專利名稱：油佐劑疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油佐劑疫苗。更具體地說，本發(fā)明涉及作為制劑在佐劑作用和穩(wěn)定性方面優(yōu)越的W/O/W(水/油/水)型油佐劑疫苗。
長期以來都知道油佐劑疫苗可以有效地增強(qiáng)免疫性。尤其是弗氏佐劑，當(dāng)使用滅活抗原時表現(xiàn)出特別優(yōu)越的免疫加強(qiáng)作用，是一種動物試驗中廣泛使用的有代表性的佐劑。但是由于這種佐劑也引起強(qiáng)副作用如嚴(yán)重的膿腫和肉芽腫，它僅在試驗室中使用。
因此，已經(jīng)做出很多努力以降低這類副作用以便在一般的應(yīng)用中使用油佐劑。油佐劑有各種制劑類型，諸如W/O油型(如弗氏佐劑)、O/W型(安全性優(yōu)越)、復(fù)合的W/O/W型等。
例如，JP-B-6-81731講述了一種W/O型油佐劑，含有作為表面活性劑的無水甘露糖醇油酸酯和作為油組分的石蠟油，WO 91/00107(以Kohyo No.4-506521在PCT公開的日本專利申請)講述了低粘度W/O型油佐劑，含有可代謝的油如植物油和不可代謝的油如礦物油結(jié)合在一起作為油組分。
此外，WO 90/14837公開了一種含有亞微米油滴乳劑的作為佐劑制劑的O/W型佐劑，而EP-A-315153公開了一種含有POP-POE嵌段聚合物和作為免疫刺激劑的糖肽的乳化劑的O/W型疫苗佐劑。
在這些佐劑中，W/O型油佐劑顯示高免疫增強(qiáng)作用，但由于這種制劑的連續(xù)油相而在注射部位有駐留的傾向。在不少的情形中，這種W/O型油佐劑在接種部位附近產(chǎn)生無菌膿腫和肉芽腫，并且在接種期間可能引起劇烈的疼痛。因此，這種類型的油佐劑在作為允許直接給身體接種的制劑使用時有局限性。O/W型油佐劑在注射部位顯現(xiàn)輕的局部反應(yīng)并且穩(wěn)定性優(yōu)越。然而，因為抗原是包含在連續(xù)相中的，它很快在注射部位分散，難以提供充分的療效，常常需要特殊的免疫刺激劑。
鑒于上述情形，近年來一直研究新型油佐劑-W/O/W型油佐劑。
例如，WO91/00106公開了W/O/W型多相乳劑，在注射后接觸動物體溫時變成W/O油型。這個技術(shù)不能解決所有與傳統(tǒng)W/O型油佐劑相關(guān)的問題，例如局部反應(yīng)等，因為油佐劑在體內(nèi)以W/O型佐劑的形式存在。
因為W/O/W型油佐劑呈復(fù)合乳劑的形式，當(dāng)與W/O型和O/W型油佐劑比較時，作為制劑的穩(wěn)定性不容易保持。因此，期待W/O/W型油佐劑疫苗同時表現(xiàn)出W/O型所具備的優(yōu)越的佐劑性和O/W型優(yōu)越的安全性的特征，在能夠開發(fā)出一種可以展現(xiàn)這兩種類型的良好平衡特征的油佐劑之前，有許多待解決的問題。
在專利US 5 814 321中，本發(fā)明人曾經(jīng)指出一種安全性和制劑穩(wěn)定性優(yōu)越的W/O型油佐劑疫苗和一種通過在含水相中分散W/O疫苗獲得的W/O/W型油佐劑疫苗。
但是，用傳統(tǒng)技術(shù)制備的W/O/W型油佐劑疫苗，根據(jù)配方和制備方法，表現(xiàn)出巨大的性能差異。與這些問題相關(guān)的是，抗原成分有時候驚人地增加粘度而免疫性的穩(wěn)定傳入作用卻不如W/O型油佐劑。
因此，本發(fā)明的目的是提供作為制劑的貯存穩(wěn)定性和注射部位局部反應(yīng)性改善的W/O/W型油型佐劑疫苗，它顯現(xiàn)高的免疫作用。
根據(jù)本發(fā)明，提供W/O/W型油型佐劑疫苗，它在外層含水相中含有特定量的特定分子量的聚乙二醇衍生物，這種疫苗表現(xiàn)出作為制劑的高穩(wěn)定性、在局部反應(yīng)等方面安全性優(yōu)越，以及高的免疫增強(qiáng)作用。
因此，本發(fā)明提供以下各項(1)一種含有外層含水相和內(nèi)層含水相的W/O/W型油佐劑疫苗，外層含水相含有0.5-20(重量)％的分子量400-20,000的用下式(I)表示的聚乙二醇衍生物， 式中R1和R2可以相同或不同，并且每一個可以是氫原子或1-4個碳原子的烷基，n是聚合度，內(nèi)層含水相含有生物學(xué)可接受的和有效量的抗原。(2)上述(1)的油佐劑疫苗，其中式(I)聚乙二醇衍生物的分子量為1,000-10,000。(3)上述(1)的油佐劑疫苗，其中外水相含有1-10(重量)％的式(I)的聚乙二醇衍生物。(4)上述(1)的油佐劑疫苗，這是一種通過分散或乳化W/O乳劑制備的W/O/W型油佐劑疫苗，W/O乳劑通過在含有乳化劑(D)和含水組分(E)的液體中分散或乳化在室溫下變?yōu)橐后w的油成分(A)、乳化劑(B)和含有生物學(xué)可接受和有效量的抗原的含水組分(C)來制備，其中的液體含有0.5-20％(重量)的分子量400-20,000的式(I)的聚乙二醇衍生物。(5)上述(1)的油佐劑疫苗，這是一種W/O/W型油佐劑，通過在含有乳化劑(D)和含水組分(E)的液體中分散或乳化在室溫下變?yōu)橐后w的油成分(A)、乳化劑(B)和含有生物學(xué)可接受和有效量的抗原的含水組分(C)來制備，然后往外水相加入分子量400-20,000的式(I)的聚乙二醇衍生物，濃度達(dá)到0.5-20(重量)％。(6)上述(4)或(5)的油佐劑疫苗，其中在室溫下變?yōu)橐后w的油成分(A)含有比例不小于油相20(重量)％的脂肪酸酯和/或角鯊烯。(7)上述(4)或(5)的油佐劑疫苗，其中乳化劑(B)的HLB小于10。(8)上述(7)的油佐劑疫苗，其中乳化劑(B)含有至少一種選自下列的成分多元醇與脂肪酸的偏酯和帶有聚氧乙烯鏈的非離子表面活性劑。(9)上述(4)或(5)的油佐劑疫苗，其中乳化劑(D)的HLB不小于10。(10)上述(9)的油佐劑疫苗，其中乳化劑(D)含有帶有聚氧乙烯鏈的非離子表面活性劑。
