專利名稱：檢測(cè)致病性大腸桿菌菌株的TaqMan的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于TaqManTM-PCR技術(shù)的檢測(cè)致病性大腸桿菌的快速高效分析法，和可用于該分析法中的特定的優(yōu)化的寡核苷酸引物以及標(biāo)記的寡核苷酸探針。
發(fā)明
背景技術(shù)：
腸出血性產(chǎn)志賀氏樣毒素(stl)大腸桿菌(EHEC)最近被認(rèn)為是一種重要的人和動(dòng)物致病原(1-7)。EHEC導(dǎo)致一些食品傳染病的爆發(fā)(8)。最值得注意的是在美國西部各州的與快餐鏈相關(guān)的在多州的爆發(fā)，在華盛頓600多人受影響，3人死亡(9)，在日本流行病發(fā)生，具有6000多病人和約8例死亡病例(10)。EHEC感染導(dǎo)致腹瀉、出血性結(jié)腸炎、血小板減少紫癜和特征在于急性腎病的溶血性尿毒癥(HUS)、血小板減少和微血管溶血性貧血。HUS在受影響的兒童和免疫損害個(gè)體中最終可導(dǎo)致致死的后果(3，11-17)。最近，報(bào)道了在1995年10月至1996年7月期間在德國東南部(Bavaria)EHEC病例增加，至少有45例嚴(yán)重的導(dǎo)致HUS的感染，伴有7人死亡(l8)。估計(jì)大約15例EHEC感染中的1例導(dǎo)致HUS，可推測(cè)大約600-700受影響的個(gè)體。
在大多數(shù)報(bào)道的發(fā)病中，消費(fèi)被污染的切碎的牛肉是感染的來源(5，8，19-22)，而在日本懷疑為幼茶(10)。EHEC已被從牛奶(6，19，23)、水(19)、小雞、豬和蘋果汁(19，24，25)中分離，但也報(bào)道了人平行的污物感染(15)。?？磥砜赡苁莾?chǔ)存庫(22，26)。交叉污染、不當(dāng)?shù)奶幚砗筒贿m宜的烹調(diào)均引起由EHEC導(dǎo)致的食品傳染感染。EHEC產(chǎn)生還已知為vero毒素或細(xì)胞毒素的志賀氏樣毒素(slt)(12，27)。大部分EHEC被發(fā)現(xiàn)屬于O157H7血清型，但值得注意的是，尤其在歐洲還報(bào)道了各種屬于其它血清型(O22，O26，O55，O111O114，O145)的EHEC(12，15，28-32)。
除開EHEC，一些大腸桿菌的其它菌株可導(dǎo)致腸炎或胃腸炎，并被分組在腸產(chǎn)毒性菌(ETEC)(33-36)、腸致病性菌株(EPEC)(37)、腸侵染性菌株(EIEC)(38，39)和腸聚集性菌株(WaggEC)(40，41)。這些菌株為重要的致病原，并且還導(dǎo)致嚴(yán)重的公共健康問題。由于缺乏特異和敏感程序的檢測(cè)方法，對(duì)這些致病原的診斷被極大地忽略了。ETEC合成可導(dǎo)致類似于霍亂弧菌的分泌性腹瀉(“旅行者腹瀉”)的熱不穩(wěn)定的和/或熱穩(wěn)定的腸毒素(36，42，43)。ETEC生物對(duì)腸上皮細(xì)胞的表面附著為毒素產(chǎn)生的先決條件。毒素產(chǎn)生為質(zhì)粒介導(dǎo)的，最通常包括大腸桿菌血清型O6、O15、O124、O136、O143、O145和O147(32)。
EPEC導(dǎo)致主要發(fā)生在嬰兒中的腹瀉癥狀(32)。雖然致病機(jī)理不清楚，腸的上皮降解和在組織切片中觀察到的炎性反應(yīng)可能是由于細(xì)菌的粘附特性的結(jié)果。EPEC的特異性附著因子為質(zhì)粒編碼的(EAF＝EPEC粘附因子)(37，44)。EHEC通常包含與已知為eae的EAF極為相關(guān)的粘附因子(EHEC附著和消除基因)(45，46)。EPEC最通常屬于血清型O6、O8、O25、O111、O119和O142(32)。
EIEC菌株能穿過并侵染腸上皮細(xì)胞并產(chǎn)生類似于由志賀氏細(xì)菌導(dǎo)致的炎性腹瀉(38，47，48)。糞便/污物包含血液、粘液和破碎的嗜中性粒細(xì)胞。EIEC包含編碼另外的致病性因子的毒性質(zhì)粒(48)。血清型O28、O112、O115、O124、O136、O143、O145和O147最常見于EIEC(32)。
EaggEC與幼兒持續(xù)性腹瀉和旅游者腹瀉相關(guān)。EaggEC特征在于其導(dǎo)致Hep-2細(xì)胞聚集的粘附能力。這種作用與毒性質(zhì)粒(pCVD432)的存在相關(guān)。EaggEC被懷疑還產(chǎn)生熱穩(wěn)定腸毒素(EAST1)(49-53)。它們可屬于血清型O44和O126(32)。
用于EHEC的常規(guī)檢測(cè)方法包括用選擇性和/或指示培養(yǎng)基富集和分離，如大腸桿菌培養(yǎng)基、硫酸月桂基酯胰蛋白

4-甲基繖形酰-b-酸肉湯、伊紅亞甲蘭瓊脂、McConkey山梨糖醇瓊脂和溶血素瓊脂(28，32，54-59)。不幸的是，所有這些分析是間接的并缺乏特異性鑒定EHEC或其它致病大腸桿菌菌株的能力。提出了一些生物化學(xué)鑒定和免疫檢測(cè)EHEC的方法(54，60-63)，然而，熟知致病性大腸桿菌菌株不具有或缺乏獨(dú)特的發(fā)酵途徑(58，64)。
