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一種木質(zhì)素降解酶及其制備方法與它的用途的制作方法

文檔序號:611114閱讀:426來源:國知局
專利名稱:一種木質(zhì)素降解酶及其制備方法與它的用途的制作方法
一種木質(zhì)素降解酶及其制備方法與它的用途
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及煙草加工技術(shù)領(lǐng)域。更具體地,本發(fā)明涉及一種木質(zhì)素降解酶及其制備方法,還涉及所述木質(zhì)素降解酶的用途。
背景技木畑草梗絲的主要成分是木質(zhì)素、纖維素和果膠等,而木質(zhì)素是造成梗絲雜氣、木質(zhì)氣重及燃燒時(shí)產(chǎn)生灼喉刺激感的主要原因。木質(zhì)素是ー種芳香族高分子化合物,通過形成交織網(wǎng)來增強(qiáng)細(xì)胞壁及黏合纖維, 具有抗壓作用。木質(zhì)素分為紫丁香基木質(zhì)素(syringyl lignin,S-木質(zhì)素),愈創(chuàng)木基木質(zhì)素 (guajacyl lignin, G-木旗素)禾ロ對-輕基苯基木旗素(hydroxy-phenyl lignin,H-木質(zhì)素)。畑草細(xì)胞壁物質(zhì)中的木質(zhì)素是由苯丙烷衍生物単體(如香豆醇、松柏醇和芥子醇等)構(gòu)成的一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的立體網(wǎng)狀物質(zhì),是具有生物多態(tài)性的生物大分子,其填充在纖維素和半纖維素的空隙之中,緊密結(jié)合形成了致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。木質(zhì)素普遍存在于煙草梗絲中,對卷煙抽吸品質(zhì)的影響很大,在吸食過程中木質(zhì)素受高溫?zé)峤鈺a(chǎn)生兒茶酚、烷基兒茶酚等引起澀ロ等令人不愉快的感官效果,同吋,研究表明這些物質(zhì)可能存在一定的致癌活性,因此,如何安全有效的降低梗絲木質(zhì)素成為須解決的ー個(gè)重要問題。目前,CN03144088公開了煙草梗絲加工方法,其中包括篩分、水洗、切梗、閃蒸、膨化干燥等步驟。CNOl 108471公開了煙草梗絲微波膨脹エ藝,CN200810197102公開了ー種煙草梗絲的制備方法,其中包括煙梗浸泡、蒸氣加溫、儲梗、切梗、烘干膨化等步驟,這些方法都是物理加工方法。隨著生物技術(shù)的進(jìn)歩,畑草工作者已開始研究木質(zhì)素降解酶的應(yīng)用。目前該方面報(bào)道不多,エ業(yè)化生產(chǎn)木質(zhì)素降解酶制劑及應(yīng)用于煙草梗絲處理鮮見報(bào)道。因此,本發(fā)明人利用微生物發(fā)酵エ藝生產(chǎn)木質(zhì)素降解酶(木素過氧化物酶Lip、錳過氧化物酶Mnp和漆酶 Lac),有針對性地降低煙草梗絲木質(zhì)素含量,改善抽吸時(shí)木質(zhì)氣重及灼喉刺激感。

發(fā)明內(nèi)容[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種木質(zhì)素降解酶。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供所述木質(zhì)素降解酶的制備方法。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供所述木質(zhì)素降解酶的用途。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種木質(zhì)素降解酶的制備方法。該木質(zhì)素降解酶制備方法的步驟如下
