專利名稱：一種煙草生物增質(zhì)劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種煙草生物增質(zhì)劑，同時(shí)，還涉及一種該煙草生物增質(zhì)劑的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國是世界上最大的煙葉生產(chǎn)和卷煙消費(fèi)國家，全國年種植煙葉面積1500萬畝，收購煙葉4000萬擔(dān)，年卷煙消費(fèi)量3500萬箱。我國煙草行業(yè)年實(shí)現(xiàn)稅利9000億元人民幣，居全國各行業(yè)之首位。但是，由于我國烤煙原料質(zhì)量較差，特別是煙葉香氣質(zhì)量差，煙葉陳化周期長(2-3年)、占用資金多、倉儲(chǔ)負(fù)擔(dān)重，嚴(yán)重制約著我國煙草行業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展和行業(yè)效益的進(jìn)一步提高。同時(shí)，隨著我國加入WTO，全球經(jīng)濟(jì)一體化、國內(nèi)市場國際化的趨勢日益明顯，這將會(huì)對我國煙草行業(yè)帶來嚴(yán)重的沖擊。因此，提高我國煙草行業(yè)生產(chǎn)效益的關(guān)鍵在于提高煙葉發(fā)酵質(zhì)量，縮短陳成化時(shí)間，改進(jìn)煙葉的香氣質(zhì)量。
煙葉發(fā)酵是煙草加工過程中的主要環(huán)節(jié)。改進(jìn)煙葉發(fā)酵技術(shù)，增進(jìn)煙葉的香吃味質(zhì)量，已成為卷煙工業(yè)提高加工工藝技術(shù)的重要手段。實(shí)踐證明，經(jīng)初烤和復(fù)烤之后的煙葉，并不能直接進(jìn)入卷煙工藝過程，必須經(jīng)過一段時(shí)間的自然陳化或人工發(fā)酵，才能提高其使用價(jià)值，達(dá)到減輕雜氣，改善吃味，減少刺激性，提高香氣量的目的。許多研究表明，煙葉在陳化和發(fā)酵后品質(zhì)得以改善，其主要原因是煙葉組織內(nèi)部發(fā)生了極其復(fù)雜的變化。
Koller(1858)最早對煙草的發(fā)酵機(jī)制進(jìn)行了研究，指出雪茄煙發(fā)酵在某些方面與乙醇發(fā)酵相似。1889年Suchsland對雪茄煙中微生物區(qū)系的研究認(rèn)為，煙葉發(fā)酵是由微生物引起的，Reid等(1937)也發(fā)現(xiàn)，雪茄煙發(fā)酵過程中微生物數(shù)量劇增，且與一些酶含量變化呈正相關(guān)。而Johnson(1934)的研究結(jié)果則認(rèn)為微生物對煙葉發(fā)酵的作用只是增加了煙葉中酶量。Bodnar和Borta(1933)對烤煙自然發(fā)酵的研究表明，發(fā)酵過程中煙葉的過氧化物酶、過氧化氫酶、淀粉酶活性明顯下降，而肽酶活性顯著增加。但Dixon等(1936)的研究則證明，烤煙陳化后，微生物數(shù)量有所減少，煙葉中酶的作用是極小的，烤煙發(fā)酵在很大程度上是一個(gè)純化學(xué)過程。Frankenberg(1950)在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，提出了煙葉陳化是在自身酶、微生物和自然氧化三者共同作用下完成的假說。認(rèn)為這三種作用都可能存在，可同時(shí)促進(jìn)總的化學(xué)反應(yīng)，但何種機(jī)制占主導(dǎo)作用，則取決于煙草類、型發(fā)酵前處理和發(fā)酵條件。
純化學(xué)變化的觀點(diǎn)認(rèn)為，青煙葉是一個(gè)高度活潑的催化體系，但在凋亡結(jié)束后，煙葉水分缺乏，顏色由青變黃，大部分細(xì)胞都已死亡，酶多數(shù)失去活性。Arsenjian等人的研究發(fā)現(xiàn)，在香料煙自然陳化條件下，氧化酶與底物之間沒有任何作用。
關(guān)于微生物促進(jìn)煙葉發(fā)酵的機(jī)制已引起了一些研究工作者的廣泛興趣，并取得了一些突破性的進(jìn)展。Reid等人(1933)在研究雪茄發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，微生物的活動(dòng)比較活躍。在發(fā)酵開始階段，細(xì)菌數(shù)量大量增加，當(dāng)垛溫升高氧氣量減少時(shí)，細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，在翻垛之后，溫度降低，氧氣量增加，細(xì)菌數(shù)量又重新增加。溫度又升高，氧氣又逐漸耗盡。
