專利名稱：用于治療銀屑病的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)的分支和皮膚病學(xué)，具體地涉及從人類胎盤起始獲得的具有調(diào)節(jié)皮膚再生速度活性并由此可以用于銀屑病治療的組合物，以及獲得所述組合物的方法。
現(xiàn)有技術(shù)銀屑病并不是一種最近才發(fā)現(xiàn)的疾病。它曾經(jīng)被分類為希臘麻瘋病，而且似乎曾經(jīng)存在于征服前的墨西哥(Daune，M.；FSCHS，P.P.LaRecherche(1980)，11116-1066；國(guó)際皮膚病學(xué)雜志(International Journal of Dermatology)，第36卷，第4期，1977年4月)。所有地域和所有種族均受到該疾病的侵襲，并且該疾病可以連續(xù)幾代在家族中出現(xiàn)(國(guó)際皮膚病學(xué)雜志，第36卷，第4期，1977年4月；Lerner，A.B.等，Invest.Dermatol.1975，20(2)299-314，1953)。
該疾病的開始常與皮膚的表面損傷例如燒傷和抓傷有關(guān)。其它因素例如低溫度、感染、壓力或藥物會(huì)加速或惡化銀屑病。
物理外傷可能引起血管中的血管生成因子改變、皮膚真菌病(epidermatopoyesis)、嗜中性細(xì)胞chimiotasis和所謂的組織銀屑病反應(yīng)(Moroni，P.等，Derm.Beruf.Umwelt，36(5)，第163-164頁(yè)，1988)。
已經(jīng)報(bào)道氣候因素例如寒冷會(huì)對(duì)銀屑病產(chǎn)生不利影響。在進(jìn)行的一些研究中發(fā)現(xiàn)，在氣候干燥而且濕度低的非洲，銀屑病的頻率更大(Faber，E.N.等，自然流行病學(xué)，歷史和遺傳銀屑病(NaturalEpidemiology.History and genetic psoriasis)，第二版，第231頁(yè)，Marcel Depper編，紐約，1991)。
已非常清楚地知道壓力能引發(fā)或惡化銀屑病，但是其機(jī)制仍不清楚，然而基于精神神經(jīng)免疫學(xué)(psiconeuroimmunology)的研究可以對(duì)此進(jìn)行解釋(Moroni P.等，Derm.Beruf.Umwelt，36(5)，第163-164頁(yè)，1988)。
專門的治療會(huì)導(dǎo)致病變消失，但幾乎一定會(huì)再次復(fù)發(fā)，而且在每次治療中存在逐漸喪失治療效果的趨勢(shì)(Lerner，A.B.等，Invest.Dermatol.1953，20(2)299-314，1953；Roenigk，H.H.Jr.等，Arch.Dermatol.113(12)1667-1670，1977；Frappazz，A.，等，Env.J.Dermatol.1993，3第351-354頁(yè)；Mozzanica，N.，等，Acta Dermatol.Venereol.1994，186第171-172頁(yè)；Ortonne，J.P.New Dermaytol.1994，13第746-751頁(yè)；Panizonni R.Schweizerische Rundschav fur Medizin Praxis 1995，84第649-653頁(yè)；Kirsner，R.S.Am.Fam.Phys.1995，52第237-240頁(yè))。
已知目前本領(lǐng)域中有多種制劑例如石蠟或乙醇溶液中的松脂被用于銀屑病的治療。
從上個(gè)世紀(jì)起antialine就被用于該疾病的治療，而且在其中一直占據(jù)著重要位置，但antialine的缺點(diǎn)是會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生刺激。
