專利名稱：動脈粥樣硬化和冠心病的診斷和治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及人HSP60(熱激蛋白60)在人的治療或診斷方法中的用途，更特別地，本發(fā)明涉及診斷試驗方法、診斷試劑的生產(chǎn)以及用于因動脈粥樣硬化而患有血管疾病的患者的診斷試驗試劑盒，這些患者傾向于熱激蛋白誘導的補體激活，例如患有心肌疾病如冠心病。
補體系統(tǒng)(見McAleer，M.A.和Sim，R.B.在補體的激活劑和抑制劑，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，R.B.Sim編，1993年，第1至15頁；Reid，K.B.M.和Law，A.，1988年，補體，IRL出版社，牛津)涉及抵抗感染的宿主防御—在系統(tǒng)激活后，一個催化系列的反應和相互作用發(fā)生，導致激活細胞、組織或顆粒的靶向而破壞。由于該系統(tǒng)的破壞性質，如果不正確地被引發(fā)，它具有引起宿主系統(tǒng)嚴重損傷的潛在可能(Davis，A.E.，1988年，Ann.Rev.Immunol.，第6卷第595至628頁；Frank，M.M.，1993年，在在健康和疾病中的補體，第二版，Whaley，K.等編，Kluwer Acdemic Publishers，Dordrecht，第229頁)并且如果它的活性減小，那么它具有使宿主開放于感染性病原體的進攻的潛在可能。
已經(jīng)證明補體激活在冠心病和其它動脈粥樣硬化的血管并發(fā)癥的發(fā)展中具有重要作用(Prohaszka，Z.等，1999年9月，Int.Immunol，第11卷(9)，第1363-1370頁；Torzewski等，1997年，動脈粥樣硬化，第132卷第131頁)，包括例如外周動脈粥樣硬化和中風。最近的出版物，如Xu，Q.等(1993年，The Lancet，第341卷第255頁)，Hoppichler，F(xiàn).等(1996年，動脈粥樣硬化，第126卷，第333頁)，AT398495和Birnie，D.H.等(1998年，Eur.Heart J.，第19卷第387頁)都已經(jīng)涉及了冠心病和特異性地抗動脈粥樣硬化中的分枝桿菌65Kda熱激蛋白(HSP)的抗體之間的聯(lián)系。熱激蛋白(也被稱為唇基(chaperons))，例如HSP60蛋白族，是高度保守的，且對抗它們的抗體被發(fā)現(xiàn)是高度交叉反應性的(Ellas，D.等，1990年，PANS USA，第87卷第1576頁；Daniele，M.G.等，1992年，第5卷，第443頁；de Graeff-Meeder，E.R.等，1994年，Pediatr.Res.，第152卷第3656頁；Metzler，B.等，1997年，Atheroscler.Thromb.Vasc.Biol.，第17卷第536頁；Latif，N.等，1997年，Transplant.Proc.，第29卷第1039頁-1040頁；Schett，G.等，1995年，J.Clin.Invest.，第96卷(6)第2569-2577頁；Schett，G.等，1997年，Atherosclerosis，第128卷(1)第27-38頁)。已發(fā)現(xiàn)這些對抗HSP的交叉反應性抗體和動脈粥樣硬化有關，并且還發(fā)現(xiàn)補體激活和動脈粥樣硬化有關，雖然這些關系的確切的本質還未得知，并且在動脈粥樣硬化、補體激活和交叉反應性HSP抗體之間沒有已知的因果關系。HSP的其它用途在例如WO 97/06821中有詳細描述。
來自病原體的保守的熱激蛋白引發(fā)心臟病的普遍觀點被例如Bachmaler，K.等，1999年，Science，第283卷第1335-1339頁證實。
本發(fā)明成功地確定了心肌疾病的原因(確切為地說與動脈粥樣硬化相關的疾病如冠心病、心肌梗塞和中風的原因)，這種原因在已有技術中尚未提出。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)(見下面的“試驗”)i) 人HSP60(hHSP60)和抗hHSP60抗體的免疫復合物的形成通過經(jīng)典途徑(CP)以劑量依賴性的方式引起補體系統(tǒng)的激活，但hHSP本身并不引起補體激活；以及ii) 引起補體激活的復合物中被抗hHSP抗體結合的hHSP表位對hHSP是單一的。
在患者是否患有冠心病以及冠心病的嚴重程度和在患者血清中特異性地對抗hHSP的抗體水平(即不與其它HSP如分枝桿菌HSP65結合的抗體)之間存在強烈的正相關。因此這可以被用作確定來自相同傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者和樣品的診斷試驗的基礎。