煙葉表面的微生物數(shù)量和種類與發(fā)酵條件有密切的關(guān)系。Tamyo(1953)研究表明，西班牙煙葉發(fā)酵溫度在30-45℃下主要是細(xì)菌，發(fā)酵溫度在55-65℃下則有小量的細(xì)菌。Reid等(1944)報(bào)道正常發(fā)酵條件下烤煙中的微生物主要是小球菌和芽孢桿菌，霉菌逐漸消失。如果在潮濕、高溫、和缺氧條件下，則厭氧菌占據(jù)優(yōu)勢。同樣地，在適宜的發(fā)酵條件下，雪茄煙主要是好氣性和兼好氣性的微生物，在缺氧條件下，主要是厭氧的芽孢梭菌。
關(guān)于煙葉中的微生物與煙葉的香氣和品質(zhì)的關(guān)系，Reid等(1944)和English等(1967)研究表明，在潮濕、高溫或無氧等不適當(dāng)條件下進(jìn)行發(fā)酵，煙葉中的微生物主要是霉菌、厭氧芽孢梭菌，則將造成煙葉腐爛和香氣損失。
早期關(guān)于向煙葉中接種微生物以提高煙葉香氣和吃味的報(bào)道，結(jié)果往往不能令人滿意。Koller(1958)最早進(jìn)行了添加微生物以提高雪茄煙香氣和吃味的嘗試。在雪茄煙中添加酵母菌，可大大加速發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵更為徹底，但同時(shí)也會(huì)促進(jìn)細(xì)菌和霉菌的生長。Pounds等1972在貯存的煙葉中接種不同的微生物，其中絕大部分微生物會(huì)造成煙葉的腐爛和不愉快的氣味。
后來到研究工作則收到了良好的結(jié)果。Tamyo等(1953)報(bào)道，煙葉中接種Micrococcus autantiacus可改善煙葉的香氣。English等(1967)在Pennsylvania煙葉中分別或混合接種Bacillus subtilis和B. clrculans，迅速產(chǎn)生一種愉快的香氣。Reid等也證明細(xì)菌比真菌更適宜于煙葉的發(fā)酵。進(jìn)一步研究表明，隨著微生物的生長，煙葉中的總碳和還原糖降低，pH值升高，煙堿和總氮發(fā)生變化。Koiwai等(1971)研究表明，在Nambu雪茄煙中接種從煙葉分離的細(xì)菌菌株，盡管總氮含量沒有發(fā)生明顯的變化，但游離氨基酸的含量發(fā)生了顯著的變化，游離氨基酸有利于改進(jìn)煙葉的香氣。Mikami等報(bào)道香料煙中的一些三甲基已環(huán)基化合物可通過微生物作用于類胡蘿卜素而得到。
國內(nèi)對煙草發(fā)酵的機(jī)制研究較晚，1957年張敬祥等用氫氰酸、乙醇和高溫處理煙葉，以破壞煙葉所含有的酶或抑制煙葉內(nèi)酶的活動(dòng)，然后在進(jìn)行人工發(fā)酵，結(jié)果表明，除示氧值明顯降低外，煙葉外觀品質(zhì)和內(nèi)在質(zhì)量與正常發(fā)酵無明顯差別，證明發(fā)酵過程中煙葉中酶的作用不大，而氧化作用較為明顯；青島輕工業(yè)研究所等(1980)曾用環(huán)氧乙烷來殺死煙葉表面的微生物，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵作用仍可以進(jìn)行，這一結(jié)果否認(rèn)了微生物在煙葉發(fā)酵過程中的作用。劉伯衡(1980)和余永茂等(1990)用臭氧和紫外線處理煙葉，也得出了相同的結(jié)論。Ares等(1987)的研究還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中，煙葉的尼古丁含量與示氧值呈正相關(guān)。
另一些研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)在烤煙發(fā)酵過程中存在有微生物和酶的作用。
近年來，隨著生物工程技術(shù)研究的不斷深入，微生物發(fā)酵技術(shù)已在食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，這也為該技術(shù)在煙草發(fā)酵方面的應(yīng)用研究提供了前提和手段。余永茂等(1988)利用微生物酶加速低次煙的發(fā)酵，取得了一定效果；有人發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶不僅在發(fā)酵過程中有活性，甚至在以后的卷煙制品中，過氧化物酶活性仍繼續(xù)保持。在陳化、發(fā)酵和加工過程中有酶促反應(yīng)參與，特別是一些晾制的煙葉這種作用存在的可能性更大。
謝和等(1990)報(bào)道，我國烤煙NC82陳化煙葉中的主要微生物類群是細(xì)菌，占總數(shù)的85％以上。
總之，有關(guān)煙葉發(fā)酵機(jī)理的研究，前人的工作都是側(cè)重于某一個(gè)方面，對發(fā)酵過程中煙葉各方面的變化還缺乏深入和系統(tǒng)的研究，因此，對煙葉發(fā)酵機(jī)理難以做出全面的解釋。
