外治療方案相比，效能較高；(3)回避細胞外信號療法可能受到的信號受體數(shù)目有限的牽制；(4)能夠?qū)⒔?jīng)轉(zhuǎn)染的潛在骨原細胞直接投遞至需要局部骨形成的位點；和(5)將能夠進行全身性骨形成，由此為骨質(zhì)疏松和其它代謝性骨疾病提供治療方案。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了使用早期參與導致骨形成的級聯(lián)事件的細胞內(nèi)信號分子來誘導骨形成的新型組合物和方法，從而試圖克服現(xiàn)有技術的缺點。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10-4/RLMP(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)，即序列最初分離自受激大鼠顱蓋成骨細胞培養(yǎng)物的新LIM基因。該基因已經(jīng)克隆、測序、并分析了在體外增強骨礦化效能的能力。蛋白質(zhì)RLMP影響骨基質(zhì)的礦化，以及趨向成骨細胞譜系的細胞分化。與其它已知細胞因子(例如BMP)不同，RLMP不是分泌性蛋白質(zhì)，而是細胞內(nèi)信號分子。這種特性能夠有利的提供細胞內(nèi)信號放大，而且更易于評價轉(zhuǎn)染細胞。它還適用于更加有效且特異的體內(nèi)應用。合適的臨床應用包括增強骨折、骨缺陷、骨移植中的骨修復、和骨質(zhì)疏松患者中的正常穩(wěn)態(tài)。
申請人還已經(jīng)克隆、測序、并推導了相應人蛋白質(zhì)的氨基酸序列，命名為HLMP-1。該人蛋白質(zhì)在體外和在體內(nèi)證明了對骨礦化的增強效能。
另外，申請人已經(jīng)表征了截短(短)型LMP-1，命名為HLMP-1s。這種短型得自點突變，即在cDNA克隆的一種來源中提供終止密碼子從而截短蛋白質(zhì)。該短型蛋白(LMP-1s)在細胞培養(yǎng)物中和在體內(nèi)表達時完全有功能。
通過對人心臟cDNA文庫的PCR分析，申請人已經(jīng)鑒定了在編碼HLMP-1的核苷酸序列的第325-444位堿基對區(qū)域不同于HLMP-1的另外兩種剪接變體(稱為HLMP-2和HLMP-3)。HLMP-2序列在該區(qū)域內(nèi)具有119bp的刪除和17bp的插入。與HLMP-1相比，編碼HLMP-3的核苷酸序列沒有刪除，但是也具有與HLMP-2相同的17bp，插入HLMP-1序列的第444位。
下面的描述將闡明本發(fā)明的其它特性和優(yōu)點，根據(jù)說明書將變得部分清晰，或者可以由本發(fā)明的實踐認識。通過本文描述和權(quán)利要求具體指出的方法和組合物將實現(xiàn)和達到本發(fā)明的目的和其它優(yōu)點。
在一個寬廣方面，本發(fā)明涉及包含編碼任何LIM礦化蛋白的核酸序列的分離核酸分子，其中該核酸分子在標準條件下與和全長SEQ ID NO25互補的核酸分子發(fā)生雜交，且其中該核酸分子在高度嚴謹條件下與和全長SEQ ID NO26互補的核酸分子發(fā)生雜交。在一個具體方面，該分離的核酸分子編碼HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2、或HLMP-3。另外，本發(fā)明致力于包含這些核酸分子的載體，以及包含這些載體的宿主細胞。在另一個具體方面，本發(fā)明涉及這些蛋白質(zhì)自身。
在第二種寬廣方面，本發(fā)明涉及對LIM礦化蛋白，包括HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2、和HLMP-3特異的抗體。在一個具體方面，抗體是多克隆抗體。在另一個具體方面，抗體是單克隆抗體。
在第三個寬廣方面，本發(fā)明涉及誘導骨形成的方法，其中用包含編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨前體細胞(osteogenic precursor cell)。在一個具體方面，分離核酸分子位于載體中，載體可以是質(zhì)?；虿《荆T如腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。轉(zhuǎn)染可以通過直接注射分離核酸分子而離體或在體內(nèi)發(fā)生。轉(zhuǎn)染的分離核酸分子可以編碼HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2或HLMP-3。
在另一個方面，本發(fā)明涉及融合脊髓的方法，即用包含編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨前體細胞，混和經(jīng)轉(zhuǎn)染的生骨前體細胞與基質(zhì)，并使基質(zhì)接觸骨髓。
在還有一個方面，本發(fā)明涉及通過用本發(fā)明載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞來誘導全身性骨形成的方法。
可以理解，上文一般性描述和下文詳細描述都是例示性和解釋性的，而且意欲提供所要求保護的發(fā)明的進一步解釋。
縮寫和定義BMP 骨形態(tài)發(fā)生蛋白
HLMP-1人LMP-1，也稱為人LIM蛋白或HLMPHLMP-1s 人LMP-1短(截短)型蛋白HLMPU 人LIM蛋白獨特區(qū)LMP LIM礦化蛋白MEM 極限必需培養(yǎng)基Trm 曲安西龍(Triamcinolone)-GlyP β-磷酸甘油RACE cDNA末端的快速擴增RLMP 大鼠LIM礦化蛋白，也稱為RLMP-1RLMPU 大鼠LIM蛋白獨特區(qū)RNAsinRNA酶抑制劑ROB 大鼠成骨細胞10-4 包含RLMP cDNA序列的克隆(SEQ ID NO2)UTR 非翻譯區(qū)HLMP-2人LMP剪接變體2HLMP-3人LMP剪接變體3發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新的哺乳動物LIM蛋白，此處命名為LIM礦化蛋白或LMP。本發(fā)明更具體的涉及人LMP，稱為HLMP或HLMP-1，或者人LMP的其它剪接變體，稱為HLMP-2或HLMP-3。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞中增強骨的礦化。當哺乳動物中生成LMP時，它還在體內(nèi)誘導骨的形成。
用編碼LMP或HLMP的核酸離體轉(zhuǎn)染骨髓細胞、生骨前體細胞、外周血白細胞、或間充質(zhì)干細胞，隨后將轉(zhuǎn)染細胞復植到供體體內(nèi)的方法適用于治療多種骨相關紊亂或損傷。例如，可以使用這種方法來加強長骨骨折修復；在節(jié)段性缺損中生成骨；為骨折提供骨移植替代物；促進腫瘤重建或脊骨融合；和(通過注射)為薄弱或骨質(zhì)疏松的骨提供局部治療，諸如髖骨、椎骨、或腕骨的骨質(zhì)疏松。用LMP或HLMP編碼核酸進行的轉(zhuǎn)染還可用于經(jīng)皮注射經(jīng)轉(zhuǎn)染的骨髓細胞以加速骨折長骨的修復；治療長骨骨折的愈合遲滯或不愈合或者脊骨融合的假關節(jié)??；和在髖或膝的無血管性壞死中誘導新骨形成。
除了基因療法基于離體的方法，還可以在體內(nèi)實現(xiàn)包含編碼LMP或HLMP的核酸序列的重組DNA載體的轉(zhuǎn)染。當將編碼LMP或HLMP的DNA片段插入適當病毒載體(例如腺病毒載體)時，可以將病毒構(gòu)建物直接注射到需要軟骨內(nèi)骨化的體內(nèi)位點。通過直接經(jīng)皮注射導入LMP或HLMP序列，即可刺激骨形成，而不需要手術干預來獲得骨髓細胞(以進行離體轉(zhuǎn)染)或復植到患者體內(nèi)需要新骨的位點。Alden等人(神經(jīng)外科學焦點(Neurosurgical Focus)，1998)已經(jīng)證明了使用編碼BMP-2的cDNA(已克隆到腺病毒載體中)的基因療法直接注射方法的效用。
還有可能通過將包含編碼HLMP的核酸序列的裸露的即未包囊的重組質(zhì)粒直接注射至適當身體位點來進行體內(nèi)基因療法。在本發(fā)明的這個實施方案中，當適當?shù)陌屑毎麛z取或內(nèi)在化裸露的質(zhì)粒DNA時，即發(fā)生轉(zhuǎn)染，這已有描述。正如在使用病毒構(gòu)建物的體內(nèi)基因療法的情況中，直接注射裸露的質(zhì)粒DNA具有僅需要少許或者不需要手術干預的優(yōu)點。在人患者中已經(jīng)成功的證明了使用編碼內(nèi)皮細胞有絲分裂原VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)的裸露質(zhì)粒DNA進行的直接基因療法(Baumgartner等人，循環(huán)(Circulation)97(12)1114-1123，1998)。
通過使用腺病毒載體將LMP投遞至生骨細胞，實現(xiàn)了LMP的瞬時表達。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因是腺病毒不摻入所轉(zhuǎn)染的靶細胞的基因組。LMP的瞬時表達，即在經(jīng)轉(zhuǎn)染靶細胞的生存期中發(fā)生表達，足以實現(xiàn)本發(fā)明的目的。然而，當使用摻入靶細胞基因組的載體作為投遞載體時，能夠發(fā)生LMP的穩(wěn)定表達。例如，基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體適用于該目的。
LMP的穩(wěn)定表達在多種全身性骨相關紊亂的治療中特別有用，諸如骨質(zhì)疏松和成骨不全。對于本發(fā)明的這個實施方案，除了使用整合到靶細胞基因組的載體將LMP編碼核苷酸序列投遞至靶細胞內(nèi)，還將LMP表達置于可調(diào)控啟動子的控制之下。例如，通過暴露于外源誘導劑(諸如四環(huán)素)來開啟的啟動子是合適的。使用這種方法，能夠通過施用有效量的外源誘導劑在全身基礎上刺激新骨形成。一旦形成了足夠數(shù)量的骨質(zhì)，就可以停止施用外源誘導劑。根據(jù)需要，可以重復這種過程來復原骨質(zhì)流失(例如因骨質(zhì)疏松所致)。
對HLMP特異的抗體特別適用于測定患者細胞的骨誘導即骨形成潛力的方法中。以這種方式，能夠鑒定患者是否有骨修復愈合緩慢或不良的風險。同樣，HLMP特異性抗體適用于標記物測定法，用于鑒定骨變性疾病(諸如骨質(zhì)疏松)的風險因子。
遵循眾所周知的傳統(tǒng)方法，通過連接編碼LMP的核酸片段與其它核酸序列(諸如克隆和/或表達載體)制備本發(fā)明的基因。構(gòu)建和分析這些重組載體的所需方法，例如限制性內(nèi)切酶消化、克隆方案、誘變、寡核苷酸的有機合成、和DNA測序，已有描述。對于DNA測序，優(yōu)選雙脫氧終止物法。
已經(jīng)發(fā)表了許多關于重組DNA方法的論文，包括Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港出版社，第2版，1988；Davis等人，《分子生物學基本方法》(BasicMethods in Molecular Biology)，Elsevier，1986；和Ausubel等人，《分子生物學現(xiàn)行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience，1988(特別收入本文作為參考)。
引物指導的DNA或cDNA擴增是本發(fā)明基因表達中的常用步驟。它通常是通過聚合酶鏈式反應(PCR)來進行的。授予Mullis等人的美國專利4,800,159和其它已發(fā)表來源描述了PCR。PCR的基本原理是通過引物延伸的連續(xù)循環(huán)來指數(shù)復制DNA序列。當一種引物的延伸產(chǎn)物與另一種引物發(fā)生雜交時，即成為合成另一核酸分子的模板。引物-模板復合物作為DNA聚合酶的底物，而DNA聚合酶在發(fā)揮復制功能時延伸引物。用于PCR應用的傳統(tǒng)酶是分離自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，或Taq DNA聚合酶。
基本的PCR方法存在大量變異，而且熟練技術人員能夠容易的進行構(gòu)建本發(fā)明重組載體所需任何特定步驟中選擇的具體流程。例如，為了測量10-4/RLMP的細胞表達，可以在眾所周知的標準流程下提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄，然后通過PCR為適當?shù)膍RNA序列分析獲得的cDNA。
在重組表達系統(tǒng)的表達載體中表達編碼LIM礦化蛋白的基因。當然，構(gòu)建的序列無需與原始序列或其互補序列相同，而可以是根據(jù)DNA密碼簡并性確定表達具有骨形成活性的LMP的任何序列。還可以采用保守氨基酸替代或其它修飾(諸如氨基末端存在甲硫氨酸殘基)。