A、在常壓與溫度90 100°C的條件下,煙草梗絲按照其與水的重量比1 100 500用水煮2. 0 3. 0h,得到一種固液混合物;B、然后,按照煙草梗絲量2 10g/L,往步驟Α)得到的固液混合物中添加10 20g/L葡萄糖、0. 05 0. 30g/L酒石酸銨、0. 05 0. 30g/L尿素、5mmol/L藜蘆醇、lmL/L微量元素混合液,混合均勻后得到的混合液作為培養(yǎng)基;然后分裝,在溫度121°C與0. IMpa 的條件下滅菌18 25min,冷卻后按照接種量以所述培養(yǎng)基體積計(jì)6 15%接種白腐菌 (Phanerochaete chrysosporium) CICC 40299 菌種,然后在溫度沘 32°C 與轉(zhuǎn)速 140 160r/min的條件下培養(yǎng)8 12天;C)將步驟B)培養(yǎng)得到的發(fā)酵混合物通過離心分離得到上清液,棄去沉淀;D)將步驟C)得到的上清液采用超濾濃縮、用分子量8000的透析袋透析,再采用 DEAE-Sephadex A-50柱層析或DEAE-kpharose-F. F.離子交換處理進(jìn)行純化,檢測洗脫液蛋白含量及含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活力,得到含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶。根據(jù)本發(fā)明的ー種優(yōu)選實(shí)施方式,所述的煙草梗絲是煙草上、中和下部的長梗。根據(jù)本發(fā)明的另ー種優(yōu)選實(shí)施方式,在步驟C)中,所述的發(fā)酵混合物在溫度0 4°C與4000 6000r/min的條件下進(jìn)行離心15 25min。根據(jù)本發(fā)明的另ー種優(yōu)選實(shí)施方式,所述的微量元素混合液含有l(wèi)_2g/L硼酸、 0. 02-0. 05g/L鉬酸鈉ニ水合物、1. 2-2. 0g/L氯化錳四水合物、0. 1-0. 4g/L硫酸鋅七水合物與0. 05-0. 20g/L硫酸銅五水合物。根據(jù)本發(fā)明的ー個(gè)方面,在制備含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶時(shí),該制備方法包括超濾濃縮、透析與柱層析步驟;所述的超濾濃縮是使用0. 001 0. 02 μ m微孔超濾膜在壓カ0. 1 0. 5MPa的條件下進(jìn)行超濾分離,其超濾膜的Mr = LOXlO40所述的透析是使用分子量8000的透析袋,使用pH7. 2、20mmol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析Mh,每間隔他更換一次所述的磷酸鹽緩沖液。所述的柱層析是使用DEAE-S印hadex A-50柱,使用0. 1 0. 5mol/LNaCl鹽溶液以洗脫速度為2. OmL/min進(jìn)行線性洗脫,每隔IOmin收集一管洗脫液,每管4mL,檢測每管洗脫液的蛋白含量及含木素過氧化物酶和錳過氧化物酶的活力,收集具有酶活的組分。根據(jù)本發(fā)明的另ー個(gè)方面,在制備漆酶吋,該制備方法包括超濾濃縮、硫酸銨分級沉淀、透析與DEAE-kpharose-F. F.離子交換處理;所述的超濾濃縮是使用0. 001 0. 02 μ m微孔超濾膜在壓カ0. 1 0. 5MPa的條件下進(jìn)行超濾分離,其超濾膜的Mr = 1.0X 104;在超濾濃縮步驟得到的濃縮液使用以重量計(jì)65%硫酸銨溶液進(jìn)行沉淀,讓這種沉淀與母液在溫度4°C下放置過夜,然后以轉(zhuǎn)速lOOOOr/min進(jìn)行離心20min,得到的沉淀用最少量的lOmmol/L pH5. 0醋酸鹽緩沖液溶解;得到的溶液再使用分子量8000的透析袋,使用蒸餾水進(jìn)行透析48h,每間隔1 更換一次蒸餾水;然后,得到的透析液進(jìn)行離子交換分離,使用DEAE-kpharose-F. F.離子交換柱, 使用0. 1 0. 5mol/LNaCl鹽溶液以洗脫速度2. OmL/min進(jìn)行線性洗脫,每隔IOmin收集ー管洗脫液,每管4mL,檢測每管洗脫液的蛋白含量及漆酶活力,收集具有酶活的組分。本發(fā)明還涉及采用所述方法制備得到的木質(zhì)素降解酶,其特征在于它含有含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶,其重量比是1 0.5-3.0 0.8-3.0。本發(fā)明還涉及所述的木質(zhì)素降解酶在降低煙草梗絲木質(zhì)素中的用途。下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種木質(zhì)素降解酶的制備方法。該木質(zhì)素降解酶制備方法的步驟如下A、在常壓與溫度90 100°C的條件下,煙草梗絲按照其與水的重量比1 100 500用水煮2. 0 3. 0h,得到一種固液混合物;畑草是茄科煙草屬植物,煙梗即是煙葉之粗硬葉脈,約占葉重的25-30%。煙梗是畑草エ業(yè)的副產(chǎn)物,同時(shí)也是寶貴的自然資源,目前多作棄置處理。