專利名稱：有害物質(zhì)的評價方法以及有害物質(zhì)的評價用工具箱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有害物質(zhì)的評價方法以及有害物質(zhì)的評價用工具箱。
背景技術(shù)：
目前，作為評價環(huán)境中存在的未知化學(xué)物質(zhì)對生物的影響的方法，可以使用檢查對于細(xì)菌、藻類、水蚤、魚類等生物個體的生長阻礙的生物學(xué)的毒性檢查「生物測定」。生物測定是在能夠綜合地檢測由未知物質(zhì)和設(shè)想以外的物質(zhì)產(chǎn)生的影響、化學(xué)物質(zhì)的相互作用及由環(huán)境產(chǎn)生的影響等的生物學(xué)的影響方面現(xiàn)有的物理化學(xué)方法，與液相色譜、氣相色譜、原子吸光測量法、酶免疫測定等有互補(bǔ)關(guān)系。
在該生物測定中，可以使用能夠統(tǒng)計性地處理多個個體的、生命周期短的細(xì)菌、藻類等的單細(xì)胞生物，或者小型甲殼類(水蚤)及小型魚類等的、具有比較高等的生物功能、同時容易受到化學(xué)物質(zhì)等的影響的小型水生生物等。作為生物測定的具體方法，可以列舉在日本國環(huán)境省的指南中規(guī)定的根據(jù)藻類繁殖阻礙試驗的生物體影響評價。藻類繁殖阻礙試驗是評價對藻類的被試驗物質(zhì)的各種毒性的方法。
另外，作為其它的方法，可以想出根據(jù)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光測量而測量呼吸阻礙的方法。另外，在非專利文獻(xiàn)1中記載了使用來自藻類的葉綠素?zé)晒獾墓夂铣勺璧K性的測量方法。另外，在專利文獻(xiàn)2、3中，也有關(guān)于使用延遲熒光的測量方法的記載。
非專利文獻(xiàn)1Ulrich Schreiber et al.，″New type dual-channel PAMchlorophyllfluorometer for highly sensitive water toxicity biotests″，Photosynthesis Research 74，p.317-330(2002)非專利文獻(xiàn)2Werner Schmidt and Horst Senger，″Long-term delayedluminescence in Scenedesmus obliquus.II.Influence of exogeneousfactors″，Biochimica et Biophysica Acta 891，p22-27(1987)非專利文獻(xiàn)3Joachim Burger and Werner Schmidt，″Long-termdelayed luminescenceA possible fast and convenient assay for nutritiondeficiencies and environmental pollution damages in plants″，Plant and Soil109，p.79-83(1988)發(fā)明內(nèi)容但是，在根據(jù)上述藻類繁殖阻礙試驗的生物體影響評價方法中，由于以生物的繁殖能力為試驗對象所以操作變得繁雜，同時，到得到試驗結(jié)果需要24～72小時這樣的長時間。相對于此，在上述非專利文獻(xiàn)1等中記載的測量方法中，雖然部分實現(xiàn)試驗時間的縮短，但還不夠。此外，無論在哪一種評價方法中都還沒有達(dá)到實現(xiàn)未知化學(xué)物質(zhì)等的廣泛的有害物質(zhì)的定性和定量分析。另外，即使在非專利文獻(xiàn)2、3中記載的測量方法中，也未能充分地研究有關(guān)有害物質(zhì)的定性和定量的分析的具體的方法。
于是，本發(fā)明是鑒于這樣的課題而完成的，其目的在于提供能夠以短時間進(jìn)行廣泛的有害物質(zhì)的分析的有害物質(zhì)的評價方法以及有害物質(zhì)的評價用工具箱。
為了達(dá)到這樣的目的，根據(jù)本發(fā)明的有害物質(zhì)評價方法，是一種評價在試驗對象的水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)(a toxic substance)的有害物質(zhì)評價方法，其特征在于，具備(1)第1步驟在水溶液樣品中混合具有光合成功能的光合成樣品并調(diào)制試驗測量溶液，以規(guī)定的放置時間放置試驗測量溶液，在試驗測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量；(2)第2步驟將在比較樣品中混合光合成樣品而調(diào)制的比較測量溶液以規(guī)定的放置時間放置，在比較測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量，準(zhǔn)備這樣得到的比較測量結(jié)果；以及(3)第3步驟通過基于在第1步驟及第2步驟中分別取得的延遲熒光的光量算出評價值，求出評價值的比較值，而評價在水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)；(4)評價值是在第1步驟和第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間的變化的特征點中的經(jīng)過時間。
或者，根據(jù)本發(fā)明的有害物質(zhì)的評價方法，是一種評價在試驗對象的水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)評價方法，其特征在于，具備(1)第1步驟在水溶液樣品中混合具有光合成功能的光合成樣品并調(diào)制試驗測量溶液，以規(guī)定的放置時間放置試驗測量溶液，在試驗測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量；(2)第2步驟將在比較樣品中混合光合成樣品而調(diào)制的比較測量溶液以規(guī)定的放置時間放置，在比較測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量，準(zhǔn)備這樣得到的比較測量結(jié)果；以及(3)第3步驟通過基于在第1步驟及第2步驟中分別取得的延遲熒光的光量算出評價值，求出評價值的比較值，而評價在水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)；(4)評價值是在第1步驟和第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間的變化，比較值是取了時間的變化的差的值。
由這樣的有害物質(zhì)的評價方法，由比較從混合在評價對象的水溶液樣品中的光合成樣品發(fā)出的延遲熒光的光量的時間變化，與從含有作為關(guān)于水溶液樣品的比較對象而準(zhǔn)備的比較樣品的比較測量溶液中的光合成樣品發(fā)出的延遲熒光的光量的時間變化，而得到的特征出發(fā)，可以同時且高精度地定性定量多種有害物質(zhì)。另外，通過測量延遲熒光的光量而進(jìn)行評價，可以總體上縮短測量時間。
另外，在上述的評價方法中的第1評價方法中，評價值取為在第1步驟及第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化的特征點中的經(jīng)過時間。此時，因為延遲熒光的光量的時間變化的特征點根據(jù)成為有害物質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)種類等而變化，所以，通過評價在該特征點中的經(jīng)過時間，可以更準(zhǔn)確地定性和定量各種有害物質(zhì)。
另外，在第2評價方法中，評價值取為在第1步驟及第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間的變化，比較值取為取時間的變化的差的值。由此，可以得到延遲熒光量的時間變化中的變化集中的時間和拐點這樣的特征，成為有害物質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)種類等的確定就變得容易。
另外，在上述的第2評價方法中，在第1步驟或第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間的變化具有特征點，在第3步驟中，可以對于一個特征點與測量起點或其它特征點之間的規(guī)定范圍使用將取延遲熒光的光量的時間的變化的差的值作為比較值而評價有害物質(zhì)的方法。另外，在延遲熒光的光量的時間的變化中沒有特征點時，可以對其全體或規(guī)定范圍將取延遲熒光的光量的時間變化的差的值作為比較值。
或者，在第3步驟中，可以使用對于取了在第1步驟及第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間的變化的差的值，將進(jìn)一步取了與在第1步驟或第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間的變化之比的值作為比較值來評價有害物質(zhì)的方法。
這里，關(guān)于在第2步驟中使用的比較樣品和比較測量結(jié)果，可以使用各種樣品和結(jié)果。例如，在第2步驟中，作為比較樣品可以使用成為比較對象的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在標(biāo)準(zhǔn)樣品中混合光合成樣品并調(diào)制是比較測量溶液的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，以規(guī)定的放置時間放置標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，對標(biāo)準(zhǔn)測量溶液以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量，從而取得比較測量結(jié)果的方法。此時，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，優(yōu)選使用實質(zhì)上不存在有害物質(zhì)的樣品。
或者，可以使用，在第2步驟中，作為比較樣品使用其它的水溶液樣品，對于在其它的水溶液樣品中混合光合成樣品而調(diào)制的比較測量溶液的其它試驗測量溶液，準(zhǔn)備取得的測量結(jié)果作為比較測量結(jié)果的方法。此時，作為比較測量結(jié)果，例如可以使用前次的測量結(jié)果。
另外，關(guān)于第2步驟的比較測量結(jié)果的取得，與第1步驟同樣，可以使用通過對比較測量溶液進(jìn)行延遲熒光的光量的測量而準(zhǔn)備比較測量結(jié)果的方法?；蛘咭部梢允褂?，在第2步驟中，作為比較測量結(jié)果，準(zhǔn)備預(yù)先對于比較測量溶液取得的測量結(jié)果作為比較測量結(jié)果的方法。此時，優(yōu)選將預(yù)先取得的比較測量結(jié)果存儲在存儲器等中，根據(jù)需要讀出數(shù)據(jù)使用。
另外，也優(yōu)選在第1步驟及第2步驟中，在每次測量時改變光條件，以規(guī)定的放置時間放置試驗測量溶液和比較測量溶液，在第3步驟中，評價根據(jù)光條件的比較值的變化。如果采用這樣的方法，因為光條件對延遲熒光特性的影響因每種有害物質(zhì)而不同，所以，通過評價根據(jù)放置時的光條件變化的比較值，水溶液樣品中的有害物質(zhì)的判斷變得更加容易。
另外，還優(yōu)選，試驗測量溶液中和比較測量溶液中的光合成樣品的密度，在與延遲熒光的光量具有比例關(guān)系的密度的范圍。此時，例如，測定吸光度等而測量光合成樣品的密度后，通過基于該密度而校正延遲熒光的光量，可以實現(xiàn)更高精度的有害物質(zhì)的評價。
此外，還優(yōu)選，在第1步驟及第2步驟中，在測量延遲熒光的光量前，使試驗測量溶液和比較測量溶液均勻化。如果這樣做，因為在測量中測量溶液中的光合成樣品被均勻地分布，所以就成為能夠進(jìn)行誤差更少的有害物質(zhì)的評價。
另外，關(guān)于在水溶液樣品中混合的光合成樣品，優(yōu)選使用由選自耐鹽性藻類、耐堿性藻類和耐酸性藻類的至少一種組成的光合成樣品。作為這樣的光合成樣品，可以列舉例如螺旋藻屬。
根據(jù)本發(fā)明的其它有害物質(zhì)的評價方法，是一種評價在試驗對象的水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)的評價方法，其特征是，具備(a)在水溶液樣品中混合具有光合成功能的光合成樣品并調(diào)制試驗測量溶液的調(diào)制步驟，(b)將試驗測量溶液放置規(guī)定的放置時間的放置步驟，(c)在試驗測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量的測量步驟，(d)基于在測量步驟中取得的延遲熒光的光量，評價在水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)的評價步驟，以及(e)包括在測量步驟前對試驗測量溶液進(jìn)行在規(guī)定的待命時間的暗中待命的暗中待命步驟，或?qū)υ囼灉y量溶液進(jìn)行預(yù)備的光照射和在規(guī)定的待命時間的暗中待命的預(yù)備照射步驟的任意一個的適應(yīng)化步驟。
由這樣的有害物質(zhì)評價方法，從可以在評價對象的水溶液中混合的光合成樣品發(fā)出的延遲熒光的光量的時間的變化中得到的特征出發(fā)，可以同時而且高精度地定性定量多種有害物質(zhì)。另外，通過測量延遲熒光的光量而評價，可以整體地縮短測量時間。另外，通過在測量步驟前對試驗測量溶液進(jìn)行適應(yīng)化步驟，可以提高延遲熒光的測量和根據(jù)該測量結(jié)果的有害物質(zhì)的評價的精度。
這樣，在測量步驟前實施適應(yīng)化步驟時，在暗中待命步驟中，規(guī)定的待命時間優(yōu)選為30秒以上、1小時以下的時間。另外，在預(yù)備照射步驟中的預(yù)備的光照射的時間和暗中待命的時間之比，優(yōu)選等于在測量步驟中的光的照射的時間和暗中待命的時間之比。
并且，為了這樣的評價，提供一種有害物質(zhì)評價用工具箱，是用于評價在試驗對象的水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)評價用工具箱，具備在水溶液樣品中混合的光合成樣品，用于調(diào)整水溶液樣品的鹽濃度及pH的混合鹽類，以及在水溶液樣品中分離光合成樣品與混合鹽類并使之混合的混合工具。另外，評價用工具箱，優(yōu)選具備用于將光合成樣品的分布密度均勻化的穩(wěn)定劑。作為這樣的穩(wěn)定劑，可以列舉例如比重調(diào)整劑、增粘劑。
