專利名稱：板粟花黃酮類化合物及其提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新的化合物，特別是板栗花黃酮類化合物及其提取方法。該類化合物具有有抗氧化，清除氧自由基作用，改善心腦血液循環(huán)，可用于抗衰老，心腦血管疾病等的治療。
板栗花為殼斗科栗屬植物板栗(Castanea mollissima Blume)的雄性花序。栗花水煎劑在民間用于治療久治不愈的腹瀉。《日用本草》記載栗花微溫、微苦、澀。治瘰疬?！兜崮媳静荨份d治日久赤白痢疾，大腸下血?！端拇ㄖ兴幹尽份d治小兒消化不良及腹瀉不止。栗廣泛分布于全國(guó)各地，資源十分豐富，尤其山東省內(nèi)栽培集中，產(chǎn)量很大，栗花都丟棄不用。國(guó)內(nèi)、外對(duì)花的研究很少。到目前為止，現(xiàn)有技術(shù)中只報(bào)道過板栗花中的揮發(fā)油成分，未見報(bào)道其他化學(xué)成分。
本發(fā)明的目的在于提供一種從板栗花水中提取板栗花黃酮類化合物作為有效成分。
本發(fā)明的另目的在于提供一種從板栗花水中提取板栗花黃酮類化合物的方法，和，本發(fā)明的另目的在于提供一種栗花黃酮類化合物的用途。
為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明涉及一組如通式(Ⅰ)所示的栗花黃酮類新化合物通式(Ⅰ) 其中R1為H，或OH；R2為H，或OH；R3為H，或OH；R4為TPC、CPC、或H；R5為TPC、CPC、或H；R6為TPC、CPC、或H；R7為TPC、CPC、或H； 或?yàn)棣列?，或?yàn)棣滦汀?br> 本發(fā)明人首先對(duì)其板栗花的化學(xué)成分進(jìn)行了全面系統(tǒng)的提取與分離，主要是用不同極性溶劑提取，多種和多次柱層析分離，得到數(shù)個(gè)化合物。再通過理化性質(zhì)的測(cè)定、運(yùn)用多種波譜技術(shù)，對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定出本發(fā)明之化合物。這些化合物都是首次由該化合物中分離得到。
在弄清其化學(xué)成分和含量的基礎(chǔ)上，對(duì)其主要成分的黃酮類化合物進(jìn)行生物活性篩選，發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠常壓下耐缺氧作用明顯(P＜0.01)而毒性較小。此研究結(jié)果對(duì)開發(fā)利用板栗花有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值，同時(shí)也潛在著極大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
具體講，板栗花黃酮類花黃酮類化合物的制備方法包括以下步驟●采用50-95％乙醇回流提取板栗花粗粉，提取3次，每次1小時(shí)；●所得液在50-100攝氏度下濃縮成膏狀，然后以原料5倍量的水沉降，離心，得澄清的水液。
●將該水液經(jīng)大孔樹脂吸附，柱以40-70％的乙醇洗脫；●洗脫液50-100攝氏度減壓濃縮，用所得膏狀物；●以1-3倍硅膠拌樣，晾干，于索氏提取器中，醋酸乙酯提取，提取液濃縮蒸干，得板栗花總黃酮部位。
●用乙醇溶解得到的板栗花總黃酮，1-3倍硅膠拌樣，用樣品20倍硅膠上柱，氯仿∶甲醇/99∶1-80∶20梯度洗脫，用硅膠板薄層層析檢測(cè)，相同流分合并。
●所得流分分別經(jīng)低壓硅膠柱純化，在-5-20℃重結(jié)晶，得本發(fā)明化合物。本發(fā)明所述的新的代表性化合物為栗甙A[化學(xué)名為山奈酚3-O-(6″-E-對(duì)-香豆?；?-α-D-甘露吡喃糖甙Castanoside A(Kaempferol-3-O-(6″-E-p-coumaroyl)-α-D-mannopyranoside).]；栗甙B[化學(xué)名為山萘酚-3-O-[4″,6″-雙(對(duì)-香豆酰基)]-α-D甘露吡喃糖甙，(kaempferol-3-O-(4″,6″-di-E-p-coumaroyl-)-α-D-mannopyranoside)]；栗甙C[化學(xué)名為槲皮素-3-O-β-D-甘露吡喃糖甙(quercetin-3-O-β-D-mannopyranoside)]；和栗甙D[化學(xué)名為楊梅樹皮素3-O-β-D-甘露吡喃糖甙(Myricetin-3-O-β-D-mannopyranoside D)]。