將在選擇的宿主表達系統(tǒng)中有活性的核糖體結(jié)合位點連接至嵌合LMP編碼序列的5端，形成合成基因。通過連接適當線性化的質(zhì)粒，可以將合成基因插入多種表達載體中的任一種?？烧{(diào)控啟動子(例如大腸桿菌lac啟動子)也適用于表達嵌合編碼序列。其它合適的可調(diào)控啟動子包括trp、tac、recA、T7、和λ啟動子。
通過幾種已發(fā)表的標準流程之一，例如磷酸鈣沉淀、DEAE-Dextran、電穿孔、或原生質(zhì)體融合，將編碼LMP的DNA轉(zhuǎn)染到受體細胞中，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。優(yōu)選磷酸鈣沉淀，如下進行時特別如此。
在轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)之前，參照Graham和Van Der的方法(病毒學(Virology)52456，1973)使DNA與磷酸鈣共沉淀。取40-50g DNA，以鮭魚精或小牛胸腺DNA作為載體，應用于鋪在100mm培養(yǎng)皿上的0.5×106個細胞。將DNA與0.5ml 2x Hepes溶液(280mM NaCl/50mM Hepes/1.5mMNa2HPO4，pH7.0)混和，并加入等體積的2x CaCl2(250mM CaCl2/10mM Hepes，pH7.0)。30-40分鐘后出現(xiàn)白色顆粒沉淀，均勻的滴加在細胞上，并于37℃溫育4-16小時。除去培養(yǎng)基，并將細胞在溶于PBS的15％甘油中震動3分鐘。除去甘油后，用含10％胎牛血清的Dulbecco氏極限必需培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)細胞。
還可以使用下列方法轉(zhuǎn)染DNAKimura等人(病毒學(Virology)49394，1972)和Sompayrac等人(美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)787575，1981)的DEAE-Dextran法；Potter(美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)817161，1984)的電穿孔法；和Sandri-Goddin等人(分子和細胞生物學(Molec.Cell.Biol.)1743，1981)的原生質(zhì)體融合法。
固相亞磷酰胺化學法是用于有機合成寡脫氧核苷酸和多脫氧核苷酸的優(yōu)選方法。另外，可采用許多其它化學合成法。本領域技術人員能夠容易的用這些方法合成本發(fā)明的具體序列。
本發(fā)明還包括在標準條件下與編碼本發(fā)明LIM礦化蛋白的任何核酸序列發(fā)生雜交的核酸分子。“標準雜交條件”將隨探針大小、核酸試劑的背景和濃度、以及雜交類型(例如原位、Southern印漬、或DNA-RNA雜合體雜交(Northern印漬))而變化?！皹藴孰s交條件”的確定屬于本領域技術水平之內(nèi)。例如，參閱授予Fremeau等人的美國專利5,580,775；E.M.Southern，分子生物學雜志(J.Mo1.Biol.)98503，1975；Alwine等人，酶學方法(Meth.Enzymol.)68220，1979；和Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，第7.19-7.50頁，冷泉港出版社，1989(收入本文作為參考)。
一組優(yōu)選的標準雜交條件包括將印漬在50％甲酰胺/5x SSPE(150nMNaCl/10mM NaH2PO4[pH7.4]/1mM EDTA[pH8.0])/5x Denhardt氏溶液(每100ml水含20mg Ficoll/20mg聚乙烯吡咯烷酮/20mg BSA)/10％硫酸葡聚糖/1％ SDS/100g/ml鮭魚精DNA中于42℃預雜交2小時；加入32P標記的cDNA探針，并將雜交繼續(xù)14小時；然后，將印漬用2x SSPE/0.1％ SDS于22℃清洗20分鐘2次，隨后用0.1x SSPE/0.1％ SDS于65℃清洗1小時；然后將印漬干燥并在存在增感屏的條件下使X射線膠片曝光5天。
在“高度嚴謹條件”下，若探針與其靶序列充分相同，則這兩種序列將發(fā)生雜交。正如在標準雜交條件的情況中，本領域技術人員能夠根據(jù)本領域技術水平和具體實驗的種類確定只有充分相同序列發(fā)生雜交的條件。
本發(fā)明的另一個方面包括由核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。在還有一個方面，本發(fā)明涉及基于抗LMP抗體的對這種蛋白質(zhì)的鑒定。在這個實施方案中，通過裂解細胞和SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)來制備用于Western印漬分析的蛋白質(zhì)樣品。如Ausubel等人(《分子生物學現(xiàn)行方案》(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley and Sons，1987)所述，通過電印跡將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。用速溶脫脂奶粉(1gm溶于100ml PBS)封閉濾膜后，將抗LMP抗體加到濾膜上，并于室溫溫育1小時。用磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底清洗濾膜，并與辣根過氧化物酶(HRPO)-抗體綴合物于室溫溫育1小時。再次用PBS徹底清洗濾膜，并通過加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)來鑒定抗原條帶。
單特異性抗體是本發(fā)明選擇的試劑，具體用于分析患者細胞與LMP表達有關的特定特征。如本文所用，“單特異性抗體”定義為對LMP具有均一結(jié)合特征的一種或多種抗體。如本文所用，“均一結(jié)合”指抗體結(jié)合特定抗原或表位(諸如上述LMP相關抗原或表位)的能力。由包含LMP反應性抗體的哺乳動物抗血清純化針對LMP的單特異性抗體，或者使用Kohler和Milstein(自然(Nature)256495-497，1975)的技術制備LMP反應性單克隆抗體。通過用適當濃度的LMP(含或不含免疫佐劑)免疫動物(諸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊、或馬)來制備LMP特異性抗體。
在這種方法中，在第一次免疫前采集免疫前血清。每只動物接受大約0.1mg-大約1000mg LMP，根據(jù)需要，可結(jié)合使用可接受免疫佐劑。這種可接受佐劑包括(但不限于)弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、明礬沉淀物、包含小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)的油包水乳劑、和tRNA佐劑。初始免疫包括皮下(PC)、腹膜內(nèi)(IP)、或二者兼之多處注射優(yōu)選于弗氏完全佐劑中的LMP。以規(guī)則時間間隔(優(yōu)選每周一次)對每只動物采血以測定抗體效價。動物可以在初始免疫后接受或不接受加強注射。那些接受加強注射的動物通常通過相同途徑接受于弗氏不完全佐劑中的等量抗原。以大約3周的時間間隔給予加強注射，直至獲得最高效價。每次加強免疫后大約7天或單次免疫后大約每周一次，對動物采血，收集血清，并分裝保存于大約-20℃。
通過用LMP免疫近交小鼠(優(yōu)選Balb/c小鼠)來制備LMP反應性單克隆抗體(mAb)。通過IP或SC途徑用大約0.1mg-大約10mg(優(yōu)選大約1mg)溶于大約0.5ml緩沖液或生理鹽水的LMP及等體積混和的上述可接受佐劑免疫小鼠。優(yōu)選弗氏完全佐劑。小鼠在第0天接受初始免疫，并休息大約3-30周。通過靜脈內(nèi)(IV)途徑給予經(jīng)免疫小鼠以一次或多次加強免疫，每次大約0.1mg-大約10mg溶于緩沖液(諸如磷酸鹽緩沖液)的LMP。通過本領域知道的標準流程，由經(jīng)免疫小鼠切下脾，獲得來自抗體陽性小鼠的淋巴細胞，優(yōu)選脾淋巴細胞。通過在能夠形成穩(wěn)定雜交瘤的條件下混和脾淋巴細胞與適當?shù)娜诤吓渑俭w(優(yōu)選骨髓瘤細胞)以產(chǎn)生雜交瘤細胞。融合配偶體可以包括(但不限于)小鼠骨髓瘤P3/NS1/Ag 4-1、MPC-11、S-194、和Sp 2/0，優(yōu)選Sp 2/0。在分子量大約1000、濃度大約30％-大約50％的聚乙二醇中融合抗體生成細胞和骨髓瘤細胞。通過本領域知道的流程，在添加次黃嘌呤、胸苷、和氨基蝶呤的Dulbecco’sModified Eagles Medium(DMEM)中進行培養(yǎng)，由此選擇融合的雜交瘤細胞。在大約第14、18、和21天由生長陽性孔收集上清液，并通過免疫測定法(諸如固相免疫放射性測定法SPIRA)以LMP作為抗原篩選抗體生成。還在Ouchterlony沉淀測定法中測試培養(yǎng)液，以確定mAb的同種型。通過諸如MacPherson的軟瓊脂技術(“軟瓊脂技術”，在《組織培養(yǎng)方法和應用》(Tissue Culture Methods and Applications)中，Kruse和Paterson編，Academic出版社，1973)克隆來自抗體陽性孔的雜交瘤細胞。還可參閱Harlow等人，《抗體實驗室手冊》(AntibodiesA LaboratoryManual)，冷泉港實驗室，1988。
還可以通過給降植烷致敏的Balb/c小鼠(每只小鼠大約0.5ml)在致敏后大約4天注射大約2×106-大約6×106個雜交瘤細胞，從而在體內(nèi)產(chǎn)生單克隆抗體。細胞轉(zhuǎn)移后大約8-12天收集腹水，并通過本領域知道的技術純化單克隆抗體。
通過在含大約2％胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)雜交瘤細胞系進行抗LMP單克隆抗體的體內(nèi)生產(chǎn)，來獲得足夠量的特異性mAb，并通過本領域知道的技術純化mAb。
通過多種血清學或免疫學測定法測定腹水或雜交瘤培養(yǎng)液的抗體效價，包括(但不限于)沉淀、被動凝集、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、和放射性免疫測定法(RIA)?？墒褂孟嗨茰y定法檢測體液或組織和細胞提取物中是否存在LMP。
本領域技術人員顯然知道，上述用于生成單特異性抗體的方法可用于生成對LMP多肽片段、全長初生LMP多肽、或者其變體或等位基因特異的抗體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明致力于HLMP-1的其它剪接變體。人心臟cDNA的PCR分析揭示了在HLMP-1序列的第325-444位堿基對區(qū)域不同于HLMP-1的另外兩種HLMP剪接變體(稱為HLMP-2和HLMP-3)的mRNA。HLMP-2序列在該區(qū)域內(nèi)具有119bp的刪除和17bp的插入。這些變化保留了讀碼框，產(chǎn)生423個氨基酸的蛋白質(zhì)，其與HLMP-1相比，凈損失34個氨基酸(刪除40個氨基酸，插入6個氨基酸)。HLMP-2包含在HLMP-1中存在的C末端LIM結(jié)構(gòu)域。
與HLMP-1相比，HLMP-3沒有刪除，但是在第444位也插入了相同的17bp。該插入移動了讀碼框，在第459-461位堿基對處產(chǎn)生終止密碼子。結(jié)果，HLMP-3編碼153個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)缺乏在HLMP-1和HLMP-2中存在的C末端LIM結(jié)構(gòu)域。通過Western印漬分析確認了由HLMP-2和HLMP-3編碼的蛋白質(zhì)的預測大小。
3種剪接變體的組織分布PCR分析揭示了它們是差異表達的，特定異構(gòu)體在不同組織中占優(yōu)勢。HLMP-1顯然是在白細胞、脾、肺、胎盤、和胎肝中表達的主要形式。HLMP-2似乎是骨骼肌、骨髓、和心臟組織中的主要異構(gòu)體。然而，HLMP-3在檢查的任何組織中都不是主要形式。
HLMP-3在大鼠成骨細胞傳代培養(yǎng)物中的過度表達誘導骨節(jié)形成(287±56)，與糖皮質(zhì)激素(272±7)和HLMP-1(232±200)的效果相似。既然HLMP-3缺乏C末端LIM結(jié)構(gòu)域，那么骨誘導活性就不需要這些區(qū)域。但是，HLMP-2的過度表達不誘導骨節(jié)形成(11±3)。這些數(shù)據(jù)說明由刪除的119bp編碼的氨基酸是骨誘導所必需的。這些數(shù)據(jù)還說明HLMP剪接變體的分布對于組織特異功能可能是重要的。令人驚訝的是，我們已經(jīng)顯示HLMP-2在大鼠成骨細胞傳代培養(yǎng)物中可抑制類固醇誘導的成骨細胞形成。因此，HLMP-2將在不需要骨形成的臨床情形中具有治療性效用。