因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供了在人體的治療或診斷方法中使用的hHSP60或其免疫原性片段。
自然地，可以使用重組hHSP，并且這樣的重組分子可以具有小修飾，例如作為它們的氨基酸序列的改變的結果，或作為在表達系統(tǒng)中起作用(或不起作用)的翻譯后修飾的結果。這樣的分子可以具有至少50％，或60％、70％、80％、90％或95％的與hHSP60的同源性，其通過使用BLAST2程序(www.ncbi.nlm.nih.gov)所采用的算法測定。如上述討論的，hHSP60和其它HSP60分子的同源性很高，因此為落在本發(fā)明的范圍之內，修飾分子必須顯示與hHSP60相同的功能性質，這些性質對于本發(fā)明是基本的，即它們必須顯示hHSP特異性表位。例如，這可以通過進行hHSP60和修飾分子的對比試驗來測定。取自具有傾向于能夠和hHSP結合并產(chǎn)生補體激活的抗體的患者的樣品用修飾hHSP60代替hHSP60應該同樣能夠獲得相同的結果。這樣的修飾分子在本文中被稱為“基本組成hHSP60”，并且hHSP60的參比也是這種基本組成hHSP60分子的參比。
補體系統(tǒng)不適當?shù)募せ羁赡軐е潞軐挿秶募膊?，包括動脈粥樣硬化，特別是冠心病的發(fā)展或并發(fā)癥。因此本發(fā)明可以用來診斷那些具有冠心病和其它動脈粥樣硬化血管并發(fā)癥傾向的患者。特別令人驚奇的是，試驗(下面的)已表明產(chǎn)生高水平的補體激活抗人HSP60抗體的能力是在幼年時可診斷的遺傳性狀，它和成年后冠心病發(fā)病的高易感性(即趨勢)有關。這意味著在本發(fā)明的試驗中的高水平結果對那些在其它方面很健康的幼年患者患這種疾病的易感性是指示性的。
本發(fā)明同時提供熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢的診斷試驗方法，其包括以下步驟i) 從患者取樣品；ii) 將樣品和hHSP60接觸；iii)檢測任何補體激活；以及iv) 將檢測步驟(iii)的結果和熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢相關。
本發(fā)明同時提供熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢的診斷試驗方法，其包括以下步驟i) 從患者取樣品；ii) 檢測步驟(i)的樣品中對hHSP60特異性的任何抗體；以及iii)將檢測步驟(ii)的結果和熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢相關。
上述檢測步驟(ii)可以包括以下步驟i) 將樣品和HSP60蛋白質族的非hHSP60成員(例如HSP65)接觸；ii) 將得自步驟(i)的樣品和hHSP60接觸；以及iii)檢測所有的抗體-hHSP60結合反應。
或者，檢測步驟(ii)可以包括以下步驟i) 將樣品和顯示對hHSP60單一而不顯示任何共享HSP60表位的抗原接觸；以及ii) 檢測任何抗體-抗原結合反應。
抗體-hHSP60結合反應可以通過檢測任何的補體激活而檢測，特別是通過C4b(補體因子4b)的結合。
診斷試驗方法可以是人體的診斷方法。
診斷試驗如ELISA(酶連免疫吸附測定)和免疫層析試驗如快速試驗(Rapid-Test(EP291194))可以在本發(fā)明的診斷試驗方法中使用，其它適當?shù)脑囼灧椒ê驮噭┖袑Ρ绢I域技術人員容易明確并正確使用。
除確定患者何時傾向于hHSP60介導的補體激活之外，診斷試驗還可以被用于確定傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的治療進行得如何-hHSP60誘導的補體激活降低的水平或抗hHSP60抗體可以指示治療是有效的。類似地，其它結果如果適當，可以指示治療正在防止癥狀的發(fā)展(惡化)或可以指示該癥狀正在惡化。
本發(fā)明同時提供了hHSP60在用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。本發(fā)明同時提供了hHSp60和HSP60蛋白質族的非hHSP60成員在用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。同時提供的還有顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原在用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。如下描述的，這樣的抗原可以使用如表位定位和mimotope設計的技術或者使用各種其它可獲得的技術而容易地產(chǎn)生。