我國是煙草大國,毎年有數(shù)十萬噸煙梗資源被廢棄,既造成環(huán)境污染,同時(shí)也是對自然資源的浪費(fèi)。研究表明,畑梗中含有的成分種類與煙葉成分基本一致。所述的煙草梗絲是使用水漂洗煙梗,再經(jīng)切梗、閃蒸、膨化干燥處理得到的。水漂洗時(shí)使用的水量并不是關(guān)鍵的,只是需要完全洗去在煙梗上帯有的或附著的各種雜質(zhì)就可以,一般而言,使用的水量是煙梗重量的5-15倍。所述煙草梗絲的厚度是0. 1-0. 2mm,寬度是1. 0-2. 0mm。所述的切梗、閃蒸、膨化干燥處理是技術(shù)是煙草加工技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員最熟知的技木。根據(jù)本發(fā)明,所述的煙草梗絲是煙草上、中和下部的長梗。如果所述煙草梗絲與水的重量比低于1 100,則不利于梗絲中營養(yǎng)物質(zhì)的溶出。 如果所述煙草梗絲與水的重量比高于1 500,則超過梗絲加入到培養(yǎng)基中的最大量,須濃縮,増加了處理時(shí)間且浪費(fèi)水資源。因此,所述煙草梗絲與水的重量比為1 100 500是合適的。優(yōu)選地,所述煙草梗絲與水的重量比是1 180 420。如果所述煙草梗絲用水煮的時(shí)間小于2. 0h,則梗絲中營養(yǎng)物不易溶出;如果所述畑草梗絲用水煮的時(shí)間大于3. 0h,則延長了前處理時(shí)間,增加成本。因此,所述煙草梗絲用水煮的時(shí)間是2. 0 3. Oh是合適的。優(yōu)選地,所述煙草梗絲用水煮的時(shí)間是2. 2-2.他。B、然后,按照煙草梗絲量2 10g/L,往步驟A)得到的固液混合物中添加10 20g/L葡萄糖、0. 05 0. 30g/L酒石酸銨、0. 05 0. 30g/L尿素、5mmol/L藜蘆醇、lmL/L微量元素混合液,混合均勻后得到的混合液作為培養(yǎng)基;然后分裝,在溫度121°C與0. IMpa 的條件下滅菌18 25min,冷卻后按照接種量以所述培養(yǎng)基體積計(jì)6 15%接種白腐菌 (Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299 菌種,然后在溫度沘 32°C 與轉(zhuǎn)速 140 160r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)8 12天。在本發(fā)明中,所述的微量元素混合液含有l(wèi)_2g/L硼酸、0. 02-0. 05g/L鉬酸鈉ニ水合物、1. 2-2. 0g/L氯化錳四水合物、0. 1-0. 4g/L硫酸鋅七水合物與0. 05-0. 20g/L硫酸銅五水合物。在本發(fā)明中使用的滅菌設(shè)備是本技術(shù)領(lǐng)域里通常使用的設(shè)備。
白腐菌(Phanerochaete chrysosporium)CICC 40299菌種是中國微生物菌種總目錄エ業(yè)微生物菌種中收錄的菌種。按照微生物培養(yǎng)常規(guī)方法使用該目錄推薦的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng),即在溫度觀 32°C與轉(zhuǎn)速140 160r/min的條件下發(fā)酵培養(yǎng)8 12天。C)將步驟B)培養(yǎng)得到的發(fā)酵混合物通過離心分離得到上清液,棄去沉淀;在本發(fā)明中,離心分離使用的設(shè)備是目前市場上銷售的產(chǎn)品,例如蘇州優(yōu)耐特機(jī)械制造有限公司生產(chǎn)離心機(jī)。所述的發(fā)酵混合物離心分離是在溫度0 4°C與4000 6000r/min的條件下進(jìn)行離心15 25min。D)將步驟C)得到的上清液采用超濾濃縮、用分子量8000的透析袋透析,再采用 DEAE-Sephadex A-50柱層析進(jìn)行純化,檢測洗脫液蛋白含量及含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活力,得到含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶。所述的超濾濃縮是ー種使用超濾膜進(jìn)行生物制品與醫(yī)藥制品分離、濃縮和純化的方法。超濾膜通常是由醋酯纖維或與其性能類似的高分子材料制得的。本發(fā)明使用的超濾膜都是目前市場上銷售的產(chǎn)品。透析是ー種分子選擇性地穿過膜的擴(kuò)散過程。