1997年7月22日，將位于載體中的10-4/RLMP樣品，命名為pCMV2/RLMP(包含插入片段10-4克隆/RLMP的載體pRc/CMV2)，保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852。保藏物的培養(yǎng)物編號是209153。1998年3月19日，將包含插入片段HLMP-1s的載體pHis-A樣品保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。保藏物的培養(yǎng)物編號是209698。2000年4月14日，按照布達佩斯條約(BudapestTreaty)，將質(zhì)粒pHAhLMP-2(包含衍生自含HLMP-2人心肌cDNA的cDNA插入片段的載體pHisA)和pHAhLMP-3(包含衍生自含HLMP-3人心肌cDNA的cDNA插入片段的載體pHisA)樣品保藏于ATCC，10801 University Blvd.，Manassas，VA，201 10-2209，USA。這些保藏物的保藏號依次是＿＿＿和＿＿＿。根據(jù)布達佩斯條約的要求，這些保藏物將在ATCC維持至少30年，而且在公開它們的專利授權(quán)后可以公開獲得。應當明白保藏物的可獲得性并不構(gòu)成對以侵犯由政府行為授予的專利權(quán)來實施本發(fā)明的許可。
在評價本發(fā)明的核酸、蛋白質(zhì)、或抗體時，采用了酶測定法、蛋白質(zhì)純化、和其它傳統(tǒng)生化方法。分別通過Southern印漬和Northern印漬技術分析DNA和RNA。通常，通過凝膠電泳將分析的樣品大小分離。然后將凝膠中的DNA或RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或尼龍濾膜。然后將印漬(即凝膠中樣品圖式的復制品)與探針進行雜交。通常，探針是放射性標記的，優(yōu)選32P，盡管可以用本領域知道的其它信號生成分子標記探針。然后可以通過檢測系統(tǒng)(諸如放射自顯影)使感興趣的特定條帶顯影。
為了舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，本文包括下列非限制性實施例。這些結(jié)果證明了使用本發(fā)明LIM礦化蛋白及編碼這些蛋白質(zhì)的分離核酸分子來誘導或增強骨形成的可行性。
在存在或不存在適當寡核苷酸的情況中在適當培養(yǎng)基(±刺激物)中培養(yǎng)細胞。將最初用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑培養(yǎng)的培養(yǎng)物于37℃在5％ CO2中培養(yǎng)4小時后換成既不含脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑又不含寡核苷酸的培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)物(尤其是接受寡核苷酸的培養(yǎng)物)每24小時換培養(yǎng)基，以維持寡核苷酸水平。
LMP-1反義寡核苷酸以依賴劑量的方式抑制礦化骨節(jié)的形成和骨鈣蛋白的分泌，與BMP-6寡核苷酸的效果相似。加入外源BMP-6不能挽救成骨細胞分化中的LMP-1反義阻斷，卻能夠逆轉(zhuǎn)BMP-6反義寡核苷酸抑制。該實驗進一步確認了在成骨細胞分化途徑中LMP-1相對于BMP-6處于上游。LMP-1反義寡核苷酸還在大鼠成骨細胞原代培養(yǎng)物中抑制自發(fā)的成骨細胞分化。實施例3.礦化骨節(jié)形成的定量將參照實施例1和2制備的ROB培養(yǎng)物在70％乙醇中固定過夜并用vonKossa銀染料染色。使用半自動計算機化視頻圖像分析系統(tǒng)來定量每個孔中的骨節(jié)計數(shù)和骨節(jié)面積(Boden等人，內(nèi)分泌學(Endocrinology)137(8)3401-3407，1996)。然后將這些數(shù)值相除，計算面積/骨節(jié)值。通過人工計數(shù)驗證了這種自動化方法，相關系數(shù)0.92(p＜0.000001)。所有數(shù)據(jù)表述為由每種條件5或6個孔計算得到的平均值±平均標準誤差(S.E.M.)。每次實驗使用來自不同顱蓋制備物的細胞確認至少兩次。實施例4.骨鈣蛋白分泌的定量如Nanes等人所述(內(nèi)分泌學(Endocrinology)127588，1990)，使用我們實驗室制備的針對大鼠骨鈣蛋白C末端九肽的單特異性多克隆抗體(Pab)的競爭放射性免疫測定法，測量培養(yǎng)基中的骨鈣蛋白水平。簡單的說，通過乳過氧化物酶法，用1mCi125I-Na碘化1g九肽。向裝有2001測定緩沖液(0.02M磷酸鈉/1mM EDTA/0.001％硫柳汞/0.025％ BSA)的管中加入來自細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基或溶于100μl測定緩沖液的骨鈣蛋白標準(0-12,000fmol)。然后加入Pab(140,000；100μl)，隨后加入碘化肽(12,000cpm；1001)。相似的制備測試非特異性結(jié)合的樣品，但是不含抗體。
通過加入700μl山羊抗兔IgG，隨后于4℃溫育18小時，由此分離結(jié)合的和游離的Pab。將樣品以1200rpm離心45分鐘后，棄去上清液，并在γ計數(shù)器中對沉淀物計數(shù)。以fmol/1001報告骨鈣蛋白值，然后將這些數(shù)值除以100轉(zhuǎn)換成pmol/ml培養(yǎng)基(3天產(chǎn)量)。數(shù)值以每種條件5-6個孔3次測定的平均值±S.E.M.表述。每次實驗使用來自不同顱蓋制備物的細胞確認至少兩次。實施例5.Trm和RLMP在體外對礦化的影響有義或反義寡核苷酸在未刺激細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中對總的骨節(jié)形成有很少明顯影響。但是，當用Trm刺激ROB時，RLMP的反義寡核苷酸抑制骨節(jié)礦化＞95％。向寡核苷酸處理的培養(yǎng)物中加入外源BMP-6不能挽救RLMP反義寡核苷酸所處理骨節(jié)的礦化。
骨鈣蛋白與骨礦化長期同義，而且骨鈣蛋白水平與骨節(jié)產(chǎn)生和礦化有關。RLMP反義寡核苷酸顯著降低骨鈣蛋白生成，但是反義處理的培養(yǎng)物的骨節(jié)計數(shù)沒有顯著變化。在這種情況中，加入外源BMP-6只將RLMP反義所處理培養(yǎng)物中的骨鈣蛋白生成挽救了10-15％。這說明RLMP的作用位于BMP-6下游，而且比BMP-6更具特異性。實施例6.RNA的收獲和純化使用4M異硫氰酸胍(GIT)溶液，由雙份ROB(參照實施例1和2在6孔培養(yǎng)板中制備)孔收獲細胞RNA，產(chǎn)生統(tǒng)計學上的三份樣品。簡單的說，由孔吸出培養(yǎng)物上清液，然后在每份成對孔收獲物上覆蓋0.6ml GIT溶液。加入GIT溶液后，將平板旋渦搖動5-10秒鐘(盡可能一致)。在進行進一步處理前，將樣品于-70℃保存多至7天。
通過參照Sambrook等人(《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloningA Laboratory Manual)，第2版，第7.19章，冷泉港出版社，1989)的標準方法，略微改動，純化RNA。簡單的說，向解凍的樣品中加入60 l2.0M醋酸鈉(pH4.0)、550 l水飽和酚、和150l氯仿∶異戊醇(49∶1)。旋渦震蕩后，將樣品于4℃以10000xg離心20分鐘，將水相轉(zhuǎn)移至新管，加入600 l異丙醇，并將RNA于-20℃沉淀過夜。
過夜保溫后，將樣品以10000xg離心20分鐘，并輕輕吸去上清液。將沉淀重懸于400l經(jīng)DEPC處理的水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，并在加入40l 3.0M醋酸鈉(pH5.2)和1.0ml無水乙醇后于-20℃沉淀過夜。為了回收細胞RNA，將樣品以10000xg離心20分鐘，用70％乙醇清洗1次，空氣干燥5-10分鐘，并重懸于20 l經(jīng)DEPC處理的水。根據(jù)使用分光光度計測定的光密度計算RNA濃度。實施例7.逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應將溶于總體積10.5l DEPC-H2O的5g總RNA于65℃加熱5分鐘，然后加到裝有4l 5x MMLV-RT緩沖液、2l dNTP、21 dT17引物(10pmol/ml)、0.5l RNA抑制劑(40U/ml)、和1μl MMLV-RT(200U/l)的管中。將樣品于37℃溫育1小時，然后于95℃溫育5分鐘以滅活MMLV-RT。加入80l水稀釋樣品。
使用標準方法學(50l總體積)，取5l逆轉(zhuǎn)錄樣品進行聚合酶鏈式反應。簡單的說，將樣品加到裝有水和適量PCR緩沖液、25mM MgCl2、dNTP、用于3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAP，一種持家基因)和/或BMP-6的正向和反向引物、32P-dCTP、和Taq聚合酶的管中。除非另有注明，將引物標準化使之在22輪循環(huán)中持續(xù)運行(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。實施例8.通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和磷光圖像儀分析對RT-PCR產(chǎn)物的定量向每管RT-PCR產(chǎn)物中加入5l加樣染料，混和，于65℃加熱10分鐘，然后離心。每個反應取10l，在標準條件下進行PAGE(12％聚丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺；15V/孔；恒流)。然后將凝膠在凝膠保存緩沖液(10％ v/v甘油/7％ v/v醋酸/40％ v/v甲醇/43％去離子水)中溫育30分鐘，于80℃真空干燥1-2小時，并用電子增強的磷光成像系統(tǒng)顯影6-24小時。分析顯影條帶。為每條帶的計數(shù)繪圖。
清洗后，如上所述，通過放射自顯影分析濾膜。將陽性克隆噬斑純化。用第二張濾膜重復該步驟4分鐘，使假陽性最小化。以λSK(-)噬菌粒的形式挽救經(jīng)噬斑純化的克隆。如下所述，對克隆的cDNA測序。實施例11.克隆的測序通過標準方法(Ausubel等人，《分子生物學現(xiàn)行方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，Wiley Interscience，1988)對克隆的cDNA插入片段測序。簡單的說，將適當濃度的終止混和物、模板、和反應混和物進行適當?shù)难h(huán)方案(95℃，30”；68℃，30”；72C，60”；x25)。加入終止混和物終止測序反應。于92℃加熱3分鐘后，將樣品加樣至變性6％聚丙烯酰胺測序凝膠(29∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)。將樣品以60伏恒流電泳大約4小時。電泳后，將凝膠真空干燥并放射自顯影。
人工分析放射自顯影膠片。使用缺省參數(shù)設置的BLASTn程序?qū)τ蓢疑锛夹g信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NIH，Bethesda，MD；http//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)維持的數(shù)據(jù)庫篩選獲得的序列。根據(jù)序列資料，制備新的測序引物，并重復該過程，直至將完整基因測序。所有序列在兩個方向上確認最少3次。
還使用PCGENE軟件包(16.0版)分析了核苷酸和氨基酸序列。通過NALIGN程序使用下列參數(shù)計算核苷酸序列的同源性百分值非匹配核苷酸的權(quán)，10；非匹配缺口的權(quán)，10；考慮的核苷酸最大數(shù)目，50；和考慮的核苷酸最小數(shù)目，50。
對于氨基酸序列，使用PALIGN計算同源性百分值。開放缺口罰分和單位缺口罰分都選擇10。實施例12.RLMP cDNA的克隆實施例9所述差異顯示PCR擴增產(chǎn)物包含大約260bp的主帶。將該序列用于篩選大鼠骨肉瘤(UMR 106)cDNA文庫。將陽性克隆進行嵌套引物分析，以獲得擴增全長cDNM所需引物序列(SEQ ID NO11、12、29、30、和31)。將選擇用于進一步研究的這些陽性克隆之一命名為克隆10-4。