本發(fā)明化合物可用口服方法或非腸胃道用藥?？诜盟幙梢允瞧瑒⒛z囊劑、顆粒劑、包衣劑，非經(jīng)腸用藥劑型有注射劑和栓劑等。這些制劑是按照本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法制備的。為制造片劑、膠囊劑、包衣劑所用的輔料是常規(guī)用的助劑，例如淀粉，明膠，阿拉伯膠，硅石，聚乙二醇，液體劑型所用的溶劑例如有水，乙醇，丙二醇，植物油類如玉米油，花生油橄欖油等。含有本發(fā)明化合物的制劑中還可有其它助劑，例如表面活性劑，潤(rùn)滑劑，崩解劑，防腐劑，矯味劑，色素等。
在片劑、膠囊劑、包衣劑、注射劑或栓劑中含有本發(fā)明通式(Ⅰ)化合物的劑量是以單元?jiǎng)┬椭写嬖诘幕衔锪坑?jì)算的。在單元?jiǎng)┬椭斜景l(fā)明式Ⅰ(Ⅰ)為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，以下將結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但是非限定性的描述。
實(shí)施例1取板栗花粗粉50g,50％乙醇回流提取，每次1小時(shí)，提取3次，所得液100℃濃縮成膏狀，然后以原料250ml水沉降，離心，得澄清的水液。
該水液經(jīng)大孔樹脂吸附，柱以70％的乙醇洗脫，洗脫液50℃減壓濃縮，用所得膏3倍硅膠拌樣，晾干，于索氏提取器中，醋酸乙酯提取，提取液濃縮蒸干得板栗花總黃酮部位1.8g。
板栗花總黃酮以少量乙醇溶解，1.8g硅膠拌樣，用樣品36g硅膠上柱，氯仿∶甲醇/99∶1-80∶20梯度洗脫，用硅膠板薄層層析檢測(cè)，相同流分合并。
所得流分分別經(jīng)低壓硅膠柱純化，在0℃重結(jié)晶，得栗甙B105mg，栗甙A10mg，栗甙C42mg，栗甙D31mg。
實(shí)施例2按照實(shí)施例1的方法，取板栗花粗粉50g，用95％乙醇回流提取之，提取3次，每次1小時(shí)，所得液在70攝氏度下濃縮成膏狀，然后以原料250ml水沉降，離心，得澄清的水液。
該水液經(jīng)大孔樹脂吸附，柱以60％的乙醇洗脫，洗脫液100攝氏度下減壓濃縮，用所得膏1倍硅膠拌樣，晾干，于索氏提取器中，醋酸乙酯提取，提取液濃縮蒸干得板栗花總黃酮部位1.2g。
板栗花總黃酮以少量乙醇溶解，3.6g硅膠拌樣，用樣品24g硅膠上柱，氯仿∶甲醇/99∶1-80∶20梯度洗脫，用硅膠板薄層層析檢測(cè)，相同流分合并。
所得流分分別經(jīng)低壓硅膠柱純化，在20攝氏度重結(jié)晶，得栗甙B62mg，栗甙A6mg，栗甙C11mg，栗甙D13mg。
實(shí)施例3按照實(shí)施例1的方法，取板栗花粗粉50g,70％乙醇回流提取，每次1小時(shí)，提取3次，所得液在50攝氏度下濃縮成膏狀，然后以原料250ml水沉降，離心，得澄清的水液。
該水液經(jīng)大孔樹脂吸附，柱以40％的乙醇洗脫，洗脫液60℃減壓濃縮，用所得膏2倍硅膠拌樣，晾干，于索氏提取器中，醋酸乙酯提取，提取液濃縮蒸干得板栗花總黃酮部位2.6g。
板栗花總黃酮以少量乙醇溶解，5.2g硅膠拌樣，用樣品52g硅膠上柱，氯仿∶甲醇/99∶1-80∶20梯度洗脫，用硅膠板薄層層析檢測(cè)，相同流分合并。
所得流分分別經(jīng)低壓硅膠柱純化，在-5攝氏度重結(jié)晶，得栗甙B150mg，栗甙A35mg，栗甙C61mg，栗甙D23mg。