根據(jù)本發(fā)明的有害物質(zhì)的評價方法，可以在短時間內(nèi)進(jìn)行廣泛的有害物質(zhì)的分析。


圖1是表示延遲熒光測量裝置的一個實施方式的圖。
圖2是部分表示圖1的延遲熒光測量裝置的框圖。
圖3是表示本發(fā)明的實施方式相關(guān)的生物生長阻礙主要因素的評價方法的順序的流程圖。
圖4是表示測定延遲熒光的光量時的延遲熒光測量裝置1的動作的流程圖。
圖5是表示延遲熒光的光量的時間變化的一例的圖。
圖6的(a)是表示波長665nm的吸光度與延遲熒光量的關(guān)系的一例的圖表，(b)是表示波長750nm的吸光度與延遲熒光量的關(guān)系的一例的圖表。
圖7是表示相對于吸光度的VCP1的變化的圖表。
圖8的(a)是表示改變光強(qiáng)度時的評價值CP1的圖表，(b)是表示改變光強(qiáng)度時的評價值CP2的圖表，(c)是表示改變光強(qiáng)度時的評價值TP2的圖表。
圖9的(a)是表示改變光波長時的評價值CP1的圖表，(b)是表示改變光波長時的評價值CP2的圖表，(c)是表示改變光波長時的評價值TP2的圖表。
圖10的(a)是表示相對于阿特拉津濃度的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示相對于阿特拉津濃度的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示相對于阿特拉津濃度的比較值VTP2的變化的圖表。
圖11是表示改變阿特拉津濃度時的曲線值的圖表。
圖12的(a)是表示相對DCMU濃度的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示相對于DCMU濃度的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示相對于DCMU濃度的比較值VTP2的變化的圖表。
圖13是表示改變DCMU濃度時的曲線值的圖表。
圖14的(a)是表示相對于百草枯(paraquat)濃度的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示相對于百草枯(paraquat)濃度的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示相對于百草枯(paraquat)濃度的比較值VTP2的變化的圖表。
圖15是表示改變百草枯(paraquat)濃度時的曲線值的圖表。
圖16的(a)是表示相對于無機(jī)汞濃度的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示相對于無機(jī)汞濃度的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示相對于無機(jī)汞濃度的比較值VTP2的變化的圖表。
圖17是表示改變無機(jī)汞濃度時的曲線值的圖表。
圖18的(a)是表示相對于游離氰基濃度的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示相對于游離氰基濃度的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示相對于游離氰濃度的比較值VTP2的變化的圖表。
圖19是表示改變游離氰濃度時的曲線值的圖表。
圖20的(a)是表示相對于TPN濃度的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示相對于TPN濃度的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示相對于TPN濃度的比較值VTP2的變化的圖表。
圖21是表示改變TPN濃度時的曲線值的圖表。
圖22的(a)是表示包含不同種的生物生長阻礙因素的各試驗測量溶液的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示包含不同種的生物生長阻礙因素的各試驗測量溶液的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示包含不同種的生物生長阻礙因素的各試驗測量溶液的比較值VTP2的變化的圖表。
圖23的(a)是表示包含同種的生物生長阻礙因素的各試驗測量溶液的比較值VCP1的變化的圖表，(b)是表示包含同種的生物生長阻礙因素的各試驗測量溶液的比較值VCP2的變化的圖表，(c)是表示包含同種的生物生長阻礙因素的各試驗測量溶液的比較值VTP2的變化的圖表。
圖24是表示使用本發(fā)明的一個實施方式相關(guān)的生物生長阻礙因素的評價用工具箱進(jìn)行延遲熒光的測量時的步驟的圖。
圖25是表示使用本發(fā)明的其它實施方式相關(guān)的生物生長阻礙因素的評價用工具箱進(jìn)行延遲熒光的測量時的步驟的圖。
圖26是表示本發(fā)明的其它實施方式相關(guān)的生物生長阻礙因素的評價方法的步驟的流程圖。
圖27的(a)是表示關(guān)于相對于放置時的各種光條件的TPN的比較值的圖表，(b)是表示關(guān)于相對于放置時的各種光條件的無機(jī)汞的比較值的圖表。
圖28的(a)是表示在實施例1中算出的比較值VCP1的圖表，(b)是表示在實施例1中算出的比較值VCP2的圖表，(c)是表示在實施例1中算出的比較值VTP2的圖表。
圖29是表示在實施例2中算出的比較值VCP1的圖表。
圖30是表示使用高鹽性培養(yǎng)基和低鹽性培養(yǎng)基調(diào)整水溶液樣品時的調(diào)整例的表。
圖31是表示溶液沒有均勻化和添加增粘劑的條件下的相對于放置時間的延遲熒光量變化的圖表。
圖32是表示有害物質(zhì)的連續(xù)評價方法的一例的示意圖。
圖33是表示有害物質(zhì)的連續(xù)評價方法的其它例的示意圖。
圖34是表示延遲熒光的光量的時間變化的例的圖。
圖35是表示關(guān)于在延遲熒光衰減曲線中存在特征點時的曲線值的計算方法的例的圖。
圖36是表示關(guān)于在延遲熒光衰減曲線中不存在特征點時的曲線值的計算方法的例的圖。
圖37是表示改變西瑪三嗪濃度和二氯苯酚濃度時的曲線值的圖表。
圖38是表示改變西瑪三嗪濃度和二氯苯酚濃度時的V曲線值的圖表。
圖39是表示根據(jù)延遲熒光的測量次數(shù)的評價值CP1的變化的圖表。
圖40是表示進(jìn)行了3次延遲熒光的測量的結(jié)果中的測量精度的表。
符號說明1…延遲熒光測量裝置，10…光源，12…第1測定部，12a…第1光傳感器，12b…散射光量計算部，14…測定部，14a…第2光傳感器，14b…延遲熒光的光量計算部，16…解析部，18…控制部，20…箱體，22…本體部，24…蓋部，26…導(dǎo)入口，28…設(shè)置部，30…過濾器，32…聚光光學(xué)系統(tǒng)，34…快門，36、44…電纜，38…計算部，40…存儲部，42…表示部，50…采液容器，52…水溶液樣品，54…調(diào)整溶液，56…濃縮的光合成樣品，58…試驗測量溶液，60…采液容器。
具體實施例方式
關(guān)于本發(fā)明的實施方式，參照附圖進(jìn)行說明。另外，在各圖中，對相同要素賦予相同符號，省略重復(fù)的說明。
(延遲熒光測量裝置)首先，對用于實施根據(jù)本發(fā)明的有害物質(zhì)的評價方法的延遲熒光測量裝置進(jìn)行說明。圖1是表示延遲熒光測量裝置的一個實施方式的圖，圖2是部分地表示延遲熒光測量裝置的框圖。
延遲熒光測量裝置1具備光源10、第1測定部12、第2測定部14、解析部16和控制部18。光源10是在測定對象的溶液中照射規(guī)定波長的測定光的光源，其波長是280nm～800nm。這里，光源10可以是單色光，也可以是組合了多個光源的光源。光源10的發(fā)光，可以是規(guī)定時間連續(xù)的，也可以以任意的圖形使之脈沖點燈。另外，可以使具有相同或不同波長特性的多個光源順序地發(fā)光，也可以使多個光源同時發(fā)光。
第1測定部12，是測定相對于測定光的溶液的吸光度或散射光的光量的部分，具有檢測照射在溶液中的測定光的透過光或散射光的第1光傳感器12a，以及基于第1光傳感器12a檢測并輸出的信號而計算吸光度或散射光的光量的吸光度或散射光量計算部12b。
第2測定部14，是測定由照射測定光而從光合成樣品(詳細(xì)的在后面敘述)產(chǎn)生的延遲熒光的光量的部分，具有檢測延遲熒光的第2光傳感器14a，以及基于第2光傳感器14a檢測并輸出的信號而算出延遲熒光的光量的延遲熒光的光量計算部14b。這里，延遲熒光如以下地產(chǎn)生。即，在具有光合成功能的生物反應(yīng)中，在同化色素(光合成色素)中吸收的光能，由電子傳遞通路作為化學(xué)能在生物反應(yīng)中傳遞。在該傳遞過程中，部分化學(xué)能引起逆向反應(yīng)，光合成色素由該化學(xué)能被再激勵。這樣從被再激勵的光合成色素中產(chǎn)生熒光發(fā)光。另外，延遲熒光也有被稱為延遲發(fā)光的，以下總稱為延遲熒光。
光源10、第1測定部12和第2測定部14被容納在具有遮光性的箱體20中。箱體20其本身可以由遮斷光的遮光部件形成，也可以由涂布了遮斷光的涂料等的部件形成。
箱體20具有本體部22和蓋部24。本體部22，在其一端側(cè)形成導(dǎo)入口26。導(dǎo)入口26是為了向箱體20內(nèi)導(dǎo)入含有光合成樣品的溶液而形成的，由蓋部24形成為閉塞。
另外，在箱體20內(nèi)，在光源10與第1測定部12的中間附近設(shè)置有能夠設(shè)置加入了溶液的容器(未圖示)的設(shè)置部28。設(shè)置部28，具有例如固定容器用的固定爪，以該固定爪固定容器。
在箱體20內(nèi)的設(shè)置部28和第2測定部14之間，設(shè)置著過濾器30、聚光光學(xué)系統(tǒng)32和快門34。過濾器30是以與箱體20的內(nèi)壁面連接的方式設(shè)置且透過延遲熒光的過濾器。聚光光學(xué)系統(tǒng)32是聚集微弱的延遲熒光的系統(tǒng)。快門34做成開關(guān)自由，關(guān)的時候遮斷延遲熒光。
解析部16通過第1電纜36而連接于第1測定部12和第2測定部14，具有計算部38、存儲部40和表示部42。計算部38基于由第1測定部12測定的吸光度或散射光的光量，和由第2測定部14測定的延遲熒光的光量，根據(jù)后述的演算方法，求出與溶液中存在的有害物質(zhì)相關(guān)的比較值。存儲部40是順序地存儲由計算部38求出的比較值的部分。表示部42是表示或圖示在存儲部40中順序存儲的多個比較值的部分。
控制部18通過第2電纜44連接于解析部16。即，控制部18通過第2電纜44和第1電纜36，被連接于第1測定部12和第2測定部14。另外，控制部18發(fā)送控制蓋部24的開關(guān)、光源10的發(fā)光與停止發(fā)光和快門34的開關(guān)的控制信號。
(有害物質(zhì)的評價方法)
接著，對根據(jù)本發(fā)明的有害物質(zhì)的評價方法詳細(xì)地說明。圖3是表示作為有害物質(zhì)的生物生長阻礙因素的評價方法的步驟的流程圖。該評價方法是用于評價在試驗對象的水溶液樣品中存在的生物生長阻礙主要因素的評價方法。這里，所謂生物生長阻礙因素，是對細(xì)菌、藻類、水蚤、魚類等的生物個體帶來生長阻礙作用或毒性等的壞影響的因素。
首先，在比色皿等的容器內(nèi)，混合成為試驗對象的水溶液樣品和調(diào)整溶液(步驟S01)。
作為水溶液樣品，可以利用，從湖泊河流和井水等天然水源直接采取的水，含有從土壤和污泥等固形物由一般的提取方法得到的提取成分的水溶液，清洗蔬菜等被撒布了農(nóng)藥的物體的表面而流出的水溶液，通過在液體中吸收氣體成分而得到的水溶液，含有從植物或動物等(蔬菜和肉食等)由一般的提取方法而得到的提取成分的水溶液，以及含有從植物或動物采取的組織液、血液、乳汁、糞尿等的排泄物由一般的提取方法而得到的提取成分的水溶液等。另外，上述水溶液樣品，可以使用通過預(yù)先由溶劑提取或固相提取等的分級處理而在水溶性物質(zhì)、疏水性物質(zhì)等的特性不同的成分中分離或濃縮了的樣品。
調(diào)整溶液是含有用于調(diào)整水溶液樣品的鹽濃度、pH的各種鹽類的溶液。調(diào)制用于使用光合成樣品的延遲熒光測量的測量溶液時，水溶液樣品往往是未知的水溶液，其鹽濃度、pH等往往是多種多樣的。另外，已知在鹽濃度、pH沒有適當(dāng)范圍時，對光合成樣品的光合成功能帶來影響。因此，調(diào)整溶液可以用于調(diào)整測量溶液的鹽濃度、pH。而且，為了進(jìn)行高靈敏度的測量，優(yōu)選在比色皿中的測量溶液中的光合成樣品的分布密度均勻而不偏，優(yōu)選在測量中不產(chǎn)生沉淀物和浮起物。因此，優(yōu)選調(diào)整溶液含有用于在測量溶液中的光合成樣品的分布密度不發(fā)生偏差地均勻化的穩(wěn)定劑。例如，可以通過使之在測量溶液中具有某種程度的粘性，使比重與光合成樣品一致，而均勻化。
作為調(diào)整溶液的溶質(zhì)，可以列舉例如，將水溶液樣品的鹽濃度、pH調(diào)整為適合于光合成樣品的條件的混合鹽類，將光合成樣品的測量溶液中的分布密度均勻化的穩(wěn)定劑，以及在光合成反應(yīng)中最低限度需要的營養(yǎng)鹽類等。另外，作為在調(diào)整溶液中所含的穩(wěn)定劑，可以使用在測量中的光合成樣品的空間穩(wěn)定化中需要的比重調(diào)整劑和凝膠化劑(增粘劑)等。通過使用這樣的比重調(diào)整劑，測量溶液的比重被調(diào)整為與光合成樣品基本一致。另外，該穩(wěn)定劑也可以取代調(diào)整溶液而包含在后述的光合成樣品中。
其次，在比色皿等的容器內(nèi)，在由調(diào)整溶液調(diào)整的水溶液樣品中混入光合成樣品，而被調(diào)制成為試驗測量溶液(步驟S02，調(diào)制步驟)。此時，試驗測量溶液中的光合成樣品被混合成為均勻的濃度。
所謂光合成樣品，是具有光合成功能的樣品，只要能夠是能夠發(fā)出延遲熒光的就可以，例如，可以列舉，藻類或植物性浮游生物、氰基細(xì)菌、光合成細(xì)菌、植物體和葉或其細(xì)片、愈傷組織等的植物性培養(yǎng)細(xì)胞、從植物提取的光合成小器官和類囊體膜、還有人工合成的具有光合成樣功能的膜·蛋白復(fù)合體等。優(yōu)選可以利用例如藍(lán)藻類的螺旋藻屬(Spirulina)、綠藻類的月芽藻屬(Selenastrum)和黃色藻類的等鞭金藻屬(Isochrysis)，或者，從菠菜等提取的類囊體膜等。
將如上述地調(diào)制的試驗測量溶液在規(guī)定的光條件下以規(guī)定的放置時間放置(步驟S03，放置步驟)。所謂光條件，指的是在放置時被照射在試驗測量溶液中的光波長、光量，是合成光時的各成分的波長和光量那樣的環(huán)境條件。
然后，如以下那樣地測量從試驗測量溶液發(fā)出的延遲熒光的光量，測定延遲熒光的光量的時間變化(步驟S04，測量步驟)。