通過嵌套引物分析測定的克隆10-4全長cDNA的序列分析顯示，克隆10-4包含由差異顯示PCR鑒定的最初260bp片段?？寺?0-4(1696bp；SEQ IDNO2)包含1371bp的開放讀碼框，編碼457個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO1)。終止密碼子TGA位于第1444-1446位核苷酸。位于第1675-1680位核苷酸的多聚腺苷酸化信號及毗連的poly(A)+尾位于3’非編碼區(qū)。在SEQID NO1的第113-116和第257-259位氨基酸存在兩個潛在的N-糖基化位點，分別為Asn-Lys-Thr和Asn-Arg-Thr。在第191位和第349位氨基酸發(fā)現(xiàn)了兩個潛在的依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點，分別為Ser和Thr。在第3位、第115位、第166位、第219位、和第442位存在5個潛在的蛋白激酶C磷酸化位點，Ser或Thr。在第272-279位氨基酸確定了1個潛在的ATP/GTP結(jié)合位點基元A(P環(huán))，Gly-Gly-Ser-Asn-Asn-Gly-Lys-Thr。
另外，在第341-391位和第400-451位氨基酸發(fā)現(xiàn)了2個高度保守的推定LIM結(jié)構(gòu)域。這種最新鑒定的大鼠cDNA克隆中的推定LIM結(jié)構(gòu)域顯示與其它已知LIM蛋白LIM結(jié)構(gòu)域有可觀同源性。但是，與其它大鼠LIM蛋白的整體同源性低于25％。RLMP(也稱為10-4)與人enigma蛋白(參閱美國專利5,504,192)具有78.5％的氨基酸同源性，但是與其最靠近的大鼠類似物CLP-36和RIT-18只具有分別為24.5％和22.7％的氨基酸同源性。實施例13.RLMP表達的Northern印漬分析將參照實施例1和2制備的30g來自ROB的總RNA通過甲醛凝膠電泳在1％瓊脂糖平板凝膠中大小分離，并通過滲透轉(zhuǎn)印漬至尼龍濾膜。用隨機引發(fā)32P-dCTP標記的全長10-4 cDNA的600bp EcoR1片段探查印漬。
Northern印漬分析顯示，1.7kb mRNA與RLMP探針發(fā)生雜交。暴露于BMP-6 24小時后，ROB中的RLMP mRNA上調(diào)了大約3.7倍。在用BMP-2或BMP-4刺激的ROB中，于24小時沒有看到RMLP表達的上調(diào)。
對于報導的每次RT-PCR、RNA酶保護實驗、或Western印漬分析，使用來自代表性實驗的三份樣品的數(shù)據(jù)計算平均值±S.E.M.。可以顯示相對于第0天或陰性對照的標準化圖，并以超過對照值的增加倍數(shù)表述。
使用方差單向分析及(根據(jù)需要)Bonferroni的因果推理多重比較修正來評價統(tǒng)計顯著性(D.V.Huntsberger，“方差分析”，在《統(tǒng)計學方差要素》(Elements of Statistical Variance)中，P.Billingsley編，第298-330頁，Allyn&Bacon公司，波士頓，MA，1977和Sigmastat，Jandel Scientific，Corte&Madera，CA)。顯著性α水平定義為p＜0.05。實施例15.通過Western印漬分析對大鼠LIM礦化蛋白的檢測參照England等人(生物化學和生物物理學學報(Biochim.Biophys.Acta)623171，1980)和Timmer等人(生物化學雜志(J.Biol.Chem.)26824863，1993)的方法制備多克隆抗體。
用pCMV2/RLMP轉(zhuǎn)染HeLa細胞。參照Hair等人(白血病研究(LeukemiaResearch)201，1996)的方法由轉(zhuǎn)染細胞收獲蛋白質(zhì)。如Towbin等人(美國國家科學院進展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)764350，1979)所述，進行天然RLMP的Western印漬分析。實施例16.由人PCR產(chǎn)物衍生的大鼠LMP獨特區(qū)(RLMPU)的合成根據(jù)大鼠LMP-1 cDNA序列，合成了正向和反向PCR引物(SEQ ID NO15和16)，并通過PCR由大鼠LMP-1 cDNA擴增了223bp的獨特序列。用相同PCR引物由人MG63骨肉瘤細胞cDNA分離了相似PCR產(chǎn)物。
由在T-75燒瓶中培養(yǎng)的MG63骨肉瘤細胞收獲RNA。吸去培養(yǎng)物上清液，用3.0ml GIT溶液覆蓋燒瓶，旋渦搖動5-10秒鐘，并將獲得的溶液轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管(5管，每管0.6ml)。通過標準方法，參閱例如Sambrook等人，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular CloningALaboratory Manual)，第7章第19頁，冷泉港實驗室出版社，1989和Boden等人，內(nèi)分泌學(Endocrinology)1382820-2828，1997，略微改動，純化RNA。簡單的說，向0.6ml樣品中加入60l 2.0M醋酸鈉(pH4.0)、550l水飽和酚、和150l氯仿∶異戊醇(49∶1)。加入這些試劑后，將樣品旋渦震蕩，于4℃以10000xg離心20分鐘，并將水相轉(zhuǎn)移至新管。加入600l異丙醇，并將RNA于-20℃沉淀過夜。將樣品以10000xg離心20分鐘，并輕輕吸去上清液。將沉淀重懸于400l經(jīng)DEPC處理的水，用酚∶氯仿(1∶1)抽提1次，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，并在40l 3.0M醋酸鈉(pH5.2)和1.0ml無水乙醇中于-20℃沉淀過夜。沉淀后，將樣品以10000xg離心20分鐘，用70％乙醇清洗1次，空氣干燥5-10分鐘，并重懸于20μl經(jīng)DEPC處理的水。由光密度計算RNA濃度。
將溶于總體積10.5μl DEPC-H2O的5g總RNA于65℃加熱5分鐘，然后加到裝有4l 5x MMLV-RT緩沖液、2l dNTP、2l dT17引物(10pmol/ml)、0.5l RNA抑制劑(40U/ml)、和1l MMLV-RT(200U/l)的管中。將反應于37℃溫育1小時。然后通過于95℃溫育5分鐘滅活MMLV-RT。加入80l水稀釋樣品。
使用標準方法學(總體積50l)，取5l逆轉(zhuǎn)錄樣品進行聚合酶鏈式反應(Boden等人，內(nèi)分泌學(Endocrinology)1382820-2828，1997；Ausubel等人，“通過聚合酶鏈式反應對稀有DNA的定量”，在《分子生物學現(xiàn)行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，第15.31-1章，Wiley&Sons，Trenton，NJ，1990)。簡單的說，將樣品加到裝有水和適量PCR緩沖液(25mM MgCl2、dNTP、正向和反向引物(用于PLMPU；SEQID NO15和16))、32P-dCTP、和DNA聚合酶的管中。設計將引物進行22輪一致循環(huán)用于檢測放射性條帶和33輪循環(huán)用于擴增PCR產(chǎn)物作為篩選探針(94℃，30”；58℃，30”；72℃，20”)。
對瓊脂糖凝膠純化的MG63骨肉瘤衍生PCR產(chǎn)物測序獲得的序列與RLMPU PCR產(chǎn)物的同源性超過95％。該序列命名為HLMP獨特區(qū)(HLMPU；SEQID NO6)。實施例17.逆轉(zhuǎn)錄酶衍生的MG63 cDNA的篩選如實施例7所述，通過使用特異引物對(SEQ ID NO16和17)的PCR進行篩選。將717bp MG63 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠純化并用指定引物(SEQID NO12、15、16、17、18、27、和28)進行測序。序列在兩個方向上最少確認2次。將MG63序列相互進行比對，然后與全長大鼠LMP cDNA序列進行比對，以獲得部分人LMP cDNA序列(SEQ ID NO7)。實施例18.人心臟cDNA文庫的篩選根據(jù)Northern印漬實驗，確定了LMP-1在幾種不同組織(包括人心肌)中的表達水平不同。因此檢查了人心臟cDNA文庫。將文庫以5×104pfu/ml涂布在瓊脂平板(LB底層瓊脂)上，并將平板于37℃溫育過夜。將濾膜覆蓋平板2分鐘。然后，將濾膜變性，漂洗，干燥，UV交聯(lián)，并在預雜交緩沖液(2x PIPES[pH6.5]/5％甲酰胺/1％ SDS/100g/ml變性鮭魚精DNA)中于42℃溫育2小時。加入223bp放射性標記LMP獨特區(qū)探針(32P，隨機引物標記；SEQ ID NO6)并于42℃雜交18小時。雜交后，將濾膜用1x SSC/0.1％ SDS于室溫清洗10分鐘1次，用0.1x SSC/0.1％ SDS于55℃清洗15分鐘3次。參照制造商的方案(Stratagene，La Jolla，CA)，以λ噬菌粒的形式挽救經(jīng)放射自顯影鑒定雙重陽性且經(jīng)噬斑純化的心臟文庫克隆。
陽性克隆的限制性消化產(chǎn)生不同大小的cDNA插入片段。選擇長度超過600bp的插入片段用于作為初始的測序篩選。通過實施例11所述標準方法對這些插入片段進行測序。
還使用對應于SEQ ID NO11-14、16、和27的引物對一個克隆(7號)進行自動化測序分析。通過這些方法獲得的序列通常具有97-100％的同源性。7號克隆(來自心臟文庫的部分人LMP-1 cDNA；SEQ ID NO8)所含序列與翻譯區(qū)中大鼠LMP cDNA序列的同源性超過87％。實施例19.全長人LMP-1 cDNA的確定將MG63人骨肉瘤細胞cDNA序列和人心臟cDNA 7號克隆序列的重疊區(qū)用于比對這兩種序列并衍生1644bp完整人cDNA序列。將NALIGN(PCGENE軟件包中的一個程序)用于比對這兩種序列。兩種序列的重疊區(qū)構(gòu)成完全同源的大約360bp，除了一處單一核苷酸替代，MG63 cDNA(SEQ ID NO7)第672位核苷酸是“G”，而7號克隆(SEQ ID NO8)在相應的第516位核苷酸是“A”。
使用SEQIN(PCGENE的另一種子程序)，用MG63骨肉瘤cDNA細胞的“G”替代，連接比對的兩種序列。SEQ ID NO9顯示了獲得的序列。使用NALIGN實現(xiàn)新的人衍生序列與大鼠LMP-1 cDNA的比對。全長人LMP-1 cDNA序列(SEQ ID NO9)與大鼠LMP-1 cDNA序列的翻譯部分具有87.3％的同源性。實施例20.人LMP-1氨基酸序列的確定用PCGENE子程序TRANSL確定了人LMP-1的推定氨基酸序列。SEQ IDNO9中的開放讀碼框編碼457個氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO10)。使用PCGENG子程序Palign發(fā)現(xiàn)人LMP-1氨基酸序列與大鼠LMP-1氨基酸序列具有94.1％的同源性。實施例21.人LMP cDNA 5’遠端非翻譯區(qū)的測定通過MG63總RNA的嵌套RT-PCR，使用5’cDNA末端快速擴增(5’RACE)方案，擴增了MG63 5’cDNA。該方法包括使用3’末端含兩處簡并核苷酸的oligo(dT)錨定引物合成cDNA第一條鏈(Chenchik等人，克隆技術(CLONTECHniques)X5，1995；Borson等人，PC方法及應用(PC MethodsApplic.)2144，1993)。參照Gubler等人(基因(Gene)25263，1983)的方法，使用大腸桿菌DNA聚合酶I、RNA酶H、和大腸桿菌DNA連接酶的混和物合成第二條鏈。用T4 DNA聚合酶產(chǎn)生平端后，將雙鏈cDNA連接至片段(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’)(SEQ ID NO19)。在進行RACE之前，將連接了銜接頭的cDNA稀釋至適用于Marathon RACE反應的濃度(1∶50)。然后可以特異克隆連接了銜接頭的雙鏈cDNA。
