質(zhì)微粒的蛋白質(zhì)濃度設(shè)置為4% (w/w)。因此，初步測試已經(jīng)顯示 在該條件下在熱處理后在抑7.0樣品保持液態(tài)。還可W使用較低濃度的植物蛋白質(zhì)，但由 于實際的原因，適合的是盡可能接近其凝膠化限度的濃度，從而可W限制隨后的微粒濃縮 步驟。
[0053] 方法
[0054] 熱處理溫度選擇在通過示差掃描量熱法測定的分離蛋白的變性溫度W上，并且選 擇熱處理時間，W達到轉(zhuǎn)化至微粒的轉(zhuǎn)化收率中的平穩(wěn)狀態(tài)。 陽化5] 因此使用W下條件：大豆分離蛋白85°C /15分鐘、馬鈴馨分離蛋白85°C /15分鐘 和卡諾拉分離蛋白90°C /20分鐘。
[0056] 如下制備蛋白質(zhì)分散液：在室溫在封閉玻璃瓶中，將已知量的粉末分散至 MilliQ?水中，輕柔磁力攬拌2小時W最小化氣泡形成。抑范圍在4. 0至7. 0進行篩選W 優(yōu)化熱處理后蛋白質(zhì)聚集的條件從而最大化轉(zhuǎn)化至微粒的轉(zhuǎn)化收率。將所述蛋白質(zhì)分散液 傾入22mL用塑料杯封口的玻璃管中，并浸入水浴中W達到85或90°C的所需溫度。用約2 分鐘W達到設(shè)置溫度，隨后將保溫15或20分鐘。然后在冰水中將管冷卻W停止聚集過程。 在表1中總結(jié)制備植物蛋白質(zhì)微粒的優(yōu)選的處理條件。
[0057] 表1:制備4% (w/w)植物蛋白質(zhì)微粒的優(yōu)選的條件。
[0058]
[0059] 對于大豆蛋白，已發(fā)現(xiàn)加入ImM巧改善了轉(zhuǎn)化收率和微粒密度。所述轉(zhuǎn)化收率是 處理后有效轉(zhuǎn)化為微粒的初始植物蛋白質(zhì)的分數(shù)。對于所有的蛋白質(zhì)來源，還需要隨后 進行微粒的勻化W減少的初始尺寸并得到穩(wěn)定的分散液。為該目的，將微粒的分散液在 Emulsiflex-巧高壓勻漿器（AvestinEluropeGmbH,Mannheim,德國）中流通，在化.h-1 的 流速和1000己的壓力下操作。 W60] 轉(zhuǎn)化至微粒的轉(zhuǎn)化收率測定
[0061] 在樣品W 15, OOOg離屯、20分鐘W除去微粒后，通過測定保持溶解的蛋白質(zhì)含量在 280nm通過分光光度法得到轉(zhuǎn)化收率。通過除去微粒后在280nm的吸光度和未處理樣品的 初始吸光度的比值得到溶解的蛋白質(zhì)的量。通過與初始蛋白質(zhì)含量的差異，可W計算轉(zhuǎn)化 收率。對于分光光度法，使用Nicolet Evolution 100分光計（Sysmex Digitana SA,瑞 i)，并在石英比色皿化ellma,德國）中進行測量。
[0062] 植物蛋白質(zhì)微粒的粒度分布 W63] 通過動態(tài)光散射值L巧使用Malvern Nanosizer ZS (馬爾文儀器有限公 司，GMP, Renens,瑞± )測定粒度。該儀器裝備了在633皿發(fā)射的化-Ne激光和4. OmW電 源。該儀器使用后向散射構(gòu)造，其中使用雪崩光電二極管在173°的散射角進行檢測。將 微粒分散液在MilliQ?水中稀釋100倍，并傾入方形塑料吸收池（Sarstedt，德國）中。在 25°C進行測量。根據(jù)樣品濁度，通過儀器自動設(shè)置光的光程長度。從散射強度隨時間的波 動計算自相關(guān)函數(shù)G2(t)。從相關(guān)函數(shù)的對數(shù)的多項式擬合使用"累積量（cumulants)"方 法計算顆粒的Z-平均流體動力直徑，假定分散顆粒為單分散球體。此外，從多項式"累積 量"擬合的平方和線性項的系數(shù)之間的比值計算多分散性指數(shù)（PDI)。
[0064]植物蛋白質(zhì)微粒的光密度
[00化]在25°C通過使用與前述相同的分光光度計測量溶液在A = 500nm的吸光度來測 定微粒分散液的光密度（0D)。測量前，將分散液在MilliQ?水中稀釋100倍W保持在吸光 度的線性區(qū)域中（1.8 W下），并在10分鐘后重復(fù)測量?？紤]到小于10%的光密度變化是 對抗沉降的顆粒穩(wěn)定性的標(biāo)志，該試驗?zāi)軠y定微粒的膠體穩(wěn)定性。
[0066] 植物蛋白質(zhì)微粒的形態(tài)學(xué)
[0067] 通過透射電子顯微鏡檢查（TEM)使用負染色法研究植物蛋白質(zhì)微粒分散液W及 模型奶精的微結(jié)構(gòu)。將一滴蛋白質(zhì)分散液在Millipore水中稀釋至lg.L-1，并放置在方華 膜-碳涂覆的（formware-carboncoated)銅載網(wǎng)上。80s后使用濾紙移去過量產(chǎn)品。在 pH7. 0添加1%憐鶴酸的小滴達15s，除去任何多余量。將所述網(wǎng)在室溫干燥5分鐘，使用 在120kV運行的陽ITecnaiG2SpiritBioTWIN透射電子顯微鏡（陽I公司，荷蘭）進行觀 測J。使用（Olympussoftimagingsolutions,德國）如emesa照相機記錄圖像。
