專利名稱：提高真菌突變體中血紅素蛋白產(chǎn)量的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在真菌中生產(chǎn)血紅素蛋白的方法以及能生產(chǎn)血紅素蛋白的真菌細胞。
相關(guān)技術(shù)描述血紅素是原卟啉Ⅸ與鐵的螯合復(fù)合物，可作為血紅素蛋白的輔基(prosthetic group)。原卟啉Ⅸ包含一個卟啉環(huán)，該卟啉環(huán)具有四個甲基、兩個乙烯基和兩個丙酸基的取代，獲得一個鐵原子后形成血紅素。由甘氨酸和琥珀酰輔酶A生物合成血紅素涉及八個酶促步驟，它們是由5-氨基-γ-酮戊酸合成酶(5-aminolevulinic acid synthase)(EC2.3.1.37)、膽色素原合成酶(EC4.2.1.24)、膽色素原脫氨基酶(EC4.3.1.8)、尿卟啉原Ⅲ合成酶(EC4.2.11.75)、尿卟啉原Ⅲ脫羧酶(EC4.1.1.37)、糞卟啉原Ⅲ氧化酶(EC1.3.3.3)、原卟啉原Ⅸ氧化酶(EC1.3.3.4)以及亞鐵螯合酶(EC4.99.1.1)催化的。5-氨基-γ-酮戊酸合成酶催化甘氨酸和琥珀酰輔酶A縮合形成5-氨基-γ-酮戊酸(5-aminolevulinic acid)。膽色素原合成酶(也稱為5-氨基-γ-酮戊酸脫水酶)可催化兩個分子的5-氨基-γ-酮戊酸縮合形成膽色素原。膽色素原脫氨基酶(也稱為羥甲基膽色烷合成酶或uro Ⅰ合成酶)可催化吡咯膽色素原四聚體化形成前尿卟啉原。尿卟啉原Ⅲ合成酶(也稱為uro Ⅲ合成酶或uro Ⅲ共合成酶)可催化前尿卟啉原第4個環(huán)的重排，隨后通過環(huán)化形成尿卟啉原Ⅲ。尿卟啉原Ⅲ脫羧酶(也稱為uro D或尿卟啉原脫羧酶)可催化尿卟啉原Ⅲ的全部4條乙酸側(cè)鏈的脫羧反應(yīng)形成甲基，從而產(chǎn)生糞卟啉原Ⅲ。糞卟啉原Ⅲ氧化酶(也稱為糞卟啉原酶)可催化糞卟啉原Ⅲ的A、B環(huán)上第2和4位的2個丙酸基發(fā)生氧化性脫羧反應(yīng)形成乙烯基，從而產(chǎn)生原卟啉原Ⅸ。原卟啉原Ⅸ氧化酶可催化原卟啉原Ⅸ發(fā)生六電子氧化生成原卟啉Ⅸ。亞鐵螯合酶(也稱為亞鐵裂解酶、血紅素合成酶或原血紅素亞鐵裂解酶)可催化將鐵插入到原卟啉中，生成血紅素。
血紅素的分解代謝涉及兩個酶促步驟，它們是由血紅素加氧酶(EC1.14.99.3)和膽綠素還原酶(EC1.3.1.24)催化的。血紅素加氧酶催化血紅素的氧化性裂解，形成膽綠素。膽綠素還原酶在NAD(P)H存在下催化膽綠素還原成膽紅素。
脫輔基蛋白質(zhì)向血紅素蛋白的轉(zhuǎn)化依賴于血紅素生物合成途徑提供的血紅素的利用率。血紅素蛋白的脫輔基蛋白質(zhì)形式與血紅素結(jié)合，形成活性血紅素蛋白，其構(gòu)象使血紅素蛋白比脫輔基蛋白質(zhì)更耐受蛋白水解攻擊。若微生物產(chǎn)生的血紅素量相比于產(chǎn)生的脫輔基蛋白質(zhì)量更少，脫輔基蛋白質(zhì)將累積并發(fā)生蛋白水解降解，從而降低活性血紅素蛋白的產(chǎn)率。
為克服這一問題，Jensen顯示向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加血紅素或含血紅素的物質(zhì)可顯著提高米曲霉產(chǎn)生的過氧化物酶產(chǎn)率(WO93/19195)。雖然向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加血紅素可顯著提高血紅素蛋白的產(chǎn)率，但這種方法有悖常理，花費也大，并且難于大規(guī)模應(yīng)用。
本發(fā)明的一個目的是提供可用于提高真菌菌株中血紅素蛋白產(chǎn)量的改進方法，以得到商業(yè)上有意義的量。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及生產(chǎn)血紅素蛋白的方法，包括(a)在適合血紅素蛋白生產(chǎn)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體，其中(ⅰ)所述突變體包含一或多個第一核酸序列，該序列中具有對編碼一或多種血紅素代謝酶的一或多個基因或者其控制序列的修飾，且(ⅱ)在相同條件下培養(yǎng)時，所述突變體相比于親本細胞生產(chǎn)的所述一或多種血紅素代謝酶更少，而血紅素蛋白更多；及(c)從突變細胞的培養(yǎng)基中回收血紅素蛋白。
本發(fā)明還涉及這樣的血紅素蛋白生產(chǎn)方法，其中所述突變真菌細胞還包含(ⅰ)指導(dǎo)由真菌細胞內(nèi)源性的一或多個第二核酸序列編碼的一種或多種血紅素生物合成酶表達的一或多個第二控制序列，其中該一或多個第二控制序列與第二核酸序列可操作連接；和/或(ⅱ)一或多拷貝的編碼一或多種血紅素生物合成酶的一或多個第三核酸序列。
本發(fā)明還涉及其中突變真菌細胞還包含一或多拷貝的編碼血紅素蛋白的第四核酸序列的血紅素蛋白生產(chǎn)方法。
本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)血紅素蛋白的突變真菌細胞和所述突變真菌細胞的生產(chǎn)方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及生產(chǎn)血紅素蛋白的方法，包括(a)在適合血紅素蛋白生產(chǎn)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體，其中(ⅰ)所述突變體包含一或多個第一核酸序列，該序列中具有對編碼一或多種血紅素代謝酶的一或多個基因或者其控制序列的修飾，且(ⅱ)在相同條件下培養(yǎng)時，所述突變體相比于親本細胞生產(chǎn)的所述一或多種血紅素代謝酶更少，而血紅素蛋白更多；及(b)從突變細胞的培養(yǎng)基中回收血紅素蛋白。
本文將“血紅素蛋白”定義為含有血紅素作為輔基的一組蛋白質(zhì)中的任何成員。血紅素蛋白可以是含有血紅素作為輔基的珠蛋白、細胞色素、氧化還原酶或任何其它蛋白質(zhì)。含有血紅素的珠蛋白包括血紅素蛋白和肌紅蛋白。含有血紅素的細胞色素包括細胞色素P450、細胞色素b、細胞色素c1和細胞色素c。含有血紅素的氧化還原酶包括但不限于過氧化氫酶、氧化酶、加氧酶、鹵素過氧化物酶(haloperoxidase)以及過氧化物酶。在一個優(yōu)選實施方案中，所述氧化還原酶是過氧化氫酶。在另一個優(yōu)選實施方案中，該氧化還原酶是氧化酶。在又一個優(yōu)選實施方案中，該氧化還原酶是加氧酶。在又一個優(yōu)選實施方案中，該氧化還原酶是鹵素過氧化物酶。在又一個優(yōu)選實施方案中，該氧化還原酶是過氧化物酶。血紅素蛋白可以是突變真菌細胞的天然或外源蛋白質(zhì)。
在一更優(yōu)選的實施方案中，所述過氧化物酶得自于鬼傘屬、Arthromyces屬或Phanerochaete屬菌株。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該過氧化物酶得自于灰蓋鬼傘，如灰蓋鬼傘IF08371、長根鬼傘，或Arthromyces ramosus。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述過氧化氫酶得自于Scytalidium屬、曲霉屬或腐質(zhì)霉屬菌株。在另一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該過氧化氫酶得自于Scytalidium thermophilum如Scytalidium thermophilum CBS 117.65，黑曲霉或Humicola insolens。