透析可以用于分離分子量大小不同的溶質(zhì),低于膜所截留閾值分子量的物質(zhì)可擴(kuò)散穿過膜,而高于膜截留閾值分子量的物質(zhì)則被保留在半透膜的另ー側(cè)。本發(fā)明使用的分子量8000的透析袋例如是北京紅娃數(shù)字機(jī)電技術(shù)有限公司、上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。DEAE-Sephadex A-50柱(ニ乙氨基-乙基-葡萄糖凝膠a_50)是弱堿性陽離子交換劑,使用NaOH將Cl-型轉(zhuǎn)變?yōu)镺H-型后,可以用于吸附酸性蛋白。DEAE-S印hadex A-50 是目前市場上銷售的產(chǎn)品,例如上?;巧锟萍加邢薰旧a(chǎn)的產(chǎn)品。在本發(fā)明中,按照常規(guī)方法使用DEAE-S印hadex A-50柱。例如其操作步驟如下(I)DEAE-S印hadex A-50 預(yù)處理稱5g DEAE-Sephadex A-50,懸于500ml蒸餾水內(nèi),在Ih后傾去上層細(xì)粒。按照每克 DEAE-S印hadex A-50 加 0. 5mol/l 15ml 氫氧化鈉的比例,將 DEAE-S印hadex A-50 浸泡于0. 5mol/lNa0H液中,攪勻,靜置30min,裝入布氏漏斗中抽濾,并反復(fù)用蒸餾水抽洗至pH 呈中性;再使用0. 5mol/l HCl按照與上述同樣操作進(jìn)行處理,最后使用0. 5mol/l NaOH再處理一次。處理完后,將DEAE-S印hadex A-50浸泡于0. lmol/1 pH7. 4PB中一夜。(2)裝柱①將層析柱垂直固定于滴定架上,柱底出水ロ接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開關(guān)。②將0. lmol/1, pH7. 4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度,再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的DEAE-S印hadex A-50。DEAE-Sep hadex A-50凝膠沉降2 3cm高吋,開啟出水ロ,控制流速lml/min,同時(shí)連續(xù)倒入糊狀DEAE-Sephadex A-50凝膠至所需高/又。③關(guān)閉出水ロ,待DEAE-S印hadex A_50凝膠完全沉降后,柱面放一圓形濾紙片。通過插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。(3)平衡啟開出水ロ螺旋夾,控制流速12 14滴/min。使約2倍床體積的洗脫液流出。并以PH計(jì)與電導(dǎo)儀分別測定洗脫液及流出液之pH值與離子強(qiáng)度,兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口,停止平衡。在本發(fā)明中,所述層析洗脫液中蛋白含量的檢測方法是考馬斯亮藍(lán)G-250法。在本發(fā)明中,所述層析洗脫液中的含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活力檢測方法分別是藜蘆醇法、ニ價(jià)錳分光光度法和ABTS法。酶活力是用酶純化倍數(shù)與酶活回收率表示的。根據(jù)本發(fā)明,酶純化倍數(shù)=比活力J比活力Q (n = 0,1,2,3,4,5,分別表示各純化步驟n = 0表示發(fā)酵混合液離心后得到的粗酶液;η = 1表示超濾后的酶液;η = 3表示硫酸銨沉淀后的酶液;η = 4表示透析后的酶液;η = 5表示DEAE-S^hadex Α-50柱層析或 DEAE-Sepharose-F. F.離子交換處理后的酶液)。根據(jù)本發(fā)明,酶活回收率=總活力ノ總活力。X 100% (n = 0,1,2,3,4,5,分別表示各純化步驟n = 0表示發(fā)酵混合液離心后得到的粗酶液;η = 1表示超濾后的酶液;η = 3表示硫酸銨沉淀后的酶液;η = 4表示透析后的酶液;η = 5表示DEAE-S^hadex Α-50柱層析或DEAE-kpharose-F. F.離子交換處理后的酶液)。根據(jù)檢測木素過氧化物酶洗脫液蛋白含量25. Umg、純化倍數(shù)7. 79、酶活回收率 23. M,錳過氧化物酶洗脫液蛋白含量21. 07mg、純化倍數(shù)9. 52、酶活回收率23. 99,漆酶洗脫液蛋白含22. 58mg、純化倍數(shù)18. 