圖4是表示測定延遲熒光的光量時的延遲熒光測量裝置1的動作的流程圖。另外，在箱體20內(nèi)的設(shè)置部28中，設(shè)置著加入了試驗測量溶液的容器。
首先，控制部18發(fā)送使光源10發(fā)光的控制信號。由此，光源10發(fā)光(步驟S401)。該發(fā)光在對試驗測量溶液進(jìn)行了用于使光合成樣品適應(yīng)測量光的預(yù)備的光照射后，進(jìn)行規(guī)定照射時間的用于產(chǎn)生延遲熒光的光照射。光源10一發(fā)光，第1測定部12就測定試驗測量溶液的吸光度或散射光的光量(步驟S402)。測定后，第1測定部12將關(guān)于吸光度或散射光的光量的信息發(fā)送到計算部38。此后，控制部18發(fā)送使光源10的發(fā)光停止的控制信號。由此，光源10停止發(fā)光(步驟S403)。另外，上述的吸光度或散射光的光量的測定也可以在預(yù)備的光照射時進(jìn)行。
發(fā)光停止后，控制部18發(fā)送使快門34打開的控制信號。由此，快門34打開(步驟S404)。快門34一打開，第2測定部14就測定延遲熒光的光量(步驟S405)。測定后，第2測定部14將關(guān)于在規(guī)定的測量時間中的延遲熒光的光量的時間變化的信息發(fā)送到計算部38。此后，控制部18發(fā)送使快門34關(guān)閉的控制信號。由此，快門34關(guān)閉(步驟S406)。
在至此的處理中，關(guān)于試驗測量溶液的延遲熒光量的測量(第1步驟)完成。
接著，回到圖3，以和步驟S01同樣的條件，在比色皿等別的容器內(nèi)混合標(biāo)準(zhǔn)樣品和調(diào)整溶液(步驟S05)。這里，標(biāo)準(zhǔn)樣品是已知不存在稱為生物生長阻礙因素的有害物質(zhì)的溶液，例如，可以使用滅菌蒸餾水和純水等除去了雜質(zhì)、菌類的水。
然后，以和步驟S02同樣的條件，在比色皿等的容器內(nèi)，在由調(diào)整溶液調(diào)整了的標(biāo)準(zhǔn)樣品中混入光合成樣品，調(diào)制成為標(biāo)準(zhǔn)測量溶液(步驟S06)。以下，和步驟S03～S04同樣操作，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的延遲熒光量的測量(步驟S07～S08，以上是第2步驟)。
另外，為了提高測量精度，上述的延遲熒光量的測量(步驟S401～S406)，也可以對試驗測量溶液或標(biāo)準(zhǔn)測量溶液多次反復(fù)進(jìn)行，從而算出其平均值。
測量試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的延遲熒光量的時間變化及各自的測定時的吸光度(或散射光的光量)后，計算部38就基于這些延遲熒光量的時間變化，求出相關(guān)于生物生長阻礙因素的比較值(步驟S09)。
圖5是表示標(biāo)準(zhǔn)的測定條件下的延遲熒光的光量的時間變化的例子的圖。這里，所謂標(biāo)準(zhǔn)的測定條件如下。首先，作為光合成樣品，準(zhǔn)備在光強(qiáng)度50μmol/m2/s、波長665nm的紅色單色光下以一般方法培育的藍(lán)藻類的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，準(zhǔn)備1.8ml的滅菌蒸餾水。接著，在標(biāo)準(zhǔn)樣品中添加含有4倍濃度的標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)藻培養(yǎng)用混合鹽類和用于調(diào)整pH和鹽濃度的混合鹽類的0.6ml的調(diào)整溶液。接著，混合含有換算為665nm的吸光度、OD＝0.1左右且均勻的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)，和作為凝膠化劑的0.5重量％的瓊脂的0.6ml的光合成樣品，調(diào)制3ml的測量溶液。
此后，在光強(qiáng)度1.5μmol/m2/s的白色熒光燈下放置15分鐘左右。然后，使用延遲熒光測量裝置1，在作為用于使光合成樣品適應(yīng)測量光條件的預(yù)備光照射而照射2秒665nm、0.8mW/cm2的光后，使之在黑暗下待命60秒鐘。此后，再次照射2秒665nm、0.8mW/cm2的激勵光后，以時間分辨率0.1秒測量60秒鐘內(nèi)的延遲熒光的光量。進(jìn)行3次上述60秒鐘的測量，從其平均值可以得到延遲熒光的光量的時間變化。另外，對水溶液樣品也同樣測量。
如圖5所示地，得到的延遲熒光衰減曲線(延遲熒光的光量的時間變化)，具有從光照射結(jié)束后繼續(xù)的為衰減曲線頂點的第1峰(P1)以及在光照射結(jié)束后25～35秒近處出現(xiàn)的第2峰(P2)。另外，在第1峰(P1)和第2峰(P2)之間的靠近P1處出現(xiàn)拐點(C1)。這些P1、P2和C1(特征點)表示根據(jù)生物生長阻礙因素的種類的特征性的變化。這些特征點的變化是由光合成樣品對生物生長阻礙因素的感受性的變化帶來的。另外，作為該特征點，不限于上述3個點，也可以使用P1和P2之間的極小點或者在延遲熒光衰減曲線中的其它拐點。
這里，計算部38檢測試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的延遲熒光衰減曲線中的特征點，算出評價該特征點的評價值。作為該評價值，可以使用在P1中的延遲熒光量CP1、在P2中的延遲熒光量CP2、以及在P2中的光照射結(jié)束后的經(jīng)過時間TP2。另外，作為用于評價拐點C1的評價值，使用試驗測量溶液與標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的延遲熒光的光量的時間變化的值。
然后，計算部38還進(jìn)行基于各個測量溶液測定時的吸光度(或散射光的光量)校正延遲熒光的光量或評價值。該校正是用于校正由測量溶液中的光合成樣品的濃度差產(chǎn)生的測定誤差的。該測定誤差，特別是在評價光合成樣品的極微量變化區(qū)域時，由在設(shè)置部28的光合成樣品的配置、或設(shè)置部28本身的配置等，由于光照射量、光路變化而產(chǎn)生。在該校正中，以吸光度(或散射光的光量)為基礎(chǔ)而使用被測量的細(xì)胞密度是有效的。
為了高精度地進(jìn)行上述校正，優(yōu)選試驗測量溶液中和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中的光合成樣品的密度，是在與關(guān)于各個的延遲熒光的光量具有比例關(guān)系的密度范圍。即，測量溶液中的光合成樣品密度在某值以下時，吸光度(或散射光的光量)和延遲熒光的光量，與光合成樣品的密度顯示高度相關(guān)。該密度的上限值，根據(jù)每個光合成樣品的特性適當(dāng)設(shè)定。
圖6中，圖表(a)表示波長665nm的吸光度(OD665)和延遲熒光量CP1的關(guān)系的一個例子，圖表(b)表示波長750nm的吸光度(OD750)和延遲熒光量CP1的關(guān)系的一個例子。根據(jù)圖6的例子，吸光度和延遲熒光量CP1在直到吸光度(OD)＝0.5附近有高度相關(guān)。但是，在OD＝0.5以上時可知，由光合成樣品本身的自我吸收，延遲熒光量可見并且減少。因此，此時吸光度如果在OD＝0.5以下的范圍內(nèi)，以其為基礎(chǔ)能高精度地進(jìn)行延遲熒光量的校正。
其次，計算部38從評價值算出用于使由于水溶液樣品中的生物生長阻礙因素的影響明顯化的比較值。作為比較值的例子，可以使用取了從試驗測量溶液與標(biāo)準(zhǔn)測量溶液得到的CP1、CP2、TP2的比而得到的VCP1值、VCP2值、VTP2值，取從試驗測量溶液與標(biāo)準(zhǔn)測量溶液得到的延遲熒光的光量的時間變化的差而得到的曲線(Curve)值。通過評價這些比較值，可以適當(dāng)?shù)卦u價光合成樣品對生物生長阻礙因素的感受性。
另外，在以下的本說明書中，CP1是從光照射結(jié)束后0.1秒至0.5秒的延遲熒光量累計量[counts]，TP2是出現(xiàn)第2峰(或類似的拐點)的光照射結(jié)束后的經(jīng)過時間[sec]，CP2是第2峰(或類似的拐點)出現(xiàn)的時刻±0.5秒的延遲熒光量累計量[counts]，曲線(Curve)值是包含C1的第1峰和第2峰之間的延遲熒光衰減曲線的、試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的差[counts]，VCP1值、VCP2值、VTP2值是分別作為CP1、CP2、TP2相對于標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的試驗測量溶液的比而算出的。關(guān)于這些評價值和比較值的具體計算方法可以根據(jù)需要適當(dāng)選擇。
另外，為了由這樣算出的比較值以高靈敏度檢測生物生長阻礙因素，優(yōu)選即使是在和上述延遲熒光的光量具有比例關(guān)系的光合成樣品密度的范圍內(nèi)，光合成樣品也是充分的低密度。
圖7中表示相對于波長665nm的吸光度的VCP1值的變化。該VCP1值是由以混合了含有濃度0.1ppb的DCMU的水溶液樣品以及光合成樣品鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)的測量溶液為對象進(jìn)行測量的結(jié)果而得到的值。另外，以標(biāo)準(zhǔn)測量溶液為測量對象時，吸光度在0.5以下時吸光度和延遲熒光的光量顯示高度相關(guān)。
如圖7所示地，隨著光合成樣品密度變得高于OD＝0.1，VCP1值(％)下降。另一方面，延遲熒光的光量和光合成樣品密度的相關(guān)，保持到吸光度0.5附近。由此可知，即使在延遲熒光的光量不由自我吸收而衰減的光合成樣品密度的范圍中，光合成樣品密度比較高時，生物生長阻礙因素的檢測靈敏度下降。對光合成樣品的生物生長阻礙性，由于水溶液樣品中的化學(xué)物質(zhì)被浸透吸收在光合成樣品中，并與特定的目標(biāo)生物體分子直接或間接的相互作用而發(fā)生。因此，相對于極低濃度的化學(xué)物質(zhì)，存在過剩的光合成樣品(＝目標(biāo)生物體分子)時，結(jié)果變?yōu)橛绊懴陆怠?br> 回到圖3，一旦求出比較值，存儲部40就存儲比較值(步驟S10)，表示部42就表示被存儲的比較值(步驟S11)。這里的表示通過例如圖表表示被存儲的比較值等進(jìn)行。另外，也優(yōu)選可以與關(guān)于以前被存儲的其它水溶液樣品的比較值對比那樣地并列表示等。最后，通過將被表示的比較值與已知物質(zhì)的比較值對比解析，進(jìn)行在水溶液樣品中的生物生長阻礙因素的定性·定量(步驟S12，以上是第3步驟，評價步驟)。關(guān)于步驟S12中的解析·評價方法的詳細(xì)內(nèi)容在后面詳細(xì)敘述。
另外，為了穩(wěn)定地進(jìn)行高靈敏度測量，在步驟S03中的測量溶液放置時的光條件，優(yōu)選控制在規(guī)定條件。另外，在將光合成樣品從明處移動到暗處時等，為了光合成樣品經(jīng)過一段時間慢慢地適應(yīng)該環(huán)境，從測定前起以一定的光條件保存光合成樣品，或改變放置光合成樣品的光環(huán)境后，經(jīng)過規(guī)定時間后進(jìn)行延遲熒光的測量更為適合。
在圖8中，表示作為光合成樣品使用鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)時，使測量溶液放置時的光強(qiáng)度進(jìn)行各種變化時的評價值的一個例子。在圖8中，圖表(a)表示改變光強(qiáng)度時的CP1，圖表(b)表示改變光強(qiáng)度時的CP2，圖表(c)表示改變光強(qiáng)度時的TP2。如圖8所示，在測定前在強(qiáng)光下的在明處的測量溶液中，CP1大于其它的光強(qiáng)度，在弱光下的測量溶液中，CP2大于其它的光強(qiáng)度，在黑暗下的測量溶液中，TP2大于其它的光強(qiáng)度。這樣可知，從光合成樣品發(fā)出的延遲熒光，由于放置狀態(tài)的光強(qiáng)度而變化，其結(jié)果是，影響到延遲熒光衰減曲線的測量·評價結(jié)果。從這樣的理由出發(fā)，將測量溶液放置時的光條件控制在規(guī)定的條件，在用于再現(xiàn)性良好且穩(wěn)定地測定·評價延遲熒光衰減曲線中的極大點、極小點、拐點等的特征點是重要的。
另外，在測量溶液中被混合的光合成樣品，為了得到再現(xiàn)性良好的測量結(jié)果，優(yōu)選使用以規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)的樣品。作為這樣的規(guī)定的培養(yǎng)條件，優(yōu)選是一定的光環(huán)境下(例如照射波長、照射強(qiáng)度)。另外，更優(yōu)選在低溫下在黑暗或規(guī)定的光照射強(qiáng)度(例如光強(qiáng)度1μmol/m2/s)下保存以單色光源培育的樣品，且繁殖被抑制的培養(yǎng)條件。
在圖9中表示使用以不同的光環(huán)境培育的光合成樣品鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)時的評價值。圖9中，圖表(a)表示改變培養(yǎng)條件(光波長)時的CP1，圖表(b)表示使光波長變化時的CP2，圖表(c)表示使光波長變化時的TP2。如圖9所示地，因為延遲熒光衰減曲線根據(jù)光環(huán)境而變化，所以，得到的評價值也變動。從這樣的理由出發(fā)，以規(guī)定的培養(yǎng)條件培育光合成樣品，對用于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的高靈敏度測量是重要的。
(現(xiàn)有物質(zhì)的測量)以下表示，在上述的標(biāo)準(zhǔn)測定條件下，關(guān)于在含有成為生物生長阻礙因素的現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)的水溶液樣品的延遲熒光測量的解析結(jié)果。
圖10和圖11是表示以各種濃度含有阿特拉津的水溶液樣品為對象算出的比較值的圖表。在圖10中，圖表(a)是表示相對于阿特拉津濃度的VCP1值的變化的圖表，圖表(b)是表示相對于阿特拉津濃度的VCP2值的變化的圖表，圖表(c)是表示相對于阿特拉津濃度的VTP2值的變化的圖表。另外，圖11是表示使阿特拉津濃度變化時的曲線(Curve)值的圖表。阿特拉津雖然被作為阻礙光合成的疏水性除草劑而利用，但已確認(rèn)以20μg/l左右的低濃度對青蛙等有顯示致畸形作用的內(nèi)分泌紊亂作用，是成為限制的對象的化學(xué)物質(zhì)。另外，在圖中被標(biāo)明的阿特拉津濃度，是最終被調(diào)整為合計3ml的試驗測量溶液中的濃度。
