發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌20min。按照0.8%(v/v)的接種量接入活化的種子培養(yǎng)液， 后入180rpm的旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)，控制溫度為30°C，發(fā)酵6d。
[0024] 淡紫擬青霉YT08的發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心5min，分別收集菌體沉淀物和發(fā)酵上 清液，其中發(fā)酵上清液收集灌裝后可直接作為葉用農(nóng)業(yè)生防制劑使用，同時包含部分未降 解殼聚糖的菌體沉淀物即作為根施農(nóng)業(yè)生防制劑使用。發(fā)酵終止后的每升發(fā)酵液中，制備 的根施農(nóng)業(yè)生防制劑經(jīng)稱重確定濕重為142g，葉用農(nóng)業(yè)生防制劑中殼聚糖酶活力測定為 75.1 U/mL，經(jīng)DNS法測定其殼寡糖含量為7.2g。
[0025] 實施例2發(fā)酵罐(10L)培養(yǎng)同時制備葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑 活化培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨5，酵母粉3，葡萄糖20，粉末殼聚糖5，磷酸二氫鉀3，硫酸鎂2， 磷酸氫二鈉3，？!17.0。5001111三角燒瓶中分裝1001111活化培養(yǎng)基，121°(3滅菌201^11。從試管斜 面保存菌種中挑取1環(huán)接種于活化培養(yǎng)基中，在32°C、180 rpm下培養(yǎng)36 h至菌體渾濁，制得 活化種子液。
[0026]采用優(yōu)選的培養(yǎng)基（g/L):甘油30,大豆蛋白胨40，MnS〇4 3,粉末殼聚糖（90%以上 的脫乙酰度）30,蟹殼粉15，NaCl 5，CaCl2 3，MgS〇4 3，F(xiàn)eS〇4 1.5。以70%比例裝入發(fā)酵培養(yǎng) 基，裝液量為7L，經(jīng)118°C蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照1.5%( v/v)的比例接入 活化的菌種，通過調(diào)節(jié)酸堿蠕動栗控制發(fā)酵過程中的pH始終維持在pH 6.5,利用發(fā)酵罐的 加熱裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在34°C，溶解氧參數(shù)通過調(diào)節(jié)進罐的無菌空氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的大小 使其始終維持在10%以上，發(fā)酵7d。
[0027]淡紫擬青霉YT08的發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心5min，分別收集菌體沉淀物和發(fā)酵上 清液，其中發(fā)酵上清液收集灌裝后可直接作為葉用農(nóng)業(yè)生防制劑使用，同時包含部分未降 解殼聚糖的菌體沉淀物即作為根施農(nóng)業(yè)生防制劑使用。發(fā)酵終止后的每升發(fā)酵液中，制備 的根施農(nóng)業(yè)生防制劑經(jīng)稱重確定濕重203g，葉用農(nóng)業(yè)生防制劑中殼聚糖酶活力測定為 93.5U/mL，經(jīng)DNS法測定其殼寡糖含量為8.4g。
[0028]實施例3發(fā)酵罐(50L)培養(yǎng)同時制備葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑 活化培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨4，酵母粉2，葡萄糖15，粉末殼聚糖3，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂2， 磷酸氫二鈉2，？!17.0。5001111三角燒瓶中分裝1001111活化培養(yǎng)基，121°(3滅菌201^11。從試管斜 面保存菌種中挑取1環(huán)接種于活化培養(yǎng)基中，在30°C、180 rpm下培養(yǎng)34 h至菌體渾濁，制得 活化種子液。
[0029]采用優(yōu)選的培養(yǎng)基(g/L):甘油20,大豆蛋白胨30，MnS〇4 2,粉末殼聚糖(90%以上 的脫乙酰度）25,蟹殼粉12，NaCl 4，CaCl2 2，MgS〇4 2，F(xiàn)eS〇4 1。以70%比例裝入發(fā)酵培養(yǎng) 基，裝液量為35L，經(jīng)118°C蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照1%(v/v)的比例接入活 化的菌種，通過調(diào)節(jié)酸堿蠕動栗控制發(fā)酵過程中的pH始終維持在pH 6,利用發(fā)酵罐的加熱 裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在32°C，溶解氧參數(shù)通過調(diào)節(jié)進罐的無菌空氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的大小使其 始終維持在1 〇%以上，發(fā)酵5d。