1925年引入了紫外輻射，并一直被單獨(dú)地或聯(lián)合其它藥物治療一起使用，但這種治療也有其不利的副作用。
盡管補(bǔ)骨脂素已被證實(shí)有毒性，但在過去也曾被用于該疾病的治療。
一般地，局部施用皮質(zhì)類固醇在某些特定病例中是有用的，但反彈趨勢(shì)限制了它的使用。
近來，已開始使用視黃醛衍生物、一些抗代謝物如氨甲蝶呤(metotrexate)、硫代鳥嘌呤(thioguamne)和其它物質(zhì)，但收效甚微。
從第3世紀(jì)起，有報(bào)道在中國(guó)采用胎盤作為生物學(xué)刺激劑。
1945年起，蘇聯(lián)研究人員Filatov開發(fā)并加強(qiáng)了一種從冷凍保存的動(dòng)物組織和植物中分離具有治療性質(zhì)的物質(zhì)的方法，他將該方法命名為組織療法。在該方法中，胎盤占據(jù)了一個(gè)重要位置(Filatov，V.編，Medicina Medguis.URSS，1945)。
1963年，Orechkin基于在300個(gè)皮膚感染患者上進(jìn)行的研究，得出結(jié)論在組織治療的作用下，38.5％的病例有或多或少的明顯改善而其中25％可以獲得治愈(Orechkin，獻(xiàn)給V.Filatov的組織治療方法第30周年紀(jì)念日的科學(xué)大會(huì)Material E.，Kiev12，1963)。
過去這些生物來源的刺激物對(duì)銀屑病的治療作用的機(jī)制被忽視了。Makarov和Romani指出在這些生物學(xué)刺激劑的作用下腎上腺皮質(zhì)激素類的形成獲得加強(qiáng)，而且依據(jù)使用大鼠爪獲得的實(shí)驗(yàn)理論他們闡明了這些刺激劑還具有抗炎性作用，由此能夠表現(xiàn)出與這些激素相似的作用(Makarov和Romani，Comp.Rend.Soc.Biol.1951，19664-626)。
用于該疾病治療的療法根據(jù)疾病的定位、嚴(yán)重性、持續(xù)時(shí)間、以前的治療情況和患者的年齡而有不同。
在用于對(duì)抗銀屑病的許多藥物來源中，胎盤的組織治療是最有效的之一，然而也是了解較少的一種。
發(fā)明公開本發(fā)明涉及從人類胎盤獲得的提取物，該提取物被摻入水溶性凝膠中，構(gòu)成已證明對(duì)銀屑病的治療有效的藥物。
盡管這些刺激物優(yōu)選采用腸胃外途徑施用，但在本發(fā)明中含有所述有效成分的該水溶性凝膠可以采用局部施用。
因此，本發(fā)明涉及含有從人胎盤獲得的不飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸的混合物作為有效成分的水溶性凝膠，其中當(dāng)該有效成分在施用部位被皮膚吸收后，它會(huì)參與調(diào)節(jié)表皮再生速度并產(chǎn)生抗銀屑病作用。
為了獲得對(duì)于銀屑病治療有用的該有效成分，進(jìn)行以下操作-從冷凍胎盤開始，首先通過洗滌將羊膜和臍帶分離開，用大量水再次洗滌，分離出胎盤的絨毛葉；-將絨毛葉團(tuán)塊粉碎成直徑大約12mm的顆粒；
-通過在水中攪動(dòng)和之后以紗布過濾對(duì)該固體進(jìn)行再次洗滌該固體，然后再次粉碎直到顆粒大小達(dá)到直徑2-6mm；-獲得的團(tuán)塊在每個(gè)絨毛葉團(tuán)塊1-4倍體積的乙醇中攪拌1-3小時(shí)，之后通過紗布過濾；-將得到的液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，并重新溶解在42比例的氯仿∶甲醇混合物中，再浸泡24小時(shí)；-2000rpm離心獲得的產(chǎn)物，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，最后重新溶解在1∶1比例的乙醇中。