本發(fā)明的油佐劑疫苗通過在含有乳化劑(D)和含水組分(E)的液體中分散或乳化(步驟2)用在室溫下變成液體的油組分(A)、乳化劑(B)和含有生物學(xué)可接受的有效量的抗原的含水組分(C)制備(步驟1)的W/O乳劑，其中最終獲得的W/O/W型油佐劑疫苗的外層含水相含有特定量的具有特定分子量的聚乙二醇衍生物。
室溫下變成液體的油成分(A)構(gòu)成在步驟1中制備的W/O乳劑的連續(xù)相，并構(gòu)成一種油相，這種油相變成在步驟2中獲得的W/O/W型油佐劑疫苗的分散相。在本發(fā)明中，油相是指在這種W/O/W型油佐劑疫苗中的油相。在本說明書中，“在室溫下”是指15-25℃范圍的溫度。室溫下變成液體的油成分(A)可以選用食品、藥物、化妝品等常規(guī)使用的酯和非酯油基，它們在室溫下變成液體。
在室溫下變成液體的非酯油基可以是，諸如輕石蠟油、角鯊烯、角鯊?fù)?、聚丁烯等的烴類；諸如飽和中鏈脂肪酸(如辛酸、癸酸等)之類的脂肪酸；長鏈不飽和脂肪酸(如油酸、亞油酸、亞麻酸等)；中鏈或長鏈脂肪醇等。室溫下變成液體的酯油基的例子包括由飽和中鏈脂肪酸如辛酸和癸酸衍生的各種脂肪酸酯，或不飽和長鏈脂肪酸如油酸和亞油酸和醇，以及天然的脂肪酸酯，如液體植物油(如花生油、橄欖油、紅花油、向日葵油、西蒙得木油等)，來自動物的液體油，如orange roughy油等。
作為油成分(A)，可以使用上述例子中的一個，或者將上述例子中的二個或多個混合使用。這些油成分中，如脂肪酸酯、植物油和角鯊烯之類的油，從作用方面看具有較高的抗氧化作用和較高的身體親和力。因此，作為用于本發(fā)明的油佐劑疫苗的油成分，優(yōu)選這些油中的一種或多種。具體的說，作為脂肪酸酯，優(yōu)選也是生物脂質(zhì)構(gòu)成成分的16-22個碳原子的順-Δ9-不飽和脂肪酸和有1-3個碳原子的醇的酯化化合物構(gòu)成的油基。
此外，通過使油相中脂肪酸酯和/或角鯊烯含量的比例至少不小于20(重量)％，最終的油佐劑疫苗還可以進(jìn)一步降低副作用如局部反應(yīng)等并提高安全性。當(dāng)脂肪酸酯與角鯊烯共同使用時，其總量應(yīng)該至少不小于油相的20(重量)％。
在本發(fā)明中，可以選用常規(guī)用于藥品和食品的對身體顯示高安全性的一種或多種表面活性劑，作為構(gòu)成油佐劑疫苗的乳化劑(B)和乳化劑(D)。
在步驟1中使用乳化劑(B)，用于制備由含有抗原和油成分(A)的含水組分(C)組成的W/O乳劑。
考慮到最終W/O/W型油佐劑疫苗的穩(wěn)定性，作為乳化劑(B)使用的表面活性劑優(yōu)選是親油的。即，優(yōu)選比較小的HLB(Hydrophilic-Lipophile Balance親水-親油平衡)，尤其優(yōu)選HLB小于10。乳化劑(B)可以是單一種類的或二種或多種混合的。對于這種情形，乳化劑(B)優(yōu)選使總的HLB小于10。
更具體的說，使用多元醇與脂肪酸的偏酯，例如脫水山梨醇脂肪酸酯(如一油酸脫水山梨醇酯、二油酸脫水山梨酯、倍半油酸脫水山梨醇酯等)，甘油脂肪酸酯(如甘油一油酸酯等)，聚甘油脂肪酸酯(如二甘油一油酸酯、二甘油二油酸酯等)等，在分子中帶有聚氧乙烯鏈的非離子表面活性劑，如聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯(聚山梨醇酯)[如，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇一油酸酯等]，聚氧乙烯氫化蓖麻油，聚氧乙烯聚氧化丙烯乙二醇等。也可以使用含有天然卵磷脂的甘油磷脂(glycerophospholipid)。
其中，分子中有3-10個羥基的多元醇，如脫水山梨醇、甘油和聚甘油，與有12-20個碳原子的脂肪酸的偏酯，與加入聚氧乙烯鏈的羥基脂肪酸三甘油酯(其代表是聚氧乙烯氫化蓖麻油)，尤其可以結(jié)合使用，使乳化劑(B)的總HLB小于10。以這種方式，可以得到作為制劑穩(wěn)定性更加優(yōu)越的W/O/W型油佐劑疫苗。
在本發(fā)明的說明書中，HLB按照由W.C.Griffin[W.C.Griffin，《化妝品、藥劑師會志》(J.Soc.Cosmetic.Chemists)，1，311(1949)]提議的公式確定。