可利用本領(lǐng)域已知方法，在適于生產(chǎn)血紅素蛋白的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的突變真菌細胞。例如，可在實驗室或工業(yè)用發(fā)酵罐內(nèi)，在合適的培養(yǎng)基中、允許表達和/或分離血紅素蛋白的條件下經(jīng)搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批補料或固相發(fā)酵)培養(yǎng)該細胞。培養(yǎng)是利用本領(lǐng)域已知方法(參見如Bennett J.W.和LaSure L.編，MoreGene Manipulations in Fungi，學(xué)術(shù)出版社，CA，1991)，在含碳、氮源和無機鹽的適宜營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行的。適當?shù)呐囵B(yǎng)基可商購，或按照公開的組成(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)配制而成。若血紅素蛋白被分泌至營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可直接從培養(yǎng)基中回收。可用于真菌宿主細胞中血紅素蛋白分泌的信號肽編碼區(qū)可得自于例如米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola Lanuginosa纖維素酶基因或Rhizomucor miehei脂肪酶基因。若多肽不被分泌，則可從細胞裂解物中回收。
可通過本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的血紅素蛋白。例如，可通過包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀等常規(guī)方法，從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收血紅素蛋白。然后可通過一系列層析操作如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等對所回收的蛋白質(zhì)進行進一步純化。
在本發(fā)明的一個方面，通過修飾，如破壞或刪除親本真菌細胞中編碼血紅素代謝酶的一或多個第一核酸序列或者其調(diào)控序列，得到相同條件下培養(yǎng)時血紅素代謝酶產(chǎn)量比親本細胞減少、而血紅素蛋白產(chǎn)量更高的突變真菌細胞，從而可以在真菌細胞中更大量地生產(chǎn)血紅素蛋白。該第一核酸序列可以是編碼血紅素加氧酶或膽綠素還原酶的任何序列。
可以將血紅素代謝酶在細胞中進行表達所必需的第一核酸序列修飾或使它失活來方便地構(gòu)建出血紅素代謝酶活性缺乏的突變真菌菌株。要進行修飾或失活的第一核酸序列可以是例如編碼血紅素代謝酶或其顯示血紅素代謝酶活性所必需的部分的核酸序列，或者是由該核酸序列的編碼序列表達血紅素代謝酶時所必需的核酸序列調(diào)控元件。這種調(diào)控或調(diào)節(jié)序列的例子可以是啟動子序列或它的功能性部分(即足夠影響血紅素代謝酶表達的那部分)。其他可能被修飾的調(diào)控序列描述于本文中，包括但不限于前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、肽原序列、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。
可以通過對細胞進行誘變處理并挑選出其血紅素代謝酶產(chǎn)生能力降低的細胞，從而對第一核酸序列進行修飾或失活。誘變可以是特異的或隨機的，可通過例如使用合適的物理或化學(xué)誘變劑、使用合適的寡核苷酸、或?qū)NA序列進行PCR介導(dǎo)誘變而完成。另外，可利用這些誘變劑的任何組合形式進行誘變。
適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的例子包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。
使用這類試劑時，通常于合適的條件下，在有所選突變劑存在時培養(yǎng)待誘變細胞，并挑選出血紅素代謝酶活性或產(chǎn)量呈現(xiàn)減少的細胞，由此完成誘變。
可以通過在編碼血紅素代謝酶的第一核酸序列或者其轉(zhuǎn)錄或翻譯所必需的調(diào)控元件中導(dǎo)入、取代或去除1或多個核苷酸來完成血紅素代謝酶生產(chǎn)的修飾或失活。例如，可以插入或去除一或多個核苷酸來導(dǎo)入終止子、去掉起始密碼子或改變開放讀碼框?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域已知的方法通過定點誘變或PCR誘變來達到這種修飾或失活的目的。盡管一般來說，修飾可以在體內(nèi)進行，即直接對待修飾核酸序列的表達細胞進行，但優(yōu)選象下面的例子一樣在體外進行修飾。
使基因失活或產(chǎn)量減少的方便方法的例子是基于基因取代或基因破壞技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，在體外將相當于目標內(nèi)源基因或基因片段的核酸序列進行誘變，從而產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將該序列轉(zhuǎn)化到宿主細胞中，產(chǎn)生缺陷型基因。經(jīng)過同源重組，缺陷型核酸序列將取代內(nèi)源基因或基因片段?？赡鼙容^理想的是缺陷基因或基因片段還編碼標記，以便用該標記選擇出編碼血紅素代謝酶的基因已經(jīng)被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化子。
可選擇地，利用成熟的反義技術(shù)，用與血紅素代謝酶編碼序列互補的核苷酸序列使編碼血紅素代謝酶的第一核酸序列修飾或失活。更具體地說，可以導(dǎo)入與編碼血紅素代謝酶的第一核酸序列互補的核苷酸序列，該序列在細胞中可以進行轉(zhuǎn)錄并能與細胞中產(chǎn)生的血紅素代謝酶mRNA雜交，從而減少或消除細胞的血紅素代謝酶產(chǎn)量。在能使得互補的反義核苷酸序列與血紅素代謝酶mRNA雜交的條件下，翻譯出的血紅素代謝酶量就會減少或消除。
與第一核酸序列互補的核酸序列可來源于任何微生物。該核酸序列來源的選擇取決于突變真菌細胞，但優(yōu)選真菌來源，如酵母和絲狀真菌。優(yōu)選的絲狀真菌來源包括但不限于枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、Phanerochaete屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬及木霉屬。優(yōu)選的酵母來源包括但不限于假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酶母屬、酵母屬、裂殖酵母屬和Yarrowia屬內(nèi)各種。此外，該核酸序列可以是真菌細胞的天然序列。