由于血清型與致病大腸桿菌類型之間的絕對(duì)的相互關(guān)系不能確定，因此血清分型不是令人確信的(12，27，32，58，65)。
已建立了用于實(shí)驗(yàn)研究的DNA雜交技術(shù)，但其不能適用于大規(guī)模的常規(guī)診斷方法(66，67)。報(bào)道了基于DNA擴(kuò)增的使用PCR的分析法(68-72)。這些方法的局限包括麻煩的后PCR檢測(cè)方法(瓊脂糖電泳，生物素/抗生物素蛋白基ELISA檢測(cè)系統(tǒng))。
為了克服這些問題，開發(fā)了能特異性測(cè)定EHEC、ETEC、EPEC、EIEC和EaggEC特有的毒性因子的基于PCR擴(kuò)增的熒光原檢測(cè)法的PCR分析法。
該分析法利用Taq-DNA聚合酶5’-3’外切酶活性(73)以裂解在5’和3’末端分別與熒光報(bào)道染料(例如6-羧基-熒光素[FAM]；λem＝518nm)和熒光猝滅染料(6-羧基四甲基羅丹明[TAMRA]；λem＝582nm)共價(jià)結(jié)合的內(nèi)部寡核苷酸探針。同時(shí)通過完整的探針分子TAMRA有效地猝滅來自FAM的熒光(76)。在發(fā)生關(guān)聯(lián)PCR擴(kuò)增的情況下，Taq聚合酶從特定的PCR引物延伸并裂解對(duì)模板鏈退火的內(nèi)部熒光原寡核苷酸探針。因此，報(bào)道染料和猝滅染料被從空間上分開。作為寡核苷酸的水解和報(bào)道染料和猝滅染料的物理分離的結(jié)果，可在518nm處觀察到可測(cè)定的熒光強(qiáng)度的增加。PCR循環(huán)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物和隨后的熒光強(qiáng)度的指數(shù)增加。
在不打開PCR試管時(shí)能測(cè)定熒光信號(hào)的光學(xué)試管中進(jìn)行TaqManTM-PCR。這大大最小化了后PCR加工時(shí)間并幾乎完全消除了交叉PCR污染問題。采用這種方法，可在18小時(shí)內(nèi)半自動(dòng)同時(shí)進(jìn)行生物物質(zhì)的大腸桿菌菌株和帶有毒性基因的其它腸細(xì)菌的毒性基因的存在的檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明，提供用于檢測(cè)致病性大腸桿菌的TaqManTM-PCR，使得首次在常規(guī)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)了EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、EaggEC和相關(guān)的帶有這些毒性基因的腸細(xì)菌的特異性、快速和高處理量的常規(guī)檢測(cè)。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種快速、高效用于檢測(cè)和鑒定生物樣品中的致病性大腸桿菌的分析法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可用于編碼致病性大腸桿菌特有的毒性因子/毒素的序列擴(kuò)增的特異性、優(yōu)化引物和標(biāo)記的寡核苷酸探針。
發(fā)明概述本發(fā)明尤其單獨(dú)包括下面或其組合一種檢測(cè)樣品中致病性大腸桿菌的方法，包括使用選自下面的一組特異于產(chǎn)毒性大腸桿菌毒性因子/毒素的寡核苷酸引物將從所述樣品分離的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增與編碼熱不穩(wěn)定毒素或熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的用于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的基因雜交的引物；
與編碼熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；與pCVD432質(zhì)粒雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；與inv質(zhì)粒雜交的用于在腸侵染性大腸桿菌中含有的DNA序列擴(kuò)增的引物；與EAF質(zhì)?