類似地，競爭性抑制抗hHSP60抗體和hHSP60結合的結合試劑可能是有用的。因為具有這種作為結合試劑的能力而被篩選出的分子包括多肽、β轉角模擬物(beta-turn mimetics)、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳族化合物、雜環(huán)化合物、苯二氮類、寡聚氮取代的甘氨酸和寡氨基甲酸酯。龐大的化合物組合庫可以通過編碼合成庫建立，這種方法在以下文獻中描述Affymax，WO 95/12608，Affymax，WO 93/06121，哥倫比亞大學，WO 94/08051，Pharmacopeia，WO95/35503和Scripps，WO 95/30642(這些文獻均引入本文做參考)。肽文庫同樣可以通過噬菌體展示產(chǎn)生。參見，例如Devlin，WO91/18980?；谂c抗hHSP60抗體競爭地與Hhsp60結合而篩選化合物庫。抗hHSP60抗體結合的抑制通過補體激活抑制與得自對照的結果比較而確定。這種化合物的識別在藥物發(fā)現(xiàn)方法中特別有用，識別與hHSP60或抗hHSP60抗體特異性地結合并且因此可以抑制抗hHSP60抗體的補體誘導活性的化合物。
本發(fā)明同時提供用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試驗試劑盒，其特征在于它包括hHSP60。本發(fā)明同時提供用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試驗試劑盒，其特征在于它包括hHSP60和HSP60蛋白質族的非hHSP60成員。本發(fā)明同時提供用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試驗試劑盒，其特征在于它包括顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原。
除在診斷上有用外，本發(fā)明還提供了治療機會。與抗hHSP60抗體結合以在患者中引起熱激蛋白誘導的補體激活所需的hHSP60表位(或多個表位)可以容易地用來自傾向于(或患有)熱激蛋白誘導的補體激活的患者的血清確定。通過使用表位定位(Geysen，H.M.等，1987年，Journalof Immunological Methods，第102卷第259-274頁；Geysen，H.M.等，1988年，J.Mol.Recognit.，第1卷(1)第32-41頁；Jung，G.和Beck-Sickinger，A.G.，1992年，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.，第31卷；第367-486頁)，可以產(chǎn)生一系列為hHSP60序列的重疊肽。然后每一個重疊肽可以與患者血清樣品混合。那些引起補體激活的(即C4b的結合)顯示抗體結合和補體激活所需的表位。核心表位序列可以從它們被決定并且產(chǎn)生顯示(即攜帶)表位而不引起補體激活的肽或其它分子。如果表位定位失敗，那么其它技術如mimotope設計(Geysen，H.M.等，1987年，1988年，如上；Jung，G.和Beck-Sickger，A.G.，1992年，如上)可以被用于合成顯示表位的分子，使用例如抗體在它們的療效測定中作為參比物質。特別地，這允許具有三級和四級結構特征的表位的決定和復制，這種特征有可能無法通過表位定位識別。因此，本發(fā)明同樣延伸至hHSP60的片段的用途。產(chǎn)生單克隆抗體的克隆(Harlow，E.和Lane，D.，“使用抗體實驗室手冊，ColdSpring Harbor Laboratory Press，紐約，1998年)可以通過它們與補體激活所需的hHSP60表位(上述)結合的能力，或通過它們在hHSP60存在下引起補體激活的能力而容易被識別，并且本發(fā)明延伸至到這樣的單克隆抗體及其抗原結合片段的用途。類似地，hHSP60可以被分成片段，并且攜帶和顯示hHSP60特異性表位的特異性片段被識別。其它技術(如上面討論的)可以獲得用來識別抗體靶和結合的競爭性抑制劑，并且可以容易地得以應用。
因此根據(jù)本發(fā)明同時提供hHSP60在治療熱激蛋白誘導的補體激活，特別是治療由于動脈粥樣硬化而發(fā)生的血管疾病的患者的藥物的生產(chǎn)中的用途。藥物可以用于健康的保持或恢復，即它可以治愈、緩解、消除或減輕熱激蛋白誘導的補體激活的癥狀，或者它可以預防或減輕熱激蛋白誘導的補體激活的可能性。該藥物可以例如是疫苗。用途可以包括表位或肽的用途，所述表位和肽攜帶被hHSP60顯示而不被HSP60分子族的其它成員顯示的表位。同時提供用于治療熱激蛋白誘導的補體激活的患者的藥物的生產(chǎn)方法，其特征在于hHSP60的使用。