或者，與第一核酸序列互補的核酸序列可以是下述序列之一或多個1．血紅素加氧酶基因a．人(Yoshida等人，1988，歐洲生物化學(xué)雜志，171457-461；Shibahara等人，1989，歐洲生物化學(xué)雜志，179557-563)；b．大鼠(Shibara等人，1985，美國國家科學(xué)院院報，827865-7869；Muller等人，生物化學(xué)雜志，2626795-6802)；c．Cyanidium caldarin(Cornejo和Beale，1988，生物化學(xué)雜志，26311915-11921)；d．集胞藍細菌屬之種(Synechocystis sp.)(Cornejo等人，1998，植物雜志1599-107)；和e．雞(Lu等人，1998，基因207177-186)2．膽綠素還原酶基因a．人(Maines等人，1996，歐洲生物化學(xué)雜志，235372-381；Komuro等人，1996，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報，130989-99)；b．大鼠(McCoubrey等人，1995，基因，160235-240)；和c．集胞藍細菌屬之種(Schluchter和Glazer，1997，生物化學(xué)雜志27213562-13569)。
在本發(fā)明方法中，相同條件下培養(yǎng)時，突變真菌細胞與相應(yīng)的親本細胞相比，其產(chǎn)生的血紅素代謝酶至少少10％，優(yōu)選至少少25％，更優(yōu)選至少少50％，還更優(yōu)選至少少75％，最優(yōu)選至少少95％。更進一步地，相同條件下培養(yǎng)時，突變真菌細胞與相應(yīng)的親本細胞相比，其產(chǎn)生的血紅素蛋白至少多10％，優(yōu)選至少多25％，更優(yōu)選至少多50％，還更優(yōu)選至少多75％，最優(yōu)選至少多95％。
在本發(fā)明的另一方面，突變細胞還包含可指導(dǎo)該突變真菌細胞內(nèi)源性的一或多個第二核酸序列編碼的一或多種血紅素生物合成酶表達的一或多個第二控制序列，其中所述一或多個第二控制序列與第二核酸序列可操作連接。
可通過本領(lǐng)域熟知方法將控制序列和/或核酸序列導(dǎo)入突變真菌細胞中。例如，可通過同源或非同源重組將這些序列導(dǎo)入并整合至宿主基因組中，其中這些序列的一或多拷貝被整合到單個和/或多個靶序列中。或者，可將這些序列以未整合表達載體如自身復(fù)制型染色體外質(zhì)粒形式導(dǎo)入和保持。本領(lǐng)域中將核酸序列導(dǎo)入真菌細胞的標準方法包括以已知方式進行的原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及被轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的細胞壁再生(參見EP238023和Malardier等，1989，基因，78147-156)。優(yōu)選利用含有核酸構(gòu)建體的整合載體轉(zhuǎn)化細胞，所述核酸構(gòu)建體含有控制序列和/或編碼血紅素生物合成酶的核酸序列，其中該構(gòu)建體便利地整合到絲狀真菌細胞的宿主基因組中，優(yōu)選染色體中。本文中術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈或雙鏈核酸分子，它分離自天然存在的基因，或是已被修飾而包含了以自然界并不存在的方式聯(lián)合并置的數(shù)段核酸。
該第二核酸序列優(yōu)選是編碼選自下述的血紅素生物合成酶的任何核酸序列5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、膽色素原合成酶、膽色素原脫氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脫羧酶、糞卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶或亞鐵螯合酶，其中第二核酸序列是親本真菌細胞的內(nèi)源序列。術(shù)語“內(nèi)源”在本文中指起源于親本真菌細胞。
術(shù)語“控制序列”在本文中是指包括可指導(dǎo)第二核酸序列的編碼序列在突變真菌細胞中、與控制序列相容的條件下表達的所有組分。表達應(yīng)理解為多肽生產(chǎn)中涉及的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌?？刂菩蛄锌梢允蔷幋a血紅素生物合成酶的第二核酸序列的天然序列，或可得自其它來源，或可以是天然和外源控制序列的組合。外源控制序列可簡單替換或添加到天然控制序列中，以獲得與編碼序列正常相連的天然控制序列相比更高水平的目的血紅素生物合成酶表達。這類控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列以及轉(zhuǎn)錄終止子。為了能在控制序列的指導(dǎo)下進行表達，將根據(jù)本發(fā)明所用的第二核酸序列與控制序列可操作連接，從而在與控制序列相容的條件下獲得第二核酸序列編碼序列的表達。術(shù)語“編碼序列”在本文中定義為置于上述控制序列的控制之下時可轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成血紅素生物合成酶的序列。編碼序列的邊界由位于mRNA 5’-末端、開放閱讀框上游的ATG翻譯起始密碼子和位于mRNA 3’-末端、開放閱讀框下游的轉(zhuǎn)錄終止子序列確定。編碼序列包括但不限于DNA、cDNA及重組核酸序列。術(shù)語“可操作連接”在本文中指其中控制序列相對于DNA序列的編碼序列所處的位置使得該控制序列能指導(dǎo)多肽生產(chǎn)的構(gòu)型。
第二控制序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，即可被突變真菌細胞識別而使第二核酸序列表達的核酸序列。啟動子序列含有可介導(dǎo)血紅素生物合成酶表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。啟動子可以是在選定的突變真菌細胞內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的任何啟動子序列，可得自突變真菌細胞的天然或外源基因。
可指導(dǎo)第二核酸序列在絲狀真菌細胞中轉(zhuǎn)錄的適當啟動子的實例有得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO96/00787)等的基因的啟動子、NA2-tpi(來源于黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶編碼基因的啟動子的雜合體)，和其突變的、截短的和雜合的啟動子。
指導(dǎo)第二核酸序列在酵母細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的例子有得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)以及釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因的啟動子。Romanos等，1992，酵母(Yeast)8423-488中描述了可用于酵母細胞的其它有用啟動子。
