一種葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑同時(shí)制備的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑同時(shí)制備的方法，以及其在農(nóng)作物病原 菌和根結(jié)線蟲生物防治中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物線蟲病是農(nóng)作物、蔬菜、果樹、林木、花卉及藥材種植的四大病源生物之一，其 危害僅次于真菌，超過細(xì)菌和病毒。植物寄生線蟲每年造成世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的損失約1000億 美元，全球農(nóng)業(yè)上最重要的危害線蟲是根結(jié)線蟲和胞囊線蟲，我國(guó)較為嚴(yán)重的線蟲有根結(jié) 線蟲、大豆胞囊線蟲、小麥粒線蟲、甘薯莖線蟲、水稻干尖線蟲、栗線蟲、松材線蟲等，僅我國(guó) 農(nóng)作物種植業(yè)線蟲病損失就達(dá)600億元。植物寄生線蟲的防治通常靠化學(xué)殺線蟲劑、栽培技 術(shù)、培育抗性品種和生物農(nóng)藥，但是目前仍無特效的化學(xué)農(nóng)藥，且由于潛在的環(huán)境問題，涉 及人類和動(dòng)物健康，殺線蟲劑的使用受到很大的限制。
[0003] 淡紫擬青霉能廣泛寄生于線蟲卵，殺蟲效果高效，被認(rèn)為是最具有應(yīng)用前景的根 結(jié)線蟲生防真菌，該菌具有功效高、寄生廣、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，特別是在控制植物病源線蟲方 面功效顯著。作為一種生物制劑，淡紫擬青霉在殺線蟲過程中具有安全、高效、持效期長(zhǎng) 等特點(diǎn)，其殺線蟲的活性并不比化學(xué)殺線蟲劑差，并有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。淡紫擬青霉除 了具有殺線蟲效果外，還可以寄生半翅目、同翅目、等翅目和鞘翅目及鱗翅目等昆蟲，另外 對(duì)植物病原菌具有拮抗作用。淡紫擬青霉的次級(jí)代謝物也有一定的生理效能，如產(chǎn)生類似 吲哚乙酸產(chǎn)物，促進(jìn)植物根系和植株生長(zhǎng)，對(duì)種子萌發(fā)和生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，還能產(chǎn)生多種 功能酶并具有一定的化學(xué)農(nóng)藥降解效應(yīng)。
[0004] 殼寡糖是新一代海洋生物源農(nóng)藥，具有無毒害、不污染環(huán)境、兼有藥效和肥效雙重 生物調(diào)節(jié)功能的特點(diǎn)，可誘導(dǎo)激活植物免疫系統(tǒng)，提高植物抗病毒能力。殼寡糖是以殼聚糖 為原料，經(jīng)酶法降解成的具有一定聚合度和結(jié)構(gòu)的系列產(chǎn)物。殼寡糖可作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié) 劑，能夠刺激植物的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，增強(qiáng)植物對(duì)病蟲害的防御能力。殼寡糖作為植物免疫激 活因子的基礎(chǔ)研究始于20世紀(jì)60年代，后來陸續(xù)報(bào)道殼寡糖對(duì)煙草花葉病毒病、稻瘟病 和紋枯病、核盤霉菌病原菌等植物病具有較好的防治作用，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖對(duì)植物體 內(nèi)多種功能酶具有較好的誘導(dǎo)激活作用，并且可誘導(dǎo)植保素合成，此外殼聚糖對(duì)鱗翅目和 同翅目等害蟲均具有一定的殺蟲活性。殼寡糖的生防效果在煙草、水稻、番茄、棉花、小麥、 草莓、油菜、黃瓜、大豆、辣椒、木瓜等農(nóng)作物中的防治效果均有很好的防效。因此殼寡糖具 有廣譜抑菌活性并對(duì)人畜無毒，開發(fā)殼寡糖生物源農(nóng)藥是減少化學(xué)農(nóng)藥施用量的有效途 徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)背景及其存在的不足，提供一種葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑實(shí) 現(xiàn)同時(shí)制備的方法，以及其在農(nóng)作物病原菌和根結(jié)線蟲生物防治中的應(yīng)用。以淡紫擬青霉 YT08為出發(fā)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵的方法同時(shí)生產(chǎn)制備葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑，其中葉用農(nóng) 業(yè)生防制劑對(duì)植物病原真菌有強(qiáng)抑制作用，根施農(nóng)業(yè)生防制劑對(duì)根結(jié)線蟲具有較強(qiáng)的殺滅 效果。