因為hHSP60已經(jīng)被確定是熱激蛋白誘導的補體激活的原因，hHSP60(或如上述討論的其片段)可被用于藥物發(fā)現(xiàn)方法，識別那些能夠防止其引發(fā)補體激活的試劑。因此本發(fā)明同時提供識別抑制hHSP60誘導的補體激活的化合物、物質或試劑的方法，其特征在于hHSP60(或其片段)的使用。同時提供hHSP60(或其片段)在抑制hHSP60誘導的補體激活的化合物、物質或試劑的識別方法中的用途。同時提供本發(fā)明的試驗在藥物發(fā)現(xiàn)方法中的用途，例如篩選組合化學庫確實檢測那些可以抑制hHSP60誘導的補體激活或動脈粥樣硬化或冠心病發(fā)作的化學藥品或藥物。
本發(fā)明將參照附圖從隨后的說明中變得更加明確，它們僅通過實施例的方式顯示傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的檢測的形式。
附圖中

圖1顯示hHSP60的劑量依賴性的補體激活。人HSP60和正常人血清(NHS；實心方塊)或和熱滅活人血清(HIHS；實心圓)一起保溫。與hHSP60結合的C4b的量用抗C4b抗體測定。未涂覆的對照平板和NHS(空心圓)或和HIHS(空心三角)一起保溫。該圖顯示四個平行測定的平均OD值和標準偏差。來自于全部三個重復試驗的一個代表試驗的結果被列出。發(fā)現(xiàn)指示(**)的情況與未涂覆的對照平板相比，C4b的結合有顯著性的增加(斯氏t檢驗，p＜0.01)；圖2顯示無丙種球蛋白血清(AGS)中hHSP60的經(jīng)典途徑激活的缺乏。人HSP60(0.1μg/ml)和NHS或兩種不同的AGS一起保溫。與平板結合的C4b的量用抗C4b抗體測定。未涂覆的孔被用作對照。AGS+IgG代表和抗體(5％熱滅活血清)重組的AGS。來自于全部兩個重復試驗的一個代表試驗的結果被列出。發(fā)現(xiàn)指示(***，p＜0.0001；*，p＜0.05)的情況與未涂覆的對照平板相比，C4b的結合有顯著性的增加(斯氏t檢驗)；圖3顯示了(圖A)抗hHSP60抗體水平和與hHSP60結合的C4b的量之間的相關。在抗hHSP60抗體水平和與hHSP60結合的C4b之間觀察到高顯著性(r＝0.459，p＜0.0001)正相關。圖B顯示在抗牛分枝桿菌HSP65抗體水平和與hHSP60結合的C4b的量之間相關性的缺乏(r＝0.1068，p＝0.554)。通過使用在各平板上測試的8個單獨血清的結果作為標準，實現(xiàn)了在不同平板獲得的結果的歸一化。
圖4顯示通過競爭性ELISA獲得的抗hHSP60和抗牛分枝桿菌HSP65抗體之間的差異。用hHSP60(左圖)或用牛分枝桿菌HSP65(右圖)涂覆ELISA平板，并和患者血清的系列稀釋保溫。IgG型的抗體和平板的結合被進入保溫混合物中(緩沖液被加入到對照樣品中，實心方塊)的5μg/mlhHSP60(空心圓)或HSP65(虛線)阻斷。來自于全部三個重復試驗的一個代表試驗的結果被列出。數(shù)值代表三個平行試驗的平均值和SEM OD值；圖5顯示對因為家族史原因而危險的兒童冠心病易感性預測的研究的結果。Y軸顯示了補體激活指數(shù)。X軸顯示了兩套中值數(shù)據(jù)，包括對照兒童的數(shù)據(jù)(中值0.58，四分位間范圍(interquartile range)0.33-1.07)(左邊的數(shù)據(jù))以及危險兒童的數(shù)據(jù)(中值＝1.27，四分位間范圍0.53-2.33)(右邊的數(shù)據(jù))。用Mann-Whitney檢驗的結果p＝0.0002。
試驗試驗如下面詳細描述進行且結果顯示i) hHSP60能夠通過抗HSP60抗體誘導補體級聯(lián)的激活；ii) 在hHSP60誘導的補體激活和抗HSP60抗體之間存在相關；以及iii)在抗HSP抗體系列中，不和其它HSP60蛋白交叉反應的是hHSP60特異性抗體，其通過與hHSP60相互作用引起補體級聯(lián)的激活。
該結果表明患者血清中的抗hHSP60抗體(即不和其它HSP60蛋白交叉反應的)的水平和因為動脈粥樣硬化引起的冠心病的正相關。
另外的獨立進行的研究表明本發(fā)明的試驗給出在補體激活抗hHSP60抗體和冠心病事件中的強烈相關，第二和第三三分位數(shù)(tertile)的讓步比(odds ratio)為5.24和6.37。
同時用來自其父母或祖父母在45歲前患有心肌梗塞的健康兒童的樣品進行研究。結果表明產(chǎn)生高水平補體激活抗hHSP60抗體的能力是與成年時冠心病發(fā)病的高易感性有關的遺傳性狀，因此是特別有用的幼年診斷。定義術語“抗體”在本文中被用于指免疫球蛋白分子和免疫蛋球白分子的免疫活性部分，即含有抗體結合部位或抗原互補位的分子。這樣的分子也被稱為免疫球蛋白分子的“抗原結合片段”。