第二控制序列也可以是適當?shù)霓D(zhuǎn)錄終止序列，即可被突變真菌細胞識別而終止轉(zhuǎn)錄的一段序列。該終止序列與編碼血紅素生物合成酶的第二核酸序列的3’末端可操作連接。終止序列可以是編碼血紅素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。在選定的突變真菌細胞內(nèi)有功能的任何終止子在本發(fā)明中很可能有用處。
優(yōu)選用于絲狀真菌宿主細胞的終止子可得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶編碼基因。
酵母宿主細胞的優(yōu)選終止子得自編碼釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)或釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。Romanos等，1992(出處同前)中描述了可用于酵母宿主細胞的其它有用終止子。
第二控制序列也可能是適當?shù)那皩?dǎo)序列，即mRNA中對突變真菌細胞的翻譯具有重要作用的非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼血紅素生物合成酶的第二核酸序列的5’末端可操作連接。前導(dǎo)序列可能是第二核酸序列的天然或外源序列。在選定的突變真菌細胞內(nèi)有功能的任何前導(dǎo)序列很可能在本發(fā)明中也是有用的。
用于絲狀真菌細胞的優(yōu)選前導(dǎo)序列得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶的基因。用于酵母細胞的合適前導(dǎo)序列得自釀酒酵母烯醇酶(ENO-1)基因、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母α-因子基因及釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)。
第二控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，即與第二核酸序列的3’末端可操作連接、并且轉(zhuǎn)錄時能被突變真菌細胞識別而將多腺苷酸殘基加到轉(zhuǎn)錄mRNA上的一段序列。多聚腺苷酸化序列可以是編碼血紅素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。在選定的突變真菌細胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列很可能在本發(fā)明中也是有用的。
特別優(yōu)選用于絲狀真菌細胞的多聚腺苷酸化序列得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶及黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。Guo和Sherman，1995，分子細胞生物學(xué)(Molecular Cellular Biology)155983-5990中描述了可用于酵母細胞的多聚腺苷酸化序列。
第二控制序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與血紅素生物合成酶氨基末端相連的氨基酸序列，使血紅素生物合成酶定位于特定細胞區(qū)室中。信號肽編碼區(qū)可以是編碼血紅素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。第二核酸序列編碼序列的5’末端可能本身含有信號肽編碼區(qū)，該信號肽編碼區(qū)與編碼該定位血紅素生物合成酶的編碼區(qū)區(qū)段在翻譯讀框內(nèi)自然連接。或者，該編碼序列的5’末端可含有相對于該定位血紅素生物合成酶編碼序列部分為外源的信號肽編碼區(qū)的核酸。信號肽編碼區(qū)可得自粗糙脈孢菌ATP酶基因(Viebrock等人，1982，EMBO雜志，1565-571)或釀酒酵母細胞色素c過氧化物酶基因(Kaput等人，1982，生物化學(xué)雜志，25715054-15058)。然而，能夠在選定的突變真菌細胞中促使血紅素生物合成酶定位的任何信號肽編碼區(qū)在本發(fā)明中均可使用。
可用于絲狀真菌細胞的有效信號肽編碼區(qū)是得自于米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉中性淀粉酶基因、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola Lanuginosa纖維素酶基因或Rhizomucor miehei脂肪酶基因的信號肽編碼區(qū)。
用于酵母細胞的有效信號肽編碼區(qū)可得自于編碼釀酒酵母α-因子、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶及釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。Romanos等(1992，出處同前)描述了有用的其它信號肽編碼區(qū)。
第二控制序列也可以是編碼位于具生物化學(xué)活性的成熟多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)，所獲得的多肽公知為酶原或多肽原(或在某些情形下為酶原)。酶原通常是沒有活性的，通過肽原的催化或自身催化切割可從酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓幕钚远嚯?。本文將有生物化學(xué)活性的多肽限定為以可發(fā)揮其天然對應(yīng)物的生物化學(xué)活性的活性形式生產(chǎn)的血紅素生物合成酶。該前肽序列可以是編碼血紅素生物合成酶的第二核酸序列的天然或外源序列。編碼前肽的核酸序列可得自編碼釀酒酵母α-因子和嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶的基因。
在本發(fā)明的另一方面中，突變真菌細胞還包含一或多拷貝的編碼WO97/47746中所述一或多種血紅素生物合成酶的一或多個第三核酸序列。第三核酸序列可以是編碼選自下述的血紅素生物合成酶的任何核酸序列5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、膽色素原合成酶、膽色素原脫氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脫羧酶、糞卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶或亞鐵螯合酶。第三核酸序列可來源于任何微生物。第三核酸序列來源的選擇取決于突變真菌細胞，但優(yōu)選真菌來源，如酵母和絲狀真菌。優(yōu)選的絲狀真菌來源包括但不限于枝頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、Phanerochaete屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬及木霉屬內(nèi)的種。優(yōu)選的酵母來源包括但不限于假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酶母屬、酵母屬、裂殖酵母屬和Yarrowia屬內(nèi)的種。此外，第三核酸序列可以是突變真菌細胞的天然序列。