為了制備本發(fā)明的油佐劑疫苗，將乳化劑組合物作為構(gòu)成W/O乳劑的一種組分與上述乳化劑(B)一起使用以增大油佐劑的效力和制劑的穩(wěn)定性，W/O乳劑含有抗原溶液(抗原溶液通過先將氨基酸或其鹽與含有非還原糖或分子中至少有5個羥基的糖醇的水溶液混合來制備)，和有3個或多個羥基的多元醇與脂肪酸的偏酯(這是一種在室溫下變成液體的非離子表面活性劑)。氨基酸或其鹽，和所用的呈水溶液形式的糖或糖醇，可以從在日本藥典和日本藥典藥物(JapanesePharmacpoeia and Japanese Pharmacertical Codex)中所列的食品、藥品中常規(guī)使用的那些中選擇。這里所使用的抗原溶液可以呈任何形式，只要它是液態(tài)的，而例子有溶液、懸浮液等。例如，氨基酸或其鹽可以是甘氨酸、丙氨酸、精氨酸鹽酸鹽、組氨酸、苯丙氨酸、門冬氨酸鈉、門冬氨酸鉀、谷氨酸鈉、谷氨酸鉀或它們的水合物，其中糖和糖醇優(yōu)選選自海藻糖、木糖醇、山梨醇、甘露糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇等。
上述乳化劑組合物是通過制備含有上述氨基酸或其鹽和上述糖或糖醇的水溶液，并將這種水溶液與上述非離子表面活性劑以10∶1-1∶1(水溶液表面活性劑)的重量比混合和攪拌得到的。該乳化劑組合物用量比例是含有抗原溶液的W/O乳液的約1-20(重量)％，優(yōu)選約2-10(重量)％。
乳化劑(D)在步驟(2)中用于將上述W/O乳劑在含有乳化劑(D)和含水組分(E)的液體中分散或乳化。
考慮到最終的W/O/W型油佐劑疫苗的穩(wěn)定性，作為乳化劑(D)使用的表面活性劑優(yōu)選親水的和具有較高HLB值的，尤其優(yōu)選HLB至少不小于10。這種乳化劑(D)可以單獨(dú)使用或按照需要混合使用。在此情形中，乳化劑(D)優(yōu)選使總HLB不小于10。
更具體的說，使用分子中有聚氧乙烯鏈的和HLB不小于10的非離子表面活性劑，例如聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯聚氧化丙烯二醇等。這些表面活性劑可以與多元醇和脂肪酸的偏酯結(jié)合使用，例如脫水山梨醇脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯等，以及含有天然的卵磷脂的甘油磷脂。其中，尤其是聚氧乙烯聚氧化丙烯二醇單獨(dú)使用或與其它表面活性劑的結(jié)合使用能夠使W/O/W型油佐劑疫苗具有優(yōu)越的制劑穩(wěn)定性。
作為乳化劑(B)或乳化劑(D)使用的甘油磷脂可以是，例如天然的磷脂，如從蛋黃和大豆提取和純化的磷脂以及它們的氫化加成化合物，和各種合成的磷脂和其中?；糠趾蛪A基部分已經(jīng)被調(diào)節(jié)的溶血磷脂。
在本發(fā)明的W/O//W型油佐劑疫苗中，含水組分(C)構(gòu)成含水相，含水相是在步驟(1)中制備的W/O乳劑中的分散相并且構(gòu)成分散于油相中的內(nèi)層含水相，油相是在最終W/O/W型油佐劑疫苗中分散相。含水組分(C)含有各種抗原。
包含在含水組分(C)中的抗原可以是各種類型的并可以呈各種形式。更具體的說，常規(guī)使用的滅活細(xì)胞、滅活病毒顆粒、滅活支原菌，以及病原體感染預(yù)防因子，如用于亞單元疫苗的附著蛋白、包膜抗原等，都可以使用。滅活的細(xì)胞可以是革蘭氏陰性菌如大葉性肺炎放線桿菌、大腸桿菌等，革蘭氏陽性菌如豬丹毒絲菌等。滅活的病毒顆粒的病毒包括，例如日本腦炎病毒等。滅活支原菌屬的支原菌屬的例子有豬或雞的支原菌屬。作為病原體感染預(yù)防因子，例子有紐卡斯?fàn)柌〔《镜腇蛋白。也可以使用含有多個抗原的復(fù)合疫苗。
除了抗原之外，本發(fā)明的油性佐劑疫苗可以含有非抗原的有效的成分，如抗生素?？股氐睦影蛩峥敲顾兀}酸氧四環(huán)素等。
在含水組分(C)中生物學(xué)可接受的和有效量的抗原由所使用的抗原的目的和種類適當(dāng)?shù)卮_定。
在本發(fā)明中，上述抗原是包含在內(nèi)層含水相中的。在本發(fā)明的W/O/W型油佐劑疫苗的制備過程期間，即使有一部分抗原漏出進(jìn)入外層含水相，本發(fā)明的療效也不減少。
在本發(fā)明中，含水組分(E)構(gòu)成W/O/W型油佐劑疫苗的外層含水相。更具體的說，含水組分(E)適當(dāng)?shù)乜紤]最終佐劑疫苗的穩(wěn)定性和對身體的安全性來選擇。例如使用生理鹽水、磷酸鹽緩沖的生理鹽水等。
根據(jù)本發(fā)明，在油佐劑疫苗的外層含水相中所含的聚乙二醇衍生物用下式(I)表示 式中R1和R2可以相同或不同，并且每一個可以是氫原子或1-4個碳原子的烷基，n是聚合度。
在上述式(I)中，在R1和R2處的有1-4個碳原子的烷基可以是直鏈或支鏈的，例子有甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。合適的R1和R2是氫原子、甲基和乙基，其中氫原子特別適用。R1和R2合適的組合是氫原子與氫原子、氫原子與甲基、氫原子與乙基、甲基與甲基等。氫原子與氫原子的組合特別適用。n是使分子量在400-20,000范圍內(nèi)的聚合度。