為了將該有效成分制備成水溶性凝膠制劑，將獲得的25.5-55.8g人類胎盤提取物溶解在由35-50g純凈水、0.10-0.30g羥苯甲酸甲酯和0.01-0.05羥苯甲酸丙酯組成的水溶性賦形劑中，其中在加入該有效成分之前，先向該賦形劑中攪拌加入2-5g羧甲基纖維素和5-20g甘油。
通過確定人類胎盤提取物PE-100的組成，發(fā)現(xiàn)它基本上是由不飽和脂肪酸如棕櫚油酸和油酸，以及多不飽和脂肪酸如亞油酸、花生四烯酸(arachidonic acid)和二十碳二烯酸(eicosadienoic acid)組成的。
這些多不飽和脂肪酸與該疾病的治療密切相關(guān)，它們可以抑制表皮細(xì)胞的過度繁殖。它們被治療的患者接受證實(shí)，可以將該組合物廣泛地用于所提出的應(yīng)用中，因?yàn)槠駷橹惯€沒有報(bào)道過其它可以治愈銀屑病而又與本發(fā)明的組合物一樣無害的產(chǎn)品。
根據(jù)從患者獲得的臨床報(bào)告，該藥物不僅沒有局部毒副作用而且也沒有毒副作用的征兆。
為了確定該藥物的有效性，進(jìn)行開放非隨機(jī)研究，用從該胎盤提取物獲得的該水溶性凝膠治療大量銀屑病患者。
組織治療胎盤中心(Histotherapy Placental Center)控制了其中一組實(shí)驗(yàn)，其中評(píng)價(jià)了總共400名患者。
用該藥物進(jìn)行2年的治療，觀察到在該階段期間有78％的治療患者出現(xiàn)令人滿意的改善。
另一臨床研究是采用醫(yī)院內(nèi)的26名確診銀屑病患者進(jìn)行的。在治療評(píng)估中有84.6％的患者表現(xiàn)出完全清除了損傷，該實(shí)驗(yàn)獲得了滿意的結(jié)果。
1990年，研究者開始接觸受到前蘇聯(lián)(USSR)切爾諾貝利發(fā)生的核事故影響的古巴兒童，這些兒童幾乎全部患有銀屑病。對(duì)其中56名患者進(jìn)行了研究，這些患者對(duì)于其它藥物治療不起反應(yīng)，而且正如文獻(xiàn)中所描述的，家族病例一般是難于治療的。給這些患者進(jìn)行3個(gè)月的治療，治療結(jié)束時(shí)這些治療患者的90％以上有臨床改善。
同樣地，給在其它醫(yī)院治療的100名銀屑病患者施用本發(fā)明的產(chǎn)品?？偨Y(jié)為期6年的試驗(yàn)結(jié)果，78％的病例該疾病減輕并且沒有出現(xiàn)繼發(fā)反應(yīng)或癥狀，而其中50％沒有發(fā)生疾病復(fù)發(fā)。
實(shí)施例實(shí)施例1提取物PE-100的加工過程的描述用大量的水清洗化凍的胎盤，除去臍帶和羊膜，僅保留絨毛葉。在粉碎機(jī)中粉碎絨毛葉團(tuán)塊直到獲得直徑8-12mm的顆粒。
利用滾動(dòng)槽將該固體物移動(dòng)到反應(yīng)器區(qū)域，然后加至1600L反應(yīng)器，向該固體中加入2-4體積的未凈化水；攪拌2-8分鐘，采用紗布過濾，之后粉碎直到獲得直徑2-6mm大小的顆粒。然后，稱重該固體物，并在該1600L反應(yīng)器中裝入乙醇(每kg絨毛葉1-4倍體積的乙醇)。攪拌該混合物1-3小時(shí)，然后將其通過紗布。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)產(chǎn)生的液體，并將固體物重新溶解在4∶2比例的氯仿∶甲醇混合物中，浸泡24個(gè)小時(shí)。之后2000rpm離心，將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，然后重新溶解在1∶1比例的乙醇中，以此方法獲得的有效成分命名為胎盤提取物-100(PE-100)。
當(dāng)該P(yáng)E-100獲得化學(xué)、生物學(xué)和微生物學(xué)控制實(shí)驗(yàn)室的批準(zhǔn)后，將其用于制備所述水溶性凝膠。實(shí)施例2制備含有人類胎盤提取物的水溶性凝膠利用1巴真空將用于該制備的純凈水裝入反應(yīng)器Olsa中。