第三核酸序列可以是下述序列中的一種或多種1．5-氨基-γ-酮戊酸合成酶基因a．釀酒酵母(Urban-Grimal等，1986，歐洲生物化學(xué)雜志，156511-59)；b．構(gòu)巢曲霉(Bradshaw等，1993，現(xiàn)代遺傳學(xué)，23501-507)；c．類球紅細菌(Tai等，1988，基因，70139-152)；d．莢膜紅細菌(Hornberger等，1990，分子普通遺傳學(xué)，211371-378)；e．大腸桿菌(Drolet等，1989，分子普通遺傳學(xué)，216347-352)；以及f．米曲霉(WO97/47736)。
2．膽色素原合成酶基因a．釀酒酵母(Myers等，1987，生物化學(xué)雜志，26216822-16829)；b．金黃色葡萄球菌(Kafala和Sasarman，1994，加拿大微生物學(xué)雜志，40651-657)；c．類球紅細菌(Delaunay等，1991，細菌學(xué)雜志，1732712-2715)；d．大腸桿菌(Echelard等，1988，分子普通遺傳學(xué)，214，503-508)；e．枯草芽孢桿菌(Hansson等，1991，細菌學(xué)雜志，1732590-2599)；以及f．米曲霉(WO97/47736)。
3．膽色素原脫氨基酶基因a．釀酒酵母(Keng等，1992，分子普通遺傳學(xué)，234233-243)；b．人(Yoo等，1993，基因組，15221-29；Raich等，1986，核酸研究，145955-5968)；c．大腸桿菌(Thomas和Jordan，1986，核酸研究，146215-6226)；以及d．枯草芽孢桿菌(Petricek等，1990，細菌學(xué)雜志，1722250-2258)。
4．尿卟啉原Ⅲ合成酶基因a．釀酒酵母(Amillet和Labbe-Bois，1995，酵母，11419-424)；b．枯草芽孢桿菌(Hansson等，1991，細菌學(xué)雜志，1732590-2599)；以及c．大腸桿菌(Jordan等，1987，核酸研究，1510583)。
5．尿卟啉原Ⅲ脫羧酶基因a．釀酒酵母(Garey等，1992，歐洲生物化學(xué)雜志，2051011-1016)；以及
b．人(Romeo等，1986，生物化學(xué)雜志，2619825-9831)。
6．糞卟啉原Ⅲ氧化酶基因a．人(Martasek等，1994，美國國家科學(xué)院院報，9113024-3028)；b．大腸桿菌(Troup等，1994，細菌學(xué)雜志，176673-680)；以及c．釀酒酵母(Zaagorec等，1986，生物化學(xué)雜志，2639718-9724)。
7．原卟啉原Ⅸ氧化酶基因a．人(Taketani等，1995，基因組，29698-703)；b．枯草芽孢桿菌(Dailey等，1994，生物化學(xué)雜志，269813-815)；以及c．大腸桿菌(Sasarman等，1993，加拿大微生物學(xué)雜志，39155-161)。
8．亞鐵螯合酶基因a．釀酒酵母(Labbe-Bois，1990，生物化學(xué)雜志，26572878-72883)；b．牛(Shibuya等，1995，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報，1231117-120)；c．大豆慢生根瘤菌(Frustaci和O’Brian，1993，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，592347-2351)；d．大腸桿菌(Frustaci和O’Brian，1993，細菌學(xué)雜志，1752154-2156)；以及e．枯草芽孢桿菌(Hansson和Hederstedt，1992，細菌學(xué)雜志，17488081-88093)。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，所說的第三核酸序列得自曲霉屬之種。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，所說的第三核酸序列得自無花果曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉或米曲霉。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，第三核酸序列得自酵母屬之種。在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，第三核酸序列得自釀酒酵母、卡爾酵母、糖化酵母、Saccharomycesdouglassi，克魯弗酵母、諾地酵母或Saccharomyces oviformis。
在一個優(yōu)選實施方案中，第三核酸序列與WO97/47746所述的一或多個第三控制序列可操作連接。第三控制序列可以是編碼血紅素生物合成酶的第三核酸序列的天然序列，也可以部分或全部來源于外源。外源控制序列可簡單地替換天然控制序列，以使得與天然控制序列和編碼序列正常相連時相比其目的血紅素生物合成酶產(chǎn)量更高。第三控制序列可以是上述有關(guān)第二控制序列時例舉的控制序列中的任何一種。
在本發(fā)明的另一方面，突變真菌細胞含有一或多拷貝的一或多個第二控制序列和一或多拷貝的一或多個第三核酸序列。優(yōu)選地，該第三核酸序列與一或多個第三控制序列可操作連接。
第二控制序列、第三核酸序列和/或第三控制序列可包含在同一核酸構(gòu)建體中，也可包含在不同的核酸構(gòu)建體中。每一核酸構(gòu)建體都可含有整合元件以用于指導(dǎo)通過同源重組而整合至真菌宿主基因組的精確位點。為了提高在精確位點發(fā)生整合的可能性，整合元件優(yōu)選地應(yīng)含有足夠長的核酸，如100-1500個堿基對，優(yōu)選400-1500個堿基對，最優(yōu)選為800-1500個堿基對，該核酸與相應(yīng)的靶序列高度同源以提高同源重組的概率。整合元件可以是與突變真菌細胞的基因組內(nèi)靶序列同源的任何序列。另外，整合元件可以是非編碼核酸序列或編碼核酸序列。另一方面，也可通過非同源重組將每種核酸構(gòu)建體整合至突變真菌細胞的基因組中。
可利用本領(lǐng)域熟知的分子生物學(xué)技術(shù)，將核酸構(gòu)建體插入適當?shù)妮d體中，或?qū)⒌谌怂嵝蛄兄苯硬迦胍押锌刂菩蛄械妮d體中。載體可以是能便利地進行重組DNA操作并能使核酸序列表達的任何一種載體。載體的選擇通常取決于該載體與欲導(dǎo)入該載體的突變真菌細胞之間的相容性。載體可以是自主復(fù)制型載體，即在染色體外完整存在、并能獨立于染色體復(fù)制而進行復(fù)制的載體，諸如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體?；蛘撸d體也可以是導(dǎo)入突變真菌細胞時能整合至基因組中并與其整合入的染色體一起復(fù)制的一種載體。載體系統(tǒng)可以是單個載體或質(zhì)粒，也可以是合在一起含有待導(dǎo)入真菌細胞基因組內(nèi)的總DNA的兩個或多個載體或質(zhì)粒。