抗體分子的實例是完整免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的那些含有抗原互補位的部分，包括本領域已知為Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)的那些部分。
“治療”是被設計用來治愈、緩解、消除或減輕人或動物體的癥狀，或者預防或降低人或動物體感染任何疾病或功能障礙的可能性的治療。實施本發(fā)明的形式此外，固相重組hHSP60能夠激活合并的正常人血清以及冠心病患者血清中的補體系統(tǒng)。由于第一補體成分被Mg2+EGTA阻斷的C4激活和結合抑制，以及具有純合C2缺乏患者的血清中沒有出現(xiàn)C3與hHSP60的結合，因此可以推斷hHSP60通過CP激活人血清中的補體。
CP可以被不同的物質直接激活或用特異性抗體的貢獻，即通過免疫復合物的形成被激活。在hHSP60的情況中，由于在無丙種球蛋白的血清樣品沒有觀察到補體激活，CP的引發(fā)看起來是通過免疫復合物的形成而發(fā)生的。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)表明抗hHSP60的特異性抗體引發(fā)，并且劑量依賴性地促進通過hHSP60進行的補體激活。
此外，抗IgG抗體(類風濕因子)同樣可能影響這種激活。并且，分枝桿菌HSP65同樣被發(fā)現(xiàn)激活CP，但這種激活的程度與抗HSP60或抗HSP65抗體的水平不相關。由于抗HSP65和抗幽門螺桿菌抗體彼此相關(Birnie，D.H.等，1998年，如前所述)，進行了試驗以確定是否抗H.pylori抗體的量和HSP65誘導的補體激活程度相關。發(fā)現(xiàn)與HSP65結合的C4b的量和在CHD患者血清中抗H.pylori抗體水平間有強烈的正相關。另一種對HSP65誘導的CP激活和抗HSP65抗體水平之間缺乏相關性的可能的解釋有可能是抗HSP65抗體的不同的(補體非激活)亞型。
這些發(fā)現(xiàn)表明當暴露于hHSP60與特異性抗體的復合體時，補體系統(tǒng)可能被有效激活。不同的病理癥狀和緊張狀況都可能明顯地增加內皮細胞中hHSP60的表達(Wick，G.等，1995年，Immunol.Today，第16卷第27頁；Xu，Q.和Wick，G.，1996年，Mol.Med.Today，第2卷(9)第372頁)。例如，非毒性的局部缺血再灌注被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生能夠激活人血清中補體系統(tǒng)的人體臍靜脈內皮細胞(Collard，C.D.等，1997年，Circulation，第96卷第326頁)。這一過程的機理還沒有完全被了解。然而，本結果表明在內皮細胞表面hHSP60的過度表達可能是提高培養(yǎng)的內皮細胞補體激活能力的因素之一，特別是在抗HSP65抗體的高滴定度存在時。由于補體激活在動脈粥樣硬化形成的早期和晚期都具有重要的作用，本發(fā)現(xiàn)具有重要的病理學意義。
假定的抗HSP65抗體在冠心病的發(fā)展中的作用被最近的幾個發(fā)現(xiàn)所支持。Xu等(1993年，如前所述)發(fā)現(xiàn)高水平的抗分枝桿菌HSP65抗體與頸動脈粥樣硬化有關。更近地，Hopplicher等(1996年，如前所述)測得114個患有冠心病的患者具有與76個年齡和性別相當?shù)慕】祵φ障啾让黠@升高的抗HSP65滴定度。類似地，Birnie等(1998年，如前所述)驗證了在冠狀動脈粥樣硬化的程度和抗HSP65抗體的滴定度之間的正相關。
抗hHSP60和抗HSP65抗體在它們的抗原識別和補體激活能力之間的差異的驗證非常重要，并且在以前沒有被提出。與健康的受檢者相比，60kDa族的熱激蛋白的抗體在患有幾種疾病的患者體內升高。如果抗卡普拉黃素族不同成員的抗體被平行測量，通常(但不總是(Handley，H.H.等，1996年，Clin.Exp.Immunol.，第103卷第429頁))在它們的量之間發(fā)現(xiàn)強烈的相關。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在HIV患者的血清中抗HSP60和抗HSP65抗體水平之間存在顯著性的相關。
全部256個檸檬酸鹽血漿樣品如下面詳細介紹地進行分析。對每一個取自某病例的樣品，即患有冠心病的患者，從沒有心臟問題跡象的患者中選擇兩個樣品。
·56個樣品與110個對照取自事件發(fā)生前的病例。
·33個樣品與66個對照取自事件發(fā)生后的病例。
