專利名稱：重組人血小板生成素制劑的制備生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用攜帶編碼人血小板生成素蛋白質的核苷酸序列的真核細胞表達系統(tǒng)，大規(guī)模生產重組人血小板生成素蛋白質的方法。特別是涉及以高產率為目的的分離和純化高比活性人血小板生成素的方法。
人血小板生成素(hTPO)是一種刺激血小板前體——巨核細胞生長成熟及分化的一種細胞因子，是分子量為70-100千道爾頓的一種糖蛋白。該蛋白質作為一種正常激素，可刺激巨核細胞前體細胞的增殖和分化，并促進巨核細胞成熟，使其形態(tài)變大并多倍體化，并進一步產生血小板。因此臨床上可用于治療多種原因引起的血小板減少。美國專利號NO.5,986,049(ZymoGenetics，Seattle，USA)和美國專利號NO.5,744,587(ZymoGenetics，Seattle，USA.)分別公開了以親和層析法純化血小板生成素的方法，前者使用親和層析和離子交換層析對哺乳動物的血小板生成素進行了純化，所得TPO純度達到90％以上。后者以吸附法、親和層析和疏水層析法制備由BHK細胞表達的人血小板生成素，由700升收獲培養(yǎng)基中獲得了250毫克蛋白。
綜上所述，這些現有材料所描述的工藝或者純度達不到臨床使用的要求，或者工藝復雜，產率較低，均不能獲得令人滿意的效果。特別是要以高收率、低成本獲得高比活性的基因工程產品，對表達系統(tǒng)的選擇，培養(yǎng)方法的確定，純化工藝的建立等方面需進行深入研究和長期驗證，否則要真正實現人血小板生成素的商品化并獲取應有的利益將是不可能的。
迄今為止，已建立并在生產實踐中成功地使用了許多從天然來源或從以DNA重組技術制備的轉化體細胞及其培養(yǎng)物中分離和純化所需目的產物的方法，這些方法包括鹽析、超濾、電泳(如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦、毛細電泳等)、柱層析(如離子交換層析、凝膠層析、高效液相層析、親和層析等)。由于所需產物分子量大小、帶電性和分子電荷數目、親水性及等電點的不同，改變在分離和純化產物時所需的方法或方法組合及它們的次序也將完全不同。因此在找到一套適合工業(yè)化生產規(guī)模使用的對重組菌株或細胞株的發(fā)酵培養(yǎng)條件，以提高產物表達效率，并且改進分離和純化DNA重組產物，如目前已在臨床應用中證實其效果十分顯著的重組人血小板生成素(rhTPO)的方法，是一個本領域有待解決的問題。
本發(fā)明是通過采用本實驗室構建的攜帶編碼人血小板生成素蛋白質的核苷酸序列的真核細胞(CHO細胞)為表達系統(tǒng)，中國專利公開號為CN 1127785A，利用特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件及連續(xù)柱層析方法來實現的。其技術方案要點包括以下步驟取凍存的生產細胞株，39℃水浴，在無菌操作下離心。棄上清后加入適量的含5-20％胎牛血清的合成培養(yǎng)基，所使用的合成培養(yǎng)基是α-MEM培養(yǎng)基，還可以是DMEM培養(yǎng)基，F12培養(yǎng)基。并接種于細胞培養(yǎng)瓶中，在二氧化碳孵箱中37℃培養(yǎng)。待細胞生長良好并貼滿培養(yǎng)瓶壁后，繼續(xù)傳代(傳三代)培養(yǎng)。用顯微鏡觀察細胞的狀態(tài)，在細胞呈梭形，生長狀態(tài)良好時，棄去舊培養(yǎng)基，用消化液將細胞消化，收集于接種瓶中。用于接種的細胞數量為2.5×106個/毫升。
含人血小板生成素基因的重組細胞株的表達采用連續(xù)型細胞反應器(以下簡稱細胞罐)，加入纖維素載體片(Disc)、PBS緩沖液(pH6.5-7.5)，連好管路，高壓滅菌。待細胞罐冷卻至室溫后接入主機，并連接空氣、氧氣、二氧化碳、氮氣等四種氣體。校正好pH電極和溶氧電極后，排出細胞罐內的PBS緩沖液，加入含5-20％胎牛血清的合成培養(yǎng)基，再將細胞接種液緩慢加入細胞罐中，調節(jié)攪拌轉數為50轉/分鐘，溫度為36-38℃，通入四種氣體，控制溶氧在30-80％，pH6.5-7.5，進行貼壁培養(yǎng)一段時間。然后提高轉數到80-100轉/分鐘，進行細胞罐內擴增培養(yǎng)7-12天。(有血清培養(yǎng)基可有效刺激細胞的分化和增殖)。