本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有能便于對轉(zhuǎn)化細胞進行篩選的一個或多個選擇標記。選擇標記是其產(chǎn)物能提供對殺生物劑或?qū)Σ《镜目剐浴⒅亟饘倏剐?、賦予營養(yǎng)缺陷體原養(yǎng)型等的基因。絲狀真菌細胞適用的選擇標記包括但并不限于amdS、pyrG、argB、niaD、sC、trpC、bar和hygB。酵母細胞適用的標記包括但不限于ADE2、HIS3、IEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。在曲霉細胞中，優(yōu)選使用構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG標記，以及吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar標記。此外，也可通過共轉(zhuǎn)化完成篩選，如WO91/17243所述，其中選擇標記包含于另一個載體中。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知用于連接核酸構(gòu)建體、啟動子、終止子和其它元件以及將它們插入至含有復(fù)制必需信息的適當載體中的方法(參見如Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989)。
在本發(fā)明方法中，突變真菌細胞還包括一或多拷貝的一或多個編碼血紅素蛋白的第四核酸序列。第四核酸序列可與第二控制序列、第三核酸序列及第三控制序列包含在同一載體中，它們也可包含在不同載體中。優(yōu)選第四核酸序列與第四控制序列可操作連接。上文就第二控制序列而列舉的控制序列也適用于第四控制序列。
在本發(fā)明方法中，營養(yǎng)培養(yǎng)基中還可包括血紅素源、其類似物或者一或多種血紅素生物合成途徑中間體。有關(guān)血紅素類似物和生產(chǎn)途徑中間體的一覽表參見Porphyrin Products Inc.(Logan，UT)的產(chǎn)品小冊子。比如，若將編碼血紅素生物合成途徑中的一種酶的核酸序列導(dǎo)入突變真菌細胞，則在此之前的一個或多個步驟中的一或多種生產(chǎn)途徑中間體可能變得具有限速性。在此情形下，可將一或多種生產(chǎn)途徑中間體補加到培養(yǎng)基中。為將這些生產(chǎn)途徑中間體導(dǎo)入細胞，可以使用一種能使細胞膜半通透化的酶，如NOVOZYM234TM(Novo Nordisk A/S)。
在本發(fā)明方法中，營養(yǎng)培養(yǎng)基中還可包括鐵源?；蛘?，營養(yǎng)培養(yǎng)基中還可包括能誘導(dǎo)卟啉合成的其它任何金屬離子。參見如Mamet等，1996，生物金屬，973-77。
本發(fā)明也涉及可用于生產(chǎn)血紅素蛋白的突變真菌細胞，該細胞具有對一或多個編碼一或多種血紅素代謝酶的第一核酸序列或其控制序列的修飾，其中在相同條件下培養(yǎng)時，突變細胞相比于親本細胞生產(chǎn)的一或多種血紅素代謝酶更少，而血紅素蛋白更多。
本發(fā)明的突變真菌細胞還包含可指導(dǎo)細胞內(nèi)源的一或多個第二核酸序列所編碼的一或多種血紅素生物合成酶表達的一個或多個第二控制序列，以及/或者一或多拷貝的編碼一或多種血紅素生物合成酶的一或多個第三核酸序列。這些序列可整合至突變真菌細胞的基因組中，或可包含在染色體外自主復(fù)制型載體中。
本發(fā)明的突變真菌細胞還可含有一或多拷貝的編碼血紅素蛋白的一或多個第四核酸序列，其中所述一或多個第四核酸序列與可指導(dǎo)細胞中血紅素蛋白表達的第四控制序列可操作連接；編碼血紅素蛋白的第四核酸序列被整合至細胞基因組中，或包含于染色體外自主復(fù)制型載體中。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)突變真菌細胞的方法，包括對親本真菌細胞中的編碼血紅素代謝酶的一或多個第一核酸序列或者其控制序列進行修飾，如破壞或刪除，從而在相同條件下培養(yǎng)時，突變真菌細胞相比于親本細胞生產(chǎn)的血紅素代謝酶更少，而血紅素蛋白更多。
本發(fā)明方法中真菌細胞的選擇很大程度上取決于控制序列、編碼血紅素生物合成酶和血紅素蛋白的核酸序列的來源。
在一個優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是一種酵母細胞?！敖湍浮痹诒疚闹邪óa(chǎn)子囊酵母(內(nèi)孢霉目)、產(chǎn)擔子酵母，和屬于半知菌類(芽孢綱)的酵母。產(chǎn)子囊酵母分成蝕精霉科和酵母科兩個科。后者包括四個亞科裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae)(例如裂殖酵母屬)、拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母亞科(Saccharomycoideae)(例如畢赤酵母屬、克魯維酵母屬和酵母屬)。產(chǎn)擔子酵母包括白冬孢酵母屬(Leucosporidim)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、鎖擲酵母屬(Spordiobolus)、Filobasidium和Filobasidiella。屬于半知菌類的酵母分成兩個科擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae)(例如，Sorobolomyces屬和布勒彈孢酵母屬)和隱球酵母科(Cryptococcaceae)(例如假絲酵母屬)。因為酵母的分類在將來可能會改變，為了本發(fā)明的目的，應(yīng)按照《酵母的生物學(xué)和活性》(Skinner，F(xiàn).APassmore，S.M和Davenport，R.R編，Soc.App.Bactoriol，論文集系列No.9，1980)中所述定義酵母。酵母的生物學(xué)和遺傳學(xué)加工在本領(lǐng)域里已廣為人知(見例如《酵母的生物化學(xué)和遺傳學(xué)》，Bacil，MHorecker，B.JStopani，A.O.M.編，第2版，1987；《酵母》，Rose，A.H.和Harrison，J.S.編，第2版，1987；《酵母屬酵母的分子生物學(xué)》，Strathern等編，1981)。
在一個較優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia屬細胞。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克魯弗酵母、諾地酵母或Saccharomyces oviformis細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是乳酸克魯維酵母。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是Yarrowia lipolytica細胞。
