本發(fā)明涉及煙草工業(yè)領(lǐng)域，具體是一種生物技術(shù)提升再造煙葉香氣品質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：再造煙葉主要由煙末、碎片、煙?；虻痛螣熑~加入膠粘劑和其他添加劑等組成。煙末、碎片、煙梗是煙草工業(yè)的副產(chǎn)物，以前多作棄置處理。我國是煙草大國，每年有數(shù)十萬噸煙末、碎片、煙梗資源被廢棄，既造成環(huán)境污染，同時也是對自然資源的浪費(fèi)。研究表明，煙末、碎片、煙梗中含有的成分種類與煙葉成分基本一致，但是存在雜氣重、刺激性大和口感不適等吸味缺陷。再造煙葉的細(xì)胞壁物質(zhì)主要有纖維素、半纖維素、果膠、木質(zhì)素等。細(xì)胞壁物質(zhì)和淀粉含量高，煙葉粗糙，煙氣刺激大，不和順；水溶性糖含量高使煙葉吃味醇和，香氣優(yōu)美，但糖類化合物含量高，焦油釋放量大；過量的纖維素會賦予煙氣尖刺和灼熱感并產(chǎn)生嗆咳；煙草木質(zhì)素的熱裂解對煙草品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，木質(zhì)素含量越高，煙葉品質(zhì)越差，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，青雜氣重，吸味辛辣、澀口，其裂解時產(chǎn)生小分子醛類和苯酚類物質(zhì)，如丙烯醛、苯酚、1,2-苯二酚等。同時木質(zhì)素也是造紙工業(yè)排放黑液COD和色度形成的主要原因，其結(jié)構(gòu)是由甲氧基取代的對-羥基肉桂酸聚合而成的異質(zhì)多晶三維多聚體，分子間多為穩(wěn)定的醚鍵、C-C鍵，是目前公認(rèn)的微生物難降解芳香化合物之一。生物轉(zhuǎn)化法是在細(xì)胞或酶等生物催化下進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，即是指利用微生物(微生物的生長細(xì)胞、微生物的休止細(xì)胞)、酶(來自微生物或動植物的純酶或粗酶)或植物細(xì)胞，通過簡單的生物轉(zhuǎn)化或生物合成制備所需物質(zhì)的方法。與化學(xué)催化劑相比，生物催化劑專一性更強(qiáng)、催化活性更高、條件更易控制。可接受大量的外源復(fù)雜分子作為底物，化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性或?qū)τ尺x擇性的催化底物生成相應(yīng)的產(chǎn)物。生物轉(zhuǎn)化廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的生物合成、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化、有機(jī)化合物的不對稱合成、光學(xué)活性化合物的拆分、活性成分篩選及新藥開發(fā)、藥物代謝研究等諸多領(lǐng)域。用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的香蘭素與植物提取的天然香蘭素等同(Natural-identicalvanillin)，被稱為生物香蘭素(BilogicVanillin)。其轉(zhuǎn)化前體有丁香酚、異丁香酚、香草醇、香草胺、松柏醇、阿魏酸、芳香族氨基酸等天然化合物。阿魏酸酯酶能切斷細(xì)胞壁中多糖一多糖、多糖一木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，利用阿魏酸酯酶處理植物性的原材料，可以將阿魏酸從植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游離出來，從而破壞了細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，使得木質(zhì)素、半纖維素以及纖維素之間的連接被部分打破，結(jié)構(gòu)變得比處理前疏松。阿魏酸存在于烤煙煙葉中。纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)可被生物酶定向水解生成葡萄糖、低聚糖、短肽、氨基酸等，能有效降低卷煙的刺激性，減輕雜氣和改善吸味。微生物在增殖過程中可產(chǎn)生龐大的高活性酶系，如多糖水解酶類、蛋白酶類、酯化酶類、氧化還原酶類及裂合酶類等，在酶促作用、化學(xué)作用及微生物體內(nèi)復(fù)雜代謝的協(xié)同作用下，可使植物原料發(fā)生分解、降解、氧化、還原、聚合、偶聯(lián)、轉(zhuǎn)化等作用，形成復(fù)雜的低分子化合物，其中包括各種香味化合物，如醇類、醛類、酮類、酸類、脂類、酚類、吡喃類、吡啶類和萜烯類等，這些香氣物質(zhì)無疑也是煙草或用于煙草的添加劑的香氣組分。采用丁酸桿菌阿魏酸酯酶、木質(zhì)素降解酶協(xié)同作用、桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3復(fù)合生物轉(zhuǎn)化再造煙葉水溶液，分解、轉(zhuǎn)化再造煙葉中木質(zhì)素、纖維素、蛋白質(zhì)等大分子刺激性物質(zhì)為糖類、阿魏酸等，再轉(zhuǎn)化阿魏酸等為香蘭素等香味前體物質(zhì)，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、香氣豐富優(yōu)美、具有奶甜香氣，提升再造煙葉香氣品質(zhì)，還未見報道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物技術(shù)提升再造煙葉香氣品質(zhì)的方法，采用丁酸桿菌阿魏酸酯酶、木質(zhì)素過氧化物酶(Lip和錳過氧化物酶MnP協(xié)同作用)、桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3復(fù)合發(fā)酵，以再造煙葉水溶液為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，再經(jīng)常規(guī)工業(yè)工序生產(chǎn)再造煙葉，其中丁酸桿菌阿魏酸酯酶釋放再造煙葉細(xì)胞壁中的阿魏酸，疏松結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，兩種木質(zhì)素過氧化物酶協(xié)同作用分解木質(zhì)素，桑腸桿菌VL4-3能轉(zhuǎn)化阿魏酸生成香蘭素，其酶體系能分解、轉(zhuǎn)化再造煙葉中的大分子刺激性物質(zhì)或難揮發(fā)的香味前體物質(zhì)為小分子香氣物質(zhì)或還原糖等，并且丁酸桿菌阿魏酸酯酶和桑腸桿菌VL4-3中的多糖酶具有協(xié)同作用，這些酶和微生物的復(fù)合生物轉(zhuǎn)化，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、煙氣柔和、香氣豐富優(yōu)美、具有奶甜香氣，改善口感，提高再造煙葉的香氣品質(zhì)。