將含胎牛血清的合成培養(yǎng)基更換為無蛋白的合成培養(yǎng)基，所使用的無蛋白培養(yǎng)基是BPT-6培養(yǎng)基，還可以是CD CHO Medium，CHO-III-PFM。用連續(xù)灌流培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，應用AFS軟件控制細胞的發(fā)酵條件，包括溫度、溶氧、pH值等。收獲的培養(yǎng)基于4-8℃低溫貯藏。本生產條件下收獲的培養(yǎng)基中rhTPO的表達產量可達到1萬工作單位/毫升培養(yǎng)液(相當于40毫克rhTPO蛋白/升培養(yǎng)液)。同時應用無蛋白的合成培養(yǎng)基可降低純化過程中雜蛋白質的含量，增加各層析色譜柱的容量，延長其使用壽命，有效提高半成品的純度。
取收獲的培養(yǎng)基用濾膜過濾，以PELLICON超濾系統(tǒng)，10,000或30,000 MWCO超濾板濃縮5-10倍。然后以15-20倍體積的pH5.5-6.5，10-20mM的緩沖液脫鹽，所使用的緩沖液是檸檬酸緩沖液，還可以是磷酸鹽緩沖液，Tris-HCl緩沖液。濃縮脫鹽液以一定的流速上預先用pH5.5-6.5，10-20mM的上述緩沖液平衡的陽離子交換層析柱，所使用的陽離子交換介質是SP Sepharose FF，還可以是CM Sepharose FF，Source15 S，Source 30 S，SP Sepharose HP。再用平衡緩沖液平衡層析柱。先用5-15倍柱體積含有0.05-0.2M NaCl的平衡緩沖液沖洗柱子，再用含0.05-0.2M NaCl和0.2-0.8％tween 20和2-6M脲和0.5-1.5mM甘氨酸的平衡緩沖液洗脫，收集的洗脫峰直接上凝膠層析柱脫鹽，所使用的凝膠層析介質是Sephadex G-25 Medium，還可以是Sephadex G-25Coarse，Sephadex G-25 Fine，Sephadex G-25 Superfine，Sephadex G-50Coarse，Sephadex G-50 Medium，Sephadex G-50 Fine，Sephadex G-50Superfine，用pH6.5-7.5，含10-30μM硫酸銅的10-20mM緩沖液洗脫，所使用的緩沖液是Tris-HCl緩沖液，還可以是磷酸鹽緩沖液，檸檬酸緩沖液，收集洗脫峰。洗脫峰直接上預先以上述緩沖液平衡的陰離子交換層析柱，所使用的層析介質是Q Sepharose FF，還可以是DEAESepharose FF，Source 15 Q，Source 30 Q，Q Sepharose HP。上樣結束后先用2-5倍柱體積的平衡緩沖液平衡柱子，再用3-10倍柱體積的含4-8M脲和0.5-1.5mM甘氨酸和2-6mM醋酸和10-30μM硫酸銅的溶液沖洗，最后以3-10倍柱體積的含0.08-0.25M NaCl的平衡緩沖液洗脫，收集洗脫峰，加入EDTA至終濃度0.5-1.5mM，放置過夜。反相高效液相層析柱(孔徑300，粒度12-15μm)用A液(含0.01-0.03％tween 20和5％異丙醇的10-20mM Tris-HCl溶液，pH6.0-7.0，其中的異丙醇還可以是乙醇，乙腈)充分平衡，所使用的反相層析介質是Polymeric C4Protein，還可以是Sourse 15 RPC，Sephasil Protein C4。直接泵入陰離子交換柱的洗脫峰樣品，以A液洗平，然后用B液(含0.01-0.03％tween 20和95％異丙醇的10-20mM Tris-HCl溶液，pH6.0-7.0，其中的異丙醇還可以是乙醇，乙腈)進行梯度洗脫(0％-100％B)，收集30-60％B時的洗脫峰。HPLC活性峰直接上凝膠層析柱，所使用的凝膠層析介質是Sephacryl S-200 High Resolution，還可以是Superdex 200 prep grade，Sephacryl S-300 High Resolution，Superose 12 prep grade，Superose6 prep grade，Sephadex G-150，Sephadex G-200。用含100-200mMNaCl，pH6.4-7.4，10-20mM的緩沖液洗脫，所使用的緩沖液是磷酸鹽緩沖液，還可以是檸檬酸緩沖液，Tris-HCl緩沖液。收集蛋白峰(即rhTPO)。取樣測定rhTPO的比活、蛋白含量，經質檢合格后將rhTPO中加入穩(wěn)定劑，所使用的穩(wěn)定劑是0.25-2％的人血白蛋白，還可以是明膠，聚山梨醇酯類，糊精。無菌過濾后制成rhTPO成品制劑。經本工藝純化的rhTPO，其純度可達100％，比活可達到3×105工作單位/毫克蛋白。