在另一個優(yōu)選實施方案中，真菌宿主細胞是一種絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)亞支的所有絲狀真菌形式(由Hawksworth等定義，1995，出處同前)。絲狀真菌的特征在于有由殼多糖、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其他復(fù)雜多糖組成的菌絲壁。其營養(yǎng)生長是通過菌絲的延長進行的，碳分解代謝是專性需氧的。相比之下，酵母(例如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出芽進行的，碳的分解代謝可能是發(fā)酵性的。在一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬及木霉屬細胞。
在一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是曲霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是枝頂孢屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是鐮孢屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是腐質(zhì)霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是毛霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是毀絲霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是脈孢菌屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是青霉屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是梭孢殼屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是Tolypocladium屬細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是木霉屬細胞。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是泡盛曲霉細胞、臭曲霉細胞、日本曲霉細胞、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis，F(xiàn)usarium crookwellense、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、Fusarium sulphureum，F(xiàn)usariumtoruloseum， Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum細胞。在一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌親本細胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)在另一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是Humicola insolens細胞或Humicola lanuginosa細胞。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是米黑毛霉(Mucor miehei)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是粗糙脈孢菌細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是產(chǎn)紫青霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，該絲狀真菌細胞是Thielavia terrestris細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，該木霉屬細胞是Trichoderma harzianum，康寧木霉、Trichodermalongiblachiatum、Trichoderma reesei，或綠色木霉細胞。
可通過包括原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及細胞壁再生的方法以已知方式轉(zhuǎn)化真菌細胞。EP238023和Yelton等，1984，美國國家科學(xué)院學(xué)報，811470-1474中描述了轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細胞的合適操作。Malardier等，1989，基因，78147-156或WO96/00787中描述了轉(zhuǎn)化鐮孢的合適方法?？衫肂ecker和Guarente描述于酶學(xué)方法，194卷，酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)指南(Abelson，J.N.和Simon，M.I.編)，182-187頁(Academic Press，IncNew York)；Ito等，1983，細菌學(xué)雜志，153163；和Hinnen等，1978，美國國家科學(xué)院學(xué)報，751920中記載的操作轉(zhuǎn)化酵母。
本文所述和要求權(quán)利的發(fā)明并不局限于本文所公開的具體實施方案的范圍，因為這些實施方案僅僅旨在闡明本發(fā)明的幾個方面。任何等價的實施方案都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。實際上，根據(jù)前文的描述，除了本文所示和所述的以外，本發(fā)明的多種修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是顯而易見的，這種修飾也欲包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。有沖突時，以本發(fā)明公開內(nèi)容，包括定義為準。
本文提及很多參考文獻，它們的公開內(nèi)容都全文列入本文作為參考。
權(quán)利要求
1．一種生產(chǎn)血紅素蛋白的方法，包括(a)在適合生產(chǎn)血紅素蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體，其中(ⅰ)所述突變體包含一或多個第一核酸序列，其中具有對編碼一或多種血紅素代謝酶的一或多個基因或者其控制序列的修飾，且(ⅱ)在相同條件下培養(yǎng)時，所述突變體相比于親本細胞生產(chǎn)的所述一或多種血紅素代謝酶更少，而血紅素蛋白更多；及(b)從突變體的培養(yǎng)基中回收血紅素蛋白。
2．權(quán)利要求1的方法，其中第一核酸序列編碼血紅素加氧酶。
3．權(quán)利要求1的方法，其中第一核酸序列編碼膽綠素還原酶。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述突變體還包含(ⅰ)指導(dǎo)由該細胞內(nèi)源性的一個或多個第二核酸序列編碼的一種或多種血紅素生物合成酶表達的一或多個第二控制序列，其中該一或多個第二控制序列與第二核酸序列可操作連接；和/或(ⅱ)一或多拷貝的編碼一或多種血紅素生物合成酶的一或多個第三核酸序列。