近年來，隨著生物工程技術(shù)研究的不斷深入，微生物發(fā)酵技術(shù)已在食品、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，這也為該技術(shù)在煙草發(fā)酵方面的應(yīng)用研究提供了前提和手段。但是迄今為止，微生物技術(shù)還沒有在煙草發(fā)酵工程上得到利用，卷煙工業(yè)上仍然采用傳統(tǒng)的人工發(fā)酵或自然陳化的方法來處理煙葉。然而，由于人工發(fā)酵增質(zhì)效果差，自然陳化周期又太長，資金周轉(zhuǎn)慢，多年來一直困擾著我國卷煙工業(yè)質(zhì)量和效益的提高。
煙葉在調(diào)制過程中，經(jīng)過一系列的生理生化反應(yīng)，使其主要的化學(xué)成分發(fā)生了劇烈的變化，形成了風(fēng)格各異，內(nèi)在品質(zhì)明顯不同的原煙。但是新調(diào)制好的烤煙、曬煙或晾煙在品質(zhì)上尚存在不同程度的缺陷，如青雜氣重、刺激性大、煙氣粗糙、煙香味被雜氣掩蓋，尤其是低等級的煙葉還有苦、辣、澀、等缺點(diǎn)，這樣的煙葉是不宜直接用來加工煙制品的，必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)年惢?、發(fā)酵處理。在陳化、發(fā)酵過程中，煙葉內(nèi)在化學(xué)成分發(fā)生一系列變化，使青雜氣和刺激性大大減少，煙香味增強(qiáng)，吸味醇和，煙葉顏色更加均勻并適當(dāng)加深。因此，陳化、發(fā)酵是卷煙工業(yè)提高質(zhì)量的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種煙草生物增質(zhì)劑，以顯著提高煙葉的發(fā)酵質(zhì)量，縮短陳化時(shí)間，改善煙葉的化學(xué)成分，提高煙葉的香氣質(zhì)量。
同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供了一種該煙草生物增質(zhì)劑的制備方法。
另外，本發(fā)明的目的還在于提供了一種該煙草生物增質(zhì)劑的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案在于采用了一種煙草生物增質(zhì)劑，包括以下重量份數(shù)的成份巨大芽孢桿菌ZXB1(Bacillus megaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941，180-200份；枯草芽孢桿菌ZXB2(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354，180-200份；糖化酶5-15份；淀粉酶50-200份；蛋白酶450-550份。
所述的糖化酶為黑曲霉糖化酶。
所述的淀粉酶為細(xì)菌α-淀粉酶。
所述的蛋白酶可以為枯草芽孢桿菌中性蛋白酶。
同時(shí)，本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種煙草生物增質(zhì)劑的制備方法，包括以下步驟(1)菌劑的制備；(2)煙草生物增質(zhì)劑的配制取重量份數(shù)為180-200份的巨大芽孢桿菌ZXB1(Bacillus megaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941，180-200份的枯草芽孢桿菌ZXB2(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354，經(jīng)固體培養(yǎng)制備的菌粉；5-15份的糖化酶、淀粉酶50-200份及450-550份的蛋白酶混合。
所述的菌劑的制備包括以下步驟①菌種ZXB1，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941；ZXB2，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354；②斜面培養(yǎng)在新鮮斜面上接種一環(huán)菌苔，與30℃條件下培養(yǎng)2天；③菌種瓶擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基配方是，麩皮70％，豆餅粉28.5％，尿素1.5％，料∶水＝1∶1.0，pH為9.0，按配方將原料稱好拌勻后，加適量水(料∶水＝1∶1.0).繼續(xù)翻拌，達(dá)到手握成團(tuán)，觸之即散的程度，再用2％NaOH溶液調(diào)整pH值為9.0，分別于菌種瓶中，裝量至瓶肩稍靠下一點(diǎn)，擦去瓶口及瓶身粘附的培養(yǎng)料，然后塞上棉塞，上邊蓋兩層紙板用線繩扎好，在1.1-1.5kg/cm2壓力下滅菌1.5h；待培養(yǎng)料冷卻后接種，在培養(yǎng)好的斜面菌種中倒入7ml無菌水，制成菌懸液。將制好的菌懸液分別倒入3只菌種瓶培養(yǎng)基中，搖勻，置于28℃條件下培養(yǎng)3天，可見瓶壁上有菌苔，取下棉塞有刺鼻的微臭味，觀察無其它雜菌污染即為合格；