所有的樣品均取自中年男性，并且病例和兩個對照樣品是年齡匹配的。取樣后，樣品立即進行離心并在-45℃冷凍，然后在用干冰運輸?shù)組RC單元。血漿然后在-80℃存貯并且僅在用于此評價時解凍。本試驗的實際測試為盲試，直到測試全部完成才開始分析。1.試驗原理將純化的人重組HSP60蛋白涂覆在微滴孔表面。然后施加樣品。抗hHSP60抗體和孔中的抗原復合。未結合的物質被洗去，加入過氧化物酶綴合的抗C4b。如果抗體已經(jīng)結合并激活補體級聯(lián)，C4b綴合物將與共價結合在抗原上的C4b片段結合。未結合的物質再次被洗去。加入底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)后，僅在酶存在的那些孔中有顏色出現(xiàn)，表明人C4b的存在。然后通過加入硫酸終止酶促反應并在450nm測量吸光度。2.材料
HSP60(www.stressneg.com)是從人早幼粒細胞白血病(HL-60)的cDNA文庫克隆的重組hHSP60。平板涂覆將50μl在0.05M，pH為9.6的碳酸鹽緩沖液中的1μg/mlhHSP60加入到每個孔中，并在4℃保溫過夜。然后在將平板阻斷之前用200μl的1％明膠、5％蔗糖、0.15MnaCl、0.05M的Tris以及0.1％吐溫20洗滌，并在液體除去前在RT(室溫)保溫1小時，平板在37℃干燥過夜。陰性對照0.05Mtris、0.15MnaCl、5％明膠，pH7.5低陽性對照低陽性對照包括在0.05M Tris、0.15M NaCl、5％明膠，pH7.5中的約1/500的稀釋兔抗hHSP60。綴合物在穩(wěn)定酶綴合物稀釋劑中的約1/500稀釋的C4b蛋白的異雙功能HRP綴合物。低陽性對照還含有約1/60000稀釋的山羊抗兔HSP綴合物。洗滌緩沖液0.05M Tris、0.15M NaCl、0.1％吐溫20，pH7.5。終止溶液0.2％硫酸。測定試劑盒
試劑制備洗滌緩沖液使用1份洗滌緩沖液濃縮物和19份蒸餾水稀釋濃洗滌緩沖液。為每8個孔條(well strip)，通過加入4ml濃緩沖液到76ml蒸餾水中制備80ml稀洗滌緩沖液。3.測定步驟1.在開始測定前使所有的試劑盒成分和測試樣品達到室溫(20℃到25℃)。
2.試劑盒對照應與每批樣品一起展開以檢驗試驗性能。試劑盒對照應該平行兩份展開。為包括試劑盒對照在內的要測試的樣品數(shù)目選擇足夠的微孔條。將條放置在框上，并除去保護塑料密封膜。在提供的EIA數(shù)據(jù)記錄紙上記錄試劑盒對照和測試樣品的位置。未使用的條應該被存貯在帶有干燥劑的可重新密封的箔袋中，其在置于2℃到8℃存貯前被替換。
3.不稀釋對照或測試樣品，將50μl樣品或對照血清(試劑2、3)分散到適當?shù)目字小φ諔撟詈蠹尤胍源_保結果的精確解釋。輕輕搖動5秒鐘。用提供的平板蓋蓋上平板，然后在RT 20℃到30℃將其放在吸水紙上20分鐘。
4.在保溫周期結束時，移去平板，留下吸水紙，然后如下面描述洗滌平板。
5.如在試劑制備部分描述的那樣稀釋洗滌緩沖液(試劑5)。用稀洗滌緩沖液手動或用自動平板洗滌器洗滌平板三次。對于機器洗滌，確保每個孔分散300μl且將適當?shù)南緞┘尤氲綇U液收集瓶中。洗滌完畢，通過在吸水紙上輕敲倒置的平板除去過量液體。
對于手動洗滌，通過仔細地將內容物清空到含有適當?shù)南緞┑娜萜髦邢礈炜?，然后將孔置于廢液容器中。再重復該過程兩次。洗滌后，通過在吸水紙上輕敲倒置的平板除去過量液體。必須記住對試驗用血清的潛在生物危害采取適當?shù)念A防措施。這些預防措施必須貼在實驗室的公共區(qū)域。洗滌步驟很關鍵，因為不充分的洗滌會導致差的精確度和錯誤升高的吸光度。
6.在每個孔中分散100μl綴合物(試劑4)。在將蓋放到平板上并放回保溫器之前，輕輕地搖動平板5秒鐘，確保平板被放置在吸水紙的頂部。在RT 20℃到30℃保溫60分鐘。
7.在保溫周期結束時，重復步驟4以及步驟5中描述的洗滌步驟。
8.在每個孔中分散100μl穩(wěn)定化的TMB底物(試劑7)。在將蓋放回到平板并在室溫(20℃到30℃)置于黑暗中15分鐘之前，輕輕地晃動平板5秒鐘。
9.通過加入100μl終止液(試劑8)到每個孔中終止反應。這將導致在含有酶的孔中顏色從藍到黃的變化，該現(xiàn)象表明補體激活的存在在。在空氣將平板讀數(shù)器清除。在終止反應后立即測定每個孔在450nm的吸光度。4.結果的計算和解釋對每一個試驗和對照，測定孔中獲得的OD。試驗有效性對有效的試驗結果，低陽性對照的平均OD值應該大于0.3。
顯示陽性結果的OD水平，即補體激活抗hHSP60抗體的顯著水平，可以預期在樣品群之間變化，例如在成年和幼年群體之間。例如，在一個群體中被認為是陽性的結果可能在另一群體中并不重要。因此，對被研究的群體建立了標準曲線，該曲線將OD與實際危險相關并定義了結果被認為是陽性的截斷值。