本發(fā)明提供一種生物技術(shù)提升再造煙葉香氣品質(zhì)的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25～35℃、pH5～9條件下，靜置培養(yǎng)24～72h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在25～35℃，轉(zhuǎn)速100～150rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)12～36h，連續(xù)轉(zhuǎn)接1～3次后制得種子培養(yǎng)液；所述的桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3保藏號為CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L；所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L；(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟(1)所得的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比2～10％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.15～0.4％的丁酸桿菌阿魏酸酯酶、木質(zhì)素過氧化物酶(Lip和錳過氧化物酶MnP協(xié)同作用)復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH至4.5～6.0，在35～45℃條件下，發(fā)酵1～12小時，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟(2)所得的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在55～65℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)40～60min，碟螺離心分離液渣，將萃取液75～85℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度超過70℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘渣則通過用干燥機(jī)實(shí)施100～120℃干燥處理，滅活酶和菌，制成一定的水含量的煙草基片，將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。進(jìn)一步的，步驟(2)中所述的丁酸桿菌阿魏酸酯酶為食品級，酶活100-1000u/g，占再造煙葉的質(zhì)量比為0.05～0.15％；木質(zhì)素過氧化物酶Lip，食品級，酶活100～1000u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.05～0.15％；錳過氧化物酶MnP，食品級，酶活100～1000u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.05～0.10％。進(jìn)一步的，步驟(3)中所述的一定的水含量為質(zhì)量比5～15％。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用生物酶和微生物對再造煙葉進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，通過阿魏酸酯酶水解煙末、煙梗細(xì)胞壁的阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，釋放阿魏酸，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，使木質(zhì)素、半纖維素以及纖維素之間的連接被部分打破，結(jié)構(gòu)變得比處理前疏松，結(jié)合木質(zhì)素過氧化物酶的協(xié)同作用來降解木質(zhì)素；然后桑腸桿菌轉(zhuǎn)化阿魏酸生產(chǎn)香蘭素及其香氣前體物質(zhì)，同時桑腸桿菌的酶體系中的蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、淀粉酶等，降解再造煙葉及其萃取液中的蛋白質(zhì)、果膠、淀粉和纖維素，生成游離氨基酸、還原糖等，最終使生產(chǎn)的再造煙葉萃取液及其基片中，刺激性大分子物質(zhì)包括木質(zhì)素、纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)含量減少，且小分子香氣成分增加，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、煙氣柔和、香氣優(yōu)美、增加奶香氣，改善口感，提高再造煙葉的香氣品質(zhì)。本發(fā)明工藝條件溫和易操作，實(shí)現(xiàn)了酶和微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對再造煙葉香氣品質(zhì)的提升，綠色環(huán)保，具有工業(yè)化應(yīng)用的前景。