上述式(I)的聚乙二醇衍生物的分子量為400-20,000，優(yōu)選1,000-10,000，特別優(yōu)選3,000-9,000。它在外層含水相中的含量是該相的0.5-20(重量)％，優(yōu)選1-10(重量)％，更優(yōu)選1-5(重量)％。
當(dāng)聚乙二醇衍生物的分子量小于400或含量小于0.5(重量)％時，不能獲得足夠的粘度降低作用。此外，作為佐劑的作用會消弱。當(dāng)聚乙二醇衍生物的分子量超過20,000時，外層含水相本身的粘度增加，這本身又增大了油佐劑疫苗整體的粘度，從而提供不了充分降低粘度的作用。當(dāng)含量超過20(重量)％時，內(nèi)層含水相和外層含水相表現(xiàn)出完全不同的滲透壓。因此不能提供穩(wěn)定的W/O/W型乳劑，這反而可能使穩(wěn)定的油佐劑疫苗的制劑無法獲得。
在本發(fā)明中，較高分子量的上述聚乙二醇衍生物導(dǎo)致較高粘度的外層含水相，其結(jié)果是油佐劑疫苗具有較高的粘度。需要按照聚乙二醇衍生物的分子量將其含量調(diào)節(jié)至上述范圍內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，上述列舉的分子量在400-20,000范圍內(nèi)的聚乙二醇衍生物，可以單獨(dú)使用或者將具有不同分子量的二種或多種衍生物聯(lián)合使用。
考慮到作為制劑的穩(wěn)定性和最終油佐劑疫苗的佐劑作用，聚乙二醇衍生物優(yōu)選分子量為1,000-10,000并且在外層含水相中的含量比為該相的1-10(重量)％，優(yōu)選1-5(重量)％。
根據(jù)本發(fā)明所制備的油佐劑疫苗的特征在于，優(yōu)良的佐劑作用和較低的粘度，這歸功于聚乙二醇衍生物是存在于外層含水相中。一般說來，由于在內(nèi)層含水相中所含物質(zhì)的作用，由于在內(nèi)層含水相與外層含水相中含有不同的物質(zhì)，W/O/W型乳劑常常表現(xiàn)出快速增長的粘性和水/油顆粒的結(jié)團(tuán)作用。具體地講，用于油佐劑疫苗的抗原溶液可以含有各種高濃度的組分，例如細(xì)胞成分和介質(zhì)成分。因此，對于作為W/O/W型油佐劑幼苗的使用，具有相同組成的W/O/W型乳劑可以表現(xiàn)太另人驚異的粘度和穩(wěn)定性的不同等級，這是歸咎于在抗原溶液中所使用的其它成分的作用。這提出了一個嚴(yán)重的問題，尤其當(dāng)將多種抗原混合制作作疫苗時，因而需要在疫苗生產(chǎn)和調(diào)節(jié)時采用一切手段避免之。但是，在本發(fā)明中，聚乙二醇衍生物是包含在外層含水相中以減低粘度的，與內(nèi)層含水相的組成和成分無關(guān)，這本身即克服了這些問題。當(dāng)一種油佐劑疫苗具有高粘度時，在給身體施藥時其可使用性便成了問題，這又造成在身體中擴(kuò)散性降低并引起不利的后果，例如局部反應(yīng)，以及在注射部位殘留疫苗。通過將聚乙二醇衍生物加入到外層含水相中，這些方面也可以獲得改善。
影響水/油/水型油佐劑性能的一個主要因素是在外層含水相中所含W/O乳劑的粒度。一般的說，在外層含水相中所含水/油乳劑的粒度大的時候，這種W/O/W型油佐劑接種后表現(xiàn)出W/O型油佐劑的性能。這意味著佐劑的作用變得很大但副作用如局部反應(yīng)也變得很強(qiáng)。此外，顆粒有結(jié)團(tuán)的傾向從而降低了作為制劑的穩(wěn)定性。相反，當(dāng)W/O乳劑含有比較小的顆粒時，制劑有較高的穩(wěn)定性、減低的副作用和較弱的佐劑作用。即使當(dāng)W/O乳劑顆粒比較小時本發(fā)明制備的W/O/W型油佐劑疫苗仍表現(xiàn)出高免疫增強(qiáng)作用。因此，本發(fā)明的疫苗表現(xiàn)出作為制劑的較高的穩(wěn)定性、較少和較低水平的副作用和優(yōu)越的效力。從作為制劑的穩(wěn)定性和副作用的降低方面看，構(gòu)成W/O/W型油佐劑疫苗的基本上所有的W/O乳劑顆粒的尺寸優(yōu)選不大于50微米而平均粒度不大于20微米。
本發(fā)明的油佐劑疫苗的制備方法沒有特別的限制，并且可以是已知的方法。當(dāng)制備本發(fā)明的油佐劑疫苗時，在步驟1中制備的W/O乳劑優(yōu)選含有一種油成分(A)，比例為30-90(重量)％，優(yōu)選40-80(重量)％，一種乳化劑(B)，比例為1-20(重量)％，優(yōu)選2-15(重量)％，和一種含有抗原的含水組分(C)，比例為5-75(重量)％，優(yōu)選15-60(重量)％，都相對W/O乳劑計。乳化劑(D)在步驟2中使用，比例為0.1-20(重量)％，優(yōu)選0.5-10(重量)％，以乳化劑(D)、含水組分(E)和聚乙二醇衍生物的總重量計。
W/O乳劑(在步驟1中制備)與含有乳化劑(D)以及在步驟2中的含水組分(E)的液體的混合比按照目標(biāo)或選定的抗原種類確定。重量比優(yōu)選為，W/O乳劑含有乳化劑(D)和含水組分(E)的液體＝2∶1-1∶10，優(yōu)選2∶1-1∶5。