67、酶活回收率32. 21,收集含有這些酶的洗脫液作為本發(fā)明制備的酶溶液。在制備含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶時(shí),本發(fā)明的制備方法包括超濾濃縮、透折與柱層析步驟;所述的超濾濃縮是使用0. 001 0. 02 μ m微孔超濾膜在壓カ0. 1 0. 5MPa的條件下進(jìn)行超濾分離,其超濾膜的Mr = LOXlO40所述的透析是使用分子量8000的透析袋,使用pH7. 2、20mmol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析Mh,每間隔他更換一次所述的磷酸鹽緩沖液。所述的柱層析是使用DEAE-S印hadex Α-50柱,使用0. 1 0. 5mol/LNaCl鹽溶液以洗脫速度為2. OmL/min進(jìn)行線性洗脫,每隔IOmin收集一管洗脫液,每管4mL,檢測每管洗脫液的蛋白含量及含木素過氧化物酶和錳過氧化物酶的活力,收集具有酶活的組分。在制備漆酶吋,本發(fā)明的制備方法包括超濾濃縮、硫酸銨分級沉淀、透析與 DEAE-Sepharose-F. F.離子交換處理;所述的超濾濃縮是使用0. 001 0. 02 μ m微孔超濾膜在壓カ0. 1 0. 5MPa的條件下進(jìn)行超濾分離,其超濾膜的Mr = 1.0X 104;在超濾濃縮步驟得到的濃縮液使用以重量計(jì)65%硫酸銨溶液進(jìn)行沉淀,讓這種沉淀與母液在溫度4°C下放置過夜,然后以轉(zhuǎn)速lOOOOr/min進(jìn)行離心20min,得到的沉淀用最少量的lOmmol/L pH5. 0醋酸鹽緩沖液溶解;得到的溶液再使用分子量8000的透析袋,使用蒸餾水進(jìn)行透析48h,每間隔1 更換一次蒸餾水;然后,得到的透析液進(jìn)行離子交換分離,使用DEAE-kpharose-F. F.離子交換柱, 使用0. 1 0. 5mol/LNaCl鹽溶液以洗脫速度2. OmL/min進(jìn)行線性洗脫,每隔IOmin收集ー 管洗脫液,每管4mL,檢測每管洗脫液的蛋白含量及漆酶活力,收集具有酶活的組分。
本發(fā)明還涉及采用本發(fā)明方法制備得到的木質(zhì)素降解酶。所述的木質(zhì)素降解酶含有含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶,其重量比是1 0.5-3.0 0.8-3.0。本發(fā)明還涉及所述的木質(zhì)素降解酶在降低煙草梗絲木質(zhì)素中的用途。[有益效果]本發(fā)明使用白腐菌(Phanerochaete chrysosporium) CICC 40299菌株在直接添加煙草梗絲為底物的培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)有針對性的降解煙草梗絲木質(zhì)素的Lip、Mnp和Lac, 可改善了煙草梗絲燃燒時(shí)雜氣、木質(zhì)氣重及燃燒時(shí)產(chǎn)生灼喉刺激感的不良影響。本發(fā)明的有益效果是(1)直接添加煙草梗絲作為培養(yǎng)基的一部分,在提供微生物發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)又起誘導(dǎo)煙草梗絲木質(zhì)素降解酶產(chǎn)生的作用;(2)白腐菌在在直接添加畑草梗絲為部分培養(yǎng)基成分上生長,并生產(chǎn)木質(zhì)素降解酶Lip、Mnp和Lac的エ藝方法;(3)得到可直接用于煙草梗絲處理的木質(zhì)素降解酶。該煙草梗絲木質(zhì)素降解酶生產(chǎn)方法與現(xiàn)有的其他方法相比,產(chǎn)生了酶活性更高、 更有針對性的降解煙草梗絲木質(zhì)素并可直接應(yīng)用于梗絲前處理的有益效果。
具體實(shí)施方式通過下述實(shí)施例將會更進(jìn)ー步深刻地理解本發(fā)明。實(shí)施例1 使用煙草梗絲制備木質(zhì)素降解酶發(fā)酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株,按照說明書中描述的方法培養(yǎng)制備其菌劑。 使用水漂洗、切梗、閃蒸、膨化干燥處理得到的煙草梗絲在溫度90°C水煮預(yù)處理池,得到的固液混合物作為一部分發(fā)酵培養(yǎng)基。使其煙草梗絲量達(dá)到2g/L,同時(shí)使葡萄糖達(dá)到10g/L、 酒石酸銨0. 05g/L、尿素0. 