如圖10所示可知，隨著阿特拉津濃度的增加，VCP1值增大，另一方面VCP2值減少。另外，隨著阿特拉津濃度的增加，VTP2值有一些減少。另外，由圖11判斷，隨著變?yōu)楦邼舛?，曲線(Curve)值在激勵后時間1秒附近向正的一側(cè)變化，在激勵后時間3～4秒附近向負(fù)的一側(cè)變化下去。
另外，圖12和圖13是表示以各種濃度含有DCMU(敵草隆，diuron)的水溶液樣品為對象算出的比較值的圖表。在圖12中，圖表(a)是表示相對于DCMU濃度的VCP1值的變化的圖表，圖表(b)是表示相對于DCMU濃度的VCP2值的變化的圖表，圖表(c)是表示相對于DCMU濃度的VTP2值的變化的圖表。另外，圖13是表示使DCMU濃度變化時的曲線(Curve)值的圖表。DCMU(敵草隆，diuron)與阿特拉津同樣，作為阻礙光合成的除草劑而被廣泛利用，但被指出有對生物的壞影響而成為限制的對象。另外，在圖中被標(biāo)明的DCMU濃度，是在最終被調(diào)整為合計3ml的試驗測量溶液中的濃度。
如圖12所示，可知，隨著DCMU濃度的增加，VCP1值增大，而VCP2值減少。另外，隨著DCMU濃度的增加，VTP2值幾乎不變。另外，由圖13判斷，曲線(Curve)值，隨著變?yōu)楦邼舛?，在激勵后時間1秒附近向正的一側(cè)變化，在激勵后時間3～5秒附近向負(fù)的一側(cè)變化下去。
另外，圖14和圖15是表示以各種濃度含有百草枯(paraquat)的水溶液樣品為對象被算出的比較值的圖表。在圖14中，圖表(a)是表示相對于百草枯濃度的VCP1值的變化的圖表，圖表(b)是表示相對于百草枯濃度的VCP2值的變化的圖表，圖表(c)是表示相對于百草枯濃度的VTP2值的變化的圖表。另外，圖15是表示使百草枯濃度變化時的曲線(Curve)值的圖表。百草枯(paraquat)進(jìn)入細(xì)胞后，擾亂生物體反應(yīng)的電子傳遞，或通過產(chǎn)生活性氧而在細(xì)胞中引起障礙，被作為除草劑利用。另外，在圖中被標(biāo)明的百草枯濃度，是在最終被調(diào)整為合計3ml的試驗測量溶液中的濃度。
如圖14所示，隨著百草枯(paraquat)濃度的增加，VCP2值和VTP2值減少，但在高濃度時該減少變緩。另外，隨著百草枯(paraquat)濃度的增加，VCP1值在低濃度中有一些減少。另外，由圖15判斷，隨著變?yōu)楦邼舛?，曲線(Curve)值在激勵后時間1～4秒附近向負(fù)的一側(cè)變化。
另外，圖16和圖17是表示將以各種濃度含有無機(jī)汞的水溶液樣品為對象算出的比較值的圖表。在圖16中，圖表(a)是表示相對于無機(jī)汞濃度的VCP1值的變化的圖表，圖表(b)是表示相對于無機(jī)汞濃度的VCP2值的變化的圖表，圖表(c)是表示相對于無機(jī)汞濃度的VTP2值的變化的圖表。另外，圖17是表示使無機(jī)汞濃度變化時的曲線(Curve)值的圖表。無機(jī)汞是不僅對光合成樣品而且對一般的細(xì)胞也顯示毒性的物質(zhì)。另外，在圖中被標(biāo)明的無機(jī)汞濃度，是作為氯化汞溶液調(diào)制、最終被調(diào)整為合計3ml的試驗測量溶液中的換算為汞離子濃度的濃度。
如圖16所示地，隨著無機(jī)汞濃度的增加，VTP2值增加，而VCP2值減少。另外，隨著無機(jī)汞濃度的增加，VCP1值在低濃度時不太變化，但在高濃度時增加。另外，由圖17判斷，隨著變?yōu)楦邼舛?，曲線(Curve)值在經(jīng)過時間1～2秒附近時間分布在正的一側(cè)變化。
另外，圖18和圖19是表示將以各種濃度含有游離氰的水溶液樣品作為對象而算出的比較值的圖表。在圖18中，圖表(a)是表示相對于游離氰濃度的VCP1值的變化的圖表，圖表(b)是表示相對于游離氰濃度的VCP2值的變化的圖表，圖表(c)是表示相對于游離氰濃度的VTP2值的變化的圖表。另外，圖19是表示使游離氰濃度變化時的曲線(Curve)值的圖表。游離氰不僅對光合成樣品、而且對一般的細(xì)胞也顯示毒性。另外，在圖中被標(biāo)明的游離氰濃度，是作為氰化鉀溶液調(diào)制、最終被調(diào)整為合計3ml的試驗測量溶液中的換算為氰離子的濃度。
如圖18所示地，隨著游離氰濃度的增加，VTP2值和VCP2值在低濃度時幾乎不變化，但在高濃度時減少。另外，隨著有機(jī)氰濃度的增加，VCP1值幾乎不變化。另外，由圖19判斷，隨著變?yōu)楦邼舛?，曲線(Curve)值向正側(cè)變化，該變化集中在激勵后時間2～4秒附近。
另外，圖20和圖21是表示將以各種濃度含有TPN的水溶液樣品作為對象而算出的比較值的圖表。在圖20中，圖表(a)是表示相對于TPN濃度的VCP1值的變化的圖表，圖表(b)是表示相對于TPN濃度的VCP2值的變化的圖表，圖表(c)是表示相對于TPN濃度的VTP2值的變化的圖表。另外，圖21是表示使TPN濃度變化時的曲線(Curve)值的圖表。TPN是在顯示殺菌作用的農(nóng)藥等中所含的成分，是使與產(chǎn)生細(xì)胞的能量ATP相關(guān)的酶失活，且不作用于光合成、而作用于呼吸代謝的化學(xué)物質(zhì)。另外，在圖中被標(biāo)明的TPN濃度，稀釋只將TPN作為主劑含有的殺菌劑而使用、最終被調(diào)整為合計3ml的試驗測量溶液中的換算為TPN濃度的濃度。
如圖20所示，隨著TPN濃度的增加，VCP1值和VTP2值增加，而VCP2值減少。另外，由圖21判斷，隨著成為高濃度，曲線(Curve)值在激勵后時間1秒附近向正側(cè)變化，在激勵后時間3～5秒附近向負(fù)側(cè)變化。
TPN是成為在蔬菜中的殘留農(nóng)藥的成為限制對象的殺菌劑的主要品種，法定的限制濃度為1ppm。另外，以TPN為主劑的主要的市售殺菌劑中的散布濃度是400ppm。本法中的檢測靈敏度顯示，能夠檢測散布濃度的10000分之1左右的濃度，由從蔬菜表面得到水溶液樣品也可以充分地檢測限制標(biāo)準(zhǔn)以下的TPN。
(生物生長阻礙因素的解析·評價)在實際的水溶液樣品的測量中，往往其中同時存在多個生物生長阻礙因素。由生物生長阻礙因素的評價方法而得到的延遲熒光衰減曲線，時間性地分離由各種生長阻礙因素產(chǎn)生的影響，對于生物生長阻礙因素相加地出現(xiàn)。因此，在存在多個生物生長阻礙因素時，能夠?qū)⒎謩e地推斷每個的同時，也能夠累計地評價它們的變化。這樣，可以同時進(jìn)行生物生長阻礙因素的定性評價和定量評價。
在水溶液樣品中存在不同種類的生物生長阻礙因素時，例如存在著DCMU和無機(jī)汞時，在本實施方式中使用的比較值中出現(xiàn)主要變化的比較值，例如，在DCMU中為VCP1值，在無機(jī)汞中為VCP2值和VTP2值。這樣，在延遲熒光衰減曲線中出現(xiàn)變化的比較值同時含有不同的生物生長阻礙因素時，全部比較值的變化相加地出現(xiàn)。
圖22表示分別由以0.1ppb濃度含有作為生物生長阻礙因素的DCMU的試驗測量溶液「DCMU」、以20ppb濃度含有作為生物生長阻礙因素的汞離子的試驗測量溶液「Hg2+」、以及以0.1ppb濃度含有DCMU和以20ppb濃度含有汞離子的試驗測量溶液「DCMU+Hg」得到的比較值VCP1、VCP2值和VTP2值。在圖22中，圖表(a)是表示各試驗測量溶液的VCP1值的圖表，圖表(b)是表示各試驗測量溶液的VCP2值的圖表，圖表(c)是表示各試驗測量溶液的VTP2值的圖表。
如圖22的圖表(a)所示，可知，對于VCP1值，出現(xiàn)主要變化的評價值VCP1值在「DCMU」中是116.0，在含有DCMU和汞離子的「DCMU+Hg」中是129.6，在只含有汞離子的「Hg2+」中成為104.1，含有DCMU時VCP1值的變化大。另外，如圖22的圖表(b)所示，可知，對于VCP2值，出現(xiàn)主要變化的評價值VCP2值在「Hg2+」中是59.9，在含有DCMU和汞離子的「DCMU+Hg」中是44.9，在只含有DCMU的「DCMU」中成為88.0，含有汞離子時CP2的變化大。另外，如圖22的圖表(c)所示，可知，對于VTP2值，出現(xiàn)主要變化的評價值VTP2值在「Hg2+」中是144.9，在含有DCMU和汞離子的「DCMU+Hg」中是149.9，在只含有DCMU的「DCMU」中成為100.0，含有汞離子時TP2的變化大。
從以上的結(jié)果可知，在含有DCMU和汞離子的「DCMU+Hg」中，在DCMU出現(xiàn)主要變化的VCP1值和在汞離子中出現(xiàn)主要變化的比較值VCP2和VTP2值中出現(xiàn)變化，能夠同時測量同時含有DCMU和汞離子的情況。
另一方面，在水溶液樣品中存在同種的生物生長阻礙因素時，例如存在阿特拉津(atrazine)和DCMU時，在本實施方式中使用的比較值中出現(xiàn)主要變化的比較值都成為VCP1值。這樣，在同時含有相同生物生長阻礙因素時，延遲熒光衰減曲線中出現(xiàn)變化的比較值，全部比較值的變化相加地出現(xiàn)。
圖23表示分別從以0.2ppb濃度含有作為生物生長阻礙因素的阿特拉津的試驗測量溶液「阿特拉津」、以0.1ppb濃度含有作為生物生長阻礙因素的DCMU的試驗測量溶液「DCMU」、以及以0.1ppb濃度含有DCMU和以0.2ppb濃度含有阿特拉津的試驗測量溶液「阿特拉津+DCMU」得到的比較值VCP1值、VCP2值和VTP2值。在圖23中，圖表(a)是表示各試驗測量溶液的VCP1值的圖表，圖表(b)是表示各試驗測量溶液的VCP2值的圖表，圖表(c)是表示各試驗測量溶液的VTP2值的圖表。
如圖23的圖表(a)所示，可知，VCP1值，在「阿特拉津」中成為106.4，在「DCMU」中成為125.6，在「阿特拉津+DCMU」中成為是132.2，在同時含有阿特拉津和DCMU時，VCP1值相加地增加。另外，如圖23的圖表(b)所示，可知，VCP2值，在「阿特拉津」中成為90.0，在「DCMU」中成為84.6，在「阿特拉津+DCMU」中成為是86.0，看不到大的變化。另外，如圖23的圖表(c)所示，可知，VTP2值，在「阿特拉津」中成為100.0，在「DCMU」中成為101.5，在「阿特拉津+DCMU」中成為100.0，看不到大的變化。
由以上的結(jié)果，在含有阿特拉津和DCMU的「阿特拉津+DCMU」中，在都出現(xiàn)主要變化的比較值VCP1值中相加性的值增加。這樣，由于同種的生物生長阻礙因素給延遲熒光的測量結(jié)果帶來相加性的影響，所以，可以得到對于成為同種的生物生長阻礙因素的化學(xué)物質(zhì)的生物生長阻礙因素的綜合性的評價結(jié)果。
(生物生長阻礙因素的評價用工具箱)接著，詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明的生物生長阻礙因素的評價用工具箱。為了簡便地實施上述生物生長阻礙因素的評價方法，可以使用生物生長阻礙因素的評價用工具箱(kit)。生物生長阻礙因素的評價用工具箱是包含在水溶液樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣品中被混合的濃縮光合成樣品，含有用于調(diào)整混合有光合成樣品的水溶液樣品或標(biāo)準(zhǔn)樣品的鹽濃度和pH的濃縮的混合鹽類、營養(yǎng)鹽類的調(diào)整溶液，以及在水溶液樣品中分離光合成樣品和調(diào)整溶液并使之混合的混合設(shè)備的工具箱。
這里，優(yōu)選在上述濃縮光合成樣品、調(diào)整溶液的任意一個或在其兩者中，含有對光合成樣品的空間穩(wěn)定化所必要的穩(wěn)定劑。另外，在使?jié)饪s光合成樣品中含有穩(wěn)定劑時，可以使用在濃縮狀態(tài)下不給光合成樣品帶來壞影響的穩(wěn)定劑。另外，可以合適地使用不阻礙對水溶液樣品中的生長阻礙因素吸附和分解等對光合成樣品的作用的穩(wěn)定劑。作為穩(wěn)定劑，可以列舉例如瓊脂糖等的多糖類和高分子聚合物。
另外，作為混合設(shè)備，只要是可以在采液容器中將光合成樣品和調(diào)整溶液在水溶液樣品中分離、混合的就可以使用任意形狀的采液容器。
圖24是表示使用這樣的生物生長阻礙因素評價用工具箱進(jìn)行延遲熒光測量時的步驟的圖。如圖所示，在規(guī)定的采液容器50中采取規(guī)定量的水溶液樣品52，此后，混合調(diào)整溶液54使鹽濃度和pH成為規(guī)定的范圍。再在采液容器50中混合濃縮光合成樣品56。此后，在采液容器50內(nèi)放置被調(diào)制的試驗測量溶液58后，將采液容器50收納在延遲熒光測量裝置1中并進(jìn)行延遲熒光的光量的測量。
另外，作為采液容器，也優(yōu)選使用能由吸引等采取規(guī)定量的水溶液樣品的注射筒和滴液吸移管那樣的容器作為采液容器。在該采液容器內(nèi)，也優(yōu)選以分離狀態(tài)收納含有穩(wěn)定劑的調(diào)整溶液和濃縮光合成樣品的任意一方或二者。此時，因為能夠以水溶液樣品采取時的一個動作進(jìn)行調(diào)整溶液、光合成樣品、穩(wěn)定劑的混合，所以，可以更簡便地進(jìn)行測量。
另外，在水溶液樣品被吸引時，更優(yōu)選在首先與調(diào)整溶液混合、接著與濃縮光合成樣品混合那樣的位置上，保持調(diào)整溶液和濃縮光合成樣品。由此，即使是在水溶液樣品的鹽濃度、pH能給光合成樣品帶來影響的范圍內(nèi)，也可以通過以調(diào)整溶液在調(diào)整后混合光合成樣品而減少對光合成樣品的影響。
圖25是表示使用滴液吸移管型的生物生長阻礙因素評價用工具箱進(jìn)行延遲熒光的測量時的步驟的圖。如該圖所示，在滴液吸移管型的采液容器60內(nèi)，可以上下分離地容納調(diào)整溶液54和濃縮光合成樣品56。在采液容器60中，為了分離并保持調(diào)整溶液和濃縮光合成樣品，也可以在采液容器60本體上具備壁或溶液袋等的分離設(shè)備。另外，從采液容器60的結(jié)構(gòu)簡單化、降低成本的觀點出發(fā)，也可以通過在調(diào)整溶液和濃縮光合成樣品中分別包含濃縮的凝膠化劑等的穩(wěn)定劑而使各個或單個溶液保持高粘性。
在這樣的采液容器60中，、水溶液樣品52被吸引采取到收容調(diào)整溶液54的位置，水溶液樣品和調(diào)整溶液54被暫且混合。此后，在采液容器60中，水溶液樣品52被吸引采取直到到達(dá)規(guī)定量，并與濃縮光合成樣品56相互混合。這樣，在采液容器60內(nèi)，放置被調(diào)制的試驗測量溶液后，將采液容器60收納在延遲熒光測量裝置1中進(jìn)行延遲熒光的光量的測量。
通過使用以上說明的生物生長阻礙因素評價用工具箱，由于可以分別混合相對水溶液樣品含有高濃度的鹽類的調(diào)整溶液和光合成樣品分別，所以，可以使鹽類對光合成樣品的影響最小限度化，可以防止由于滲透壓差等產(chǎn)生的光合成樣品的死亡·破損。
以下，對在本發(fā)明的實施方式相關(guān)的生物生長阻礙因素的評價方法的作用效果進(jìn)行說明。