根據(jù)本發(fā)明，通過部分或全部將上述分子量400-20,000的式(I)的聚乙二醇衍生物先加入到上述含乳化劑(D)和含水組分(E)之中，將聚乙二醇衍生物加入到外層含水相中。另一種方法是，制備W/O/W型油佐劑并將分別溶于水、生理鹽水或緩沖液中的聚乙二醇衍生物加入。聚乙二醇衍生物的加入量如上述。
當(dāng)制備含有多種抗原的油佐劑疫苗時，制備在內(nèi)含水相含有每一種抗原的水/油乳劑，混合之并分散于含乳化劑(D)和含水組分(E)的液體中，如后所示。另一種方法是，制備任何數(shù)量的抗原W/O/W型油佐劑并混合之，如后所述。
本發(fā)明的油佐劑疫苗作為藥品可以含有在佐劑活性中不直接相關(guān)的各種添加劑，如緩沖劑、防腐劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等。
為了制備本發(fā)明的油佐劑疫苗，可以使用任何能夠進(jìn)行乳化的裝置，用來制備在內(nèi)層含水相中含有抗原的W/O乳劑(步驟1)和用來分散或乳化在含有乳化劑(D)和含水相(E)的液體中的W/O乳劑(步驟2)，可以使用典型的乳化裝置(例如，均化器、均質(zhì)器CLEARMIX(M TECHNIQUE制造)等)、使用多孔膜的薄膜乳化裝置、高壓噴射乳化裝置等。必要時，將構(gòu)成本發(fā)明的油佐劑疫苗的W/O乳劑通過膜過濾器使顆粒的尺寸小于某一水平。
不過，在制備疫苗時，待使用的每一組成都可以先進(jìn)行消毒處理，例如，依照其性質(zhì)通過加熱消毒或通過過濾消毒。
當(dāng)本發(fā)明制備的油佐劑疫苗施用到身體上時，采用適當(dāng)?shù)氖┧幫緩?，例如皮下、肌?nèi)和腹膜內(nèi)注射，以及通過鼻腔粘膜和腸內(nèi)腔給藥。劑量和施藥頻率按照有關(guān)領(lǐng)域中通常所使用的方法確定以獲得希望的免疫效果。
本發(fā)明通過參照說明性的例子進(jìn)行詳細(xì)解釋。無論怎樣本發(fā)明不受這些例子的限制。
在以下的例子中，使用聚乙二醇(下文也稱之為PEG或Macrogol)作為聚乙二醇衍生物。[油佐劑疫苗的制備]下面每一實施例中所使用的油佐劑疫苗通過使用CLEARMIX CLM-0.8S(MTECHNIQUE)用下述方法制備。乳化作用在室溫下完成并且在必要時使用冷卻水。下列組合物中的每一種組成采用適當(dāng)?shù)南痉椒ㄟM(jìn)行消毒處理。攪拌、乳化等每一種操作在無菌環(huán)境下完成。在實施例中，“份”是指“重量份”。
在下面的油佐劑疫苗的制備中，“外層含水相”是指要與W/O乳劑混合用于制備W/O/W型油佐劑疫苗的液體?！秾嵤├?疫苗1的制備》按照在表1中W/O-1的組成，將除了抗原懸浮體之外的每種組分稱重并放置在燒杯中。在使用前將聚氧乙烯氫化蓖麻油加熱到50℃并溶解。將谷氨酸鈉和山梨醇的水溶液與脫水山梨醇倍半油酸酯以重量比1/1進(jìn)行混合、攪拌并且加入。將剩余的脫水山梨醇倍半油酸酯加入。伴隨攪拌逐漸將抗原懸浮體加入并在常溫下在CLEARMIX CLM-0.8S(M TECHNIQUE)中，以12,000rpm攪拌混合5分鐘以獲得W/O型乳劑(W/O-1)。
按照在表3中外層含水相1的組成，將每種組分溶于磷酸鹽緩沖的鹽水(BPS，pH7.4)中(外層含水相1)。將上述W/O-1(1份)和外層含水相1(1份)在燒瓶中稱重并使用CLEARMIX CLM-0.8S以9,000rpm混合5分鐘以獲得油佐劑疫苗1。在下面的實施例和對比例中，除非另有說明，W/O乳劑和外層含水相是在與實施例1疫苗制備相同的條件下進(jìn)行混合?！秾嵤├?疫苗2的制備》稱重在實施例1中制備的W/O型乳劑(W/O-1，1份)和按照在表3中外層含水相2的組成制備的外層含水相2(1份)并制備油佐劑疫苗2。《實施例3疫苗3的制備》按照在表1中W/O-2的組成，將除了抗原懸浮體之外的每種組分在燒杯中稱重。在使用前將聚氧乙烯氫化蓖麻油加熱到50℃并溶解。將日本藥典Macrogol6000先均勻地溶于抗原懸浮體中。在與實施例1中相同的條件下制備W/O型乳劑(W/O-2)。
然后，稱重W/O-2(3份)和按照在表3中外層含水相3的組成制備的外層含水相3(2份)并制備油佐劑疫苗3。《實施例4疫苗4的制備》按照在表3中外層含水相4的組成，稱重每種組分。將各組分加熱到約60℃，充分混合、分散并冷卻到室溫以用作外層含水相4。然后，稱重在實施例3中制備的W/O型乳劑(W/O-2，1份)和外層含水相4(3份)，并制備油佐劑疫苗4?！秾嵤├?疫苗5的制備》按照在表1中W/O-3的組成，將除了抗原溶液之外的每種組分在燒杯中稱重。以與實施例1相同的方式，將抗原懸浮體逐漸加入并同時攪拌混合物并以與實施例1相同的方式制備W/O型乳劑(W/O-3)。
然后，在燒瓶中稱重這種W/O型乳劑(W/O-3，2份)和外層含水相2(3份)并制備油佐劑疫苗5?！秾嵤├?疫苗6的制備》將按照實施例5制備的W/O型乳劑(W/O-3，2份)和按照在表4中外層含水相5的組成制備的外層含水相5(2份)稱重，并使用CLEARMIX CLM-0.8S以9,000rpm混合5分鐘以獲得一種乳劑。將日本藥典Macrogol 6000溶于PBS中，達(dá)到10(重量)％的濃度，并將制成的溶液(1份)加入。將混合物輕輕攪拌以得到油佐劑疫苗6?！秾嵤├?疫苗7的制備》按照在表2中W/O-4的組成，將除了抗原懸浮體之外的每種組分在燒杯中稱重。以與實施例1相同的方式，使用CLEARMIX CLM-0.8S，制備W/O型乳劑(W/O-4)。