05g/L、藜蘆醇5mmol/L、微量元素混合液lmL/L,pH自然,搖瓶裝樣量為250mL三角瓶容積的40%,白腐菌CICC 40299菌劑接種量是以培養(yǎng)基體積計(jì)10%, 培養(yǎng)溫度30°C,轉(zhuǎn)速150r/min,培養(yǎng)時(shí)間10d。將含有菌絲體及梗絲的液體培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心分離后,再進(jìn)行超濾濃縮、透析、層析處理,然后采用本申請說明書中描述的方法檢測洗脫液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力,收集具有酶活的組分。其測定結(jié)果是總蛋白含量分別為0.2 Img (Lip)、0. 15mg (Mnp)、0· 49mg (Lac), 酶純化倍數(shù)分別% 3. 98 (Lip)、2. 77 (Mnp)、4. 63 (Lac),酶活回收率分別為6. 12 (Lip)、 5. 77 (Mnp)、14. 11 (Lac)。實(shí)施例2 使用煙草梗絲制備木質(zhì)素降解酶發(fā)酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株,按照說明書中描述的方法培養(yǎng)制備其菌劑。使用水漂洗、切梗、閃蒸、膨化干燥處理得到的煙草梗絲在溫度90°C水煮預(yù)處理池, 得到的固液混合物作為一部分發(fā)酵培養(yǎng)基。使其煙草梗絲量達(dá)到10g/L,同時(shí)使葡萄糖達(dá)到20g/L、酒石酸銨0. 30g/L、尿素0. 30g/L、藜蘆醇5mmol/L、微量元素混合液lmL/L,pH自然,搖瓶裝樣量為250mL三角瓶容積的40%,白腐菌CICC 40299菌劑接種量是以培養(yǎng)基體積計(jì)10%,培養(yǎng)溫度30°C,轉(zhuǎn)速150r/min,培養(yǎng)時(shí)間10d。將含有菌絲體及梗絲的液體培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心分離后,再進(jìn)行超濾濃縮、透析、層析處理,然后采用本申請說明書中描述的方法檢測洗脫液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力,收集具有酶活的組分。其測定結(jié)果是總蛋白含量分別為37. 56mg(Lip)、35· Hmg(Mnp)、31· 5Img(Lac),酶純化倍數(shù)分別為9. 74 (Lip)、12. 85 (Mnp), 27. 12 (Lac),酶活回收率分別為31. 22 (Lip),34. 58 (Mnp)、 41. 97 (Lac)。實(shí)施例3 使用煙草梗絲制備木質(zhì)素降解酶發(fā)酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株,按照說明書中描述的方法培養(yǎng)制備其菌劑。使用水漂洗、切梗、閃蒸、膨化干燥處理得到的煙草梗絲在溫度90°C水煮預(yù)處理2. 5h, 得到的固液混合物作為一部分發(fā)酵培養(yǎng)基。使其煙草梗絲量達(dá)到5g/L,同時(shí)使葡萄糖達(dá)到20g/L、酒石酸銨0. 25g/L、尿素0. 15g/L、藜蘆醇5mmol/L、微量元素混合液lmL/L,pH自然,搖瓶裝樣量為250mL三角瓶容積的40%,白腐菌CICC 40299菌劑接種量是以培養(yǎng)基體積計(jì)10%,培養(yǎng)溫度30°C,轉(zhuǎn)速150r/min,培養(yǎng)時(shí)間10d。將含有菌絲體及梗絲的液體培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心分離后,再進(jìn)行超濾濃縮、透析、層析處理,然后采用本申請說明書中描述的方法檢測洗脫液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力,收集具有酶活的組分。其測定結(jié)果是總蛋白含量分別為:29. 37mg(Lip)、32· 72mg(Mnp)、26. 89mg(Lac),酶純化倍數(shù)分別為10. 22 (Lip)、9· 89 (Mnp)、18. 68 (Lac),酶活回收率分別為32. 09 (Lip) ,28. 34 (Mnp)、 36. Ol(Lac)。