工作單位是經依賴細胞測得的體外活性計算而來。
下面借助實施例進一步舉例描述本發(fā)明，但這些實施例并不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例一細胞的增殖取凍存細胞株，39℃水浴，無菌操作下離心(1000轉/分鐘×5分鐘)。棄上清后加入5毫升含5％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(每10升含α-MEM100.2克，胎牛血清500毫升，葡萄糖35克，碳酸氫鈉22克)吹打均勻，接種于100毫升細胞培養(yǎng)瓶中，再加10毫升含5％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，于37℃、含5％CO2的二氧化碳孵箱(Forma公司生產)中培養(yǎng)。待細胞生長狀態(tài)良好，貼滿培養(yǎng)瓶壁后，傳入四個500毫升培養(yǎng)瓶中，并在細胞再次貼滿瓶壁時，傳入32瓶500毫升的培養(yǎng)瓶。用顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞處于對數生長期時，棄去舊培養(yǎng)基，用消化液(每升含有EDTA 0.2克，葡萄糖1克，胰酶2克，pH7.6)將細胞消化，收集于接種瓶中。用于接種的細胞數量為2.5×106個/毫升，共900毫升。
實施例二重組人血小板生成素的表達細胞罐采用容積為5升的連續(xù)型細胞反應器(CELLIGEN PLUS，NBS公司制造)，加入150克纖維素載體片(Disc，LifeGen Inc.生產)、3.5升的PBS緩沖液(pH7.0)，連好管路，在121℃、15磅下高壓滅菌1.5小時。待細胞罐冷卻至室溫后接入主機，連接空氣、氧氣、二氧化碳和氮氣等四種氣體，校正好pH電極和溶氧電極。排出細胞罐內的PBS緩沖液，加入2500毫升含5％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，再將900毫升細胞接種液緩慢加入細胞罐中，調節(jié)轉數為50轉/分鐘，通入四種氣體(氧氣、氮氣、二氧化碳氣和壓縮空氣)，控制溶氧50％，pH7.0，使細胞貼壁生長四小時。然后提高轉數到80轉/分鐘，繼續(xù)擴增培養(yǎng)十天。將培養(yǎng)基更換成無蛋白的合成培養(yǎng)基(每10升含BPT-6培養(yǎng)基165克，碳酸氫鈉24克，丁酸鈉0.55克)，用連續(xù)灌流培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，應用AFS軟件(NBS公司設計生產)控制細胞發(fā)酵條件(溫度37℃、溶氧50-80％、pH6.8-7.4，培養(yǎng)基灌流量為3升/天)，收獲液于4-8℃低溫下貯藏。
實施例三rhTPO的超濾取收獲培養(yǎng)基40升，用1.0微米的預濾器過濾。以PELLICON超濾系統(tǒng)，一塊30,000 MWCO超濾板在以6升/分鐘的流速濃縮至4升。然后在同樣的流速下以80升的pH6.0，20mM檸檬酸緩沖液脫鹽。
實施例四陽離子交換層析純化rhTPO將濃縮脫鹽液上樣于體積為1000毫升預先用pH6.0，20mM檸檬酸緩沖液平衡好的SP陽離子交換層析柱，流速20毫升/分鐘，用3升的平衡緩沖液平衡SP Sepharose Fast Flow柱。接著先用10升的0.1MNaCl-20mM檸檬酸緩沖液，pH6.0沖洗柱子，再用5升的0.1M NaCl-0.5％tween 20-4M Urea-1mM Gly的20mM Citra洗脫，洗脫流速60毫升/分鐘。
實施例五凝膠層析純化rhTPO收集的洗脫峰上4000毫升的Sephadex G-25柱，用20mMTris-HCl-20μM硫酸銅，pH7.0洗脫，流速40毫升/分鐘，收集脫鹽峰。
實施例六陰離子交換層析純化rhTPO脫鹽峰直接上預先以20mM Tris-HCl，pH7.0平衡好的300毫升的Q Sepharose FF層析柱，上樣流速10毫升/分鐘，上樣結束后先用1升的20mM Tris-HCl，pH7.0沖洗柱子，再用1500毫升的6M Urea-1mMGly-5mM HAc-20μM硫酸銅溶液沖洗，接著用20mM Tris-HCl，pH7.0的平衡液將柱床pH洗至7.0，以1500毫升的0.14M NaCl-20μM硫酸銅-20mM Tris-HCl，pH7.0洗脫，洗脫流速20毫升/分鐘，收集洗脫峰，加入EDTA至終濃度1mM，無菌過濾，放置過夜。