[0006] 本發(fā)明的目的可以通過如下措施來達(dá)到： 1. 一株具有防治番茄與葡萄根結(jié)線蟲病害的淡紫擬青霉，該菌株具有高產(chǎn)殼聚糖酶 的特性，其保藏名稱為:YT08,保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏日期：2014年11月26日，保藏號(hào)為CGMCC No. 10026,分類命名：淡紫擬青霉 (Paecilomyces lilacinus)。
[0007] 2.菌種活化 活化培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨3~5,酵母粉1~3,葡萄糖10~20,粉末殼聚糖2~5,磷酸二 氫鉀1~3,硫酸鎂1~2，磷酸氫二鈉1~3，pH 7.0。50〇1111三角燒瓶中分裝100ml活化培養(yǎng) 基，121°C滅菌20min。從試管斜面保存菌種中挑取1環(huán)接種于活化培養(yǎng)基中，在30~32°C、 180 rpm下培養(yǎng)30~36 h至菌體渾池，制得活化種子液。
[0008] 3.液體發(fā)酵 (1)搖瓶培養(yǎng) 采用優(yōu)選的培養(yǎng)基(g/L):甘油18~30,大豆蛋白胨25~40，MnS〇4 1~3,粉末殼聚糖 (90%以上的脫乙酰度）20~30,蟹殼粉10~15，NaCl 2~5，CaCl2 1~3，MgS〇4 1~3，F(xiàn)eS〇4 0.5~1.5，pH 5~6.5,每500ml三角燒瓶中分裝200ml發(fā)酵培養(yǎng)基，121°C滅菌20min。按照 0.8~1.5%( v/v)的接種量接入活化的種子培養(yǎng)液，后入180rpm的旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)，控制溫 度為30~34°C，發(fā)酵5-8d。
[0009] (2)發(fā)酵罐培養(yǎng) 采用優(yōu)選的培養(yǎng)基(g/L):甘油18~30,大豆蛋白胨25~40，MnS〇4 1~3,粉末殼聚糖 (90%以上的脫乙酰度）20~30,蟹殼粉10~15，NaCl 2~5，CaCl2 1~3，MgS〇4 1~3，F(xiàn)eS〇4 0.5~1.5。以70%比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)118°C蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護(hù)條件下按照 0.8~1.5%( v/v)的比例接入活化的菌種，通過調(diào)節(jié)酸堿蠕動(dòng)栗控制發(fā)酵過程中的pH始終維 持在pH 5~6.5，利用發(fā)酵罐的加熱裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在30~34°C，溶解氧參數(shù)通過調(diào)節(jié)進(jìn) 罐的無菌空氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的大小使其始終維持在10%以上，發(fā)酵4-7d。
[0010] 4.產(chǎn)品制備:淡紫擬青霉YT08的發(fā)酵液經(jīng)10000r/min離心5min，分別收集菌體沉 淀物和發(fā)酵上清液，其中發(fā)酵上清液收集灌裝后可直接作為葉用農(nóng)業(yè)生防制劑使用，同時(shí) 包含部分未降解殼聚糖等的菌體沉淀物即作為根施農(nóng)業(yè)生防制劑使用。制備的根施農(nóng)業(yè)生 物制劑經(jīng)稱重確定單位發(fā)酵液體積中的菌體含量，同時(shí)葉用農(nóng)業(yè)生防制劑經(jīng)DNS法分別測(cè) 定殼聚糖酶活力和殼寡糖的含量。
[0011] 所用的殼聚糖酶測(cè)定方法:葉用農(nóng)業(yè)生防制劑稀釋到合適的梯度，取0.2 mL加水 至lml，再加入lmL膠體殼聚糖底物溶液（1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)），在40°C水浴中保溫反應(yīng)20 min，加 DNS試劑3 mL，沸水浴5 min，定容至25ml后取4ml反應(yīng)樣液在5000 rpm下離心10min。以對(duì) 照組作為空白在520 nm處測(cè)定0D值，根據(jù)DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其酶活力。空白對(duì)照組:0.2 mL 稀釋到相同梯度的葉用農(nóng)業(yè)生防制劑，加水至lml，沸水浴5min滅活，再加入相同體積的殼 聚糖溶液和DNS試劑，處理方法同樣品組。酶活計(jì)算：以單位體積(mL)單位時(shí)間(min)水解產(chǎn) 生的氨基葡萄糖的umol數(shù)為酶活力的定義單位。