然后，稱重W/O-4(1份)和按照表3中外層含水相4的組成制備外層含水相4(1份)并制備油佐劑疫苗7。《實施例8疫苗8的制備》按照在表2中W/O-5的組成，將除了抗原懸浮體之外的每種組分在燒杯中稱重。在使用前將聚氧乙烯氫化蓖麻油加熱到60℃并溶解。伴隨攪拌將抗原懸浮體逐漸加入并以與實施例1相同的方式制備W/O型乳劑(W/O-5)。
然后，稱重W/O-5(1份)和外層含水相2(1份)并制備油佐劑疫苗8。《實施例9疫苗9的制備》按照在表2中W/O-6的組成，將除了抗原懸浮體之外的每種組分在燒杯中稱重。將蛋黃卵磷脂均勻地溶于油相中并且在使用前將聚氧乙烯氫化蓖麻油加熱到60℃并溶解。伴隨攪拌將抗原懸浮體逐漸加入并以與實施例1相同的方式制備W/O型乳劑(W/O-6)。
然后，稱重W/O-6(3份)和外層含水相3(2份)并制備油佐劑疫苗9?！秾Ρ葘嵤├?疫苗10的制備》稱重在實施例1中制備的W/O-1(1份)和在表4所示的外層含水相5(1份)并制備油佐劑疫苗10。《對比實施例2疫苗11的制備》稱重在實施例1中制備的W/O-1(1份)和在表4所示的外層含水相6(1份)并制備油佐劑疫苗11。《對比實施例3疫苗12的制備》稱重在實施例3中制備的W/O-2(3份)和在表4所示的外層含水相7(2份)并制備油佐劑疫苗12?！秾Ρ葘嵤├?疫苗13的制備》稱重在實施例5中制備的W/O-3(2份)和在表4所示的外層含水相5(3份)并制備油佐劑疫苗13?！秾Ρ葘嵤├?疫苗14的制備》稱重在實施例7中制備的W/O-4(1份)和在表4所示的外層含水相8(1份)并制備油佐劑疫苗14?！秾Ρ壤龑嵤?疫苗15的制備》稱重在實施例8中制備的W/O-5(1份)和在表4所示的外層含水相6(1份)并制備油佐劑疫苗15?！秾Ρ葘嵤├?疫苗16的制備》稱重在實施例9中制備的W/O-6(3份)和在表4所示的外層含水相7(2份)并制備油佐劑疫苗16。
用于各實施例和對比實施例的疫苗所用的W/O乳劑的成分列于表1和2中，外層含水相的成分列于表3和4中，各疫苗的W/O乳劑與外層含水相的混合比列于表5中。表1W/O乳劑-1的成分
*1)圓括號中的數(shù)字表示加入的氧化乙烯的平均摩爾數(shù)。
*2)通過將谷氨酸鈉一水合物(25克)和山梨醇(10克)溶于蒸餾水中制備的水溶液(100毫升)。
*3)Mcrogol先溶于抗原懸浮體中。表2W/O乳劑-2的成分
*1)圓括號中的數(shù)字表示加入的氧化乙烯的平均摩爾數(shù)?，F(xiàn)。如果點(diǎn)擊Show On Map，將在圖的中心出現(xiàn)該輛車。
3.3監(jiān)控車輛的狀態(tài)根據(jù)在電子地圖上的它們的圖象和在車輛Vehicle書簽上的狀態(tài)電子數(shù)據(jù)表來控制車輛的狀態(tài)(見圖8中的″車輛位置監(jiān)視″)。
在電子數(shù)據(jù)表中示出以下車輛信息速度-指出汽車的當(dāng)前速度(千米/時)。如果一個車輛的速度沒有超過允許的速度時，用綠色示出。在車輛違反速度模式時(例如超過20千米/時)，用紅色示出速度大小，并定期發(fā)出聲音信號。
車輛狀態(tài)控制傳感器14-指示出車輛根據(jù)以下電子數(shù)據(jù)表裝有傳感器的狀態(tài)
在門傳感器反應(yīng)時情況，“Doors 123456”(所有的門打開)，“Doors1.3”(1號門和3號門打開)。如果所有門關(guān)閉是“Doors...”在設(shè)備區(qū)傳感器反應(yīng)時出現(xiàn)“Bay open”。
在距離傳感器反應(yīng)時-“Over 1 meter to AC”或“Less than 1 meter toAC”點(diǎn)火(Ignition)-表示狀態(tài)-開或關(guān)。
將每一種疫苗(或稀釋的疫苗)皮下接種到5周大的未染病的小鼠(每組5只)的內(nèi)股(0.25毫升/小鼠)。免疫接種后3周，每一只小鼠的內(nèi)股皮下注射(2.2×106CFU/0.1毫升/小鼠)Er Fujisawa菌株[Japanese Association of Veterinary Biologics(JAVB)]。注射后，對小鼠的存活監(jiān)視10天，并計算50％存活疫苗稀釋物倍數(shù)，用PD50表示。免疫處理2周后，給小鼠接種未稀釋的疫苗和5倍稀釋的疫苗(每一種配方10只鼠)并用觸診檢查注射部位以確定硬結(jié)的程度。硬結(jié)的程度用5級(0無，1輕-4嚴(yán)重)記分并且對每一種配方計算平均值。
將這個時候制備的W/O/W型油佐劑疫苗用激光衍射粒度分析儀SALD-2100(SHIMADZU CORPORATION)測量平均粒度。
效力(PD50)匯總于表6中。表6豬丹毒-小鼠免疫試驗結(jié)果(實驗實施例1)