④淺盤培養(yǎng)將配制好的料分裝于塑料袋中，每袋約1000g，用線繩扎口，注意不要扎得太緊，否則不利蒸汽流通滅菌，料裝好后立即送入高壓滅菌鍋中，在1.4-1.5kg/cm2壓力下滅菌1.5h，待料溫降至40℃時(shí)按2％接種量接入菌種瓶中培養(yǎng)好的菌種，充分拌勻，然后均勻攤平，厚度2-3cm，上蓋一層白布，以利保濕，培養(yǎng)室溫度控制在28℃-30℃，當(dāng)料溫高于35℃時(shí)，要及時(shí)翻動(dòng)培養(yǎng)料，并調(diào)整淺盤的上下位置。待培養(yǎng)3天后，料溫逐漸下降，鏡檢絕大部分菌體已形成芽孢，即可終止培養(yǎng)；⑤干燥，粉碎將培養(yǎng)好的固體菌劑放入干燥箱中，在50℃條件下進(jìn)行烘干，烘至含水量小于8％，然后用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎細(xì)度要求通過80目篩的菌粉達(dá)到95％以上；⑥質(zhì)量檢驗(yàn)合格菌粉的質(zhì)量要求為總菌數(shù)應(yīng)大于80億個(gè)/g，水分小于8％，95％的菌粉須通過80目篩，大腸桿菌數(shù)必須小于30個(gè)/100g，沙門氏菌和綠濃桿菌不得檢出。
另外，本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了一種煙草生物增質(zhì)劑的應(yīng)用，使用時(shí)，先將1000g制劑用5000ml清水浸泡30min，邊浸泡邊攪拌，使菌和酶充分溶出；之后用兩層紗布過濾，除去殘?jiān)?，濾液用于噴霧處理發(fā)酵煙葉。在制絲生產(chǎn)線上使用時(shí)，選取潤葉工序，利用壓縮空氣將濾液噴灑到潤葉筒內(nèi)的葉片上，之后貯葉4h，以下工序同于正常制絲工藝。
本發(fā)明的煙草生物增質(zhì)劑在對烤煙葉面微生物區(qū)系、發(fā)酵或陳化過程中煙葉生物活性及葉面優(yōu)勢增香菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，利用3種優(yōu)勢菌株和具有高生物活性的有關(guān)酶混合制成增香劑，并在烤煙人工發(fā)酵和自然陳化過程中進(jìn)行了初步應(yīng)用，取得了良好的效果，這為生物工程技術(shù)在煙葉發(fā)酵工藝中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明是應(yīng)用微生物學(xué)、酶學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)和手段，對烤煙的發(fā)酵機(jī)理進(jìn)行了深入研究，以此為指導(dǎo)，從烤煙葉面微生物區(qū)系中篩選出優(yōu)勢增香菌，在分離鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)選增香菌株，優(yōu)化定型發(fā)酵增質(zhì)劑配方，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用實(shí)驗(yàn)和工業(yè)驗(yàn)證，取得了良好的效果，這為生物工程技術(shù)在煙葉發(fā)酵工藝和制絲生產(chǎn)線上的推廣應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。由于煙葉中存在著大量的微生物，這些微生物在煙葉發(fā)酵過程中起著重要的作用，本發(fā)明的巨大芽孢桿菌ZXB1(Bacillusmegaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941及枯草芽孢桿菌ZXB2(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354，有利于提高煙葉中的香氣和吃味，從而改進(jìn)煙葉的品質(zhì)。本發(fā)明的煙草生物增質(zhì)劑用于烤煙自然陳化，可將發(fā)酵周期縮短至9個(gè)月，比常規(guī)發(fā)酵時(shí)間縮短了1年以上；煙草微生物發(fā)酵增質(zhì)劑用于在線配方葉片處理，在短時(shí)間內(nèi)可明顯改善卷煙質(zhì)量。