經(jīng)理化分析經(jīng)過實(shí)施例1-3得到的栗甙A、B、C、D，得知其結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)如下栗甙A(castanoside A) R1=R3=H R2=OHR4=R5=R6=HR7=TPCC-1″ =β型C-2″ =β型C-4″ =α型板栗甙B(castanoside B)R1=R3=H R2=OHR4=R5=H R6=R7=TPCC-1″ =β型C-2″ =β型C-4″ =α型栗甙C(castanoside C) R1=H R3=R2=OHR4=R5=R6=R7=HC-1″ =β型C-2″ =α型C-4″ =β型栗甙D(castanoside D)R1=R2=R3=OHR4=R5=R6=R7=HC-1″ =β型C-2″ =α型C-4″ =β型Castanoside A:mp248℃；元素分析為C,60.70％；H,4.42％.calcd.value:C,60.61％；H,4.38％；UV(MeOH)λmax315,265nm,+NaOMe 370,315nm:+AlCl3365,315nm；+AlCl3/HCl 315,265nm；+NaOAc 375,280nm；+NaOAc/H3BO3375,265.nm；IR(KBr)νmax:3393(OH),2916,1692(C=O),1686(C=O),1655,1606,1515(Ar)1439,1360,1018cm-1；1H and13C NMR data see Table 1；EIMS m/z:286,229,213,184,164,146,128,121,83,73,65,41.FABMS m/z:595[M+H]+,567,553,467,403,311,287,219,191,127,99。Castanoside B:mp236℃；元素分析為C,63.30％；H,4.28％.calcd.value:C,63.24％；H,4.32％；UV(MeOH)λmax: 314,268,225(sh)nm；+NaOMe 370,315nm+AlCl3:370,310nm；+AlCl3/HCl 315,268nm；+NaOAC 370,280nm；±NaOAC/H3BO3375,265nm；IR(KBr)νmax:412(OH),2960,1690(C=O),1655(C=O),1632,1606,1515(Ar),1439,1359,1207,1024cm-1；1H and13C NMR data see Table1；EIMS m/z:286,269,249,229,201,184,164,136,121,108,93,83,69,51；FABMS m/z:741[M+H]+,455,287,271,185,147,115,107,104。Castanoside C:mp250℃；元素分析為C,54.23％；H,4.25％.calcd.value:C,54.31％；H,4.31％；UV(MeOH)λmax:365,255,225(sh)nm；+NaOAC415,307nm；+AlCl3410,307nn；+AlCl3/HCl 365,307nm；+NaOAc 415,315nm；+NaOAC/H3BO3385,315nm；IR(KBr)νmax:3514(OH),2924,,1656(C=O),1607,1567,1501(Ar),1367,1088 cm；1H and13C NMR see Table 2；EIMS m/z:358,336,302,286,257,229,200,167,153,125,125,97,57；FABMSm/z:465[M+H]+,429,394,375,303,275,19,182,99。Castaneside D.mp246℃；元素分析為C,52.45％；H,4.22％.calcd.value:C,52.50％；H,4.17％；UV(MeOH)λmax:370,270nm,+NaOMe420,270nm；+NaOAc 430,280nm；+NaOAc/H3BO3380,260nm；+AlCl3430,280nm；+AlCl3/HCl365,260nm；IR(KBr)vmax:3388(OH),2940,1655(C=O),1604,1572,1508(Ar),1492,1317,1202,1029 cm-1,1H and13C NMR see Table 2；EIMSm/z:368,318,302,273,245,219,191,170,144,112,97,60；FABMS m/z:481[M+H]+,413,365,319,219,191,115.