；騟ae基因雜交的用于腸致病性特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；和/或與編碼志賀氏樣毒素slII或sltII的基因雜交的用于腸出血性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物，接著使用常規(guī)方法檢測(cè)和鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物；如上的方法，其中與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的熱不穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3′和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產(chǎn)毒素性大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-25′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質(zhì)粒雜交的引物組為EA-15′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv-質(zhì)粒雜交的引物組為
EI-15′TTT CIG GAI GGI AIG GIG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質(zhì)粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae基因雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與編碼志賀氏樣毒素SltI的基因雜交的引物為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；和與編碼志賀氏樣毒素SltII的基因雜交的引物為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SltII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T；如上方法，其中具有另外的5’-3’外切酶活性的聚合酶被用于DNA的擴(kuò)增，并且在大多數(shù)5’堿基被熒光染料，在大多數(shù)3’堿基被熒光猝滅染料標(biāo)記的在靶DNA中雜交的寡核苷酸探針包括在擴(kuò)增方法中；所述標(biāo)記的寡核苷酸探針易受由所述DNA聚合酶的5’-3’外切酶降解以產(chǎn)生可通過熒光原檢測(cè)方法檢測(cè)的片段；如上方法，其中用于檢測(cè)腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的熱不穩(wěn)定毒素的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′；用于檢測(cè)腸產(chǎn)毒素大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素的標(biāo)記的寡核苷酸探針為
5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′；用于檢測(cè)腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′；用于檢測(cè)pCVD432質(zhì)粒的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′；用于檢測(cè)inv質(zhì)粒的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′用于檢測(cè)EAF質(zhì)粒的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′；用于檢測(cè)eae基因的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′；用于檢測(cè)志賀氏樣毒素SltI基因的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′；和用于檢測(cè)志賀氏樣毒素SltII基因的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′；
上述方法，其中熒光報(bào)道染料為6-羧基熒光素(fluoroscein)、四氯-6-羧基熒光素或六氯-6-羧基熒光素，而熒光猝滅染料為6-羧基四甲基羅丹明；上述方法，其中PCR擴(kuò)增方法由在MgCl2濃度為5.2mmol，55℃退火溫度和65℃延伸溫度下進(jìn)行的35次PCR循環(huán)組成；可用于致病大腸桿菌的毒性因子/毒素特異性的DNA的PCR擴(kuò)增的一組引物選自下面與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素或熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的一組引物；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的一組引物；與編碼腸聚集性大腸桿菌的pCVD432質(zhì)粒雜交的一組引物；與腸侵染性大腸桿菌的inv質(zhì)粒雜交的一組引物；與腸致病性大腸桿菌的EAF質(zhì)粒，或eae基因雜交的一組引物；與編碼腸出血性大腸桿菌的志賀氏樣毒素sltI或sltII的基因雜交的一組引物；上述的引物組，其中與編碼腸產(chǎn)毒素大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產(chǎn)毒素大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-2；5′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質(zhì)粒雜交的引物組為