本發(fā)明的煙草生物增質(zhì)劑在新鄭煙草集團(tuán)、許昌卷煙總廠等卷煙工業(yè)企業(yè)經(jīng)過多次的中試，都取得了明顯的增質(zhì)增香效果，本發(fā)明可以顯著提高煙葉的發(fā)酵質(zhì)量，縮短陳化時(shí)間，改善煙葉的化學(xué)成分，提高煙葉的香氣質(zhì)量?？煽s短煙葉陳化時(shí)間10-12個(gè)月，若按縮短陳化時(shí)間1年計(jì)算，每萬箱可節(jié)約煙葉倉儲(chǔ)成本為1萬箱×40公斤/箱×26元/公斤(平均)×4.5％＝26.7萬元。平均單箱卷煙成本可降低3.5元，提高煙葉使用等級1/3個(gè)等級，單箱卷煙加料成本可以節(jié)約3元。
此外，煙葉質(zhì)量的提高，可以增強(qiáng)我國煙葉和卷煙在國際市場上的競爭能力，在減少煙葉進(jìn)口的同時(shí)，還可以擴(kuò)大出口創(chuàng)匯，將會(huì)產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
煙草生物增質(zhì)劑耐溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)過煙草微生物發(fā)酵增質(zhì)劑處理后的煙葉，通過加熱80℃10min，140℃10min，140℃20min后，對煙葉中的活菌數(shù)、酶活力殘留率進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。
表1 煙草微生物發(fā)酵增質(zhì)劑耐溫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表1中可以看出，經(jīng)過三種不同條件的熱處理后，煙葉中活菌數(shù)的殘留率均在90％以上，這可能與增質(zhì)劑中增香菌是以芽孢形式存在，芽孢有較強(qiáng)的耐高溫性能有關(guān)。熱處理后α-淀粉酶殘留率分別為94％，71％和67％；糖化酶殘留率分別為89％，68％和55％；蛋白酶的殘留率分別為85％，52％和44％。α-淀粉酶的殘留率較高，糖化酶次之，蛋白酶殘留率最低，這是由于α-淀粉酶熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，而糖化酶，蛋白酶熱穩(wěn)定性較差引起的。潤葉條件對煙草發(fā)酵增質(zhì)劑影響不大，而烘絲階段的高溫條件將會(huì)對增質(zhì)劑的活性產(chǎn)生影響。
煙草生物增質(zhì)劑的應(yīng)用效果煙草生物增質(zhì)劑對煙草化學(xué)成分的影響利用分離得到的優(yōu)勢微生物增香菌與具有高生物活性的有關(guān)酶配制成4種劑型的煙草發(fā)酵增香，并采用1％和2％兩種濃度對烤煙葉面進(jìn)行噴灑，然后分別進(jìn)行自然發(fā)酵和人工發(fā)酵，結(jié)果表明，增香劑的配方組成不同，對煙葉發(fā)酵的作用效果也不一樣。無論是自然發(fā)酵還是人工發(fā)酵，與對照相比較，處理④煙葉中各種化學(xué)成分變化最大，其次是處理②，再次是處理③，處理①煙葉內(nèi)各種化學(xué)成分變化幅度最小(表2和表3)。增香劑處理煙葉中化學(xué)成分的變化趨勢與不處理直接發(fā)酵煙葉化學(xué)成分的變化趨勢完全一致，但各成分的變化幅度明顯加大，說明在發(fā)酵過程中使用增香劑有利于促進(jìn)葉內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，加快煙葉發(fā)酵進(jìn)程。
煙草生物增質(zhì)劑對煙葉煙氣特性的影響對自然發(fā)酵和人工發(fā)酵過程中使用生物增質(zhì)劑的煙葉特性評吸結(jié)果表明，增香劑的組成特性不同，其增質(zhì)增香效果具有明顯的差異。與對照相比較，噴灑增香劑的煙葉經(jīng)過發(fā)酵后，香氣質(zhì)改善，香氣量增加，雜氣、刺激性減輕，余味純凈舒適，總體香吃味質(zhì)量變好，不同處理之間的增香效果表現(xiàn)為處理④＞處理②＞處理③＞處理①(表4和表5)。
表2煙草生物增質(zhì)劑對自然發(fā)酵煙葉化學(xué)成分的影響


表3煙草生物增質(zhì)劑對人工發(fā)酵煙葉化學(xué)成分的影響

表4煙草生物增質(zhì)劑對自然發(fā)酵煙葉煙氣特性的影響


表5煙草生物增質(zhì)劑對人工發(fā)酵煙葉煙氣特性的影響