表1栗甙A-B的核磁共振譜的數(shù)據(jù)1H and13C NMR(,DMSO-D6)
表2栗甙C-D的核磁共振譜的數(shù)據(jù)1H and13C NMR(DMSO-d6)
實(shí)驗(yàn)例1板栗花黃酮化合物對(duì)小鼠耐缺氧作用的試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分組每組8只，灌胃給藥，每日一次，每次0.5ml/20g鼠(藥物濃度為20mg/ml)，連續(xù)灌胃7天，于最后一次給藥后1.5小時(shí)開始做耐缺氧試驗(yàn)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，板栗花黃酮組與對(duì)照組比較，有非常顯著性差異(P＜0.01)。說明板栗花黃酮對(duì)心血管有作用，是一個(gè)很有希望的新一類型的治療心血管作用。實(shí)驗(yàn)例2板栗花黃酮化合物對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)因受小鼠灌胃量的影響，無法測(cè)定，故做了耐受量的試驗(yàn)，給小鼠一次性灌胃栗花總黃酮0.8ml/20g(1.6g/kg)，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，觀察7天，無死亡，生長(zhǎng)良好。解剖觀察，主要臟器無明顯異常，初步表明本品毒副作用很小。
由此可見，板栗花黃酮化合物有酚羥基及不飽和雙鍵，預(yù)示其有抗氧化，清除氧自由基作用，改善腦血液循環(huán)，可用于抗衰老，心腦血管疾病治療，如高血壓，冠心病等疾病，而且這類疾病發(fā)病率高，數(shù)量大。因此這類化合物有其重要醫(yī)療用途，其開發(fā)前景較好，有潛在市場(chǎng)和可觀經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種通式(Ⅰ)的板栗花黃酮類化合物， 其中R1為H，或OH；R2為H，或OH；R3為H，或OH；R4為TPC、CPC、或H；R5為TPC、CPC、或H；R6為TPC、CPC、或H；R7為TPC、CPC、或H； 或?yàn)棣列停驗(yàn)棣滦汀?br> 2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物為山奈酚3-O-(6″-E-對(duì)-香豆酰基)-α-D-甘露吡喃糖甙。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物為山萘酚-3-O-[4″,6″-雙(E-對(duì)-香豆?；?]-α-D-甘露吡喃糖甙。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物為槲皮素-3-O-β-D-甘露吡喃糖甙。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于所述的化合物為楊梅樹皮素3-O-β-D-甘露吡喃糖甙。
6.一種含有藥物有效計(jì)量的如權(quán)利要求1所述的化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
7.一種如權(quán)利要求1所述的板栗花黃酮類化合物的制備方法包括以下步驟●采用50-95％乙醇回流提取板栗花粗粉，提取3次，每次1小時(shí)；●所得液在50-100攝氏度下濃縮成膏狀，然后以原料5倍量的水沉降，離心，得澄清的水液?！駥⒃撍航?jīng)大孔樹脂吸附，柱以40-70％的乙醇洗脫；●洗脫液50-100攝氏度減壓濃縮，用所得膏狀物；●以1-3倍硅膠拌樣，晾干，于索氏提取器中，醋酸乙酯提取，提取液濃縮蒸干，得板栗花總黃酮部位?！裼靡掖既芙獾玫降陌謇趸傸S酮，1-3倍硅膠拌樣，用樣品20倍硅膠上柱，氯仿∶甲醇/99∶1-80∶20梯度洗脫，用硅膠板薄層層析檢測(cè)，相同流分合并。●所得流分分別經(jīng)低壓硅膠柱純化，在-5-20℃重結(jié)晶，得本發(fā)明化合物。
8.如權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗缺氧藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的化合物,特別是一種板栗花黃酮化合物及其提取方法。該化合物具有有抗氧化,清除氧自由基作用,改善腦血液循環(huán),可用于抗衰老,心腦血管疾病等的治療。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1323797SQ0013413
公開日2001年11月28日 申請(qǐng)日期2000年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月17日
發(fā)明者丁杏苞, 王嗣, 王曉靜, 解硯英, 仲英, 左春旭, 王福文 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所