實(shí)施例4 使用煙草梗絲制備木質(zhì)素降解酶發(fā)酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株,按照說明書中描述的方法培養(yǎng)制備其菌劑。使用水漂洗、切梗、閃蒸、膨化干燥處理得到的煙草梗絲在溫度90°C水煮預(yù)處理2. 5h, 得到的固液混合物作為一部分發(fā)酵培養(yǎng)基。使其煙草梗絲量達(dá)到8g/L,同時(shí)使葡萄糖達(dá)到16g/L、酒石酸銨0. 20g/L、尿素0. 20g/L、藜蘆醇5mmol/L、微量元素混合液lmL/L,pH自然,搖瓶裝樣量為250mL三角瓶容積的40%,白腐菌CICC 40299菌劑接種量是以培養(yǎng)基體積計(jì)10%,培養(yǎng)溫度30°C,轉(zhuǎn)速150r/min,培養(yǎng)時(shí)間10d。將含有菌絲體及梗絲的液體培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心分離后,再進(jìn)行超濾濃縮、透析、層析處理,然后采用本申請說明書中描述的方法檢測洗脫液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力,收集具有酶活的組分。其測定結(jié)果是總蛋白含量分別為20. 34mg(Lip)、22· 3Img(Mnp)、17. 89mg(Lac),酶純化倍數(shù)分別為9. 88 (Lip)、8· 73 (Mnp)、16. 90 (Lac),酶活回收率分別為35. 21 (Lip) ,23. 12 (Mnp)、 40. 07(Lac)。實(shí)施例5 使用煙草梗絲制備木質(zhì)素降解酶發(fā)酵菌株是白腐菌CICC 40299菌株,按照說明書中描述的方法培養(yǎng)制備其菌劑。使用水漂洗、切梗、閃蒸、膨化干燥處理得到的煙草梗絲在溫度90°C水煮預(yù)處理3. Oh, 得到的固液混合物作為一部分發(fā)酵培養(yǎng)基。使其煙草梗絲量達(dá)到10g/L,同時(shí)使葡萄糖達(dá)到12g/L、酒石酸銨0. 15g/L、尿素0. 30g/L、藜蘆醇5mmol/L、微量元素混合液lmL/L,pH自然,搖瓶裝樣量為250mL三角瓶容積的40%,白腐菌CICC 40299菌劑接種量是以培養(yǎng)基體積計(jì)10%,培養(yǎng)溫度30°C,轉(zhuǎn)速150r/min,培養(yǎng)時(shí)間10d。將含有菌絲體及梗絲的液體培養(yǎng)混合物進(jìn)行離心分離后,再進(jìn)行超濾濃縮、透析、層析處理,然后采用本申請說明書中描述的方法檢測洗脫液蛋白含量及Lip、Mnp和Lac活力,收集具有酶活的組分。其測定結(jié)果是總蛋白含量分別為23. 91mg(Lip) ,19. 72mg(Mnp)、20· 86mg(Lac),酶純化倍數(shù)分別 % 11. 74 (Lip)、13. 32 (Mnp)、15. 65 (Lac),酶活回收率分別為35. 04 (Lip) ,43. 30 (Mnp)、 14. 99 (Lac)。
權(quán)利要求
1.一種木質(zhì)素降解酶的制備方法,其特征在于該方法步驟如下A、在常壓與溫度90 100°C的條件下,煙草梗絲按照其與水的重量比1 100 500 用水煮2. 0 3. 0h,得到一種固液混合物;B、然后,按照煙草梗絲量2 10g/L,往步驟Α)得到的固液混合物中添加10 20g/ L葡萄糖、0. 05 0. 30g/L酒石酸銨、0. 05 0. 30g/L尿素、5mmol/L藜蘆醇、lmL/L微量元素混合液,混合均勻后得到的混合液作為培養(yǎng)基;然后分裝,在溫度121°C與0. IMpa的條件下滅菌18 25min,冷卻后按照接種量以所述培養(yǎng)基體積計(jì)6 15%接種白腐菌 (Phanerochaete chrysosporium) CICC 40299 菌種,然后在溫度沘 32°C 與轉(zhuǎn)速 140 160r/min的條件下培養(yǎng)8 12天;C)將步驟B)培養(yǎng)得到的發(fā)酵混合物通過離心分離得到上清液,棄去沉淀;D)將步驟C)得到的上清液采用超濾濃縮、用分子量8000的透析袋透析,再采用 DEAE-Sephadex A-50柱層析或DEAE-kpharose-F. F.