煙草生物增質(zhì)劑對卷煙中氨基酸和高級脂肪酸含量的影響(1)煙草生物增質(zhì)劑對卷煙中氨基酸含量的影響據(jù)報(bào)道，煙葉中氨基酸對煙葉的香吃味質(zhì)量和卷煙的吸食風(fēng)格都有著重要影響。通過對卷煙中氨基酸含量的測定結(jié)果(表6)表明，在處理后的卷煙中的氨基酸含量是降低的，但不同種類的氨基酸其含量的變化趨勢不同。與對照煙相比，脯氨酸含量表現(xiàn)為增加，冬氨酸，蘇氨酸，絲氨酸，谷氨酸，甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，酪氨酸，賴氨酸，精氨酸等13種氨基酸的含量都有不同程度的下降，而胱氨酸，苯并氨酸，組氨酸，色氨酸等4種氨基酸表現(xiàn)為處理與對照間不存在差異這一結(jié)果表明，卷煙中氨基酸含量的變化與微生物發(fā)酵增質(zhì)劑加速煙葉內(nèi)在成分的分解與轉(zhuǎn)化程度密切相關(guān)。表明在潤葉環(huán)節(jié)使用增香菌種和酶制劑混合處理配方葉片，使煙葉中的蛋白質(zhì)在微生物和蛋白酶的作用下逐漸降解為氨基酸，之后經(jīng)過烘絲加熱過程，這些新產(chǎn)生的氨基酸易與煙絲中的糖類發(fā)生非酶棕色化反應(yīng)，形成復(fù)雜的致香物質(zhì)，從而最終硬氣卷煙中大多數(shù)氨基酸不同程度的減少。多數(shù)研究表明，卷煙加工過程中氨基酸含量的降低有利于卷煙顏色加深，香吃味得到改善。
表6煙草生物增質(zhì)劑對卷煙中氨基酸含量的影響


(2)煙草生物增質(zhì)劑對卷煙中高級脂肪酸含量的影響煙草中的高級脂肪酸是一類重要的非揮發(fā)性有機(jī)酸，其含量的高低決定著煙草香味的主要成份，直接或間接地對煙葉品質(zhì)及其卷煙質(zhì)量產(chǎn)生影響[19，20]。在潤葉過程中向配方葉片中添加微生物增香菌種和酶復(fù)合制劑，加速了卷煙中高級脂肪酸含量的變化，比較之下有些脂肪酸變化十分劇烈，有些是微小的，從測定結(jié)果(表7)看，豆蔻酸，亞油酸，花生烯酸3種脂肪酸與對照相比是增加的，其中豆蔻酸，花生烯酸增加比例較大，分別比對照增加12.4％和10％。月桂酸，軟脂酸，硬脂酸，和油酸與對照相比含量下降，其中月桂酸下降了23.1％，軟脂酸下降了22.8％，而硬脂酸和油酸下降幅度相對較小，分別達(dá)到15.4％和11.1％。這表明，卷煙中各種脂肪酸含量的消長與增香菌種的活性和生長條件密切相關(guān)。
表7煙草生物增質(zhì)劑對卷煙中高級脂肪酸含量的影響

煙草生物增質(zhì)劑對卷煙中致香物質(zhì)和化學(xué)成分含量的影響(1)煙草生物增質(zhì)劑對卷煙致香成分含量的影響對卷煙中致香物質(zhì)含量的測定結(jié)果(表8)表明，經(jīng)微生物發(fā)酵增質(zhì)劑處理后的煙葉，有17種致香物質(zhì)成分含量高于對照，只有7種致香物質(zhì)成分含量低于對照。其中經(jīng)增質(zhì)劑處理后的卷煙中致香物質(zhì)含量增幅最大的是苯甲醛(35.48％)、苯乙醛(46.95％)、苯乙醇(43.97％)、茄酮(30.23％)、β-大馬酮(29.76％)、巨豆-4，6(Z)，8(E)-三烯酮-3(27.12％)巨豆-4，6(E)，8(Z)-三烯酮-3(19.86％)、巨豆-4，6，(E)，8(E)-三烯酮-3(28.28％)、茄哪士酮(22.65％)，(1S、2E、4R、6E、8R、11S、12E)-8，11-氧撐-2，6，12-西柏三烯-4-醇等。據(jù)報(bào)道，上述這些成分多數(shù)重要的卷煙加香原料，它們在卷煙中含量的增加無疑對提高卷煙總體香吃味質(zhì)量和風(fēng)格是十分有利的。
(2)煙草生物增質(zhì)劑對卷煙化學(xué)成分和內(nèi)在質(zhì)量的影響研究結(jié)果(表9)表明，經(jīng)微生物處理后的卷煙中水溶性總糖和總植物堿的含量與對照煙相比呈現(xiàn)不同程度的增加，增加幅度分別為14.88％和2.69％，而卷煙中總氮含量則表現(xiàn)為下降(2.92％)。從化學(xué)比值上看，微生物發(fā)酵煙的糖/堿比、氮/堿比比對照煙更為合理、協(xié)調(diào)，說明煙草發(fā)酵增質(zhì)劑有利于促進(jìn)煙氣的酸堿平衡，也使抽吸質(zhì)量更為豐滿和圓潤。進(jìn)一步的評吸結(jié)果(表10)也說明，微生物發(fā)酵增質(zhì)劑對增加卷煙的香氣量、改善香氣質(zhì)、減少雜氣和刺激性，提高卷煙的整體香氣味質(zhì)量的效果是十分明顯的。
表8微生物發(fā)酵增質(zhì)劑對卷煙致香成分含量的影響


表9微生物發(fā)酵增質(zhì)劑對卷煙中化學(xué)成分含量的影響

表10微生物發(fā)酵增質(zhì)劑對卷煙內(nèi)在質(zhì)量的影響

使用時(shí)，1000g制劑可處理的配方煙葉為100kg。
具體實(shí)施例方式