具體實(shí)施方式下面通過具體的實(shí)施例對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。應(yīng)當(dāng)理解，此部分所描述的具體實(shí)施例僅可用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1本發(fā)明提供一種生物技術(shù)提升香氣品質(zhì)的再造煙葉，包括以下步驟：(1)菌株活化：將桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在27℃、pH5條件下，靜置培養(yǎng)28h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在28℃，轉(zhuǎn)速100rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接1后制得種子培養(yǎng)液；所述的桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3，菌株保存號為CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟(1)所述的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比3％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.15％的丁酸桿菌阿魏酸酯酶、木質(zhì)素過氧化物酶(Lip和錳過氧化物酶MnP)復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH至4.5，在35℃條件下，發(fā)酵2小時，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；所述的丁酸桿菌阿魏酸酯酶為食品級，酶活1000u/g，占再造煙葉的質(zhì)量比為0.05％；木質(zhì)素過氧化物酶Lip，食品級，酶活1000u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.05％；錳過氧化物酶MnP，食品級，酶活1000u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.05％；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟(2)所得的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在55℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)60min，碟螺離心分離液渣，將萃取液80℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度80℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘渣則通過用干燥機(jī)實(shí)施102℃干燥處理，滅活酶和菌，制成水含量質(zhì)量占比為13％的煙草基片；將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。實(shí)施例2本發(fā)明提供一種生物技術(shù)提升香氣品質(zhì)的再造煙葉，包括以下步驟：(1)菌株活化：將桑腸桿菌接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在30℃、pH5.5條件下，靜置培養(yǎng)48h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在30℃，轉(zhuǎn)速110rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次后制得種子培養(yǎng)液；所述的桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3保藏號為CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟(1)所述的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比4％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.2％的丁酸桿菌阿魏酸酯酶、木質(zhì)素過氧化物酶(Lip和錳過氧化物酶MnP)復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH至5，在37℃條件下，發(fā)酵3小時，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；所述的丁酸桿菌阿魏酸酯酶為食品級，酶活500u/g，占再造煙葉的質(zhì)量比為0.10％；木質(zhì)素過氧化物酶Lip，食品級，酶活800u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.10％；錳過氧化物酶MnP，食品級，酶活500u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.07％；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟(2)所得的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在60℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)50min，碟螺離心分離液渣，將萃取液81℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度81℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘渣則通過用干燥機(jī)實(shí)施105℃干燥處理，滅活酶和菌，制成水含量質(zhì)量占比為11％的煙草基片；將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。