溫?zé)岵嚢枇u苯甲酸甲酯和羥苯甲酸丙酯直到它們?nèi)芙狻Ｔ谠摮绦蜷_始之前，將羧甲基纖維素和甘油一起混合1-3小時(shí)，以獲得恰當(dāng)?shù)某吻?。?dāng)所述溶液冷卻至30-60℃后，加入該羧甲基纖維素與甘油，保持持續(xù)的攪拌，之后在輕柔攪拌下加入PE-100直到形成均一凝膠，取樣以控制該過程。一旦在技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行過了檢查，取一些樣品進(jìn)行化學(xué)、生物學(xué)和微生物學(xué)控制檢查，以便確定該批產(chǎn)品的質(zhì)量。實(shí)施例3通過局部使用將含有人類胎盤提取物的凝膠用于銀屑病治療實(shí)施例2中獲得的水溶性凝膠作為局部施用藥物用于100名銀屑病患者，這些患者均來自Havana市綜合醫(yī)院“Calixto Garcia”的皮膚病科。
用手指將該凝膠局部施用在銀屑病傷口上并抹開形成一薄層，但不要搓揉。
每隔8小時(shí)施用一次，其中一次施用應(yīng)伴隨有之前和之后的30分鐘紅外線照射。
在2年的試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，結(jié)果有78％的病例表現(xiàn)出該疾病的減輕，并且沒有出現(xiàn)局部或全身副反應(yīng)，而50％未發(fā)生疾病復(fù)發(fā)。
從本發(fā)明組合物治療的患者獲得的結(jié)果的一個(gè)例子顯示在

圖1中。實(shí)施例4皮膚刺激研究該試驗(yàn)包括持續(xù)90天每天給Sprague Dawley大鼠(SPF)皮膚施用抗銀屑病凝膠，目的是評(píng)價(jià)使用該物質(zhì)治療的危險(xiǎn)性和/或益處。
該試驗(yàn)完成后，考慮到所獲得的病理學(xué)結(jié)果，尤其是身體重量和器官重量的比較評(píng)價(jià)結(jié)果和它們與絕對(duì)重量的關(guān)系，以及形態(tài)學(xué)上的改變(宏觀和微觀)，我們得出結(jié)論使用的該制劑中測(cè)試物質(zhì)引起的直接作用不產(chǎn)生損傷，而且在剃光的皮膚上進(jìn)行相同重復(fù)施用也是無害的。實(shí)施例5研究在使用了該人類胎盤提取物的水溶性凝膠后銀屑病組織塊上觀察到的組織學(xué)改變?cè)诨颊呙咳站植渴┯迷撊祟愄ケP凝膠之前和之后三個(gè)月，對(duì)受到銀屑病損傷的不同身體區(qū)域中的活檢組織進(jìn)行這些研究，目的是觀察引起的組織學(xué)改變。
測(cè)微計(jì)測(cè)量的乳頭間上皮嵴的高度值和整個(gè)大小的表皮樣品的角質(zhì)層厚度值作為疾病減輕指數(shù)。
對(duì)組織塊不僅進(jìn)行經(jīng)典的蘇木精和伊紅雙染色，也進(jìn)行了氮鳥嘌呤分析。
利用計(jì)算機(jī)程序?qū)?shù)字資料進(jìn)行平均值比較的t-Student檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
所獲結(jié)果顯示，在8個(gè)研究病例中角質(zhì)層和所述嵴的相應(yīng)平均值均有顯著降低，這證實(shí)了該治療在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是有效的。