使用銜接頭特異寡核苷酸AP15’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(AP1)(SEQ.ID NO20)作為有義引物和實施例16中所述來自獨特區(qū)(HLMPU)的基因特異引物(GSP)，進行第一輪PCR。使用嵌套引物對GSP1-HLMPU(反義/反向引物)(SEQ ID NO23)和GSP2-HLMPUF(SEQ ID NO24)(參閱實施例16；有義/正向引物)進行第二輪PCR。使用商品化試劑盒高級cDNA PCR核心試劑盒(Clone Tech Laboratories公司，Palo Alto，CA)，采用抗體介導(其它方面是標準的)的熱啟動方案進行PCR。用于MG63 cDNA的PCR條件包括起始熱啟動變性(94℃，60sec)，隨后是94℃，30sec；60℃，30sec；68℃，4min；30輪循環(huán)。第一輪PCR產(chǎn)物的長度為大約750bp，而嵌套PCR產(chǎn)物為大約230bp。將第一輪PCR產(chǎn)物克隆到線性化載體pCR2.1中(3.9kb)。使用M13正向和反向引物(SEQ ID NO11和12)從兩個方向?qū)Σ迦肫芜M行測序。實施例22.含5’遠端UTR的全長人LMP-1 cDNA的確定比對重疊的MG63人骨肉瘤細胞cDNA 5’UTR序列(SEQ ID NO21)、MG63 717bp序列(實施例17；SEQ ID NO8)、和人心臟cDNA 7號克隆序列(實施例18)以衍生新的1704bp人cDNA序列(SEQ ID NO22)。使用NALIGN(PCGENE和Omiga 1.0二者；Intelligenetics)實現(xiàn)比對。重疊序列構(gòu)成具有100％同源性的幾乎完整717bp區(qū)(實施例17)。使用SEQIN實現(xiàn)比對序列的連接。實施例23.LIM蛋白表達載體的構(gòu)建使用實施例17和18所述序列構(gòu)建pHIS-5ATG LMP-1s表達載體。用ClaI和EcoRV消化717bp克隆(實施例17；SEQ ID NO7)。凝膠純化小片段(～250bp)。用ClaI和XbaI消化7號克隆(實施例18；SEQ ID NO8)，并凝膠純化1400bp片段。連接分離的～250bp和1400bp限制性片段以形成～1650bp片段。
7號克隆中的單一核苷酸替代(相對于717bp PCR序列和原始大鼠序列)在翻譯的第672位堿基對產(chǎn)生終止密碼子，由此編碼截短(短)型蛋白質(zhì)，稱為LMP-1s。這就是用于表達載體的構(gòu)建物(SEQ ID NO32)。通過比對SEQ ID NO32與5’RACE序列(SEQ ID NO21)產(chǎn)生含5’UTR的全長cDNA序列(SEQ ID NO33)。然后推導LMP-1s氨基酸序列(SEQ IDNO34)是223個氨基酸的蛋白質(zhì)，并通過Western印漬(如實施例15)確認了預測分子量～23.7kD。
用EcoRV和XbaI消化pHis-ATG載體(InVitrogen，Carlsbad，CA)。回收載體，然后將1650bp限制性片段連接到線性化pHis-ATG中?？寺〔U增連接產(chǎn)物。通過標準方法純化pHis-ATG-LMP-1s表達載體，也稱為含插入片段HLMP-1s的pHIS-A。實施例24.在體外用LMP表達載體誘導骨節(jié)形成和礦化參照實施例1，分離大鼠顱蓋細胞并培養(yǎng)成傳代培養(yǎng)物。如實施例1所述，用糖皮質(zhì)激素(GC)刺激培養(yǎng)物或不進行刺激。參照實施例25，使用修改后的Superfect試劑(Qiagen，Valencia，CA)轉(zhuǎn)染方案，每個孔用3g各種載體轉(zhuǎn)染大鼠顱蓋成骨細胞傳代培養(yǎng)物。
如實施例3所述，通過Von Kossa染色使礦化骨節(jié)顯影。人LMP-1s基因產(chǎn)物過度表達在體外本身即可誘導骨節(jié)形成(～203骨節(jié)/孔)。骨節(jié)水平是由GC陽性對照誘導(～412骨節(jié)/孔)的大約50％。其它陽性對照包括pHisA-LMP-Rat表達載體(～152骨節(jié)/孔)和pCMV2/LMP-Rat-Fwd表達載體(～206骨節(jié)/孔)，而陰性對照包括pCMV2/LMP-Rat-Rev。表達載體(～2骨節(jié)/孔)和未處理(UT)板(～4骨節(jié)/孔)。這些數(shù)據(jù)證明人cDNA的骨誘導效果至少與大鼠cDNA相同。這種效果低于GC刺激的觀察結(jié)果，最有可能是因為表達載體沒有達到最適劑量。實施例25.LMP在體外和在體內(nèi)誘導細胞分化通過用NotI和ApaI于37℃消化過夜，由克隆10-4(參閱實施例12)切下大鼠LMP cDNA。用相同的限制性酶消化載體pCMV2 MCS(InVitrogen，Carlsbad，CA)。將來自克隆10-4的線性cDNA片段和pCMV2凝膠純化，提取，并用T4連接酶連接。將連接的DNA凝膠純化，提取，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109細胞進行擴增。挑取陽性瓊脂菌落，用NotI和ApaI消化，并通過凝膠電泳檢查限制性消化產(chǎn)物。制備陽性克隆的原種培養(yǎng)物。
以類似方式制備反向載體，除了所用限制性酶是XbaI和HindIII。因為使用這些限制性酶，所以將來自克隆10-4的LMP cDNA片段以反向(即不可翻譯地)插入pRc/CMV2。產(chǎn)生的重組載體命名為pCMV2/RLMP。
將適當體積的pCMV10-4(最佳終濃度是60nM[3g]；對于這個實驗，優(yōu)選終濃度范圍0-600nM/孔
)重懸于Minimal Eagle Media(MEM)至終體積450l，并旋渦震蕩10秒鐘。加入Superfect(7.5l/m1終溶液)，將溶液旋渦震蕩10秒鐘，然后于室溫溫育10分鐘。溫育后，加入添加10％ FBS的MEM(1ml/孔；6ml/板)，并用移液器混和。
然后迅速將獲得的溶液加到(1ml/孔)清洗后的ROB培養(yǎng)物上。將培養(yǎng)物于37℃在含5％ CO2的潮濕空氣中溫育2小時。然后，用無菌PBS輕輕清洗細胞1次，并加入適當?shù)臉藴蕼赜囵B(yǎng)基。
結(jié)果在用pCMV10-4誘導的所有大鼠細胞培養(yǎng)物中都出現(xiàn)了顯著的骨節(jié)形成。例如，pCMV10-4轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生429骨節(jié)/孔。暴露于Trm的陽性對照培養(yǎng)物產(chǎn)生460骨節(jié)/孔。相反，不接受處理的陰性對照產(chǎn)生1骨節(jié)/孔。相似的，當用pCMV10-4(反向)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物時，沒有觀察到骨節(jié)。
為了證明體內(nèi)從頭骨形成，由4-5周齡正常大鼠(rnu/+；隱性無胸腺狀況是雜合的)的后肢吸取骨髓。將吸取的骨髓細胞用αMEM清洗，離心，并通過將沉淀重懸于0.83％NH4Cl/10mM Tris(pH7.4)來裂解RBC。用MEM清洗剩余骨髓細胞3次，每3×106個細胞用9g pCMV-LMP-1s(正向或反向)轉(zhuǎn)染2小時。然后用MEM清洗轉(zhuǎn)染細胞2次，并以濃度3×107細胞/ml重懸。
用無菌移液器將細胞懸浮液(100l)加到無菌2×5mm I型牛膠原盤(Sulzer Orthopaedics，Wheat Ridge，CO)上。通過手術將牛膠原盤移植至4-5周齡無胸腺大鼠(rnu/rnu)的頭、胸、腹、或背脊的皮下。于第3-4周處死大鼠，通過手術切下牛膠原盤或外科手術區(qū)域，并在70％乙醇中固定。通過放射顯影法分析固定標本，并對用Goldner Trichrome染色的5m厚切片進行未脫鈣組織學檢查。還使用失活(胍提取)脫礦骨基質(zhì)(Osteotech，Shrewsbury，NJ)取代膠原盤進行實驗。
放射顯影揭示了高水平的礦化骨形成，與含LMP-1s轉(zhuǎn)染骨髓細胞的原始膠原盤的形式是一致的。在陰性對照(用反向LMP-1s cDNA(不編碼翻譯蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)染的細胞)中沒有觀察到礦化骨形成，而對載體的吸收顯得很好。
組織學揭示了在LMP-1s轉(zhuǎn)染植入物中沿成骨細胞的新骨小梁。隨著陰性對照中的載體部分再吸收沒有看到骨。
進一步實驗，即在無胸腺大鼠腰椎和胸椎之間變換位點加入18套(9個陰性對照pCMV-LMP-REV和9個實驗性pCMV-LMP-1s)植入物，其放射顯影證明9個陰性對照移植中沒有一個在椎骨之間顯示骨形成(脊骨融合)。所有9個經(jīng)pCMV-LMP-1s處理的植入物都在椎骨之間顯示固相骨融合。實施例26.由實施例2和3中演示的序列合成pHIS-5’ATG LMP-1s表達載體用ClaI和EcoRV(New England Biologicals，city，MA)消化717bp克隆(實施例17)。凝膠純化小片段(～250bp)。用ClaI和XbaI消化7號克隆(實施例18)。凝膠純化來自該消化反應的1400bp片段。通過標準方法連接分離的～250bp和1400bp cDNA片段以形成～1650bp片段。用EcoRV和XbaI消化pHis-A載體(InVitrogen)?；厥站€性化載體，并連接嵌合的1650bp cDNA片段。通過標準方法克隆并擴增連接產(chǎn)物，并如先前所述將pHis-A-5’ATG LMP-1s表達載體(也稱為含插入片段HLMP-1s的載體pHis-A)保藏于ATCC。實施例27.在體外用pHis-5’ATG LMP-1s表達載體誘導骨節(jié)形成和礦化參照實施例1，分離大鼠顱蓋細胞并培養(yǎng)成傳代培養(yǎng)物。參照實施例1，用糖皮質(zhì)激素(GC)刺激培養(yǎng)物或不進行刺激。參照實施例25，每個孔用3g重組pHis-A載體DNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物。參照實施例3，通過Von Kossa染色使礦化骨節(jié)顯影。
人LMP-1s基因產(chǎn)物過度表達在體外可單獨(即不用GC刺激)誘導顯著的骨節(jié)形成(～203骨節(jié)/孔)。這是由暴露于GC陽性對照的細胞產(chǎn)生的骨節(jié)數(shù)量(～412骨節(jié)/孔)的大約50％。由轉(zhuǎn)染了pHisA-LMP-Rat表達載體(～152骨節(jié)/孔)和pCMV2/LMP-Rat-Fwd(～206骨節(jié)/孔)的培養(yǎng)物獲得相似結(jié)果。相反，陰性對照pCMV2/LMP-Rat-Rev產(chǎn)生～2骨節(jié)/孔，而在未處理板中看到～4骨節(jié)/孔。這些數(shù)據(jù)證明，在這種模型系統(tǒng)中，人LMP-1 cDNA的骨誘導效果至少與大鼠LMP-1 cDNA相同。這次實驗的效果低于GC刺激的效果，但是是可比的。實施例28. LMP誘導可溶性骨誘導因子的分泌如實施例24所述RLMP-1或HLMP-1s在大鼠顱蓋成骨細胞培養(yǎng)物中的過度表達導致骨節(jié)形成顯著多于陰性對照。為了研究LIM礦化蛋白的作用機制，在不同時間點收獲條件培養(yǎng)基，濃縮10倍，過濾除菌，用含新鮮血清的培養(yǎng)基稀釋至最初濃度，并施加于未轉(zhuǎn)染細胞4天。
在第4天由RLMP-1或HLMP-1s轉(zhuǎn)染細胞收獲的條件培養(yǎng)基誘導骨節(jié)形成的效果與在轉(zhuǎn)染細胞中直接過度表達RLMP-1大致一樣有效。來自反向RLMP-1或HLMP-1s轉(zhuǎn)染細胞的條件培養(yǎng)基對骨節(jié)形成沒有明顯效果。在第4天之前由LMP-1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物收獲的條件培養(yǎng)基同樣不誘導骨節(jié)形成。這些資料說明LMP-1的表達引起可溶性因子的合成和/或分泌，而在轉(zhuǎn)染后4天以內(nèi)這種可溶性因子在培養(yǎng)基中未達到有效量。
既然rLMP-1的過度表達導致骨誘導因子分泌進入培養(yǎng)基，那么就用Western印漬分析來確定培養(yǎng)基中是否存在LMP-1蛋白。使用對LMP-1(QDPDEE)特異的抗體來評價rLMP-1蛋白的存在，并通過傳統(tǒng)方法進行檢測。只在培養(yǎng)物的細胞層中發(fā)現(xiàn)LMP-1蛋白，而培養(yǎng)基中沒有。
通過標準的25％和100％硫酸銨沉淀及隨后的DE-52陰離子交換分批層析法(100mM或500mM NaCl)實現(xiàn)骨誘導性可溶性因子的部分純化。在高硫酸銨、高NaCl部分中觀察到所有活性。這種定位與單一因子負責調(diào)理培養(yǎng)基的可能性是一致的。實施例29.由低劑量腺病毒介導的腰椎脊骨融合(lumbar spine Fusion)中的基因療法該研究確定了使用腺病毒投遞LMP-1 cDNA(SEQ ID NO2)從而在正常即免疫活性兔中促進脊骨融合的最佳劑量。
使用Adeno-QuestTM試劑盒(Quantum Biotechnologies公司，Montreal)，用由CMV啟動子啟動的LMP-1 cDNA(SEQ ID NO2)構(gòu)建了復制缺陷型人重組腺病毒。使用含β-半乳糖苷酶基因的商品化重組腺病毒(Quantum Biotechnologies公司，Montreal)作為對照。