實施例七高效液相層析純化rhTPOHPLC柱填料為C4(孔徑300，粒度15μm，Separation Group生產)，柱體積100毫升，先用1000毫升的A液(5％異丙醇-0.01％tween20-10mM Tris-HCl，pH6.4)充分平衡后，直接泵入Q柱的洗脫峰樣品，上樣流速7毫升/分鐘，以500毫升的A液洗平，然后用2000毫升的A液和2000毫升的B液(95％異丙醇-0.01％tween 20-10mM Tris-HCl，pH6.4)進行梯度洗脫(0％-75％B)，洗脫流速7毫升/分鐘，收集45％異丙醇時的洗脫峰。
實施例八凝膠層析純化rhTPOHPLC活性峰分數次上Sephacryl S-200 High Resolution柱，柱體積375毫升，每次上樣5-10毫升，用150mM NaCl-10mM PB(pH6.8)洗脫，洗脫流速3毫升/分鐘，收集蛋白峰(即rhTPO)，將幾次收集的蛋白峰合并，混合均勻，即得到rhTPO半成品。
實施例九rhTPO的制劑取樣測定rhTPO的比活、蛋白含量，經質檢合格后向rhTPO中加入0.5％的人血白蛋白做為穩(wěn)定劑，無菌過濾后制成rhTPO成品制劑。
經本工藝純化的rhTPO，由40升發(fā)酵培養(yǎng)液可獲得蛋白260毫克，其純度可達100％，比活可達到3×105工作單位/毫克蛋白。
權利要求
1.本發(fā)明的目的是提供一種在工業(yè)化生產規(guī)模上提高攜帶編碼人血小板生成素或其突變蛋白之基因的真核宿主細胞的表達效率的方法，以及提供一種在工業(yè)化生產規(guī)模上純化由攜帶編碼人促血小板生成素基因或其突變蛋白基因的真核宿主細胞產生的蛋白質的方法，該方法包括在轉化體細胞的培養(yǎng)中使用特殊合成的營養(yǎng)培養(yǎng)基并添加胎牛血清，葡萄糖和碳酸氫鈉，還包括在轉化體細胞的培養(yǎng)中使用特殊合成的無蛋白培養(yǎng)基并添加碳酸氫鈉和丁酸鈉，還包括將終發(fā)酵液依次經過超濾、陽離子交換層析、凝膠層析、陰離子交換層析、反相高效液相層析和凝膠過濾層析，最終加入保護劑制成rhTPO成品制劑。
2.根據權利要求1的方法，其中所說的營養(yǎng)培養(yǎng)基是α-MEM培養(yǎng)基，還可以是DMEM培養(yǎng)基，F12培養(yǎng)基。且其中添加的胎牛血清量為5-20％，添加的葡萄糖量為1-10克/升，碳酸氫鈉加入量為2-4克/升。
3.根據權利要求1的方法，其中所說的無蛋白培養(yǎng)基是BPT-6培養(yǎng)基，還可以是CHO-III-PFM培養(yǎng)基，CD CHO Medium培養(yǎng)基，且其中添加的碳酸氫鈉量為2-4克/升，丁酸鈉量為0.01-0.25克/升。
4.根據權利要求1的方法，攜帶編碼人血小板生成素基因或其突變蛋白基因的真核宿主細胞的表達應用一種可連續(xù)培養(yǎng)的生物反應器(CELLIGEN PLUS，NBS公司制造)，用連續(xù)灌流培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，應用AFS軟件控制細胞的發(fā)酵條件，使轉數為50-100轉分鐘，溫度為36℃-38℃、溶氧為30％-80％、pH值為6.5-7.5，灌流速度為每日0.5-15升。
5.根據權利要求1的方法，發(fā)酵培養(yǎng)液首先經過超濾濃縮及脫鹽，其中，濃縮倍數為5-10倍，脫鹽液為pH 5.5-6.5的10-20mM的檸檬酸緩沖液，還可以是磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液。
6.根據權利要求1的方法，其中的陽離子交換介質為SP Sepharose FF，還可以是CM Sepharose FF，Source 15 S，Source 30 S，SP Sepharose HP。在陽離子交換層析步驟中使用了含NaCl和tween 20和脲和甘氨酸的檸檬酸緩沖液進行洗脫活性峰，其中的檸檬酸緩沖液還可以是磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液，以使該層析步驟后所得產物的濃度達到約20-30％(W/W)。