僅有兩名患者沒有表現(xiàn)出病情的改善，觀察到在組織學(xué)結(jié)果和他們的臨床拉丁方試驗(yàn)(clinical square)的評(píng)價(jià)之間相符。實(shí)施例6利用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)不同的抗銀屑病藥物進(jìn)行的藥理學(xué)評(píng)價(jià)根據(jù)Spaerman和Jarret的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?抗銀屑病藥物的藥理學(xué)分析，Br.J.Dermatology，92581，1975)在小鼠株系上進(jìn)行局部施用，以評(píng)價(jià)這些物質(zhì)的抗銀屑病活性。
如果這些物質(zhì)有效的話，應(yīng)顯著減少這些動(dòng)物的表皮解剖結(jié)構(gòu)。
為了該測(cè)試，使用了35只重20-25g患有白化病的雄性小鼠，分成7組，每組5只動(dòng)物，將這些組命名為A、B、C、D、E、F和G。
A組未用任何物質(zhì)處理，作為對(duì)照和待研究的每種物質(zhì)進(jìn)行比較。剩余組按以下方式來處理B組地奈德藥膏C組Tegrin藥膏D組人類胎盤提取物凝膠
E組倍他米松藥膏F組維生素A油G組松脂藥膏。
操作者用帶著橡膠套管的手指在小鼠尾近末端1cm開始至延長(zhǎng)2.5cm的整個(gè)外部局部施用所有這些物質(zhì)。
除了對(duì)照沒有接收任何治療外，對(duì)于所有的組，局部治療的持續(xù)時(shí)間均為21天。
該時(shí)間后，將動(dòng)物處死，沿尾表面縱向切割皮膚并立即向前延伸，取下覆蓋3cm長(zhǎng)尾部的皮膚段，并進(jìn)行相應(yīng)的組織學(xué)研究。
將該組織樣品固定在70％乙醇中，然后包埋在石蠟塊中，矢向切成7微米厚的切片，然后用蘇木精-伊紅常規(guī)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行染色。
用目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量樣品的表皮厚度。沿每條線隨機(jī)選擇10個(gè)不同的區(qū)域進(jìn)行10次測(cè)量，以便對(duì)于每種處理類型和對(duì)照獲得50個(gè)測(cè)量值。
根據(jù)該研究獲得的結(jié)果，證實(shí)通常用于銀屑病治療的4種物質(zhì)(B、C、E和G)相對(duì)未經(jīng)任何處理的對(duì)照組而言顯著減少小鼠尾的表皮厚度。
相反，證實(shí)最后可能用于銀屑病治療的維生素A會(huì)以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著方式增加表皮厚度，從而在此意義上可能具有毒性作用。
綜合起來，還證明本發(fā)明的目的胎盤提取物凝膠和前面的物質(zhì)一樣顯著降低該小鼠系的表皮厚度，這使得該制劑可用作治療該疾病的治療劑。
該研究中獲得的結(jié)果顯示在圖2中。實(shí)施例7評(píng)價(jià)人類胎盤凝膠的抗銀屑病作用使用基于羧甲基纖維素、丙二醇和蒸餾水并加入了人類胎盤乙醇提取物的水溶性凝膠，作為局部施用藥物用于26名銀屑病患者，以評(píng)價(jià)其抗銀屑病的作用。總結(jié)2年后該試驗(yàn)的結(jié)果，在22名患者(84.6％)中皮膚損傷減輕，在3名患者(11.5％)中有明顯改善，而一名患者(3.8％)損傷沒有變化。
另一方面，沒有觀察到使用該藥物導(dǎo)致不良反應(yīng)。實(shí)施例8使用抗銀屑病凝膠對(duì)切爾諾貝利的兒童進(jìn)行臨床和組織學(xué)研究為了評(píng)價(jià)本發(fā)明制劑的抗銀屑病作用，將該凝膠作為局部藥物施用于切爾諾貝利核事故后感染該病的56名銀屑病患者。