根據(jù)生物生長阻礙因素的評價方法，可以測量從在評價對象的水溶液樣品中混合的光合成樣品發(fā)出的延遲熒光的衰減曲線，以及從不存在生物生長阻礙要素的溶液中的光合成樣品發(fā)出的延遲熒光的衰減曲線。然后，可以從各個衰減曲線出發(fā)，評價峰和拐點等的特征點，通過比較二者來評價生物生長阻礙因素對光合成樣品的影響。通過進(jìn)行這樣的評價，可以同時而且高精度地定性、定量多個化學(xué)物質(zhì)。另外，通過測量評價延遲熒光的光量，可以整體地縮短測量時間。
另外，本發(fā)明不限于上述的實施方式，例如，在本實施方式相關(guān)的生物生長阻礙因素的評價方法中，測量溶液放置時的光條件被控制在規(guī)定的條件，但這也可以是在測量溶液的每次測量時，使光條件進(jìn)行各種變化來評價比較值。
圖26是表示此時的生物生長阻礙因素評價方法的步驟的流程圖。以和圖3中的步驟的不同點為中心進(jìn)行說明，首先，和步驟S01、步驟S02及步驟S05、步驟S06同樣操作，調(diào)制試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液(步驟S21～步驟S22，步驟S26～步驟S27)。然后，設(shè)定初次放置時的光條件(步驟S23、步驟S28)。此后，在設(shè)定的光條件下，將試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液以規(guī)定的放置時間放置(步驟S24、步驟S29)。此后，和圖3中的步驟S04、步驟S08～步驟S12同樣操作，從被測量的延遲熒光的光量算出比較值，評價該比較值(步驟S25、步驟S30～步驟S34)。然后，評價結(jié)束后，就返回步驟S23和步驟S28，改變上次設(shè)定的條件后，再次算出比較值，反復(fù)進(jìn)行根據(jù)光條件的比較值的變化的評價。另外，測量溶液也可以在每個光條件下重新調(diào)制。
另外，作為放置時的光條件，為了更加仔細(xì)地測量生物生長阻礙因素的變化，可以單獨或組合使用可見光區(qū)域的單色光或其組合、紅外光和紫外光等的光。
圖27是表示將放置時的光條件進(jìn)行各種改變而算出的比較值的一個例子的圖表。在圖27中，圖表(a)是表示關(guān)于相對于各種光條件的TPN的比較值的圖表，圖表(b)是表示關(guān)于相對于各種光條件的無機(jī)汞的比較值的圖表。這里，放置時的光條件，使相對于測量溶液的照射光變化為白色熒光燈、綠色單色光(波長530nm)和紅色單色光(波長665nm)3種，將各照射光的光量設(shè)定為1.5μmol/m2/s、。作為比較值，算出VCP1值、VCP2值、VTP2值。
如圖27的圖表(a)所示，在TPN的情況中，VTP2值在放置時的光條件是「白色光」時為122，「綠色光」時為89，「紅色光」時為118。VCP2值在放置時的光條件是「白色光」時為47，「綠色光」時為78，「紅色光」時為44。VCP1值，在放置時的光條件是「白色光」時為144，是「綠色光」時為112，是「紅色光」時為171。從該結(jié)果可知，在TPN的情況中，在放置時的光條件是「綠色光」時，VCP1、VCP2、VTP2全部評價值的變化率下降，生物生長阻礙因素的檢測靈敏度下降。
另外，如圖27的圖表(b)所示，在無機(jī)汞的情況中，VTP2值在放置時的光條件是「白色光」時為117、是「綠色光」時為113、是「紅色光」時為114。VCP2值在放置時的光條件是「白色光」時為77、是「綠色光」時為78、是「紅色光」時為77。VCP1值在放置時的光條件是「白色光」時為103、是「綠色光」時為96、是「紅色光」時為98。因此可知，在無機(jī)汞的情況中，由放置時的光條件產(chǎn)生的CP1、CP2、TP2的評價值的變化率沒有大的差別。
根據(jù)上述結(jié)果，水溶液樣品中的生物生長阻礙因素的作用根據(jù)放置條件的光條件而變化，但可以理解，該變化因每個生物生長阻礙因素而不同，是在特定的光波長條件下影響增大的，或者是不受由光條件產(chǎn)生的影響的生物生長阻礙因素等。
因此，可以通過對光條件進(jìn)行各種改變而評價比較值，將從相同水溶液樣品得到的試驗測量溶液放置在不同的光條件下，比較它們的測量結(jié)果，得到關(guān)于生物生長阻礙因素的定性的信息。例如，如在圖27(a)中所示，在TPN的情況中，與白色光和紅色光時比較，在綠色光時，VCP1、VCP2和VTP2的變化減少。著眼于此，能夠與其它生物生長阻礙因素進(jìn)行辨別。
以下，對本發(fā)明的適合的實施例再詳細(xì)地說明，但本發(fā)明不被這些實施例所限定。
(實施例1)作為評價對象的水溶液樣品，使用從井水、湖沼水得到的水溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品使用蒸餾水，在上述的標(biāo)準(zhǔn)測定條件下算出比較值。在圖28中表示在本實施例中的比較值的計算結(jié)果。在圖28中，圖表(a)是表示在以井水、湖沼水為對象而算出的VCP1值的圖表，圖表(b)是表示同樣地被算出的VCP2值的圖表，圖表(c)是表示同樣地被算出的VTP2值的圖表。
如圖28所示，在「井水」中VCP1值增加了137.1％，但在「湖沼水」中看不到顯著變化。另外，在VCP2值和VTP2值中看不到顯著變化。對相同地點的井水在12日內(nèi)采水4次而進(jìn)行測量的結(jié)果，幾乎同樣地得到了120～140％左右的VCP1值。
在本實施例的結(jié)果中，可以認(rèn)為作為只有VCP1值為120～140％左右的生物生長阻礙因素的已有化學(xué)物質(zhì)，是0.5ppb以下的極低濃度水平的DCMU、阿特拉津等的疏水性除草劑。因此，推測在試驗中使用的井水中含有類似于DCMU或阿特拉津的疏水性化學(xué)物質(zhì)類的農(nóng)藥。
(實施例2)作為評價對象的水溶液樣品，對含有在實施例1中的井水和蒸餾水、0.1ppb濃度的DCMU的水溶液，在標(biāo)準(zhǔn)的測定條件下，和實施例1同樣操作，算出比較值。DCMU是已知的疏水性有機(jī)物類除草劑之一，是與在實施例1中的井水評價值的變化特征類似的物質(zhì)。
另外，吸附處理井水、蒸餾水和DCMU的各水溶液，以吸附處理過的水溶液為對象，也進(jìn)行計算VCP1值。吸附中，使用由高密度過濾器過濾的水(由Millipore公司生產(chǎn)的mili-Q過濾了的水)清洗后使之干燥的活性炭。然后，對于蒸餾水、井水、0.1ppb濃度的DCMU的各個水溶液5ml加入0.8g活性炭后，緩慢浸透1小時。以在0.45μm過濾器中分別過濾這3種溶液而得到的物質(zhì)為對象，進(jìn)行延遲熒光量的測定。
圖29中表示在本實施例中的VCP1值的計算結(jié)果。在圖29中表示關(guān)于蒸餾水、井水、DCMU的各種水溶液樣品算出的VCP1值，以及關(guān)于吸附處理了的每個的各水溶液樣品而算出的VCP1值。如在圖29所示，VCP1值，相對于從蒸餾水得到的結(jié)果，「井水」為117.1、「DCMU」為120.9，從井水得到的CP1的變化，與在0.1ppb濃度的DCMU中的變化幾乎為相同的結(jié)果。
另外，相對于吸附前的蒸餾水「蒸餾水」的VCP1值100，活性炭吸附處理后的蒸餾水「蒸餾水(吸附后)」的VCP1值為99.7，評價為活性炭吸附處理對VCP1的變化幾乎沒有影響。在活性炭吸附處理前，在可看到VCP1增加的「井水」和「DCMU」中，活性炭吸附處理后的各個VCP1值為，「井水(吸附后)」95.5、「DCMU(吸附后)」96.3、與「蒸餾水」和「蒸餾水(吸附后)」成為同等的值。由該結(jié)果，評價為，在該井水中含有類似于DCMU等疏水性有機(jī)物的物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的有害物質(zhì)評價方法和有害物質(zhì)評價用工具箱，不限于上述實施方式和實施例，能夠有各種變形。例如，關(guān)于在水溶液樣品中混合的光合成樣品，一般地，如上所述，是具有光合成功能的樣品，也可以使用能夠延遲熒光發(fā)光的樣品。
另外，作為這樣的光合成樣品，優(yōu)選使用從選自由耐鹽性藻類、耐堿性藻類和耐酸性藻類的至少一種組成的光合成樣品。這里，所謂耐鹽性藻類，指的是能夠在鹽水和海水等高鹽性環(huán)境中生長的藻類。另外，所謂耐堿性藻類、耐酸性藻類，指的是能夠在極端的pH環(huán)境中生長的藻類。作為這樣的光合成樣品，可以列舉例如螺旋藻屬(Spirulina)。
即，作為光合成樣品，使用作為耐鹽性藻類已知的螺旋藻屬(Spirulina)、杜氏藻屬(Dunaliella)、具有耐堿性的螺旋藻屬(Spirulina)、具有耐酸性的眼蟲藻屬(Euglena)，以及在其它的海洋與鹽水湖中生息的藻類等、可以耐受高鹽環(huán)境和堿性(高pH)或酸性(低pH)環(huán)境的藻類時，測量比適合于這些藻類的環(huán)境鹽濃度低的淡水試樣等時，相比使用淡水性藻類等時產(chǎn)生以下的優(yōu)點。
這里，作為一個例子，對使用可以耐受高鹽性、堿性環(huán)境的藻類螺旋藻屬的情況進(jìn)行說明。螺旋藻屬是在高鹽性環(huán)境的鹽水湖和低鹽性環(huán)境的淡水湖都生息的螺旋藻屬。因此，如果使用螺旋藻屬，可以在相當(dāng)于鹽水湖環(huán)境的高鹽性培養(yǎng)基(SOT培養(yǎng)基)和相當(dāng)于淡水湖環(huán)境的低鹽性培養(yǎng)基(MA培養(yǎng)基)的兩種環(huán)境中測量延遲熒光。
一般地，成為試樣的水溶液樣品從河流和湖沼水、地下水、土壤提取水等各種環(huán)境中采取。因此，樣品的鹽濃度不均勻，其結(jié)果是，往往作為pH等藻類的生長環(huán)境，重要的要素不均勻。對此，可以用在成為試驗對象的水溶液樣品中混合調(diào)整溶液，調(diào)整鹽濃度、pH，然后與光合成樣品混合的方法。此時，通過將水溶液樣品作為高鹽性培養(yǎng)基調(diào)整，相比于低鹽性培養(yǎng)基的情況，可以更容易地調(diào)整pH等。
圖30是表示使用高鹽性培養(yǎng)基和低鹽性培養(yǎng)基、調(diào)整水溶液樣品時的調(diào)整例子的表。這里，作為水溶液樣品，使用湖水、井水、自來水和蒸餾水。在這些調(diào)整例子中，原水的pH，湖水是7.44、井水是6.03、自來水是7.07、蒸餾水是5.46，其樣品之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.91。
相對于此，以5倍濃度的高鹽性培養(yǎng)基作為調(diào)整溶液進(jìn)行調(diào)整時的pH，湖水成為9.68，井水成為9.71，自來水成為9.72，蒸餾水成為9.69。此時的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.02，相比于原水，由水溶液樣品的不同產(chǎn)生的pH的差改善了。另一方面，以5倍濃度的低鹽性培養(yǎng)基作為調(diào)整溶液進(jìn)行調(diào)整時的pH，湖水成為8.13、井水成為7.77、自來水成為8.14、蒸餾水成為8.29。此時的標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.22，雖然相比于原水得到了改善，但相比于高鹽性培養(yǎng)基結(jié)果較差。
即使關(guān)于一般的鹽濃度，相對于淡水環(huán)境、以高鹽濃度調(diào)整的高鹽性培養(yǎng)基，相比于低鹽性培養(yǎng)基，更容易改善在原水中的鹽濃度的波動。這樣，作為光合成樣品，例如在使用在海洋和鹽水湖生息的藻類等、可以耐受高鹽濃度和堿性或酸性環(huán)境的藻類時，在測量比適合于這些藻類的環(huán)境鹽濃度低的淡水樣品等時，相比于使用淡水性藻類的情況，在改善原水的pH、鹽濃度等的波動上有優(yōu)點。
另外，關(guān)于成為延遲熒光測量對象的溶液，優(yōu)選在測量延遲熒光的光量前使之均勻化。如果隨著時間經(jīng)過，測量溶液中的光合成樣品沉淀、浮起，則在光檢測器視野內(nèi)的光合成樣品的密度就變化，發(fā)光量的測量值就變化。其結(jié)果是，由于規(guī)定時間的放置和測量中的時間經(jīng)過，該測量精度有時下降。相對于此，通過將溶液均勻化，能夠進(jìn)行誤差小的有害物質(zhì)的評價。關(guān)于這樣的溶液均勻化，優(yōu)選使用用于使光合成樣品的分布密度均勻化的穩(wěn)定劑。另外，關(guān)于在有害物質(zhì)評價中可以使用的評價用工具箱，優(yōu)選具備用于使光合成樣品的分布密度均勻化的穩(wěn)定劑。作為這樣的穩(wěn)定劑，可以使用例如上述那樣的比重調(diào)整劑和增粘劑(凝膠化劑等)等。
圖31是表示相對于在溶液未均勻化和添加增粘劑的條件下的放置時間的延遲熒光量變化的圖表。這里，作為光合成樣品，使用藍(lán)藻螺旋藻屬(鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis))，關(guān)于圖5，在和上述的標(biāo)準(zhǔn)測定條件同樣的條件下，改變放置時間并進(jìn)行延遲熒光的光量的測量。
關(guān)于增粘劑的添加，在「未均勻化」中，沒有添加作為相當(dāng)于增粘劑的凝膠化劑的瓊脂而使用調(diào)整的測量溶液，在「添加增粘劑」中，表示使用了以相對于總體0.1重量％添加有作為增粘劑的瓊脂的測量溶液時的測量結(jié)果。另外，測量，從溶液剛調(diào)整后(0分鐘)到15分鐘后隨著放置時間的經(jīng)過而實施，作為延遲熒光量求出從光照射結(jié)束后0.1秒到0.5秒的延遲熒光量累計量CP1。
如圖31所示，在不含增粘劑「未均勻化」的圖表中，隨著放置時間的經(jīng)過，CP1下降。這是因為隨著時間經(jīng)過，光合成樣品沉淀、浮起起來。相對于此，在「添加增粘劑」的圖表中，即使在時間經(jīng)過后，在CP1的測量值中也看不到大的變化。由以上可知，關(guān)于測量溶液，采取將光合成樣品均勻化的方法并且在測量中使用，對于提高測量精度是有效的。
這樣的增粘劑優(yōu)選不阻礙、不擾亂來自光合成樣品的發(fā)光的測量，且以能夠測量微弱的發(fā)光的條件添加。具體的，作為增粘劑，優(yōu)選使用在光合成樣品能夠均勻化的濃度中，不具有熒光和磷光、透明而不吸收光合成樣品發(fā)光的增粘劑。作為這樣的增粘劑的例子，可以使用低濃度的瓊脂和瓊脂糖、甲基纖維素溶液等。另外，作為在測量前使光合成樣品均勻化的方法，除了添加增粘劑以外，也可以由微細(xì)的網(wǎng)和晶格結(jié)構(gòu)來抑制測量溶液中的光合成樣品的沉降、浮起或來自外部的攪拌而保持均勻性。