7.根據權利要求1和權利要求6的方法，其中的試劑濃度分別為，0.05-0.2M的NaCl，0.2％-0.8％的tween 20，2-6M的脲，0.5-1.5mM的甘氨酸，檸檬酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液的濃度為10-20mM，緩沖液的pH值為5.5-6.5。
8.根據權利要求1的方法，其中在陽離子交換層析步驟后，使用了凝膠色譜柱進行脫鹽，所使用的凝膠介質是Sephadex G-25 Medium，還可以是Sephadex G-25 Coarse，Sephadex G-25 Fine，Sephadex G-25 Superfine，Sephadex G-50Coarse，Sephadex G-50 Medium，Sephadex G-50 Fine，Sephadex G-50Superfine，所使用的緩沖液是Tris-HCl緩沖液，還可以是檸檬酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液，濃度為10-20mM，含有10-30μM的硫酸銅，緩沖液的pH值為6.5-7.5。
9.根據權利要求1的方法，其中的陰離子交換介質為Q Sepharose FF，還可以是DEAE Sepharose FF，Source 15 Q，Source 30 Q，Q Sepharose HP，在陰離子交換層析步驟中，使用了含脲和甘氨酸和醋酸和硫酸銅的溶液洗脫雜蛋白，并用含NaCl的緩沖液洗脫活性峰，以使該層析步驟后所得產物的濃度達到約45-55％(W/W)。
10.根據權利要求1和權利要求9的方法，在陰離子交換層析步驟中，洗脫雜蛋白的溶液中含有4-8M的脲，0.5-1.5mM的甘氨酸，2-6mM的醋酸，10-30μM的硫酸銅，緩沖液的pH值為4.0-5.0。
11.根據權利要求1和權利要求9的方法，在陰離子交換層析步驟中，洗脫活性峰的緩沖液是Tris-HCl緩沖液，還可以是檸檬酸緩沖液，磷酸鹽緩沖液，濃度為10-20mM，加入的NaCl濃度為0.08-0.25M，硫酸銅的濃度為10-30μM，緩沖液的pH值為6.5-7.5。
12.根據權利要求1和權利要求9的方法，陰離子交換層析步驟中的活性峰應加入EDTA，加入的濃度為0.5-1.5mM。
13.根據權利要求1的方法，其中反相層析介質為Polymeric C4Protein，還可以是Sourse 15 RPC，Sephasil Protein C4，其孔徑300，粒度12-15μm，在反相高效液相層析步驟中使用含有tween20和一種有機溶劑的緩沖液進行梯度洗脫，其中的有機溶劑是異丙醇，還可以是乙醇，乙腈，其中的緩沖液是Tris-HCl緩沖液，以使該層析步驟后所得產物的濃度達到95％(W/W)以上，其中tween20的濃度為0.01％-0.03％，Tris-HCl的濃度為10-20mM，有機溶劑的濃度為5-95％(V/V)，緩沖液的pH值為6.0-7.0。
14.根據權利要求1的方法，其中凝膠過濾層析步驟中使用的介質是SephacrylS-200 High Resolution，還可以是Superdex 200 prep grade，Sephacryl S-300High Resolution，Superose 12 prep grade，Superose 6 prep grade，SephadexG-150，Sephadex G-200，使用了含有NaCl的緩沖液進行平衡和洗脫，以使該層析步驟后所得rhTPO產物的純度達到100％(W/W)，其中NaCl的濃度為100-200mM，緩沖液是磷酸鹽緩沖液，還可以是檸檬酸緩沖液，Tris-HCl緩沖液，濃度為10-20mM，緩沖液的pH值為6.4-7.4。
15.根據權利要求1的方法，半成品中加入的保護劑為人血白蛋白，濃度為0.25％-2％，還可以是明膠，聚山梨醇酯類，糊精。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大規(guī)模生產重組人血小板生成素的制劑方法。該方法包括用特殊培養(yǎng)基,在特定培養(yǎng)條件下培養(yǎng)攜帶有編碼人血小板生成素蛋白基因序列的被轉化的哺乳動物細胞,以獲得該蛋白質產物的高表達收獲液。然后對富含人血小板生成素的收獲液依次進行離子交換層析、反相高效液相層析及凝膠過濾純化,以獲得純度高并具有高生物活性的重組人血小板生成素。
文檔編號A61K38/27GK1276382SQ0010961
公開日2000年12月13日 申請日期2000年6月19日 優(yōu)先權日2000年6月19日
發(fā)明者路明踐, 蘇冬梅, 婁競 申請人:沈陽三生制藥股份有限公司