在受到持續(xù)3個(gè)月治療的銀屑病患者中評(píng)價(jià)該治療的結(jié)果?？偨Y(jié)該治療，發(fā)現(xiàn)該抗銀屑病凝膠具有有效性，在90％以上的患者中實(shí)現(xiàn)了臨床和組織學(xué)改善，而在所有的病例中均沒有報(bào)道有不良副作用。實(shí)施例9在組織治療胎盤中心診所中評(píng)價(jià)本發(fā)明制劑的用途使用基于羧甲基纖維素、丙二醇和蒸餾水的水溶性凝膠，加上具有生物刺激物性質(zhì)的人類胎盤乙醇提取物，作為局部施用藥物用于400名來自組織治療胎盤中心疹所皮膚病科的銀屑病患者，以評(píng)價(jià)其抗銀屑病的作用。
一般目的是了解從人類胎盤加工得到的該凝膠給銀屑病患者局部施用的治療有效性。具體目的是確定治療患者的臨床改善，以及該產(chǎn)品的使用是否可能存在不良反應(yīng)。
2年結(jié)束時(shí)總結(jié)該研究，在78％的患者中實(shí)現(xiàn)了皮膚損傷的減輕，而且觀察到使用該藥物沒有引起不良反應(yīng)。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了大范圍銀屑病損傷患者的改善，(A)是局部施用該胎盤提取物之前，(B)是施用三個(gè)月之后。圖2顯示了根據(jù)Spaerman和Jarret的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诖u(píng)價(jià)物質(zhì)的抗銀屑病活性的測(cè)量中所獲得的結(jié)果。
在命名為A、B、C、D、E、F和G的7組動(dòng)物中評(píng)價(jià)這些物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的治療作用。A組未用任何物質(zhì)處理(安慰劑)，剩余組按以下方式來處理B組地奈德藥膏C組Tegrin藥膏D組人類胎盤提取物凝膠E組倍他米松藥膏F組維生素A油G組松脂藥膏。
權(quán)利要求
1.用于治療銀屑病的組合物，為了應(yīng)用，其含有來自人類胎盤的乙醇提取物作為有效成分，并含有適當(dāng)?shù)馁x形劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1和2的組合物，其中該來自人類胎盤的乙醇提取物基本上由不飽和脂肪酸例如棕櫚油酸和油酸，以及多不飽和脂肪酸例如亞油酸、花生四烯酸和二十碳二烯酸組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至3的組合物，其中對(duì)于每100g組合物，在水溶性賦形劑中含有大約59m1該乙醇提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至4的組合物，其中它是水溶性凝膠。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)分支和皮膚病學(xué)領(lǐng)域,更具體地涉及從人類胎盤獲得的表現(xiàn)出調(diào)節(jié)皮膚再生活性并因此可以用于銀屑病治療的組合物。本發(fā)明還涉及制備所述組合物的方法。本發(fā)明的技術(shù)目的是提供獲自人類胎盤的一種用于銀屑病治療的天然來源產(chǎn)物的新制劑,該制劑無毒副作用并且不會(huì)引起疾病復(fù)發(fā)。正如在所獲制劑的藥理學(xué)分析中顯示的,該制劑調(diào)節(jié)表皮的再生速度,而且正如所進(jìn)行的毒理學(xué)、遺傳毒性和臨床試驗(yàn)顯示的,該制劑無嚴(yán)重副作用。所獲產(chǎn)物具有水溶性膠體形式,并通過施用區(qū)域中的皮膚吸收作用于表皮。
文檔編號(hào)A61P17/06GK1347324SQ00805436
公開日2002年5月1日 申請(qǐng)日期2000年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月22日
發(fā)明者C·M·米雅里斯曹 申請(qǐng)人:胎盤組織治療中心