另外，關(guān)于延遲熒光的光量等，優(yōu)選對于由測量溶液中的光合成樣品的濃度差產(chǎn)生的測定誤差，根據(jù)需要進(jìn)行校正等。即，在測量中使用的光合成樣品，由于使用生物細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)小器官、膜蛋白復(fù)合體等的性質(zhì)上，由在其操作中和保存中細(xì)胞生長·分裂產(chǎn)生的增加和由死亡·分解引起的減少，有時產(chǎn)生量的變化。另外，即使沒有量的變化時，也有延遲熒光的發(fā)光能力和光量的時間變化上的特征等的質(zhì)變產(chǎn)生的情況。
這樣的變化，由于成為測量評價中的誤差，所以，在測量之前，使用評價在使用的光合成樣品中是否產(chǎn)生變化的評價方法是有效的。通過檢測光合成樣品的量變、質(zhì)變，可以管理測量結(jié)果的精度。由這樣的評價方法，在檢測光合成樣品的異常時，可以使用判斷其是否在允許范圍內(nèi)，并根據(jù)需要對測量者表示一些警告等的方法。
作為上述的光合成樣品的評價方法，有例如以下的(1)～(3)的方法。(1)評價光合成樣品的密度是否在與延遲熒光的光量具有比例關(guān)系的密度范圍。這樣的評價可以使用例如由光合成樣品的密度和延遲熒光的光量作成的校準(zhǔn)線進(jìn)行。(2)評價對于光合成樣品的密度的延遲熒光的光量，與成為評價基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)比較是否變化。例如在由光合成樣品的密度和延遲熒光的光量組成的校準(zhǔn)線中，在該校準(zhǔn)線表示的光合成樣品的單位密度的發(fā)光量的關(guān)系式中，對在一定的誤差范圍內(nèi)是否可以得到相關(guān)進(jìn)行評價。(3)評價延遲熒光的光量的時間變化與成為評價基準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)比較是否變化。例如，可以使用相對于標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的光量的時間變化的差，以及延遲熒光的光量的時間變化中的特征點的光量和特征點的出現(xiàn)時間、或者2處特征點之間的光量變化的傾斜、特定時間范圍內(nèi)的光量變化的傾斜等進(jìn)行評價。
在上述的光合成樣品的評價中，作為標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)，可以使用例如光合成樣品的吸光度和光散射量、延遲熒光的光量及其時間變化等的數(shù)據(jù)。另外，關(guān)于表示這樣的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)和允許范圍的數(shù)據(jù)，可以使用預(yù)先在測量裝置或解析裝置中存儲的數(shù)據(jù)或在光合成樣品調(diào)整時記錄的數(shù)據(jù)。另外，如果對與水溶液樣品混合前的光合成樣品實施同樣的評價，就可以從該結(jié)果推測在標(biāo)準(zhǔn)測量溶液等中的測量結(jié)果。在這樣的情況下，關(guān)于使用的數(shù)據(jù)也與上述同樣。
另外，優(yōu)選在通過評價光合成樣品檢測其變化時，根據(jù)需要對測量進(jìn)行校正。作為這樣的校正方法的例子，在光合成樣品產(chǎn)生的變化是量的變化時，由上述(1)的評價方法，如果光合成樣品的密度在與延遲熒光的光量具有比例關(guān)系的密度范圍，則在使用密度不同的光合成樣品的各測量結(jié)果中，可以由光合成樣品密度將延遲熒光的光量標(biāo)準(zhǔn)化來進(jìn)行比較。作為此時的標(biāo)準(zhǔn)化方法，有例如由光合成樣品的密度除以延遲熒光的光量的運算的方法等。
關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的有害物質(zhì)的評價方法進(jìn)一步進(jìn)行說明。
在上述實施方式中，主要對具備(1)第1步驟在水溶液樣品中混合光合成樣品并調(diào)制試驗測量溶液，將試驗測量溶液以規(guī)定的放置時間放置，在試驗測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量，(2)第2步驟在不存在有害物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品中混合光合成樣品并調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，將標(biāo)準(zhǔn)測量溶液以規(guī)定的放置時間放置，在標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量，以及(3)第3步驟通過基于第1步驟及第2步驟分別測量的延遲熒光的光量算出評價值，并求出評價值的比較值，評價在水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)的評價方法進(jìn)行說明。
這樣的有害物質(zhì)的評價方法，一般可以由(1)第1步驟在水溶液樣品中混合光合成樣品、調(diào)制試驗測量溶液，將試驗測量溶液以規(guī)定的放置時間放置，在試驗測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量，(2)第2步驟準(zhǔn)備將在比較樣品中混合光合成樣品并調(diào)制的比較測量溶液以規(guī)定的放置時間放置，并在比較測量溶液中以規(guī)定的照射時間照射光后，測量發(fā)生的延遲熒光的光量的比較測量結(jié)果，以及(3)第3步驟通過基于第1步驟及第2步驟中分別測量的延遲熒光的光量算出評價值，并求出評價值的比較值，而評價在水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)構(gòu)成。
另外，如上所述，在這樣的評價方法中，評價值優(yōu)選是在第1步驟及第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化的特征點中的經(jīng)過時間?；蛘邇?yōu)選，評價值是在第1步驟及第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化，比較值是取時間變化的差的值。
這里，關(guān)于在第2步驟使用的比較樣品及比較測量結(jié)果，可以使用各種樣品及結(jié)果。例如，在第2步驟中，可以使用，作為比較樣品可以使用成為比較對象的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在標(biāo)準(zhǔn)樣品中混合光合成樣品并調(diào)制作為比較測量溶液的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，將標(biāo)準(zhǔn)測量溶液以規(guī)定的放置時間放置，在標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中照射規(guī)定的照射時間的光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量，取得比較測量結(jié)果的方法。此時，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，關(guān)于圖3如上所述，優(yōu)選使用實質(zhì)上不存在有害物質(zhì)的樣品。
或者，在第2步驟中，可以使用，將對于作為比較樣品使用其它的水溶液樣品，并在水溶液樣品中混合光合成樣品而調(diào)制的作為比較測量溶液的其它試驗測量溶液取得的測量結(jié)果作為比較測量結(jié)果準(zhǔn)備的方法。此時，作為比較測量結(jié)果，可以使用例如前次的測量結(jié)果。
另外，關(guān)于在第2步驟中的比較測量結(jié)果的取得，可以使用與第1步驟同樣地、由對比較測量溶液進(jìn)行延遲熒光的光量的測量而準(zhǔn)備比較測量結(jié)果的方法?；蛘咭部梢允褂?，在第2步驟中，作為比較測量結(jié)果，準(zhǔn)備關(guān)于比較測量溶液預(yù)先取得的測量結(jié)果作為比較測量結(jié)果的方法。此時，優(yōu)選使用將預(yù)先取得的比較測量結(jié)果存儲在存儲器等中，根據(jù)需要讀出數(shù)據(jù)使用。這樣，關(guān)于在第2步驟中可以使用的比較樣品、比較測量溶液和比較測量結(jié)果的取得方法等可以有各種變形。
(有害物質(zhì)的連續(xù)的評價方法)對使用根據(jù)本發(fā)明的方法的有害物質(zhì)的連續(xù)評價方法(監(jiān)測方法)進(jìn)行說明。如果使用這樣的評價方法，連續(xù)地測量河流和地下水等的水溶液樣品，就可以監(jiān)視其有害性的變化。
圖32是表示有害物質(zhì)連續(xù)評價方法的一個例子的示意圖。在該評價方法中，首先，作為第1次測量，按照通常的步驟，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量和進(jìn)行以從河流等采取的水制成水溶液樣品的試驗測量溶液的測量。然后，比較這些結(jié)果，進(jìn)行在河水中所含有害物質(zhì)的評價。此時，將標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果C1、試驗測量溶液的測量結(jié)果S1以及對應(yīng)于這些比較結(jié)果的水溶液樣品的有害性的評價結(jié)果D1記錄下來。
此后，在作為測量時間間隔而設(shè)定了的規(guī)定時間經(jīng)過后，作為第2次測量，再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量、以新采取的河水作為水溶液樣品的試驗測量溶液的測量、以及這些結(jié)果的比較，記錄標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果C2、試驗測量溶液的測量結(jié)果S2、以及有害性的評價結(jié)果D2。
此后，同樣地實施每次規(guī)定時間經(jīng)過的測量，例如，在第n次測量中，記錄標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果Cn、試驗測量溶液的測量結(jié)果Sn與有害性的評價結(jié)果Dn。通過連續(xù)地比較這些記錄的水溶液樣品的有害性評價結(jié)果D1、D2…、Dn，可以監(jiān)視由在河水等中的有害物質(zhì)產(chǎn)生的污染的變化。
圖33是表示有害物質(zhì)連續(xù)評價方法的其它例子的示意圖。在該評價方法中，首先，以與上述同樣的順序?qū)嵤┑?次測量，記錄標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果C1和試驗測量溶液的測量結(jié)果S1。另外，此時對于對應(yīng)于這些比較結(jié)果的水溶液樣品的有害性評價結(jié)果D1，也根據(jù)需要記錄下來。
此后，經(jīng)過規(guī)定的時間后，作為第2次測量，只進(jìn)行以新采取的河水制成水溶液樣品的試驗測量溶液的測量，記錄該測量結(jié)果S2。另外，這里，進(jìn)行該第2次測量中的試驗測量溶液的測量結(jié)果S2與第1次測量中的試驗測量溶液的測量結(jié)果S1的比較，記錄對應(yīng)于這些比較結(jié)果的水溶液樣品的有害性評價結(jié)果E2。該評價結(jié)果E2，簡易地表示從第1次測量至第2次測量之間，成為水溶液樣品的河水等的有害性怎樣變化。
此后，同樣地實施每次規(guī)定時間經(jīng)過的測量，例如，在第n次測量中，記錄對應(yīng)于試驗測量溶液的測量結(jié)果Sn和第n-1次測量的測量結(jié)果Sn-1的比較結(jié)果的有害性評價結(jié)果En。通過連續(xù)地比較這些記錄的水溶液樣品的有害性的評價結(jié)果E2、E3…、En，可以簡便地監(jiān)視由在河水等中的有害物質(zhì)產(chǎn)生的污染的變化。
如圖32和圖33所示的評價方法那樣地，改變測量時間而連續(xù)地進(jìn)行有害物質(zhì)的評價時，有時由于第1次測量和第2次以后的測量之間的時間經(jīng)過，而在光合成樣品中發(fā)生變化。所謂光合成樣品的變化，例如是由光合成樣品的惡化、分解、死亡、繁殖等引起的光合成樣品的密度的變化那樣的量的變化，或是延遲熒光的光量的時間變化的特征點中的經(jīng)過時間以及延遲熒光的光量的變化那樣的質(zhì)的變化等。關(guān)于這樣的光合成樣品的變化，可以在實施延遲熒光的光量的測量和光合成樣品的細(xì)胞密度的測量后，進(jìn)行以下那樣的校正。
首先，在發(fā)生光合成樣品的密度的量的變化時，如果預(yù)先調(diào)查關(guān)于在測量中使用的光合成樣品，在細(xì)胞密度和延遲熒光的光量存在比例關(guān)系的范圍，就可以將由吸光度或光散射量等測量的光合成樣品的細(xì)胞密度校正為原樣。
作為具體的校正方法，例如在第1次測量中，在測量來自測量溶液的延遲熒光的光量的同時測量樣品的細(xì)胞密度。另外，即使在第2次測量中，也在測量來自測量溶液的延遲熒光的光量的同時測量樣品的細(xì)胞密度。這里，對第1次測量和第2次測量的各個測量結(jié)果，如果進(jìn)行將延遲熒光的光量除以細(xì)胞密度的校正，即使在第1次測量和第2次測量之間光合成樣品的細(xì)胞密度變化時，也可以比較它們。
另外，在產(chǎn)生延遲熒光的光量的時間變化的特征點的經(jīng)過時間和延遲熒光的光量等的質(zhì)的變化時，如果預(yù)先調(diào)查，對于在測量中使用的光合成樣品，延遲熒光的光量的時間變化與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)比較是在允許范圍內(nèi)，就可以將這些特征點之間的位置關(guān)系等校正為原樣。
對具體的校正方法的例子，參照圖34進(jìn)行說明。圖34是表示延遲熒光的光量的時間變化的例子的圖，圖表(a)表示在第1次測量中取得的延遲熒光的光量的時間變化，圖表(b)表示在第2次測量中取得的延遲熒光的光量的時間變化。
關(guān)于這些延遲熒光量的時間變化，例如對在圖表(a)中所示的第1次測量中的特征點A、B，求出其經(jīng)過時間a1、b1。同樣地，對在圖表(b)中所示的第2次測量中的特征點A、B，求出其經(jīng)過時間a2、b2。另外，對這些測量結(jié)果，從第1次測量結(jié)果求出相對于經(jīng)過時間a1的b1的比率(b1/a1)。同樣地，從第2次測量結(jié)果求出相對于經(jīng)過時間a2的b2的比率(b2/a2)。然后，通過進(jìn)行這些比率(b1/a1)和(b2/a2)的比較，可以進(jìn)行使特征點的位置關(guān)系成為原樣的校正。