最初，以感染復數(shù)(“MOI”)0.025、0.25、2.5、或25噬斑形成單位(pfu)/細胞進行60分鐘病毒轉(zhuǎn)導，進行體外劑量應答實驗以確定腺病毒投遞的LMP-1(“AdV-LMP-1”)在大鼠顱蓋成骨細胞培養(yǎng)物中誘導骨分化的最佳濃度。通過7天暴露于109M糖皮質(zhì)激素(“GC”)分化陽性對照培養(yǎng)物。剩下陰性對照不處理。在第14天，將培養(yǎng)物von Kossa染色后，對礦化骨節(jié)數(shù)目計數(shù)，并通過放射性免疫測定法測量分泌到培養(yǎng)基中的骨鈣蛋白水平(pmol/ml)(平均值±SEM)。
表1顯示了實驗結(jié)果。在未處理的陰性對照培養(yǎng)物中基本上沒有形成自發(fā)骨節(jié)。數(shù)據(jù)顯示等于0.25pfu/細胞的MOI對于骨誘導骨節(jié)是最有效的，達到的水平與陽性對照(GC)可比。更低或更高的腺病毒劑量不如它有效。
表1
然后進行體內(nèi)實驗以確定最佳體外劑量能否在骨骼成熟的新西蘭白兔中促進橫突間脊骨融合。麻醉9只兔子，并使用18號針頭經(jīng)髁間節(jié)由股骨末梢吸取3cc骨髓。然后分離血沉棕黃層，用AdV-LMP-1轉(zhuǎn)導10分鐘，并將細胞送回手術室用于灌輸。進行單一水平后側(cè)腰椎關節(jié)固定術，并剝除橫突皮質(zhì)、插入含8-15×106個AdV-LMP-1(MOI＝0.4)或AdV-BGal(MOI＝0.4)轉(zhuǎn)導的自體帶核血沉棕黃層細胞的載體(兔失活骨基質(zhì)或膠原海綿)。5周后對兔施行安樂死，并通過人工觸摸、平面X射線、CT掃描、和未脫鈣組織學評價脊骨融合。
在所有9只兔子中接受AdV-LMP-1的脊骨融合位點都誘導固相、連續(xù)的脊骨融合塊。相反，接受AdV-BGal或較低劑量AdV-LMP-1(MOI＝0.04)的位點產(chǎn)生少許骨或沒有，并導致脊骨融合速率與僅用載體可比(＜40％)。這些結(jié)果與通過人工觸摸、CT掃描、和組織學進行的評價是一致的。但是，平面射線顯影有時過高評價存在的骨量，尤其是在對照位點。使用兩種測試的載體材料的LMP-1 cDNA投遞和骨誘導都是成功的。沒有證據(jù)表明存在針對腺病毒載體的全身或局部免疫應答。
這些資料證明在先前驗證很有前途的兔脊骨融合模型有一致骨誘導。而且，與需要過夜轉(zhuǎn)導或在培養(yǎng)物中擴增細胞數(shù)周的其它方法相比，使用自體骨髓細胞和手術間離體基因轉(zhuǎn)導(10分鐘)的方案在臨床上更加可行。另外，重組腺病毒最有效劑量(MOI＝0.25)大大低于在其它基因療法應用中報導的劑量(MOI＝40-500)。我們認為這要歸功于LMP-1是細胞內(nèi)信號分子且具有有力的信號放大級聯(lián)的事實。此外，在細胞培養(yǎng)物中誘導骨的相同濃度AdV-LMP-1在體內(nèi)也有效的觀察結(jié)果還令人驚訝的顯示，而其它生長因子在由細胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)變成動物實驗時通常需要增加劑量。一并考慮，這些觀察結(jié)果指出，使用腺病毒投遞LMP-1 cDNA的局部基因療法是可能的，而需要的低劑量有可能使針對腺病毒載體的免疫應答的消極影響最小化。實施例30.外周靜脈血具核細胞(血沉棕黃層)用于生成骨的LMP-1 cDNA基因療法的應用如上所述(實施例29)在4只兔子中進行了脊骨融合手術，除了轉(zhuǎn)導細胞是來自靜脈血而非骨髓的血沉棕黃層。用Adeno-LMP或pHIS-LMP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細胞，獲得了與使用骨髓細胞同樣成功的結(jié)果。將普通靜脈血細胞用于基因投遞的這一發(fā)現(xiàn)使基因療法在臨床上更加可行，因為它避免了痛苦的常規(guī)麻醉骨髓采集并由相同體積起始材料產(chǎn)生多2倍的細胞。實施例31.人LMP-1剪接變體的分離內(nèi)含子/外顯子mRNA轉(zhuǎn)錄本剪接變體是信號轉(zhuǎn)導和細胞/組織發(fā)育中較常見的調(diào)控機制。多種基因的剪接變體顯示可改變蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA、和蛋白質(zhì)-底物相互作用。剪接變體還可以控制基因表達的組織特異性，從而在不同的組織中表達不同的形式(因此發(fā)揮不同功能)。剪接變體是細胞中的常見調(diào)控現(xiàn)象。LMP剪接變體有可能在其它組織中產(chǎn)生效果，諸如神經(jīng)再生、肌肉再生、或其它組織發(fā)育。
為了對人心臟cDNA文庫篩選HLMP-1序列的剪接變體，制備了對應于部分SEQ ID NO22的PCR引物對。使用標準技術合成的正向PCR引物對應于SEQ ID NO22的第35-54位核苷酸，序列如下5’GAGCCGGCATCATGGATTCC 3’(SEQ ID NO35)反向PCR引物與SEQ ID NO22的第820-839位核苷酸反向互補，序列如下5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3’(SEQ ID NO36)通過標準技術，將正向和反向PCR引物用于對人心臟cDNA(ClonTech，目錄編號7404-1)篩選序列與HLMP-1相似的序列，循環(huán)方案如下94℃，30”；64℃，30”；72℃，60”；30輪循環(huán)，隨后于72℃溫育10分鐘。將擴增的cDNA序列凝膠純化，并提交給Emory DNA Sequence Core Facility進行測序。使用標準技術對克隆測序，并用PCGENE(Intelligenetics；程序SEQUIN和NALIGN)檢查序列，以測定與SEQ ID NO22的同源性。然后用Intelligenetics的程序TRANSL將相對于SEQ ID NO22具有推定的其它剪接位點的兩種同源核苷酸序列翻譯成相應的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
這兩種新的人cDNA序列之一(SEQ ID NO37)包含1456bp10 20 30 40 50 60CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG70 80 90100110120GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT130140150160170180GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC190200210220230240GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA250260270280290300GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG310320 * 330340 * 350360CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGTGCAG ACCCCTGACA AACAGCCGCT CCGACCGCTG370380390400410420GTCCCAGATG CCAGCAAGCA GCGGCTGATG GAGAACACAG AGGACTGGCG GCCGCGGCCG430440450460470480GGGACAGGCC AGTCGCGTTC CTTCCGCATC CTTGCCCACC TCACAGGCAC CGAGTTCATG490500510520530540CAAGACCCGG ATGAGGAGCA CCTGAAGAAA TCAAGCCAGG TGCCCAGGAC AGAAGCCCCA550560570580590600GCCCCAGCCT CATCTACACC CCAGGAGCCC TGGCCTGGCC CTACCGCCCC CAGCCCTACC610620630640650660AGCCGCCCGC CCTGGGCTGT GGACCCTGCG TTTGCCGAGC GCTATGCCCC GGACAAAACG670680690700710720AGCACAGTGC TGACCCGGCA CAGCCAGCCG GCCACGCCCA CGCCGCTGCA GAGCCGCACC730740750760770780TCCATTGTGC AGGCAGCTGC CGGAGGGGTG CCAGGAGGGG GCAGCAACAA CGGCAAGACT790800810820830840CCCGTGTGTC ACCAGTGCCA CAAGGTCATC CGGGGCCGCT ACCTGGTGGC GTTGGGCCAC850860870880890900GCGTACCACC CGGAGGAGTT TGTGTGTAGC CAGTGTGGGA AGGTCCTGGA AGAGGGTGGC910920930940950960TTCTTTGAGG AGAAGGGCGC CATCTTCTGC CCACCATGCT ATGACGTGCG CTATGCACCC970980990 1000 1010 1020AGCTGTGCCA AGTGCAAGAA GAAGATTACA GGCGAGATCA TGCACGCCCT GAAGATGACC1030 1040 1050 1060 1070 1080TGGCACGTGC ACTGCTTTAC CTGTGCTGCC TGCAAGACGC CCATCCGGAA CAGGGCCTTC1090 1100 1110 1120 1130 1140TACATGGAGG AGGGCGTGCC CTATTGCGAG CGAGACTATG AGAAGATGTT TGGCACGAAA1150 1160 1170 1180 1190 1200TGCCATGGCT GTGACTTCAA GATCGACGCT GGGGACCGCT TCCTGGAGGC CCTGGGCTTC1210 1220 1230 1240 1250 1260AGCTGGCATG ACACCTGCTT CGTCTGTGCG ATATGTCAGA TCAACCTGGA AGGAAAGACC1270 1280 1290 1300 1310 1320TTCTACTCCA AGAAGGACAG GCCTCTCTGC AAGAGCCATG CCTTCTCTCA TGTGTGAGCC1330 1340 1350 1360 1370 1380CCTTCTGCCC ACAGCTGCCG CGGTGGCCCC TAGCCTGAGG GGCCTGGAGT CGTGGCCCTG1390 1400 1410 1420 1430 1440CATTTCTGGG TAGGGCTGGC AATGGTTGCC TTAACCCTGG CTCCTGGCCC GAGCCTGGGC1450TCCCGGGCCC TGCCCA
由刪除119bp片段(*之間)和插入17bp片段(下劃線)引起的讀碼框移動導致截短的基因產(chǎn)物，其氨基酸序列(SEQ ID NO38)如下1020 30 40 50 60MDSFKVVLEG PAPWGFRLQG GKDFNVPLSI SRLTPGGKAA QAGVAVGDWV LSIDGENAGS70 80 90100110120LTHIEAQNKI RACGERLSLG LSRAQPVQNK PQKVOTPDKQ PLRPLVPDAS KQRLMENTED130140150160170180WRPRPGTGQS RSFRILAHLT GTEFMQDPDE EHLKKSSQVP RTEAPAPASS TPQEPWPGPT190200210220230240APSPTSRPPW AVDPAFAERY APDKTSTVLT RHSQPATPTP LQSRTSIVQA AAGGVPGGGS250260270280290300NNGKTPVCHQ CHQVIRARYL VALGHAYHPE EFVCSQCGKV LEEGGFFEEK GAIFCPPCYD310320330340350360VRYAPSCAKC KKKITGEIMH ALKMTWHVLC FTCAACKTPI RNRAFYMEEG VPYCERDYEK370380390400410420MFGTKCQWCD FKIDAGDRFL EALGFSWHDT CFVCAICQIN LEGKTFYSKK DRPLCKSHAFSHV這種423個氨基酸蛋白質(zhì)顯示與SEQ ID NO10所示蛋白質(zhì)100％同源，加粗區(qū)域序列(第94-99位)除外，它是由于上述核苷酸變化所致。
第二種新的人心臟cDNA序列(SEQ ID NO39)包含1575bp10 20 30 40 50 60CGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG70 80 90100110120GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT130140150160170180GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC
190200210220230240GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA250260270280290300GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG310320330340350360CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGCCTCC GCCCCCGCCG CGGACCCTCC GCGGTACACC370380390400410420TTTGCACCCA GCGTCTCCCT CAACAAGACG GCCCGGCCCT TTGGGGCGCC CCCGCCCGCT430440450460470480GACAGCGCCC CGCAACAGAA TGGGTGCAGA CCCCTGACAA ACAGCCGCTC CGACCGCTGG490500510520530540TCCCAGATGC CAGCAAGCAG CGGCTGATGG AGAACACAGA GGACTGGCGG CCGCGGCCGG550560570580590600GGACAGGCCA GTCGCGTTCC TTCCGCATCC TTGCCCACCT CACAGGCACC GAGTTCATGC610620630640650660AAGACCCGGA TGAGGAGCAC CTGAAGAAAT CAAGCCAGGT GCCCAGGACA GAAGCCCCAG670680690700710720CCCCAGCCTC ATCTACACCC CAGGAGCCCT GGCCTGGCCC TACCGCCCCC AGCCCTACCA730740750760770780GCCGCCCGCC CTGGGCTGTG GACCCTGCGT TTGCCGAGCG CTATGCCCCG GACAAAACGA790800810820830840GCACAGTGCT GACCCGGCAC AGCCAGCCGG CCACGCCCAC GCCGCTGCAG AGCCGCACCT850860870880890900CCATTGTGCA GGCAGCTGCC GGAGGGGTGC CAGGAGGGGG CAGCAACAAC GGCAAGACTC910920930940950960CCGTGTGTCA CCAGTGCCAC AAGGTCATCC GGGGCCGCTA CCTGGTGGCG TTGGGCCACG970980990 1000 1010 1020CGTACCACCC GGAGGAGTTT GTGTGTAGCC AGTGTGGGAA GGTCCTGGAA GAGGGTGGCT1030 1040 1050 1060 1070 1080TCTTTGAGGA GAAGGGCGCC ATCTTCTGCC CACCATGCTA TGACGTGCGC TATGCACCCA1090 1100 1110 1120 1130 1140GCTGTGCCAA GTGCAAGAAG AAGATTACAG GCGAGATCAT GCACGCCCTG AAGATGACCT1150 1160 1170 1180 1190 1200GGCACGTGCA CTGCTTTACC TGTGCTGCCT GCAAGACGCC CATCCGGAAC AGGGCCTTCT1210 1220 1230 1240 1250 1260ACATGGAGGA GGGCGTGCCC TATTGCGAGC GAGACTATGA GAAGATGTTT GGCACGAAAT1270 1280 1290 1300 1310 1320GCCATGGCTG TGACTTCAAG ATCGACGCTG GGGACCGCTT CCTGGAGGCC CTGGGCTTCA1330 1340 1350 1360 1370 1380GCTGGCATGA CACCTGCTTC GTCTGTGCGA TATGTCAGAT CAACCTGGAA GGAAAGACCT1390 1400 1410 1420 1430 1440TCTACTCCAA GAAGGACAGG CCTCTCTGCA AGAGCCATGC CTTCTCTCAT GTGTGAGCCC1450 1460 1470 1480 1490 1500CTTCTGCCCA CAGCTGCCGC GGTGGCCCCT AGCCTGAGGG GCCTGGAGTC GTGGCCCTGC1510 1520 1530 1540 1550 1560ATTTCTGGGT AGGGCTGGCA ATGGTTGCCT TAACCCTGGC TCCTGGCCCG AGCCTGGGCT1570CCCGGGCCCT GCCCA由插入17bp片段(粗體、斜體、和下劃線)引起的讀碼框移動導致在第565-567位(下劃線)提前出現(xiàn)翻譯終止密碼子，所衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO38)包含153個氨基酸的，如下所示10 20 30 40 50 60MDSFKVVLEG PAPWGFRLQG GKDFNVPLSI SRLTPGGKAA QAGVAVGDWV LSIDGENAGS70 80 90100110120LTHIEAQNKI RACGERLSLG LSRAQPVQSK PQKASAPAAD PPRYTFAPSV SLNKTARPFG130140150
這種蛋白質(zhì)直至第94位氨基酸顯示與SEQ ID NO10有100％同源性，此處插入核苷酸序列中所述17bp片段，導致讀碼框移動。蛋白質(zhì)的第94-153位氨基酸與SEQ ID NO10不同源。由于核苷酸序列中所述提前出現(xiàn)的.終止密碼子，因此不存在SEQ ID N010的第154-457位氨基酸。實施例32.基因組HLMP-1核苷酸序列申請人已經(jīng)鑒定了編碼HLMP-1的基因組DNA序列，包括與HLMP-1表達有關的推定調(diào)控元件。SEQ ID NO41顯示了完整基因組序列。該序列衍生自AC023788(克隆RP11-564G9)，基因組測序中心，華盛頓大學醫(yī)學院，圣路易斯，MO。
HLMP-1的推定啟動子區(qū)跨越SEQ ID NO41的第2660-8733位核苷酸。該區(qū)域包含至少10個潛在糖皮質(zhì)激素應答元件(“GRE”)(第6148-6153位、第6226-6231位、第6247-6252位、第6336-6341位、第6510-6515位、第6552-6557位、第6727-6732位、第6752-6757位、第7738-7743位、和第8255-8260位核苷酸)、12個針對Drosophilla decapentaplegic的Mother的Sma-2同源物(“SMAD”)潛在結(jié)合元件位點(第3569-3575位、第4552-4558位、第4582-4588位、第5226-5232位、第6228-6234位、第6649-6655位、第6725-6731位、第6930-6936位、第7379-7384位、第7738-7742位、第8073-8079位、和第8378-8384位核苷酸)、和3個TATA盒(第5910-5913位、第6932-6935位、和第7380-7383位核苷酸)。3個TATA盒、所有GRE、和8個SMAD結(jié)合元件(“SBE”)群聚于跨越SEQ ID NO41的第5841-8733位核苷酸的區(qū)域。這些調(diào)控元件可用于例如調(diào)控編碼涉及骨形成過程的蛋白質(zhì)的外源核苷酸序列的表達。這將能夠全身性施用涉及骨形成和修復的治療因子或基因，以及與組織分化和發(fā)育有關的因子或基因。
除了推定調(diào)控元件以外，還鑒定了對應于編碼HLMP-1的核苷酸序列的13個外顯子。這些外顯子跨越SEQ ID NO41的下列核苷酸外顯子1 第8733-8767位外顯子2 第9790-9895位外顯子3 第13635-13787位外顯子4 第13877-13907位外顯子5 第14387-14502位外顯子6 第15161-15297位外顯子7 第15401-15437位外顯子8 第16483-16545位外顯子9 第16689-16923位外顯子10 第18068-18248位外顯子11 第22117-22240位外顯子12 第22323-22440位外顯子13 第22575-22911位在HLMP-2中，存在另一個外顯子(外顯子5A)，跨越第14887-14904位。
本文引用的所有發(fā)表物和專利完整收入作為參考。
上文詳述以及作為例示提供的實施例傳授了本發(fā)明的原理，本領域技術人員通過閱讀本公開書應當領會，可以在形式和細節(jié)上進行多種變化而不偏離本發(fā)明的真實范圍。
序列表<110> Boden M.D.，Scott DHair Ph.D.，Gregory A<120> LIM礦化蛋白剪接變體<130> 剪接變體LMP<140> 6148.0222-00304<141> 2000-04-28<150> 60/132,021<151> 1999-04-30<160> 42<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 457<212> PRT<213> 褐家鼠<400> 1Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Leu Thr85 90 95Pro Pro Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu100 105 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Thr Asp Ser Ala115 120 125Leu Ser Gln Asn Gly Gln Leu Leu Arg Gln Leu Val Pro Asp Ala Ser130 135 140Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly145 150 155 160Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr165 170 175Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu Phe Met Lys Lys Ser Ser Gln180 185 190Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Thr Ile Pro Gln Glu195 200 205Ser Trp Pro Gly Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp210 215 220Ala Val Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser225 230 235 240Thr Val Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln245 250 255Asn Arg Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly260 265 270Gly Ser Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Lys Ile275 280 285Ile Arg Gly Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu290 295 300Glu Phe Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe305 310 315 320Phe Glu Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Ser Cys Tyr Asp Val Arg325 330 335Tyr Ala Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile340 345 350Met His Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Pro Cys Phe Thr Cys Ala355 360 365Ala Cys Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly370 375 380Ala Pro Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys385 390 395 400Arg Gly Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala405 410 415Leu Gly Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln420 