EA-1；5′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv質(zhì)粒雜交的引物組為EI-15′TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質(zhì)粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae基因雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與志賀氏樣毒素sltI基因雜交的引物組為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；和與志賀氏樣毒素sltII雜交的引物組為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SItII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAA KCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。
上述引物除開用于靶DNA擴(kuò)增的引物外還包含在大多數(shù)5’堿基被熒光報(bào)道染料，如6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素標(biāo)記，在大多數(shù)3’堿基被熒光猝滅染料，如6-羧基四甲基羅丹明標(biāo)記的標(biāo)記寡核苷酸探針，并具有選自下面的核苷酸序列5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′其與編碼腸產(chǎn)毒素大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素的基因雜交；5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′其與編碼腸產(chǎn)毒素大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交；5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′其與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交；5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′其與pCDV432質(zhì)粒雜交；5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′其與inv質(zhì)粒雜交；5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′其與EAF質(zhì)粒雜交；5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′其與eae基因雜交；5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′其與志賀氏樣毒素SltI基因雜交；和5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′
其與志賀氏樣毒素SltII基因雜交；上述方法在診斷活動(dòng)物體，包括人的大腸桿菌感染中的用途，或在診斷消費(fèi)品，如肉、奶和蔬菜的大腸桿菌污染中的用途。