為了在各個試驗間進行比較，必須計算補體激活指數(shù)(CAI)CAI＝樣品的OD/低陽性對照的平均OD低陽性對照的平均OD的使用允許不同系列試驗，例如使用不同的設備之間的結果的標準化。5.結果在采集原始數(shù)據(jù)后進行下列統(tǒng)計分析。在病例和對照中的補體激活指數(shù)結果如表3.1所示。將外露層(outlier)從對照中除去。條件對數(shù)回歸分析優(yōu)勢比(OR)為在log CAI中的1 sd增加(0.94)。
這等價于CAI的2.6倍增長。
數(shù)據(jù)如表4所示。事件發(fā)生的時間56個病例在他們的事件發(fā)生前取樣。在33個病例中，在事件發(fā)生后取樣。
與事件發(fā)生的時間有明顯的相互影響(p＝0.007)。在事件發(fā)生取樣的病例中，CAI顯著性地增加，而這種關系在事件發(fā)生后取樣的病例中沒有被發(fā)現(xiàn)。事件發(fā)生前的樣品事件發(fā)生前所取樣品的數(shù)據(jù)如表5所示。事件發(fā)生后的樣品事件發(fā)生后所取樣品的數(shù)據(jù)如表6所示。
在那些事件發(fā)生前取樣的病例中，沒有證據(jù)表明該關系根據(jù)事件的近似性而變化(p＝0.65)。6.等分分析通過等分進行的CAI分析表明該關系是非線性的，僅在最低等分中危險降低。CAI等分的截斷點為0.27和0.6。同樣存在與事件發(fā)生時間的顯著性相互影響(p＝0.007)。
所有的等分分析中的結果如表7所示。事件發(fā)生前的樣品的等分結果如表8所示，而事件發(fā)生后的樣品的等分結果如表9所示。
在補體激活指數(shù)嵌套的(nested)病例-對照研究中的單變關系如表10所示。補體激活指數(shù)對事件發(fā)生前所取的樣品，補體激活指數(shù)的等分和病例/對照狀態(tài)之間的關系在對吸煙狀況、心收縮壓、膽固醇、甘油三酸酯、纖維蛋白原以及體重指數(shù)的調整后依然保持(P＝0.003)。
相對于等分1，等分2和等分3的讓步比分別為5.24(1.50-18.26)和6.37(1.80-22.58)。
全部模型如表11所示。該分析使用155個觀察-53個病例和102個匹配的對照。讓步比在除吸煙和抗體指數(shù)的變量中提高了1 sd。甘油三酸酯和纖維蛋白原用對數(shù)變換。
在模型中單獨使用補體激活指數(shù)的等分，ROC(接受器工作特征)曲線下的面積為0.65。7.結論數(shù)據(jù)表明由本發(fā)明的試驗測定的補體激活指數(shù)(CAI)與患冠心病的危險強烈相關。這如表8所示。
表10表明膽固醇、吸煙、纖維蛋白原和心收縮壓同樣與這些男性的危險相關。
表11是對這些危險因素的獨立關系的強度的多變量分析。從該表中的p值和95％置信區(qū)間可以看到僅該試驗與危險獨立相關。與具有分布中低部三分之一水平的男性相比，中部三分之一的男性的危險為5.2倍，而高部三分之一的男性的危險為6.4倍。
在本評價中，所使用的試驗試劑盒因此被認為對冠心病危險具有高預測性。
分析了總共117個樣品。
危險兒童-64個年齡在10到16歲之間的健康兒童，他們的父母或祖父母中至少有一個在45歲以前患有心肌梗塞。
對照-53個年齡匹配的健康兒童，他們在選擇性外科手術前或受到外傷后被隨機選擇。這些對照并不完全充分，因為他們中僅有一部分被問及家族史，因此不能排除這組中同樣含有危險兒童。因此預期當危險兒童與正確的對照，即那些被證明陰性冠心病家族史的兒童相比時，結果(下面)中顯示的差異將更高。
血清樣品在測試前在-70℃保存。1.試驗原理—如前所詳述的。2.材料—如前所詳述的。3.試驗過程—如前所詳述的。4.結果的計算和解釋—如前所詳述的。5.結果在采集原始數(shù)據(jù)后，進行下列統(tǒng)計分析。
危險兒童的讓步比(OR)通過使用在對照組中測定的兩個單獨的75％和95％的截斷限計算。這給出分別使用補體激活指數(shù)(CAI)1.07和2.0的截斷值。
數(shù)據(jù)在表12和13以及圖5中給出。
該結果表明危險組的兒童與對照組的兒童相比給出顯著性高的結果。7.結論數(shù)據(jù)表明在本評價中，產(chǎn)生高水平補體激活抗hHSP60抗體的能力是與在成年時冠心病發(fā)病的易感性升高相關的遺傳性狀。
這意味著在本發(fā)明的試驗中的高水平結果對那些在其它方面完全健康的幼年患者患這種疾病的易感性是指示性的。
權利要求
1.用于人體的治療或診斷方法的hHSP60或其免疫原性片段。
2.熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢的診斷試驗方法，所述方法包括以下步驟i) 將患者樣品和hHSP60接觸；ii) 檢測任何補體激活；以及iii)將檢測步驟(ii)的結果和熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢相關。