離子交換處理進(jìn)行純化,檢測洗脫液蛋白含量及含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶活力,得到含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于所述的煙草梗絲是煙草上、中和下部的長梗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于在步驟C)中,所述的發(fā)酵混合物在溫度0 4°C與4000 6000r/min的條件下進(jìn)行離心15 25min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于所述的微量元素混合液含有l(wèi)_2g/L硼酸、0. 02-0. 05g/L鉬酸鈉ニ水合物、1. 2-2. 0g/L氯化錳四水合物、0. 1-0. 4g/L硫酸鋅七水合物與0. 05-0. 20g/L硫酸銅五水合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于在制備含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶時(shí),該制備方法包括超濾濃縮、透析與柱層析步驟;所述的超濾濃縮是使用0. 001 0. 02 μ m微孔超濾膜在壓カ0. 1 0. 5MPa的條件下進(jìn)行超濾分離,其超濾膜的Mr = LOXlO40所述的透析是使用分子量8000的透析袋,使用pH7. 2、20mmol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透折Mh,每間隔他更換一次所述的磷酸鹽緩沖液。所述的柱層析是使用DEAE-S印hadex A-50柱,使用0. 1 0. 5mol/LNaCl鹽溶液以洗脫速度為2. OmL/min進(jìn)行線性洗脫,每隔IOmin收集一管洗脫液,每管4mL,檢測每管洗脫液的蛋白含量及含木素過氧化物酶和錳過氧化物酶的活力,收集具有酶活的組分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法,其特征在于在制備漆酶吋,該制備方法包括超濾濃縮、硫酸銨分級沉淀、透析與DEAE-kpharose-F. F.離子交換處理;所述的超濾濃縮是使用0. 001 0. 02 μ m微孔超濾膜在壓カ0. 1 0. 5MPa的條件下進(jìn)行超濾分離,其超濾膜的Mr = 1.0X 104;在超濾濃縮步驟得到的濃縮液使用以重量計(jì)65%硫酸銨溶液進(jìn)行沉淀,讓這種沉淀與母液在溫度4°C下放置過夜,然后以轉(zhuǎn)速lOOOOr/min進(jìn)行離心20min,得到的沉淀用最少量的lOmmol/L pH5. 0醋酸鹽緩沖液溶解;得到的溶液再使用分子量8000的透析袋,使用蒸餾水進(jìn)行透析48h,每間隔1 更換ー 次蒸餾水;然后,得到的透析液進(jìn)行離子交換分離,使用DEAE-kpharose-F. F.離子交換柱,使用 0. 1 0. 5mol/LNaCl鹽溶液以洗脫速度2. OmL/min進(jìn)行線性洗脫,每隔IOmin收集一管洗脫液,每管4mL,檢測每管洗脫液的蛋白含量及漆酶活力,收集具有酶活的組分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法制備得到的木質(zhì)素降解酶,其特征在于它含有含木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶,其重量比是1 0.5-3.0 0.8-3.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的木質(zhì)素降解酶在降低煙草梗絲木質(zhì)素中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種木質(zhì)素降解酶及其制備方法與它的用途。該木質(zhì)素降解酶制備方法包括煙草梗絲水煮、液體發(fā)酵、離心分離、超濾濃縮、透析處理與柱層析純化等步驟。該煙草梗絲木質(zhì)素降解酶生產(chǎn)方法與現(xiàn)有的其他方法相比,產(chǎn)生了酶活性更高、更有針對性的降解煙草梗絲木質(zhì)素并可直接應(yīng)用于梗絲前處理的有益效果。
文檔編號A24B15/20GK102559619SQ20111042101
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者張建棟, 施栩翎, 郭春梅 申請人:華寶食用香精香料(上海)有限公司
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