本發(fā)明用于檢測(cè)PCR擴(kuò)增的常規(guī)方法是費(fèi)力的，采用可能的致癌物質(zhì)(溴化乙啶凝膠電泳)，并且不適宜作為微生物常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)分析法(68-72)。這提出一個(gè)嚴(yán)重的問題，尤其當(dāng)由于特征性的生物化學(xué)、血清學(xué)和/或形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)不能將可能的致病細(xì)菌與兼性致病或非致病細(xì)菌區(qū)分時(shí)。因此，直接檢測(cè)這些種類擁有的毒性因子或毒素的特定的基于核酸的診斷方法是必須遵循的。這主要對(duì)于致病性大腸桿菌細(xì)菌的診斷是這種情況。EHEC、EPEC、EIEC、ETEC和EaggEC的生物化學(xué)特性不是獨(dú)特的，不能被用于將它們從其它大腸桿菌菌株分開中(54，60-62)。而且，也可在其它腸細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的毒性質(zhì)粒(38，48，83，88，89)。由于各異的血清學(xué)特性，通過血清分型鑒定致病性大腸桿菌也不是準(zhǔn)確的鑒定方法(12，15，28-32)。使用特征性毒性因子和/或毒素基因特異性的探針的傳統(tǒng)的菌落雜交分析法是麻煩和費(fèi)時(shí)的(66，67)。為了證實(shí)是否發(fā)生了靶基因的特異性擴(kuò)增，傳統(tǒng)的PCR方法需要各種后PCR步驟(68-72)。TaqManTM-PCR檢測(cè)體系(74，75，90)實(shí)現(xiàn)了快速、特異性、敏感和高產(chǎn)率的用于區(qū)分致病性大腸桿菌細(xì)菌和其它大腸桿菌菌株的診斷法。該分析法具有定量起始靶序列的能力。由于在PCR循環(huán)后，PCR反應(yīng)的試管不被打開，交叉PCR污染的可能的危險(xiǎn)幾乎可以忽略。96個(gè)樣品的掃描時(shí)間約為8分鐘，可用可商購的鋪展片程序(spred sheet porgram)自動(dòng)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算。因此，整個(gè)后PCR加工時(shí)間被縮至最短。
TaqManTM體系依賴于加入特定的內(nèi)部熒光原寡核苷酸探針的標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)。由于非特異性PCR擴(kuò)增極不可能產(chǎn)生陽性熒光信號(hào)，因此常規(guī)PCR與內(nèi)雜交的寡核苷酸探針的Taq聚合酶依賴性降解結(jié)合還使該檢測(cè)方法具有特異性。必須遵循選擇熒光原探針的一些規(guī)則(74，75)。標(biāo)準(zhǔn)是探針的長度、報(bào)道和猝滅染料的位置和在5’-末端不存在鳥苷(74)。而且，探針距一個(gè)特異性PCR引物的距離是非常重要的。這是由于探針必須對(duì)模板鏈退火以被Taq聚合酶裂解。由于退火至少部分依賴于探針的Tm，因此探針被設(shè)計(jì)具有如引物的較高的Tm。根據(jù)本發(fā)明，這通過設(shè)計(jì)比特異性引物長3-6個(gè)bp的探針而得以解決(除開sltII)。PCR擴(kuò)增包括引物退火后的靶序列的延伸，并且延伸引物的Tm增加。對(duì)于其中3’末端被加帽以避免延長的熒光原寡核苷酸，Tm保持恒定，這使得在被Taq聚合酶降解前探針更可能解離。寡核苷酸探針的降解可通過熒光原探針和引物的空間鄰近最優(yōu)化。通過將sltI的探針從距引物121bp移至距其9bp，可獲得ΔRQ值的顯著提高。第二種優(yōu)化TaqManTM-PCR的方法是在65℃下進(jìn)行PCR延伸，其中在Taq聚合酶到達(dá)并與其雜交之前探針也不太可能從模板上解離。ΔRQ值因此可再次增加1.2-1.5倍。ΔRQ值的增加可能是由于Taq聚合酶獲得的退火的寡核苷酸探針的比例或由于Taq聚合酶的增加的持續(xù)合成能力。
熒光原探針的濃度影響TagManTM結(jié)果的準(zhǔn)確性。當(dāng)探針濃度大于50pmol/PCR反應(yīng)時(shí)，僅相對(duì)小的部分被Taq聚合酶水解。未降解探針與降解探針的比例仍然高，并且未猝滅的報(bào)道染料的熒光發(fā)射相對(duì)于仍接近猝滅報(bào)道染料的報(bào)道染料的熒光強(qiáng)度沒有明顯增加。因此，在高的探針濃度下，ΔRQ值比使用中間探針濃度(10-20pmol)的低。當(dāng)探針濃度太低時(shí)，ΔRQ值增加，然而，PCR結(jié)果的可變性增加，因?yàn)榭赡芪〉男〉恼`差或PCR反應(yīng)間的最小的差異變得為關(guān)鍵。產(chǎn)生最小可變性和最高RQ值的最佳探針濃度被發(fā)現(xiàn)為20pmol的探針濃度。
由于TaqManTM-PCR使用內(nèi)部寡核苷酸探針用于模板擴(kuò)增的檢測(cè)，可廣泛設(shè)計(jì)特異性引物和探針。當(dāng)存在給定基因的核苷酸序列變異體時(shí)，引物和探針序列的設(shè)計(jì)尤其重要。對(duì)于sltI和sltII就是這種情況。對(duì)于sltI，對(duì)比所有公開的序列，設(shè)計(jì)引物和探針以與所有三種變異體的保守區(qū)結(jié)合。對(duì)于sltII，公開基因的僅一個(gè)區(qū)是保守的，因此，該區(qū)被選擇用于熒光原寡核苷酸探針。用于sltII擴(kuò)增的引物被設(shè)計(jì)在公開的sltII變異體的不確定的位置包含所有可能的核苷酸序列(簡(jiǎn)并引物方法)(79-83)。通過采用簡(jiǎn)并引物，可在一個(gè)PCR反應(yīng)中檢測(cè)所有公開的變異體。