實(shí)施例3本發(fā)明提供一種生物技術(shù)提升再造煙葉香氣品質(zhì)的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在32℃、pH6.5條件下，靜置培養(yǎng)60h后得到斜面培養(yǎng)物，再接種到種子培養(yǎng)基，在32℃，轉(zhuǎn)速120rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)32h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后制得種子培養(yǎng)液；所述的桑腸桿菌(Enterobactermori)VL4-3保藏號為CCTCCNO：M2012020，于2012年2月16日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。所述的斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，瓊脂13g/L。所述的種子培養(yǎng)基：麥芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L。(2)復(fù)合生物轉(zhuǎn)化預(yù)處理：在再造煙葉的萃取工序，將步驟(1)所述的種子培養(yǎng)液按質(zhì)量比6％接種到再造煙葉水溶液中，并添加占再造煙葉質(zhì)量比的0.4％的丁酸桿菌阿魏酸酯酶、木質(zhì)素過氧化物酶(Lip和錳過氧化物酶MnP協(xié)同作用)復(fù)合酶，攪拌混合均勻，在pH至5.8，在42℃條件下，發(fā)酵4小時，得到再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液；所述的丁酸桿菌阿魏酸酯酶為食品級，酶活300u/g，占再造煙葉的質(zhì)量比為0.15％；木質(zhì)素過氧化物酶Lip，食品級，酶活100u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.15％；錳過氧化物酶MnP，食品級，酶活200u/g，占再造煙葉質(zhì)量比的0.10％；(3)再造煙葉常規(guī)生產(chǎn)工序：所述步驟(2)所得的再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，在62℃、pH自然條件下萃取反應(yīng)40min，碟螺離心分離液渣，將萃取液83℃下真空濃縮至固含量40％，得到濃縮液，在此過程中，溫度83℃，本發(fā)明的酶和菌失活；而殘渣則通過用干燥機(jī)實(shí)施110℃干燥處理，滅活酶和菌，制成水含量質(zhì)量占比為12％的煙草基片；將濃縮液噴涂到煙草基片上卷制成提升香氣品質(zhì)的再造煙葉。試驗(yàn)例1：感官評吸效果對比試驗(yàn)將實(shí)施例1、2、3制備的生物技術(shù)提升香氣品質(zhì)的再造煙葉與未經(jīng)處理的對照樣品卷制成煙支，放入恒溫恒濕箱內(nèi)(22℃+1、相對濕度為60％+2％)平衡48h，請專家評吸小組評吸。經(jīng)評吸小組反復(fù)評吸，表1表明：本發(fā)明制備的生物技術(shù)提升香氣品質(zhì)的再造煙葉，酶和菌株的復(fù)合生物轉(zhuǎn)化作用下，能降解、分解、轉(zhuǎn)化再造煙葉萃取液和基片中的蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、果膠、淀粉、纖維素等大分子物質(zhì)為還原糖、香蘭素及其香味前體物質(zhì)，使生產(chǎn)的再造煙葉降低刺激性、減少青雜氣、香氣豐富優(yōu)美、具有奶甜香氣，提升再造煙葉香氣品質(zhì)。表1.生物技術(shù)提升香氣品質(zhì)的再造煙葉的感官評吸效果對比試驗(yàn)例2：再造煙葉木質(zhì)素含量的檢測采用測定木質(zhì)素含量的經(jīng)典方法Klason法來檢測再造煙葉中的木質(zhì)素含量，其原理是用72％硫酸除去纖維素，難溶的木質(zhì)素經(jīng)過濾、洗滌、干燥稱重、計算等步驟可得到其含量，本發(fā)明的生物技術(shù)提升香氣品質(zhì)的再造煙葉中的木質(zhì)素含量均有降低，結(jié)果如表2。表2.綜合方法全面提升品質(zhì)的再造煙葉的木質(zhì)素含量實(shí)驗(yàn)組木質(zhì)素含量木質(zhì)素降低率空白對照3.25％/實(shí)施例1組2.78％14.46％實(shí)施例2組2.74％15.69％實(shí)施例3組2.91％10.46％試驗(yàn)例3：再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液香蘭素HPLC檢測再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后用高效液相色譜檢測，用AgilentEclipseXDB-C8色譜柱(5μm,4.6*150mm)，流動相為甲醇/0.5％冰乙酸＝30/70，流速1mL/min，檢測波長280nm，進(jìn)樣量10μL，檢測時間40min。用50％甲醇溶液配制1g/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液,稀釋成一系列不同濃度,每次進(jìn)樣10μL,以峰面積對標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表3.再造煙葉生物轉(zhuǎn)化液中香蘭素的濃度實(shí)驗(yàn)組香蘭素濃度(mg/L)未處理對照/實(shí)施例1組127實(shí)施例2組258實(shí)施例3組242以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3