[0068] 結(jié)果
[0069] 所述微粒特征為寬范圍的尺寸和多分散性，其取決于蛋白質(zhì)來源（表2)。然而，在 500nm10分鐘的光密度穩(wěn)定性是顯而易見的，因為其與其初始值相比沒有降低或降低小于 5%。
[0070] 大豆和馬鈴馨蛋白的粒度分布在圖1中顯示?？蒞看到馬鈴馨微粒大于大豆微 粒，但馬鈴馨蛋白質(zhì)微粒顯示比大豆窄的粒度分布（圖1A)，其中在較大的直徑可見小強度 是峰（圖1B)。卡諾拉蛋白質(zhì)微粒大于DLS設(shè)備的檢測限度，但使用Mastersizer的檢測顯 示3010nm的化2平均直徑。已發(fā)現(xiàn)運些微粒顯示對抗沉降的高穩(wěn)定性，其可能是低密度的 標(biāo)志，而且可能是多孔結(jié)構(gòu)。微粒的總的粒度分布落入散射特性的預(yù)測范圍，所W運些顆粒 顯示表2中可溶咖啡中呈現(xiàn)的一些調(diào)白特性。
[0071] 將本發(fā)明的所有3個類型的微粒在負染模式進行透射電子顯微鏡檢查。結(jié)果在 圖2中呈現(xiàn)?？蒞看到微粒顯示不規(guī)則形狀，尤其是大豆，其中球體結(jié)構(gòu)和伸長結(jié)構(gòu)均可見 (圖2A)。使用馬鈴馨和卡諾拉蛋白質(zhì)制備的微?？雌饋砀o實，并顯示更聚集的狀態(tài)（圖 2B和C)，運不僅僅是由顯微檢查制備技術(shù)，還證實了通過DLS測定的較大的尺寸。還令人 驚訝地發(fā)現(xiàn)卡諾拉微粒顯示具有被大空隙分離的緊密顆粒的"海綿樣"結(jié)構(gòu)。該特定結(jié)構(gòu) 可W解釋運些顆粒即使具有大尺寸仍然具有的穩(wěn)定性。同樣，光可W經(jīng)由顆粒的孔容易地 散射，例如顆粒不會聚集。
[0072] 表2:通過熱處理4% (w/w)的蛋白質(zhì)分離物得到的植物微粒的物理化學(xué)性質(zhì)。將 樣品在MilliQ?水中稀釋1/100,用于尺寸測定和光密度（0D)測量。通過加入4% (w/w) 植物蛋白質(zhì)微粒在可溶咖啡中測定亮度。
[0073]
陽074] 實施例2植物蛋白質(zhì)微粒在咖啡中的調(diào)白特性和穩(wěn)定性 陽0巧]方法 陽076] 在可溶咖啡（2.6% (w/w))中或在烘賠并研磨的咖啡化67% (w/w))中評價實施 例1中制備的植物蛋白質(zhì)微粒調(diào)白特性。對于可溶咖啡，在80°C將雀巢經(jīng)典咖啡（Nescaf6 Classic) W2. 4% (w/w)在2/3MilliQ?水和l/3VittelTM礦泉水的混合液中重新配制。對 于烘賠并研磨的咖啡，使用自動咖啡機（濾紙孔隙率4)用1500mL水（與如前所述相同的 混合液）制備40g福爵經(jīng)典烘賠咖啡（Folgers classic roast coffee)。得到的咖啡提取 率為0. 67% (w/w)。為測定植物蛋白質(zhì)微?；蛳鄳?yīng)的乳劑的調(diào)白特性，將咖啡奶精和咖啡 Wl/6 的重量比例混合。使用 HunterL油 ColorFlex 裝置（Hunter&Caprez AG, Zundkon, 瑞± )測定混合物的顏色性質(zhì)L(白度）、a和b。
[0077]結(jié)果 陽07引在2. 6% (w/w)可溶咖啡中研究植物蛋白質(zhì)微粒的穩(wěn)定性和調(diào)白特性，W測試匹 配商購的低脂和無脂肪奶精的調(diào)白特性所需要的優(yōu)選的蛋白質(zhì)濃度。
[0079] 圖3中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示多種蛋白質(zhì)濃度的植物蛋白質(zhì)微粒的調(diào)白特性W及在可 溶咖啡中的穩(wěn)定性。
[0080] 可W看到運3種類型的植物蛋白質(zhì)微粒在純咖啡中穩(wěn)定而不添加任何緩沖鹽。運 已經(jīng)表明即使可溶咖啡抑酸性很強（約5. 0)，由于蛋白質(zhì)的兩性性質(zhì)產(chǎn)生的微粒的緩沖容 量能得到穩(wěn)定的混合物。當(dāng)比較各蛋白質(zhì)來源的調(diào)白特性時，可得到結(jié)論：馬鈴馨微粒具有 最高的調(diào)白能力，而大豆和卡諾拉顆粒非常接近。該特有的特征可能與馬鈴馨微粒的非常 窄的粒度（與大豆和卡諾拉相比）有關(guān)。
[0081] 商購的無脂肪和低脂咖啡奶精的亮度與使用4% (w/w)馬鈴馨、8% (w/w)大豆和 8% (w/w)卡諾拉蛋白質(zhì)微粒相匹配。運些差異非?？赡苁怯捎诳Х鹊牡鞍踪|(zhì)調(diào)白料的略 微不同的微結(jié)構(gòu)和粒度分布造成的，如上文已經(jīng)討論的那