[0030]淡紫擬青霉YT08的發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心5min，分別收集菌體沉淀物和發(fā)酵上 清液，其中發(fā)酵上清液收集灌裝后可直接作為葉用農(nóng)業(yè)生防制劑使用，同時包含部分未降 解殼聚糖的菌體沉淀物即作為根施農(nóng)業(yè)生防制劑使用。發(fā)酵終止后的每升發(fā)酵液中，制備 的根施農(nóng)業(yè)生防制劑經(jīng)稱重確定濕重185g，葉用農(nóng)業(yè)生防制劑中殼聚糖酶活力測定為 91.8U/mL，經(jīng)DNS法測定其殼寡糖含量為8.6g。
[0031] 實施例4根施農(nóng)業(yè)生防制劑的使用效果評價 實施例1中制備的根施農(nóng)業(yè)生防制劑命名為PL-1，實施例2中制備的根施農(nóng)業(yè)生防制劑 命名為PL-2,實施例3中制備的根施農(nóng)業(yè)生防制劑命名為PL-3。
[0032] 栽培基質(zhì)為無病土、有機肥和沙按照9:1:3比例混合配制，所用的栽培基質(zhì)經(jīng)檢測 均無線蟲存在。挑取12cm左右長度的番茄幼苗栽培在30X30cm的花盆中，每盆1株，共60株。 上述的60盆番茄苗的栽培基質(zhì)中均施入200條2齡番茄根結(jié)線蟲，其中30盆分別施入3g根施 農(nóng)業(yè)生防制劑，標(biāo)記為PL-l、PL-2和PL-3根施農(nóng)業(yè)生防制劑各占10盆；另外30盆再施入3g 濕酒糟作為空白對照。常規(guī)管理60天后，計算防治效果。
[0033]所用的番茄根結(jié)線蟲獲得途徑如下：采集溫室大棚中根結(jié)線蟲病株番茄的根系， 首先用水沖洗干凈，剪成小段后加入次氯酸鈉溶液中，封口搖動3分鐘后，先過200目篩并用 蒸餾水沖洗，再過500目篩，用蒸餾水反復(fù)沖洗后，收集于無菌小燒杯。將收集的根結(jié)線蟲卵 于26°C下孵化3天，即得到番茄根結(jié)線蟲的2齡幼蟲。
[0034] 根據(jù)根結(jié)著生的多少將病情嚴(yán)重程度分為5級:無根結(jié)的為0級，根結(jié)占全根系的 1%-25%的為1級，根結(jié)占全根系的26%-50%的為2級，根結(jié)占全根系的51% - 75%的為3級，根 結(jié)占全根系的76% -100%的為4級。病情指數(shù)和防治效果的計算公式如下： 盆栽試驗結(jié)果如表1所示，標(biāo)記為PL-UPL-2和PL-3根施農(nóng)業(yè)生防制劑防治番茄根結(jié)線 蟲的防治效果為分別為85.6%、85.9%和86.3%，三組供試制劑組的防治效果基本相同，且處 理組番茄的根重增長率、株高增長率和地上部分重量增長率均顯著高于對照組。
[0035] 表1根施農(nóng)業(yè)生防制劑對番茄根結(jié)線蟲的防治效果 實施例5葉用農(nóng)業(yè)生防制劑對植物病原菌的抑制效果評價 實施例1中制備的葉用農(nóng)業(yè)生防制劑命名為LBC-1，實施例2中制備的葉用農(nóng)業(yè)生防制 劑命名為LBC-2，實施例3中制備的葉用農(nóng)業(yè)生防制劑命名為LBC-3。
[0036] 采用抑制菌絲生長速率法測定葉用農(nóng)業(yè)生防制劑對植物病原菌的抑制效果。將葉 用農(nóng)業(yè)生防制劑加入滅菌融化的固體PDA培養(yǎng)基中，每100mL培養(yǎng)基加5mL，并用5mL的無菌 水做空白對照，混勻倒平板。首先將三種植物病原菌(蘋果炭疽菌、西瓜枯萎菌和番茄灰霉 菌)分別采用固體Η)Α培養(yǎng)基活化，至形成直徑lcm以上的菌落，然后用直徑0.5cm的打孔器 在已經(jīng)活化的供試農(nóng)業(yè)病原菌的菌落邊緣，按同心圓制備菌餅并接種于已加入葉用農(nóng)業(yè)生 防制劑的固體PDA平板上，每個處理設(shè)3個重復(fù)，于28°C恒溫培養(yǎng)5d，采用十字交叉法測量菌 落直徑。
[0037] 抑菌率(％)=(對照凈生長量-處理凈生長量)/對照凈生長量* 100 % 凈生長量=三次重復(fù)平均值(cm) - 0.5cm 葉用農(nóng)業(yè)生防制劑的使用效果評價見表2。由表2可以看出，制備的三種葉用農(nóng)業(yè)生防 制劑對蘋果炭疽菌、西瓜枯萎菌和番茄灰霉菌均有較強的抑制作用，采用不同培養(yǎng)條件制 備的葉用農(nóng)業(yè)生防制劑對植物病原菌的抑制效果略有差異。