(1)菌劑的制備包括以下步驟①菌種ZXB1，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941；ZXB2，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354；②斜面培養(yǎng)在新鮮斜面上接種一環(huán)菌苔，與30℃條件下培養(yǎng)2天；③菌種瓶擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基配方是，麩皮70％，豆餅粉28.5％，尿素1.5％，料∶水＝1∶1.0，pH為9.0，按配方將原料稱好拌勻后，加適量水(料∶水＝1∶1.0).繼續(xù)翻拌，達(dá)到手握成團(tuán)，觸之即散的程度，再用2％NaOH溶液調(diào)整pH值為9.0，分別于菌種瓶中，裝量至瓶肩稍靠下一點(diǎn)，擦去瓶口及瓶身粘附的培養(yǎng)料，然后塞上棉塞，上邊蓋兩層紙板用線繩扎好，在1.1-1.5kg/cm2壓力下滅菌1.5h；待培養(yǎng)料冷卻后接種，在培養(yǎng)好的斜面菌種中倒入7ml無菌水，制成菌懸液。將制好的菌懸液分別倒入3只菌種瓶培養(yǎng)基中，搖勻，置于28℃條件下培養(yǎng)3天，可見瓶壁上有菌苔，取下棉塞有刺鼻的微臭味，觀察無其它雜菌污染即為合格；④淺盤培養(yǎng)將配制好的料分裝于塑料袋中，每袋約1000g，用線繩扎口，注意不要扎得太緊，否則不利蒸汽流通滅菌，料裝好后立即送入高壓滅菌鍋中，在1.4-1.5kg/cm2壓力下滅菌1.5h，待料溫降至40℃時(shí)按2％接種量接入菌種瓶中培養(yǎng)好的菌種，充分拌勻，然后均勻攤平，厚度2-3cm，上蓋一層白布，以利保濕，培養(yǎng)室溫度控制在28℃-30℃，當(dāng)料溫高于35℃時(shí)，要及時(shí)翻動(dòng)培養(yǎng)料，并調(diào)整淺盤的上下位置。待培養(yǎng)3天后，料溫逐漸下降，鏡檢絕大部分菌體已形成芽孢，即可終止培養(yǎng)；⑤干燥，粉碎將培養(yǎng)好的固體菌劑放入干燥箱中，在50℃條件下進(jìn)行烘干，烘至含水量小于8％，然后用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎細(xì)度要求通過80目篩的菌粉達(dá)到95％以上；
⑥質(zhì)量檢驗(yàn)合格菌粉的質(zhì)量要求為總菌數(shù)應(yīng)大于80億個(gè)/g，水分小于8％，95％的菌粉須通過80目篩，大腸桿菌數(shù)必須小于30個(gè)/100g，沙門氏菌和綠濃桿菌不得檢出。
(2)煙草生物增質(zhì)劑的配制取重量份數(shù)為200克的巨大芽孢桿菌ZXB1(Bacillus meggaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941，185克的枯草芽孢桿菌ZXB2(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354，15克的商品黑曲霉糖化酶、100克的商品細(xì)菌α-淀粉酶及500克的商品枯草芽孢桿菌中性蛋白酶混合。
最后所應(yīng)說明的是以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種煙草生物增質(zhì)劑，其特征在于包括以下重量份數(shù)的成份巨大芽孢桿菌ZXB1(Bacillus megaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941，180-200份；枯草芽孢桿菌ZXB2(Bacillus subtilissubsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354，180-200份；糖化酶5-15份；淀粉酶50-200份；蛋白酶450-550份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草生物增質(zhì)劑，其特征在于所述的糖化酶為黑曲霉糖化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草生物增質(zhì)劑，其特征在于所述的的淀粉酶為細(xì)菌α-淀粉酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草生物增質(zhì)劑，其特征在于所述的蛋白酶可以為枯草芽孢桿菌中性蛋白酶。