(曲線(Curve)值的解析方法)關(guān)于在有害物質(zhì)的評價中可以使用的評價值和比較值，如上述地，作為其一個例子，可以以在第1步驟和第2步驟取得的延遲熒光的光量的時間變化為評價值，取其時間變化差的值為比較值。作為這樣的比較值，可以舉出，在上述的實施方式中，取從試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液得到的延遲熒光的光量的時間變化之差而得到的曲線(Curve)值。關(guān)于該曲線(Curve)值的解析方法，根據(jù)對試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液取得的具體的測量結(jié)果，可以使用各種解析方法。
關(guān)于相當(dāng)于延遲熒光的光量的時間變化之差的曲線(Curve)值，可以分為在測量結(jié)果延遲熒光的光量的時間變化中存在特征點的情況、和不存在特征點的情況來考慮。
在表示延遲熒光的光量的時間變化的延遲熒光衰減曲線(參照圖5)中存在特征點時，如上述地，可以著眼于在其特征點中的發(fā)光量和經(jīng)過時間等而進(jìn)行評價。另外，優(yōu)選在使用曲線(Curve)值時，著眼于2個特征點之間或測量起點與特征點之間而求出曲線(Curve)值，以其為比較值進(jìn)行評價?；蛘?，也可以不考慮特征點而對其全體或規(guī)定范圍求出曲線(Curve)值。
另一方面，在延遲熒光衰減曲線中不存在特征點時，可以對其全體或規(guī)定范圍求出曲線(Curve)值，并以其為比較值進(jìn)行評價。這里，在延遲熒光的光量的時間變化中，其各測量點n中的曲線(Curve)值可以根據(jù)(在測量點n上的試驗測量溶液的發(fā)光量)-(在測量點n上的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的發(fā)光量)求出。
另外，從光合成樣品發(fā)出的延遲熒光，一般地，如圖5示例地，在激勵后時間早的時間域中發(fā)光量多，而晚的時間域中由于衰減而發(fā)光量少。因此，如果計算曲線(Curve)值的時間域不同，則發(fā)光量之差的大小也變得不同，有時難以評價在不同的時間域中的變化。
在這樣的情況中，使用通過對于取了對試驗測量溶液和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液取得的延遲熒光的光量的時間變化之差的值曲線(Curve)值，進(jìn)一步取與對于試驗測量溶液或標(biāo)準(zhǔn)測量溶液取得的延遲熒光的光量(優(yōu)選對于標(biāo)準(zhǔn)測量溶液取得的延遲熒光的光量)之比而標(biāo)準(zhǔn)化的VCurve值作為比較值是有效的。由此，可以使評價在不同時間域中的變化容易化。這里，在延遲熒光的光量的時間變化中，在其各測量點n上的VCurve值，可以由(在測量點n上的Curve值)/(在測量點n上的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的發(fā)光量)×100求出。
另外，在存在特征點的延遲熒光衰減曲線中應(yīng)用上述的VCurve值時，也可以著眼于在特征點之間或測量起點與特征點之間而求出VCurve值，或者也可以不考慮特征點而對其全體或規(guī)定范圍求出VCurve值。
另外，關(guān)于在延遲熒光時間曲線中有無特征點，一般地，在第1步驟或在第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化具有特征點，在第3步驟中，可以使用，將對一個特征點與測量起點或其它特征點之間的規(guī)定范圍取了延遲熒光的光量的時間變化之差的值作為比較值而評價有害物質(zhì)的方法。另外，在延遲熒光的光量的時間變化中沒有特征點時，可以將對其全體或規(guī)定范圍取了延遲熒光的光量的時間變化之差的值作為比較值。
圖35是表示關(guān)于在延遲熒光衰減曲線中存在特征點時的Curve值的計算方法的例子的圖。比較標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中的延遲熒光衰減曲線和試驗測量溶液中的延遲熒光衰減曲線時，有時在這些衰減曲線中特征點的位置不同。在這樣的情況中，為了排除特征點的影響而進(jìn)行有害物質(zhì)的評價，優(yōu)選設(shè)定不含特征點的時間域作為Curve值的計算范圍。
圖35的圖表(a)～(c)，將關(guān)注的2個特征點作為激勵后時間0秒的最大值的點(測量起點)和在其后出現(xiàn)的極小值點，表示在標(biāo)準(zhǔn)測量溶液和試驗測量溶液中延遲熒光衰減曲線的特征點位置不同時的Curve值計算的時間域的設(shè)定的例子。圖35的圖表(a)表示在標(biāo)準(zhǔn)測量溶液和試驗測量溶液的延遲熒光衰減曲線中，只在標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的衰減曲線中存在特征點的情況。此時，Curve值的計算范圍優(yōu)選選擇從測量起點至標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中的極小值的出現(xiàn)點的時間范圍「a」。
另外，圖35的圖表(b)表示試驗測量溶液的延遲熒光衰減曲線中的極小點比標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中的極小點在更早時間出現(xiàn)的情況。此時，Curve值的計算范圍，優(yōu)選比較從測量起點至標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中的極小值的出現(xiàn)點的時間范圍「b」和從測量起點至試驗測量溶液中的極小值的出現(xiàn)點的時間范圍「c」，而選擇在雙方共同的時間域的時間范圍「c」。
另外，圖35的圖表(c)表示試驗測量溶液的延遲熒光衰減曲線中的極小點比標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中的極小點在更晚時間出現(xiàn)的情況。此時，Curve值的計算范圍，優(yōu)選比較從測量起點至標(biāo)準(zhǔn)測量溶液中出現(xiàn)極小值點的時間范圍「d」和從測量起點至試驗測量溶液中出現(xiàn)極小值點的時間范圍「e」，選擇在雙方是共同的時間域的時間范圍「d」。
圖36是表示關(guān)于在延遲熒光衰減曲線中不存在特征點時的Curve值的計算方法的例子的圖。這里，表示使用光強(qiáng)度50μmol/m2/s、在白色熒光燈下以一般方法培育的綠藻類的Selenastrum capricornutum作為光合成樣品的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的延遲熒光衰減曲線。關(guān)于樣品的調(diào)整，以和鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)的情況同樣的步驟進(jìn)行。在圖36的圖表中，在延遲熒光衰減曲線中沒有出現(xiàn)明確的特征點。此時，因為不能進(jìn)行著眼于特征點的評價，所以，使用Curve值的評價是有效的。
圖37表示使(a)西瑪三嗪濃度和(b)二氯苯酚濃度變化時的Curve值的圖表。具體的，圖37的圖表(a)表示，從以25、50、100ppb的濃度暴露了除草劑的一種西瑪三嗪的試驗測量溶液的測量結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果，對激勵后時間0.1～50秒的時間域計算的Curve值。另外，圖表(b)表示，從以1、5、10ppm的濃度暴露二氯苯酚的試驗測量溶液的測量結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果，對激勵后時間0.1～50秒的時間域計算的Curve值。
其中，在關(guān)于西瑪三嗪的圖表(a)中，對應(yīng)于西瑪三嗪暴露濃度的Curve值變化，隨著濃度增加、在激勵后時間0.1秒附近向正側(cè)變化。另外，可以看到，在激勵后時間0.5秒以后、也稍微向負(fù)側(cè)變化。另外，在關(guān)于二氯苯酚的圖表(b)中，可以看到，Curve值根據(jù)二氯苯酚暴露濃度變化，隨著濃度增加，在激勵后時間0.2～10秒附近向負(fù)側(cè)變化。
從以上結(jié)果可知，在延遲熒光衰減曲線中即使不存在明確的特征點時，也可以由計算Curve值，評價有害物質(zhì)的影響。另外，在這樣的Curve值中，因為出現(xiàn)變化的時間域及其正·負(fù)的變化的方向根據(jù)有害物質(zhì)而不同，所以，在確定檢測的有害物質(zhì)的種類和作用等方面是有用的。
圖38是表示使(a)西瑪三嗪濃度和(b)二氯苯酚濃度變化時的VCurve值的圖表。具體的，圖38的圖表(a)表示從以25、50、100ppb的濃度暴露了西瑪三嗪的試驗測量溶液的測量結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果，對激勵后時間0.1～50秒的時間域計算的VCurve值。另外，圖表(b)表示，從以1、5、10ppm的濃度暴露二氯苯酚的試驗測量溶液的測量結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)測量溶液的測量結(jié)果，對激勵后時間0.1～50秒的時間域計算的VCurve值。另外，關(guān)于VCurve值，具體來說，如上所述，表示將相當(dāng)于時間變化之差的Curve值作為與在標(biāo)準(zhǔn)測量試樣中的發(fā)光量的比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的例子。
其中，在關(guān)于西瑪三嗪濃度的圖表(a)中，對應(yīng)于西瑪三嗪暴露濃度、VCurve值變化，隨著濃度增加、在激勵后時間0.1～0.3秒附近的正側(cè)變化。另外，確認(rèn)以激勵后時間15秒為中心、在0.4～50秒的廣泛范圍向負(fù)側(cè)變化。另外，在關(guān)于西瑪三嗪濃度的圖表(b)中，VCurve值根據(jù)西瑪三嗪暴露濃度變化，可以看到，隨著濃度的增加、在全部激勵后時間范圍內(nèi)(0.1～50秒附近)廣泛的向負(fù)側(cè)的變化。
從以上結(jié)果可知，在延遲熒光衰減曲線中即使不存在明確的特征點時，也可以通過計算VCurve值，評價有害物質(zhì)的影響。另外，在這樣的VCurve值中，因為出現(xiàn)變化的時間域及其正·負(fù)變化方向由于有害物質(zhì)而不同，所以，在特定檢測的有害物質(zhì)的種類與作用等上有用。另外，由VCurve值，相比于Curve值，更容易比較不同時間域的變化。
(試驗測量溶液的適應(yīng)化處理)其次，對試驗測量溶液關(guān)于在測量前進(jìn)行的適應(yīng)化處理說明。關(guān)于圖5中的標(biāo)準(zhǔn)測定條件、如上述地，有用于使光合成樣品適應(yīng)于測量光條件的預(yù)備光照射和由進(jìn)行在規(guī)定時間黑暗下的待命(暗中待命)產(chǎn)生的適應(yīng)化處理(適應(yīng)化步驟)的情況。
一般，含有這樣的適應(yīng)化步驟的有害物質(zhì)評價方法，是評價在試驗對象的水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)評價方法，優(yōu)選具備(a)在水溶液樣品中混合具有光合成功能的光合成樣品、調(diào)制試驗測量溶液的調(diào)制步驟，和(b)將試驗測量溶液放置規(guī)定放置時間的放置步驟，和(c)在試驗測量溶液照射規(guī)定時間的光后、測量發(fā)生的延遲熒光的光量的測量步驟，和(d)基于在測量步驟取得的延遲熒光的光量、評價在水溶液樣品中存在的有害物質(zhì)的評價步驟，和(e)在測量步驟前，包含相對于試驗測量溶液、進(jìn)行在規(guī)定待命時間中暗中待命的暗中待命步驟，或相對于試驗測量溶液、進(jìn)行預(yù)備光照射和在規(guī)定待命時間中的暗中待命的預(yù)備照射步驟的任意一個的適應(yīng)化步驟。
在這樣的有害物質(zhì)的評價方法中，從在評價對象的水溶液樣品中混合的光合成樣品發(fā)出的延遲熒光的光量的時間變化中可以得到的特征出發(fā)，可以同時而且高精度地定性、定量多個有害物質(zhì)。另外，由測量、評價延遲熒光的光量，可以整體地縮短測量時間。另外，在測量步驟前，相對于試驗測量溶液進(jìn)行適應(yīng)化步驟，可以提高延遲熒光的測量和由該測量結(jié)果產(chǎn)生的有害物質(zhì)的評價精度。
這樣，在測量步驟前實施適應(yīng)化步驟時，在暗中待命步驟中，優(yōu)選規(guī)定的待命時間是30秒以上、1小時以下的時間。另外，在預(yù)備照射步驟中的預(yù)備光照射時間與暗中待命時間之比，優(yōu)選和在測量步驟中的光照射時間與暗中待命時間之比相等。以下，具體說明這樣的適應(yīng)化步驟。
在有害物質(zhì)的評價中可以使用的延遲熒光，是吸收于光合成樣品的光能分配在各種化學(xué)反應(yīng)后再次放出的現(xiàn)象。因此，關(guān)于直到延遲熒光的測量(測量步驟)的光合成樣品的光和溫度等的各種環(huán)境的經(jīng)歷，有時對延遲熒光的測量結(jié)果帶來重大影響(例如參照非專利文獻(xiàn)2)。因此，為了在水質(zhì)檢查等的有害物質(zhì)的評價中利用延遲熒光的測量結(jié)果，優(yōu)選控制光合成樣品的環(huán)境經(jīng)歷、以良好的再現(xiàn)性條件進(jìn)行延遲熒光的測量。
圖39是表示由延遲熒光的測量次數(shù)產(chǎn)生的CP1變化的圖表。這里，關(guān)于在換算為光合成有效放射為5μmol/m2/s的白色熒光燈下放置15分鐘的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，作為測量條件、照射2秒665nm、0.8W/cm2的光后，在暗中60秒鐘，測量延遲熒光的光量，將該測量連續(xù)實施5次，分別求出各個的CP1值。
在該測量結(jié)果中，可以得到第1次測量是15217、第2次測量是11693、第3次測量是10098、第4次測量是9690、第5次測量是9627。如這些CP1值所示，CP1值圖表在從第1次至第3次的測量結(jié)果中有波動。另外，由反復(fù)延遲熒光的測量可知，在某些值(例如從第3次至第5次的值)中測量結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性提高起來。這表示，在光合成樣品內(nèi)的光能分配，從放置條件向測量條件適應(yīng)。