結(jié)果用接種稀釋疫苗(或未稀釋的疫苗)的存活小鼠的數(shù)目和其PD50值表示。在此使用時，PD50值越大表示效力越高。在免疫組中，疫苗1、3、5、7接種組顯示PD50值不小于1300，與IFA相比，表現(xiàn)出優(yōu)越的效力。相反，免疫對比組(施用疫苗10、12、14和鋁凝膠佐劑)顯示PD50值為532.1、385.7、279.5和77.1。顯然，本發(fā)明制備的疫苗顯示出值得注意的高PD50值。這些結(jié)果證實本發(fā)明制備的疫苗具有高效力。
然后，用觸診檢查注射部位以確定硬結(jié)的程度。W/O/W型油佐劑疫苗的平均粒度與硬結(jié)的程度示于表7中。表7豬丹毒-小鼠注射部位的局部反應(yīng)(試驗實施例1)
注射部位局部反應(yīng)的記分(0無，1輕-4嚴(yán)重)免疫組幾乎不顯出注射部位的反應(yīng)，從而表現(xiàn)出高的注射安全性，而且平均粒度不大于7.2-8.1或20微米。比較起來，對比免疫組顯示幾乎相同等級的W/O/W型油佐劑疫苗的平均粒度，而對比免疫組注射部位處的反應(yīng)除了IFA和IFA-PEG外都較小。但是，在IFA和IFA-PEG注射組中的小鼠生長出嚴(yán)重的硬結(jié)，使反應(yīng)記分非常高，其中，約3/4或更多的接種IFA或IFA-PEG的小鼠受到步態(tài)混亂之苦。
上述結(jié)果證實本發(fā)明的油佐劑疫苗令人驚異地顯示出優(yōu)越的效力并且與鋁凝膠一樣在注射部位的反應(yīng)極輕。本發(fā)明的疫苗是高度安全的。《實驗實施例2豬支原體滅活的疫苗》疫苗2、4、6、11和13用豬肺炎支原體92-28菌株(從野生豬分離的菌株；Juridical Foundation，The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)在用豬血清補(bǔ)充的BHL培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且用福爾馬林滅活制備。為了做制劑，每一種疫苗的抗原含量用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)調(diào)節(jié)到抗原濃度8.0×108CCU/ml。把用氫氧化鋁凝膠(ALHYDROGEL 85，Superfos，鋁轉(zhuǎn)化9mg/ml)作為佐劑的一種疫苗(疫苗AL)，和通過將日本藥典Macrogol 4000加入到氫氧化鋁凝膠中最終濃度達(dá)到4％的一種疫苗(疫苗AL-PEG)，調(diào)節(jié)到相同抗原濃度。
每一種疫苗(2毫升/豬)給SPF(沒有特種病原體)的豬(8只豬/組，在第一次免疫處理時4周大)頸肌接種，間隔2周。第二次免疫處理一周后，將從感染豬肺炎支原體92-28菌株(從野生豬分離的菌株；Juridical Foundation，The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute)的豬得到的肺勻漿施入氣管。施藥4周后，給豬做尸體解剖，并觀察肺損害。將各個肺損害記分，并計算相對于未免疫處理的對照豬由各疫苗引起的損害的降低(％)。
結(jié)果示于表8中。表8豬支原體屬感染-小鼠免疫實驗結(jié)果(實施實施例2)
用疫苗2、4和6接種的免疫組顯示損害降低60％或更高，證實優(yōu)越的效力。第二次乳化后加入PEG的疫苗6顯示與其它免疫組幾乎相同的效果。相反，施用疫苗11和13的對比免疫組顯示損害分別降低39.8％和26.0％，而鋁凝膠疫苗全然不顯示疫苗的損害降低的效果，與PEG的加入與否無關(guān)。
上述效果證實即使在使用支原體屬作為抗原時，本發(fā)明的油佐劑疫苗仍顯出優(yōu)越的效力。此外，這些結(jié)果證實，往外層含水相加入PEG是有效的，不論在第二次乳化之前或之后。[乳劑粘度的測量]測量制備好的W/O/W型油佐劑疫苗的粘度。對在上述實驗實施例1中制備的豬丹毒絲菌疫苗(疫苗1、3、5、7、10、12、14)，以及按照疫苗2、4、6、8、9、11、13、15和16的配方并使用豬丹毒絲菌屬作為抗原制備的各個疫苗進(jìn)行測量，以便能夠在抗原懸浮體相同配方的條件下作比較。粘度在疫苗制備一周后測量，在25℃用E型旋轉(zhuǎn)粘度計(TOKI SANGYO CO.，Ltd.，RE105H型)。結(jié)果示于表9中。表9疫苗制劑的粘度
如表9所示，實施例的疫苗全都顯示在25℃的粘度不大于50mPa·s。粘度非常低便于注射。相反，對比實施例的疫苗的粘度不小于150mPa·s，迫使注射需要可觀的力量和時間。
上述結(jié)果表明本發(fā)明的W/O/W型油佐劑疫苗由于在外層含水相含有聚氧乙烯衍生物可以具有顯著降低的粘度，由此表明施用本發(fā)明的疫苗可以在很大程度上減低操作強(qiáng)度。[乳劑的包涵率的測量]測量制備好的W/O/W型油佐劑疫苗的包涵率。對在上述實驗實施例2中使用的豬支原體疫苗(疫苗2、4、6、11、13)，以及按照疫苗1、3、5、7、8、9、10、12、14、15和16的配方并且使用上述支原體作為抗原制備的各個疫苗進(jìn)行測量，以便能夠在相同的抗原懸浮體配方下進(jìn)行對比。將制備好的疫苗用PBS稀釋，從外層含水相離心分離乳劑部分。收集后測量外層含水相中的蛋白量。從在制備W/O乳劑期間加入的抗原懸浮體(構(gòu)成內(nèi)層含水相)中的蛋白減去在外層含水相中的蛋白量，以確定留在內(nèi)層含水相的蛋白量，以此為基礎(chǔ)用下式計算包涵率。包涵率(％)＝[(加入的抗原溶液中的蛋白量)-(外層含水相中的蛋白量)]/加入抗原懸浮體中的蛋白量疫苗在制成后在4℃儲存，并且在疫苗制成的第二天和3個月后測量包涵率。