5.一種如權(quán)利要求1所述的煙草生物增質(zhì)劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)菌劑的制備；(2)煙草生物增質(zhì)劑的配制取重量份數(shù)為180-200份的巨大芽孢桿菌ZXB1(Bacillus megaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941，經(jīng)固體培養(yǎng)制備的菌粉；180-200份的枯草芽孢桿菌ZXB2(Bacillus subtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354，經(jīng)固體培養(yǎng)制備的菌粉；5-15份的糖化酶、淀粉酶50-200份及450-550份的蛋白酶混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的煙草生物增質(zhì)劑的制備方法，其特征在于所述的菌劑的制備包括以下步驟①菌種ZXB1，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.941；ZXB2，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis subsp.subtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編號(hào)1.354；②斜面培養(yǎng)在新鮮斜面上接種一環(huán)菌苔，與30℃條件下培養(yǎng)2天；③菌種瓶擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基配方是，麩皮70％，豆餅粉28.5％，尿素1.5％，料∶水＝1∶1.0，pH為9.0，按配方將原料稱好拌勻后，加適量水(料∶水＝1∶1.0).繼續(xù)翻拌，達(dá)到手握成團(tuán)，觸之即散的程度，再用2％NaOH溶液調(diào)整pH值為9.0，分別于菌種瓶中，裝量至瓶肩稍靠下一點(diǎn)，擦去瓶口及瓶身粘附的培養(yǎng)料，然后塞上棉塞，上邊蓋兩層紙板用線繩扎好，在1.1-1.5kg/cm2壓力下滅菌1.5h；待培養(yǎng)料冷卻后接種，在培養(yǎng)好的斜面菌種中倒入7ml無菌水，制成菌懸液。將制好的菌懸液分別倒入3只菌種瓶培養(yǎng)基中，搖勻，置于28℃條件下培養(yǎng)3天，可見瓶壁上有菌苔，取下棉塞有刺鼻的微臭味，觀察無其它雜菌污染即為合格；④淺盤培養(yǎng)將配制好的料分裝于塑料袋中，每袋約1000g，用線繩扎口，注意不要扎得太緊，否則不利蒸汽流通滅菌，料裝好后立即送入高壓滅菌鍋中，在1.4-1.5kg/cm2壓力下滅菌1.5h，待料溫降至40℃時(shí)按2％接種量接入菌種瓶中培養(yǎng)好的菌種，充分拌勻，然后均勻攤平，厚度2-3cm，上蓋一層白布，以利保濕，培養(yǎng)室溫度控制在28℃-30℃，當(dāng)料溫高于35℃時(shí)，要及時(shí)翻動(dòng)培養(yǎng)料，并調(diào)整淺盤的上下位置。待培養(yǎng)3天后，料溫逐漸下降，鏡檢絕大部分菌體已形成芽孢，即可終止培養(yǎng)；⑤干燥，粉碎將培養(yǎng)好的固體菌劑放入干燥箱中，在50℃條件下進(jìn)行烘干，烘至含水量小于8％，然后用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎細(xì)度要求通過80目篩的菌粉達(dá)到95％以上；⑥質(zhì)量檢驗(yàn)合格菌粉的質(zhì)量要求為總菌數(shù)應(yīng)大于80億個(gè)/g，水分小于8％，95％的菌粉須通過80目篩，大腸桿菌數(shù)必須小于30個(gè)/100g，沙門氏菌和綠濃桿菌不得檢出。
7.一種如權(quán)利要求1所述的煙草生物增質(zhì)劑的應(yīng)用，其特征在于先將1000g制劑用5000ml清水浸泡30min，邊浸泡邊攪拌，使菌和酶充分溶出；之后用兩層紗布過濾，除去殘?jiān)?，濾液用于噴霧處理發(fā)酵煙葉。在制絲生產(chǎn)線上使用時(shí)，選取潤葉工序，利用壓縮空氣將濾液噴灑到潤葉筒內(nèi)的葉片上，之后貯葉4h，以下工序同于正常制絲工藝。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種煙草生物增質(zhì)劑及其制備方法和應(yīng)用，包括以下重量份數(shù)的成份巨大芽孢桿菌ZXB
文檔編號(hào)A24B15/30GK101084800SQ20061001792
公開日2007年12月12日 申請日期2006年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者趙銘欽, 邱立友, 王豹祥 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)