從以上的結(jié)果可知，將測量溶液以規(guī)定的放置時間放置的放置步驟后，在繼續(xù)進(jìn)行延遲熒光測量步驟時，不能充分地得到延遲熒光測量的再現(xiàn)性，在其測量結(jié)果中有產(chǎn)生波動的情況。在圖39所示的例子中，在測量次數(shù)從第1次至第3次的測量結(jié)果中，不能充分地得到水質(zhì)檢查的精度。另外，從第幾次的測量結(jié)果是否可以得到充分的再現(xiàn)性的判斷是繁雜的，另外，在其測量結(jié)果中也可以認(rèn)為反映了測量者的個人差異。
關(guān)于這樣的情況，研究相對于光合成樣品的環(huán)境經(jīng)歷的控制方法的結(jié)果可知，通過在放置步驟和測量步驟之間，附加用于控制光合成樣品的環(huán)境經(jīng)歷的適應(yīng)化步驟，可以得到再現(xiàn)性良好的測量結(jié)果。通過進(jìn)行這樣的適應(yīng)化步驟，在例如圖39的測量結(jié)果中，可以從第1次得到第3次以后的測量結(jié)果。
使測量溶液適應(yīng)化為測量條件的適應(yīng)化步驟，由在放置步驟和測量步驟之間附加(1)相對于測量溶液進(jìn)行在規(guī)定的待命時間中的暗中待命的暗中待命步驟、或(2)相對于試驗溶液進(jìn)行在預(yù)備光照射和規(guī)定待命時間中的暗中待命的預(yù)備照射步驟的任意一個或兩個步驟而完成。
圖40是表示在各種適應(yīng)化條件下，進(jìn)行3次延遲熒光測量的結(jié)果中的測量精度的表。具體的，在各種適應(yīng)化條件下進(jìn)行連續(xù)3次測量，將其標(biāo)準(zhǔn)偏差除以3次測量的平均值、乘100倍的值作為測量精度(％)計算。即，圖40中所示的測量精度，是3次測量中得到的CP1值，表示相對于這些平均值具有著多大程度的誤差。
另外，在這里，關(guān)于在換算為光合成有效放射為5μmol/m2/s的白色熒光燈下放置15分鐘的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，作為測量條件、照射2秒、665nm、0.8W/cm2的光后，在暗中60秒鐘，測量延遲熒光的光量，將該測量實施3次，作為本測量。然后，在該本測量實施前，以各種適應(yīng)化條件(預(yù)備照射條件)進(jìn)行適應(yīng)化處理，分別就3次測量結(jié)果求出測量精度。
作為適應(yīng)化條件，將在剛要進(jìn)行本測量之前，以和測量條件同樣的步驟、照射2秒665nm、0.8W/cm2的光后，使之在暗中待命60秒鐘的作為「測量條件1次」，將2次反復(fù)同樣步驟的作為「測量條件2次」。另外，將不照射光、使之以和測量條件相同時間在暗中待命的作為「暗中1次」，將2次反復(fù)暗中待命的作為「暗中2次」。另外，將照射和測量條件同樣時間光的作為「光1次」，將照射30秒鐘光后使之在暗中待命30秒鐘的作為「光30暗30」，將照射1秒鐘光后使之在暗中待命30秒鐘的作為「光1暗30」，不作適應(yīng)化處理的作為「無適應(yīng)化條件」。
其結(jié)果是，可知，作為相對于測量溶液的適應(yīng)化條件，反復(fù)進(jìn)行1～2次和測量條件相同的光照射一暗中待命，或不作光照射、反復(fù)進(jìn)行1～2次和測量條件相同時間的暗中待命，作為適應(yīng)化處理是適合的。在圖40所示的例子中，適應(yīng)化條件時間在相同的「測量條件2次」和「暗中2次」中的測量精度分別是3.6和4.8，在「測量條件1次」和「暗中1次」中的測量精度分別是10.6和14.2。另外，相比于只以暗中待命進(jìn)行適應(yīng)化處理時可知，實施和測量條件相同的光照射-暗中待命的一方，可以更加有效地將測量溶液適應(yīng)化到測量環(huán)境。
由以上的結(jié)果，通過將上述暗中待命步驟或預(yù)備照射步驟的任意一個、或兩個步驟附加在放置步驟和測量步驟之間，可以提高在此后實施的延遲熒光的測量精度。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明能夠作為能夠在短時間且廣泛地進(jìn)行有害物質(zhì)分析的有害物質(zhì)的評價方法和有害物質(zhì)的評價用工具箱利用。
權(quán)利要求
1.一種有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，是評價存在于試驗對象的水溶液樣品中的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)的評價方法，具備第1步驟在所述水溶液樣品中混合具有光合成功能的光合成樣品并調(diào)制試驗測量溶液，以規(guī)定的放置時間放置所述試驗測量溶液，以規(guī)定的照射時間對所述試驗測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量；第2步驟準(zhǔn)備比較測量結(jié)果，該比較測量結(jié)果是通過以所述規(guī)定的放置時間放置在比較樣品中混合所述光合成樣品而調(diào)制的比較測量溶液，以所述規(guī)定的照射時間對所述比較測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量而得到的；以及第3步驟通過基于在所述第1步驟及所述第2步驟中分別取得的延遲熒光的光量計算評價值，并求出所述評價值的比較值，而評價存在于所述水溶液樣品中的有害物質(zhì)；所述評價值是，在所述第1步驟及所述第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化的特征點上的經(jīng)過時間。
2.一種有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，是評價存在于試驗對象的水溶液樣品中的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)的評價方法，具備第1步驟在所述水溶液樣品中混合具有光合成功能的光合成樣品并調(diào)制試驗測量溶液，以規(guī)定的放置時間放置所述試驗測量溶液，以規(guī)定的照射時間對所述試驗測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量；第2步驟準(zhǔn)備比較測量結(jié)果，該比較測量結(jié)果是通過以所述規(guī)定的放置時間放置在比較樣品中混合所述光合成樣品而調(diào)制的比較測量溶液，以所述規(guī)定的照射時間對所述比較測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量而得到的；以及第3步驟通過基于在所述第1步驟及所述第2步驟中分別取得的延遲熒光的光量計算評價值，并求出所述評價值的比較值，而評價存在于所述水溶液樣品中的有害物質(zhì)；所述評價值是，在所述第1步驟及所述第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化，所述比較值是取了所述時間變化的差的值。
3.如權(quán)利要求2所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述第1步驟或所述第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化具有特征點，在所述第3步驟中，將就一個特征點與測量起點或與其它特征點之間的規(guī)定范圍、取其延遲熒光的光量的時間變化的差的值作為所述比較值而評價有害物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求2或3所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述第3步驟中，將就取了在所述第1步驟及所述第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化的差的值、進(jìn)一步取其與在所述第1步驟或所述第2步驟中取得的延遲熒光的光量的時間變化之比的值作為所述比較值而評價有害物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1～4的任意一項所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述第2步驟中，使用成為比較對象的標(biāo)準(zhǔn)樣品作為所述比較樣品，在所述標(biāo)準(zhǔn)樣品中混合所述光合成樣品并調(diào)制作為所述比較測量溶液的標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，以所述規(guī)定的放置時間放置所述標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，在以所述規(guī)定的照射時間對所述標(biāo)準(zhǔn)測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光，取得所述比較測量結(jié)果。
6.如權(quán)利要求1～4的任意一項所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述第2步驟中，作為所述比較測量結(jié)果，準(zhǔn)備對于使用其它的水溶液樣品作為所述比較樣品，并在所述其它的水溶液樣品中混合所述光合成樣品而調(diào)制的為所述比較測量溶液的其它試驗測量溶液而取得的測量結(jié)果。
7.如權(quán)利要求1～6的任意一項所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述第2步驟中，作為所述比較測量結(jié)果，準(zhǔn)備對所述比較測量溶液預(yù)先取得的測量結(jié)果作為所述比較測量結(jié)果。
8.如權(quán)利要求1～7的任意一項所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述第1步驟和所述第2步驟中，對每次測量改變光條件，并以規(guī)定的放置時間放置所述試驗測量溶液和所述比較測量溶液；在所述第3步驟中，評價根據(jù)所述光條件的所述比較值的變化。
9.如權(quán)利要求1～8的任意一項所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述試驗測量溶液中和所述比較測量溶液中的所述光合成樣品的密度，為在與延遲熒光的光量具有比例關(guān)系的密度范圍。
10.如權(quán)利要求1～9的任意一項所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述第1步驟和所述第2步驟中，在測量延遲熒光的光量之前，使所述試驗測量溶液和所述比較測量溶液均勻化。
11.如權(quán)利要求1～10的任意一項所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，所述光合成樣品由選自耐鹽性藻類、耐堿性藻類和耐酸性藻類的至少一種組成。
12.如權(quán)利要求11所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，所述光合成樣品為螺旋藻屬。
13.一種有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，是評價存在于試驗對象的水溶液樣品中的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)的評價方法，具備在所述水溶液樣品中混合具有光合成功能的光合成樣品而調(diào)制試驗測量溶液的調(diào)制步驟；以規(guī)定的放置時間放置所述試驗測量溶液的放置步驟；以規(guī)定的照射時間對所述試驗測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量的測量步驟；基于在所述測量步驟中取得的延遲熒光的光量，評價存在于所述水溶液樣品中的有害物質(zhì)的評價步驟；包括在所述測量步驟之前，對所述試驗測量溶液進(jìn)行規(guī)定的待命時間的暗中待命的暗中待命步驟，或者，對所述試驗測量溶液進(jìn)行預(yù)備的光照射和在規(guī)定的待命時間中的暗中待命的預(yù)備照射步驟的任意一個的適應(yīng)化步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述暗中待命步驟中，所述規(guī)定的待命時間是30秒以上、1小時以下的時間。
15.如權(quán)利要求13或14所述的有害物質(zhì)的評價方法，其特征在于，在所述預(yù)備照射步驟中的預(yù)備的光照射的時間與暗中待命的時間之比，等于在所述測量步驟中的光照射的時間與暗中待命的時間之比。
16.一種有害物質(zhì)評價用工具箱，其特征在于，是用于評價存在于試驗對象的水溶液樣品中的有害物質(zhì)的有害物質(zhì)評價用工具箱，具備混合于所述水溶液樣品中的光合成樣品，用于調(diào)整所述水溶液樣品的鹽濃度及pH的混合鹽類，以及在所述水溶液樣品中分離并混合所述光合成樣品和所述混合鹽類的混合用具。
17.如權(quán)利要求16所述的有害物質(zhì)評價用工具箱，其特征在于，具備用于使所述光合成樣品的分布密度均勻化的穩(wěn)定劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種生物生長阻礙因素的評價方法，具備第1步驟在水溶液樣品中混合光合成樣品而調(diào)制試驗測量溶液，放置試驗測量溶液，以規(guī)定的照射時間向試驗測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量；第2步驟在不存在生物生長阻礙因素的標(biāo)準(zhǔn)樣品中混合光合成樣品而調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，放置標(biāo)準(zhǔn)測量溶液，以規(guī)定的照射時間向標(biāo)準(zhǔn)測量溶液照射光后，測量產(chǎn)生的延遲熒光的光量；以及第3步驟通過基于在第1步驟及第2步驟中分別被測量的延遲熒光的光量算出平均值，求出平均值的比較值來評價生物生長阻礙因素。由此，可以實現(xiàn)能夠以短時間進(jìn)行廣泛的阻礙因素的分析的生物生長阻礙因素的評價方法。
文檔編號G01N21/64GK1898552SQ20048003801
公開日2007年1月17日 申請日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者勝又政和, 土屋廣司, 小池隆, 西川正隆 申請人:浜松光子學(xué)株式會社