425 430Ile Asn Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Lys Pro Leu435 440 445Cys Lys Ser His Ala Phe Ser His Val450 455<210> 2<211> 1696<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 2gcacgaggat cccagcgcgg ctcctggagg ccgccaggca gccgcccagc cgggcattca 60ggagcaggta ccatggattc cttcaaggta gtgctggagg gacctgcccc ttggggcttc 120cgtctgcaag ggggcaagga cttcaacgtg cccctctcca tctctcggct cactcctgga 180ggcaaggccg cacaggccgg tgtggccgtg ggagactggg tactgagtat cgacggtgag 240aacgccggaa gcctcacaca cattgaagcc cagaacaaga tccgtgcctg tggggagcgc 300ctcagcctgg gtcttagcag agcccagcct gctcagagca aaccacagaa ggccctgacc 360cctcccgccg accccccgag gtacactttt gcaccaagcg cctccctcaa caagacggcc 420cggcccttcg gggcaccccc acctactgac agcgccctgt cgcagaatgg acagctgctc 480agacagctgg tccctgatgc cagcaagcag cggctgatgg agaatactga agactggcgc 540ccgcggccag ggacaggcca gtcccgttcc ttccgcatcc ttgctcacct cacgggcaca 600gagttcatgc aagacccgga tgaggaattc atgaagaagt caagccaggt gcccaggaca 660gaagccccag ccccagcctc aaccataccc caggaatcct ggcctggccc caccaccccc 720agccccacca gccgcccacc ctgggccgta gatcctgcat ttgctgagcg ctatgcccca 780gacaaaacca gcacagtgct gacccgacac agccagccag ccacacctac gcctctgcag 840aaccgcacct ccatagttca ggctgcagct ggagggggca caggaggagg cagcaacaat 900ggcaagacgc ctgtatgcca ccagtgccac aagatcatcc gcggccgata cctggtagca 960ctgggccacg cgtaccatcc tgaggaattt gtgtgcagcc agtgtgggaa ggtcctggaa 1020gagggtggct tcttcgagga gaagggagct atcttttgcc cctcctgcta tgatgtgcgc 1080tatgcaccca gctgtgccaa atgcaagaag aagatcactg gagagatcat gcatgcgctg 1140aagatgacct ggcatgttcc ctgcttcacc tgtgcagcct gcaaaacccc tatccgcaac 1200agggctttct acatggagga gggggctccc tactgcgagc gagattacga gaagatgttt 1260ggcacaaagt gtcgcggctg tgacttcaag atcgatgccg gggaccgttt cctggaagcc 1320ctgggtttca gctggcatga tacgtgtttt gtttgcgcaa tatgtcaaat caacttggaa 1380ggaaagacct tctactccaa gaaggacaag cccctgtgca agagccatgc cttttcccac 1440gtatgagcac ctcctcacac tactgccacc ctactctgcc agaagggtga taaaatgaga 1500gagctctctc tccctcgacc tttctgggtg gggctggcag ccattgtcct agccttggct 1560cctggccaga tcctggggct ccctcctcac agtccccttt cccacacttc ctccaccacc 1620accaccgtca ctcacaggtg ctagcctcct agccccagtt cactctggtg tcacaataaa 1680cctgtatgta gctgtg 1696<210> 3<211> 260<212> DNA<213> 褐家鼠<400> 3ttctacatgg aggagggggc tccctactgc gagcgagatt acgagaagat gtttggcaca 60aagtgtcgcg gctgtgactt caagatcgat gccggggacc gtttcctgga agccctgggt 120ttcagctggc atgatacgtg ttttgtttgc gcaatatgtc aaatcaactt ggaaggaaag 180accttctact ccaagaagga caagcccctg tgcaagagcc atgccttttc ccacgtatga 240gcacctcctc acactactgc 260<210> 4<211> 16<212> DNA<213> MMLV<400> 4aagctttttt tttttg 16<210> 5<211> 13<212> DNA<213> MMLV<400> 5aagcttggct atg 13<210> 6<211> 223<212> DNA<213> 人類<400> 6atccttgctc acctcacggg caccgagttc atgcaagacc cggatgagga gcacctgaag 60aaatcaagcc aggtgcccag gacagaagcc ccagccccag cctcatctac accccaggag 120ccctggcctg 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1.包含SEQ ID NO37或SEQ ID NO39的分離核酸分子。
2.由SEQ ID NO37或SEQ ID NO39編碼的分離人LMP蛋白。
3.包含權(quán)利要求1的分離核酸分子的載體。
4.包含權(quán)利要求3的載體的宿主細胞。
5.權(quán)利要求4的宿主細胞，其中宿主細胞選自原核細胞、酵母細胞、和哺乳動物細胞。
6.權(quán)利要求1的分離核酸分子，其還包含標記物。
7.包含選自SEQ ID NO38和SEQ ID NO40的氨基酸序列的人LIM礦化蛋白。
8.對HLMP-2(SEQ ID NO38)或HLMP-3(SEQ ID NO40)特異的單克隆抗體。
9.誘導骨形成的方法，包括用包含SEQ ID NO39的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨前體細胞或外周血白細胞。
10.權(quán)利要求9的方法，其中分離核酸分子位于載體中。
11.權(quán)利要求10的方法，其中載體是表達載體。
12.權(quán)利要求11的方法，其中載體是質(zhì)粒。
13.權(quán)利要求11的方法，其中載體是病毒。
14.權(quán)利要求13的方法，其中病毒是腺病毒。
15.權(quán)利要求13的方法，其中病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
16.權(quán)利要求9的方法，其中生骨前體細胞或外周血白細胞進行離體轉(zhuǎn)染。
17.權(quán)利要求9的方法，其中生骨前體細胞通過直接注射分離核酸分子進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。
18.權(quán)利要求9的方法，其中LIM礦化蛋白是HLMP-3(SEQ ID NO40)。
19.融合脊骨的方法，包括a) 用包含SEQ ID NO39的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨前體細胞或外周血白細胞；b) 混和經(jīng)轉(zhuǎn)染生骨前體細胞或外周血白細胞與基質(zhì)；并c) 使基質(zhì)接觸脊骨；其中所述核苷酸序列的表達在基質(zhì)中引起礦化骨形成。
20.權(quán)利要求19的方法，其中生骨前體細胞或外周血細胞進行離體轉(zhuǎn)染。
21.在有此需要的哺乳動物宿主中誘導全身性骨形成的方法，包括a)用能夠穩(wěn)定維持于生骨前體細胞或外周血白細胞中的載體轉(zhuǎn)染生骨前體細胞或外周血白細胞，該載體包含SEQ ID NO39以及與之可操作連接的可調(diào)控啟動子，其中可調(diào)控啟動子可應答外源控制化合物；并b)根據(jù)需要，對宿主施用外源控制物質(zhì)，其施用量能有效引起SEQ IDNO39的表達。
22.刺激生骨細胞產(chǎn)生生骨可溶性因子的方法，包括a)用包含SEQ ID NO39的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨細胞或外周血白細胞；并b)過度表達該分離核酸分子。
23.由權(quán)利要求22的方法產(chǎn)生的生骨可溶性因子。
24.權(quán)利要求23的生骨可溶性因子，其中所述生骨因子是蛋白質(zhì)。
25.抑制HLMP-2或HLMP-3表達的方法，包括用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染表達HLMP-2或HLMP-3的細胞。
26.權(quán)利要求17的方法，其中所述分離核酸分子位于載體中，該載體選自質(zhì)粒和病毒。
27.權(quán)利要求26的方法，其中載體是質(zhì)粒，該質(zhì)粒直接注射到肌肉組織中。
28.抑制骨形成的方法，包括用包含SEQ ID NO37的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨前體細胞或外周血白細胞。
29.權(quán)利要求28的方法，其中分離核酸分子位于載體中。
30.權(quán)利要求29的方法，其中載體是表達載體。
31.權(quán)利要求30的方法，其中載體是質(zhì)粒。
32.權(quán)利要求30的方法，其中載體是病毒。
33.權(quán)利要求32的方法，其中病毒是腺病毒。
34.權(quán)利要求32的方法，其中病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
35.權(quán)利要求28的方法，其中生骨前體細胞或外周血白細胞進行離體轉(zhuǎn)染。
36.權(quán)利要求28的方法，其中生骨前體細胞通過直接注射分離核酸分子進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染。
37.權(quán)利要求28的方法，其中LIM礦化蛋白是HLMP-2(SEQ ID NO38)。
全文摘要
本發(fā)明致力于編碼LIM礦化蛋白或LMP的分離核酸分子。本發(fā)明還提供了包含編碼LMP的核酸序列剪接變體的載體,以及包含這些載體的宿主細胞。此外,本發(fā)明還涉及通過用包含編碼LIM礦化蛋白剪接變體的核苷酸序列的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨前體細胞來誘導骨形成的方法。轉(zhuǎn)染可以離體進行,或者通過直接注射病毒或裸露的質(zhì)粒DNA而在體內(nèi)發(fā)生。在特定的實施方案中,本發(fā)明提供了融合脊骨的方法,即用包含編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸分子轉(zhuǎn)染生骨前體細胞,混和經(jīng)轉(zhuǎn)染生骨前體細胞與基質(zhì),并使基質(zhì)接觸脊骨。最后,本發(fā)明涉及通過用本發(fā)明載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞來誘導全身性骨形成的方法。
文檔編號A61K35/76GK1355714SQ00808895
公開日2002年6月26日 申請日期2000年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月30日
發(fā)明者S·D·博登, G·A·哈爾 申請人:埃默里大學