包涵率的結(jié)果示于表10中。表10制成的疫苗的包涵率
在實施例和對比實施例中，在制成后第二天和制成后3個月都觀察到了不小于70％的包涵率，因此，表現(xiàn)出優(yōu)越的穩(wěn)定性。尤其是實施例的疫苗顯示如表9所示的極低的粘度和優(yōu)越的蛋白包涵率。
上述結(jié)果證實，具有另人注目的低粘度的本發(fā)明的W/O/W型油佐劑疫苗具有高穩(wěn)定性。
從表6-10中的結(jié)果清楚地表明，本發(fā)明的油佐劑疫苗表現(xiàn)出良好平衡的W/O型油佐劑優(yōu)越的效力特性和O/W型油佐劑優(yōu)越的安全性。本發(fā)明的構(gòu)成(其中在W/O/W型油佐劑疫苗的外層含水相中含有特定的聚乙二醇衍生物)能夠制備有用的油性佐劑疫苗，這種油性佐劑疫苗不受在內(nèi)層含水相中所含成分的影響，并且制劑穩(wěn)定性和可使用性優(yōu)越，使得注射由于降低了粘度而變得容易。
本發(fā)明的W/O/W型油佐劑疫苗提供了高的佐劑作用并表現(xiàn)出優(yōu)越的制劑穩(wěn)定性和較少的副作用(如局部反應(yīng))。
本申請是以日本專利申請No.316121/1999為基礎(chǔ)，其內(nèi)容本文引用作為參考。
權(quán)利要求
1.一種W/O/W型油佐劑疫苗，含有外層含水相和內(nèi)層含水相，外層含水相含有0.5-20(重量)％的分子量400-20,000的用下式表示(I)的聚乙二醇衍生物， 式中R1和R2可以相同或不同，并且每一個可以是氫原子或1-4個碳原子的烷基，n是聚合度，內(nèi)層含水相含有生物學(xué)可接受的和有效量的抗原。
2.權(quán)利要求1的油佐劑疫苗，其中，式(I)聚乙二醇衍生物的分子量為1,000-10,000。
3.權(quán)利要求1的油佐劑疫苗，其中，外水相含有1-10(重量)％式(I)的聚乙二醇衍生物。
4.權(quán)利要求1的油佐劑疫苗，這是一種W/O/W型油佐劑疫苗，通過下列步驟制備(a)制備含有在室溫下變?yōu)橐后w的油成分(A)、乳化劑(B)和含有生物學(xué)可接受和有效量的抗原的含水組分(C)的W/O乳劑，和(b)在含有乳化劑(D)和含水組分(E)的液體中分散或乳化這種W/O乳劑，其中的液體含有0.5-20％(重量)的分子量400-20,000的式(I)所示的聚乙二醇衍生物。
5.權(quán)利要求1的油佐劑疫苗，它是一種通過以下步驟制備的W/O/W型油佐劑(a)制備含有在室溫下變?yōu)橐后w的油成分(A)、乳化劑(B)和含有生物學(xué)可接受和有效量的抗原的含水組分(C)的W/O乳劑，(b)在含有乳化劑(D)和含水組分(E)的液體中分散或乳化這種W/O乳劑，和(c)往外水相中加入分子量400-20,000的式(I)所示的聚乙二醇衍生物至濃度達(dá)到0.5-20(重量)％。
6.權(quán)利要求4或5的油佐劑疫苗，其中，在室溫下變?yōu)橐后w的油成分(A)含有比例不小于油相20(重量)％的脂肪酸酯和/或角鯊烯。
7.權(quán)利要求4或5的油佐劑疫苗，其中，乳化劑(B)的HLB小于10。
8.權(quán)利要求7的油佐劑疫苗，其中，乳化劑(B)含有至少一種選自下列的成分多元醇與脂肪酸的偏酯和帶有聚氧乙烯鏈的非離子表面活性劑。
9.權(quán)利要求4或5的油佐劑疫苗，其中，乳化劑(D)的HLB不小于10。
10.權(quán)利要求9的油佐劑疫苗，其中，乳化劑(D)含有帶有聚氧乙烯鏈的非離子表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明提供W/O/W型油佐劑疫苗,含有外層含水相和內(nèi)層含水相,外層含水相含有0.5－20%(重量)的分子量400－20,000的聚乙二醇衍生物,內(nèi)層含水相含有生物學(xué)可接受的和有效量的抗原。本發(fā)明的構(gòu)成(其中外層含水相中含有特定分子量的聚乙二醇衍生物)能夠制備W/O/W型油佐劑疫苗,這種油佐劑疫苗顯示高佐劑作用、降低的副作用(如局部反應(yīng))、優(yōu)越的制劑穩(wěn)定性和優(yōu)越的可使用性,使得注射由于降低了粘度而變得容易。
文檔編號A61K39/39GK1307903SQ0013748
公開日2001年8月15日 申請日期2000年11月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月5日
發(fā)明者齋藤晃一, 岸本洋子, 宮原德治, 高瀨公三 申請人:日本油脂株式會社, 財團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所