3.熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢的診斷試驗方法，所述方法包括以下步驟i) 從患者取樣品；ii) 檢測步驟(i)的樣品中任何對hHSP60特異性的單一的抗體；以及iii)將檢測步驟(ii)的結果和熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢相關。
4.根據(jù)權利要求3的診斷試驗方法，其中檢測步驟(ii)包括以下步驟i) 將樣品和HSP60蛋白質族的非hHSP60成員接觸；ii) 將從步驟(i)得到的樣品和hHSP60接觸；以及iii)檢測任何抗體-hHSP60結合反應。
5.根據(jù)權利要求3的診斷試驗方法，其中檢測步驟(ii)包括以下步驟i) 將樣品和顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原接觸；以及ii) 檢測任何抗體-抗原結合反應。
6.根據(jù)權利要求4或5中的任一權利要求的診斷試驗方法，其中通過任何補體激活的檢測檢測抗體-hHSP60結合反應。
7.根據(jù)權利要求2或6中的任一權利要求的診斷試驗方法，其中通過C4b的結合檢測補體激活。
8.hHSP60在用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。
9.hHSP60和HSP60蛋白質族的非hHSP60成員在用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。
10.顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原在用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試劑的生產(chǎn)中的用途。
11.用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試驗試劑盒，其特征在于它包含hHSP60或顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原。
12.用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試驗試劑盒，其特征在于它包含hHSP60和HSP60蛋白質族的非hHSP60成員。
13.用于傾向于熱激蛋白誘導的補體激活的患者的診斷試驗試劑盒，其特征在于它包含顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原。
14.hHSP60或顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原在用于治療熱激蛋白誘導的補體激活的藥物的生產(chǎn)中的用途。
15.根據(jù)權利要求14的hHSP60或顯示對hHSP60單一的表位，而不顯示任何共享HSP60表位的抗原的用途，其中藥物是疫苗。
16.用于治療熱激蛋白誘導的補體激活的藥物的生產(chǎn)方法，其特征在于hHSP的使用。
17.根據(jù)權利要求2至7中的任一權利要求的診斷試驗方法，其是人體的診斷方法。
18.根據(jù)權利要求2至17中的任一權利要求的診斷試驗方法、用途或診斷試驗試劑盒，其中熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢是與動脈粥樣硬化相關的疾病的趨勢。
19.根據(jù)權利要求2至17中的任一權利要求的診斷試驗方法、用途或診斷試驗試劑盒，其中熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢是心肌疾病的趨勢。
20.根據(jù)權利要求2至17中的任一權利要求的診斷試驗方法、用途或診斷試驗試劑盒，其中熱激蛋白誘導的補體激活的趨勢是冠心病的趨勢。
21.hHSP60在識別抑制hHSP60誘導的補體激活的化合物或物質或試劑的方法中的用途。
22.識別抑制hHSP60誘導的補體激活的化合物或物質或試劑的方法，其特征在于hHSP的使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人HSP60(熱激蛋白60)在人的治療或診斷方法中的新用途,更特別地,本發(fā)明涉及診斷試驗方法、診斷試劑的生產(chǎn)以及用于因動脈粥樣硬化而患有血管疾病的患者的診斷試驗試劑盒,這些患者傾向于熱激蛋白誘導的補體激活,例如,患有心肌疾病如冠心病。
文檔編號A61K39/00GK1351713SQ00807857
公開日2002年5月29日 申請日期2000年5月22日 優(yōu)先權日1999年5月21日
發(fā)明者馬哈維爾·辛格, 佐爾坦·普羅哈斯卡, 捷爾吉·富斯特, 拉斯洛·羅米奇 申請人:澤梅爾魏斯醫(yī)科大學, 馬哈維爾·辛格