[0012] 所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:精確稱取100°C干燥至恒重的氨基葡萄糖鹽酸鹽0.13 g，加 蒸餾水溶解并定容至100 ml，配成.6 umol/mL濃度的溶液。按不同濃度梯度在各25mL比色 管中分別加入1 mL標(biāo)準(zhǔn)氨基葡萄糖溶液、1 mL的超純水和3mL的DNS顯色液，沸水浴反應(yīng)5 min，定容至25ml后于520mn下測(cè)0D值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0013] 所用的殼寡糖含量測(cè)定方法:在分光光度法的精準(zhǔn)檢測(cè)限內(nèi)，將葉用農(nóng)業(yè)生防制 劑稀釋到合適的梯度，在各25mL比色管中分別加入稀釋后葉用農(nóng)業(yè)生防制劑lmL、lmL的超 純水和3mL的DNS顯色液，沸水浴反應(yīng)5 min，定容至25ml后于520mn下測(cè)0D值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 確定殼寡糖的量并計(jì)算單位體積中葉用農(nóng)業(yè)生防制劑的殼寡糖總量。
[0014] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
的有益效果在于： 1.淡紫擬青霉YT08 CGMCC No. 10026是一株對(duì)農(nóng)作物根結(jié)線蟲具有強(qiáng)防治效果的絲 狀真菌，施入土壤后可以在植物根部定殖，通過自身特性產(chǎn)生大量的殼聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等 水解蛋白酶類，作為侵染因子進(jìn)入根結(jié)線蟲內(nèi)部，起到殺滅根結(jié)線蟲的效果，因此發(fā)酵后的 淡紫擬青霉YT08菌體可以作為根施的農(nóng)業(yè)生防制劑。
[0015] 2.發(fā)酵培養(yǎng)基中中添加過量的粉末殼聚糖和蟹殼粉，除一部分轉(zhuǎn)化為殼寡糖外， 還有部分未降解的殼聚糖、幾丁質(zhì)作為根結(jié)線蟲生物防治的輔助因子，另外其還可以抑制 多種植物病原菌，與菌體一起收集使用，形成生物防治的協(xié)同效應(yīng)，與淡紫擬青霉YT08-起 作為根施的農(nóng)業(yè)生防制劑。
[0016] 3.利用淡紫擬青霉YT08高產(chǎn)殼聚糖酶的特性，在菌體發(fā)酵過程中添加粉末殼聚 糖誘導(dǎo)產(chǎn)生殼聚糖酶，同時(shí)生成的殼聚糖酶又將培養(yǎng)基中的殼聚糖降解轉(zhuǎn)化為高生理活性 的低分子量殼寡糖，殼寡糖以溶解的方式存在于發(fā)酵液中，且對(duì)多種植物病原菌具有抑制 作用，因此殼寡糖可以作為生物農(nóng)藥，經(jīng)葉面噴灑后用于防治植物葉面的病原菌危害。
[0017] 4.淡紫擬青霉YT08在發(fā)酵培養(yǎng)過程中還會(huì)產(chǎn)生眾多的次生代謝產(chǎn)物，其多溶解于 水，可以促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，且對(duì)植物病原菌的抑制具有一定的增效作用，因此這些組分與生 成的殼寡糖形成協(xié)同效應(yīng)，經(jīng)葉面噴灑后用于防治植物葉面的病原菌危害。
[0018] 本發(fā)明的突出優(yōu)勢(shì)在于： 1.利用淡紫擬青霉YT08 CGMCC No. 10026高產(chǎn)殼聚糖酶及部分幾丁質(zhì)酶的特性，發(fā)酵 生產(chǎn)過程中添加粉末殼聚糖和蟹殼粉，實(shí)現(xiàn)在一種發(fā)酵工藝中同時(shí)制備根施和葉用農(nóng)業(yè)生 防制劑，節(jié)省設(shè)備投資，減小生產(chǎn)場(chǎng)地，降低生產(chǎn)成本。
[0019] 2.培養(yǎng)容易，操作方法簡(jiǎn)單高效，且由于淡紫擬青霉YT08對(duì)多數(shù)病原菌具有抑制 作用使其培養(yǎng)過程中不易染菌。
[0020] 3.本發(fā)明中制備的根施和葉用農(nóng)業(yè)生防制劑，分別對(duì)根結(jié)線蟲和植物病原菌具 有強(qiáng)抑制作用，市場(chǎng)前景廣闊。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述，這些實(shí)施例用于理解而不是限 制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 實(shí)施例1搖瓶培養(yǎng)同時(shí)制備葉用和根施農(nóng)業(yè)生防制劑 從試管斜面保存菌種中挑取1環(huán)接種于活化培養(yǎng)基中，在30°C、180 rpm下培養(yǎng)32 h至 菌體渾濁，制得活化種子液?；罨囵B(yǎng)基(g/L):蛋白胨3,酵母粉1，葡萄糖10,粉末殼聚糖2， 磷酸二氫鉀1，硫酸鎂1，磷酸氫二鈉1，ρΗ 7.0。50〇!111三角燒瓶中分裝100ml活化培養(yǎng)基， 121°C 滅菌 20min。
[0023] 采用優(yōu)選的培養(yǎng)基(g/L):甘油18,大豆蛋白胨25，MnS〇4 1，粉末殼聚糖(90%以上 的脫乙酰度)20,蟹殼粉 10，NaCl 2，CaCl2 l，MgS〇4 l，F(xiàn)eS〇4 0.5，pH 5,每500ml三角燒瓶中 分裝200ml