[0038]表2葉用農(nóng)業(yè)生防制劑對植物病原菌的抑制效果評價 綜上所述，本發(fā)明的優(yōu)點在于葉用農(nóng)業(yè)生防制劑和根施農(nóng)業(yè)生防制劑分別對植物病原 菌和根結(jié)線蟲具有高抑制率，制備方法簡單且控制工藝條件相對容易，適合大規(guī)模工廠化 生產(chǎn)，其在經(jīng)濟作物植物病原菌防治和根結(jié)線蟲病防治的方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項】
1. 一種葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑同時制備的方法及其應(yīng)用，其特征在于：是由保藏號 為CGMCCNo. 10026的菌株經(jīng)液體發(fā)酵后獲得的，分別對植物病原菌和根結(jié)線蟲均有強抑制 作用，其制備方法包括如下步驟： (1) 菌種活化:從試管斜面保存菌種中挑取1環(huán)接種于活化培養(yǎng)基中，在30~32°C、180 rpm下培養(yǎng)30~36h至菌體渾濁，制得活化種子液;所述的活化培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨3~5， 酵母粉1~3,葡萄糖10~20,粉末殼聚糖2~5,磷酸二氫鉀1~3,硫酸鎂1~2,磷酸氫二鈉1 ~3，pH7.0; (2) 搖瓶培養(yǎng)液體發(fā)酵:每500ml三角燒瓶中分裝200ml優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌 20min，按照0.8~1.5%(v/v)的接種量接入活化的種子培養(yǎng)液，后入180rpm的旋轉(zhuǎn)搖床中培 養(yǎng)，控制溫度為30~34°C，發(fā)酵5-8d; (3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)液體發(fā)酵：以70%比例裝入優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)118°C蒸汽滅菌20min 后，按照0.8~1.5%(v/v)的比例接入活化的菌種，控制發(fā)酵pH在pH5~6.5，調(diào)節(jié)溫度在30 ~34°C，溶解氧維持在10%以上，發(fā)酵4-7d; (4) 產(chǎn)品制備:淡紫擬青霉YT08的發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心5min，分別收集菌體沉淀物 和發(fā)酵上清液，其中發(fā)酵上清液收集灌裝后可直接作為葉用農(nóng)業(yè)生防制劑使用，同時包含 部分未降解殼聚糖等的菌體沉淀物即為根施農(nóng)業(yè)生防制劑。2. 如權(quán)利要求1所述的葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑同時制備的方法及其應(yīng)用，其特征在 于，采用的優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)為:甘油18~30,大豆蛋白胨25~40，MnS〇4 1~3,粉末殼 聚糖20~30,蟹殼粉10~15，NaCl2~5，CaCl2 1~3，MgS〇4 1~3，F(xiàn)eS〇4 0.5~1.5。3. 如權(quán)利要求1所述的葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑同時制備的方法及其應(yīng)用，其特征在 于，采用的誘導(dǎo)底物為粉末殼聚糖(其脫乙酰度在90%以上)和蟹殼粉。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑同時制備的方法及其應(yīng)用，該產(chǎn)品是由保藏號為CGMCC？No.10026的淡紫擬青霉YT08經(jīng)液體發(fā)酵獲得的，發(fā)酵完畢后發(fā)酵液固液分離，含有菌體的固體部分直接作為根施農(nóng)業(yè)生防制劑，而液體部分即為葉用農(nóng)業(yè)生防制劑。本發(fā)明的制備方法簡單，生產(chǎn)過程易于控制，適合工廠大規(guī)模生產(chǎn)，且葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑分別對植物病原菌和根結(jié)線蟲具有強抑制效果。CGMCC No.1002620141126
【IPC分類】A01P3/00, A01P5/00, A01N63/04, C12R1/79, C12P1/02, C12N1/14
【公開號】CN105441485
【申請?zhí)枴緾N201510808844
【發(fā)明人】程仕偉, 解孝滿, 張萍, 繆靜, 劉丹, 李加文
【申請人】魯東大學(xué)
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年11月23日