5．權(quán)利要求4的方法，其中所述突變體僅含有一或多個第二控制序列。
6．權(quán)利要求5的方法，其中第二控制序列選自前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、啟動子、前肽編碼區(qū)、信號肽編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子。
7．權(quán)利要求5的方法，其中所述一或多個控制序列得自真菌菌株。
8．權(quán)利要求4的方法，其中所述突變體僅含有一或多拷貝的一或多個第三核酸序列。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列與可指導(dǎo)該第三核酸序列表達的一或多個第三控制序列可操作連接。
10．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列得自真菌菌株。
11．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼選自下組的一或多種酶5-氨基-γ-酮戊酸合成酶、膽色素原合成酶、膽色素原脫氨基酶、尿卟啉原合成酶、尿卟啉原脫羧酶、糞卟啉原氧化酶、原卟啉原氧化酶和亞鐵螯合酶。
12．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼5-氨基-γ-酮戊酸合成酶。
13．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼膽色素原合成酶。
14．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼膽色素原脫氨基酶。
15．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼尿卟啉原合成酶。
16．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼尿卟啉原脫羧酶。
17．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼糞卟啉原氧化酶。
18．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼原卟啉原氧化酶。
19．權(quán)利要求8的方法，其中所述一或多個第三核酸序列編碼亞鐵螯合酶。
20．權(quán)利要求4的方法，其中所述突變體包含一或多拷貝的第二控制序列和一或多拷貝的第三核酸序列。
21．權(quán)利要求1的方法，其中所述突變體還包含一或多拷貝的編碼血紅素蛋白的第四核酸序列。
22．權(quán)利要求1的方法，其中營養(yǎng)培養(yǎng)基中包含有血紅素或血紅素類似物源。
23．權(quán)利要求1的方法，其中營養(yǎng)培養(yǎng)基中包含有鐵源。
24．權(quán)利要求1的方法，其中所述血紅素蛋白是氧化還原酶。
25．權(quán)利要求24的方法，其中所述氧化還原酶是過氧化氫酶、氧化酶、加氧酶、鹵素過氧化物酶或過氧化物酶。
26．權(quán)利要求25的方法，其中所述氧化還原酶是過氧化氫酶。
27．權(quán)利要求25的方法，其中所述氧化還原酶是氧化酶。
28．權(quán)利要求25的方法，其中所述氧化還原酶是加氧酶。
29．權(quán)利要求25的方法，其中所述氧化還原酶是鹵素過氧化物酶。
30．權(quán)利要求25的方法，其中所述氧化還原酶是過氧化物酶。
31．權(quán)利要求30的方法，其中所述過氧化物酶得自于鬼傘屬、Arthromyces屬或Phanerochaete屬內(nèi)的種。
32．權(quán)利要求31的方法，其中所述過氧化物酶得自于鬼傘屬菌株。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述過氧化物酶得自于灰蓋鬼傘菌株。
34．權(quán)利要求32的方法，其中所述過氧化物酶得自于長根鬼傘菌株。
35．權(quán)利要求1的方法，其中所述血紅素蛋白是親本真菌細胞的天然蛋白質(zhì)。
36．權(quán)利要求1的方法，其中所述血紅素蛋白是親本真菌細胞的外源蛋白質(zhì)。
37．權(quán)利要求1的方法，其中所述親本真菌細胞是絲狀真菌細胞或酵母細胞。
38．權(quán)利要求37的方法，其中所述絲狀真菌細胞是枝頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、毀絲霉屬、毛霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬或木霉屬細胞。
39．權(quán)利要求38的方法，其中所述絲狀真菌細胞是曲霉細胞。
40．權(quán)利要求39的方法，其中所述曲霉細胞是米曲霉細胞。
41．權(quán)利要求39的方法，其中所述曲霉細胞是黑曲霉細胞。
42．權(quán)利要求37的方法，其中所述酵母細胞是假絲酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia屬細胞。
43．可用于生產(chǎn)血紅素蛋白的突變真菌細胞，該細胞中含有對編碼一或多種血紅素代謝酶的一或多個基因或者其控制序列具有修飾的一或多個第一核酸序列，在相同條件下培養(yǎng)時，該突變真菌細胞相比于其親本細胞生產(chǎn)的一或多種血紅素代謝酶更少，而血紅素蛋白更多。
44．權(quán)利要求43的突變真菌細胞，其中還包含(ⅰ)可指導(dǎo)細胞內(nèi)源性的一或多個第二核酸序列所編碼的一或多種血紅素生物合成酶表達的一個或多個第二控制序列，其中所述一或多個第二控制序列與所述一或多個第二核酸序列可操作連接；和/或(ⅱ)一或多拷貝的編碼一或多種血紅素生物合成酶的一或多個第三核酸序列。
45．權(quán)利要求43的突變細胞，其中還含有一或多拷貝的編碼血紅素蛋白的第四核酸序列。
46．生產(chǎn)突變真菌細胞的方法，包括對包含親本真菌細胞中編碼一或多種血紅素代謝酶的一或多個基因或者其控制序列的一或多個第一核酸序列進行修飾，從而在相同條件下培養(yǎng)時，突變真菌細胞相比于親本細胞生產(chǎn)的所述一或多種血紅素代謝酶更少，而血紅素蛋白更多。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)血紅素蛋白的方法,該方法包括:(a)在適合生產(chǎn)血紅素蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)親本真菌細胞的突變體,其中(i)所述突變體包含一或多個第一核酸序列,其中具有對編碼一或多種血紅素代謝酶的一或多個基因或者其控制序列的修飾,且(ii)在相同條件下培養(yǎng)時,所述突變體相比于親本細胞生產(chǎn)的所述一或多種血紅素代謝酶更少,而血紅素蛋白更多;及(b)從突變細胞的培養(yǎng)基中回收血紅素蛋白。
文檔編號C12N1/15GK1281510SQ98811984
公開日2001年1月24日 申請日期1998年12月8日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月8日
發(fā)明者S·L·埃爾羅德 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術(shù)有限公司