模板DNA的分離方法影響PCR的進(jìn)行。比較了適宜作為用于常規(guī)應(yīng)用的快速純化步驟的兩種方法，即煮沸制備法或自旋(spin)制備法。煮沸制備物可能仍然包含一些可影響PCR反應(yīng)的細(xì)菌成分，然而，它極為迅速。自旋制備法包括起從可能的陰性影響物質(zhì)中純化DNA作用的分離步驟。與當(dāng)通過自旋制備法制備模板DNA的煮沸制備法比較，來自腸細(xì)菌的毒性基因的ΔRQ值和TaqManTM-PCR的敏感性未發(fā)現(xiàn)明顯增加。
TaqManTM-PCR對(duì)所有引物/探針結(jié)合的總的敏感性可與通過用溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的PCR產(chǎn)物的視覺值相比。在優(yōu)化的條件下，每次PCR反應(yīng)可在107非致病性大腸桿菌中檢測(cè)到少如103的較小的cfusltI+EHEC。
由于第一種產(chǎn)生slt的菌株被發(fā)現(xiàn)為O157H7陽性(1，2)，免疫磁檢測(cè)法在大腸桿菌O157中的使用(54，91)被提出作為通過富集這種血清型而提高EHEC診斷靈敏性的方法。然而，顯然為O157抗原陰性的EHEC被這種方法遺漏。在最近EHEC分離物的血清分型研究中，這變得很顯然，即與非O157EHEC比較，目前O157+EHEC的數(shù)目少(12，15，28，29，31)。在德國南部進(jìn)行的最近的一個(gè)研究中，13種分離物中的僅2種為O157陽性(92)。目前未能獲得用于其它O血清學(xué)的免疫磁檢測(cè)方法。而且，在毒性基因分析之前，在偏磁富集方法的情況下，可帶有志賀氏樣毒素的如檸檬酸桿菌屬(83)和腸細(xì)菌屬(89)的其它腸細(xì)菌將被遺漏。因此，被設(shè)計(jì)用于所有腸細(xì)菌中的毒性基因檢測(cè)的TaqManTM-PCR基PCR看來是優(yōu)良的。
大部分腹瀉疾病的感染劑是未知的。對(duì)胃腸道中的細(xì)菌致病原的常規(guī)篩選包括沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、志賀氏菌(S.aureus)、彎曲桿菌屬、弧菌屬、耶爾森氏菌屬和(C.difficile)(32)。熟知致病性大腸桿菌，如ETEC、EHEC、EIEC和EaggEC是重要的下胃腸道致病原，并因此可能明顯影響腹瀉感染的次數(shù)(32)。然而，未進(jìn)行這些細(xì)菌的常規(guī)細(xì)菌診斷方法，而且，在大多數(shù)情況下，這些致病性大腸桿菌被誤診為非致病性共生菌群類型。為了解決這個(gè)問題，開發(fā)了一組特異性引物和熒光原探針并優(yōu)化用于由這些細(xì)菌帶有的毒性因子的TaqManTM-PCR基檢測(cè)(表2和3)。在標(biāo)準(zhǔn)96井微量滴定的排列中，排列病人樣品、所有8個(gè)檢測(cè)的毒性基因的陽性和無模板對(duì)照，可獲得在5小時(shí)中從樣品DNA制備至熒光測(cè)定的來回時(shí)間。因此，用于致病性大腸桿菌的TaqManTM-PCR基分析提供一種極迅速的診斷這些細(xì)菌的方法。在準(zhǔn)確、靈敏和具特異性的同時(shí)，與常規(guī)方法相比，這種分析法需要最少的后PCR加工時(shí)間。當(dāng)在光學(xué)試管中進(jìn)行TaqManTM-PCR時(shí)，而且PCR反應(yīng)與擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉反應(yīng)的危險(xiǎn)被降至最小。致病性腸細(xì)菌帶有的毒性質(zhì)粒的檢測(cè)可證實(shí)這些細(xì)菌在宿主中導(dǎo)致疾病的能力。不清楚是否包含毒素基因或附著因子的腸細(xì)菌也通常在宿主外表達(dá)它們。這可能是為什么在許多包含EHECs的sltI和sltII可通過基于核酸的方法檢測(cè)的HUS情況下，對(duì)志賀氏樣毒素的ELISA試驗(yàn)可能是陰性的的一種解釋。
接著在用于測(cè)定在7個(gè)月中從在規(guī)定的地理區(qū)域(Bavaria南部)患有腹瀉的兒童中獲得的底樣(stool samples)的常規(guī)診斷方法中檢測(cè)用于致病性大腸桿菌檢測(cè)的根據(jù)本發(fā)明的TaqManTM-PCR分析。將通過TaqManTM-PCR獲得的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的用于PCR產(chǎn)物檢測(cè)的方法比較(溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠電泳)。分析100個(gè)底樣(表4)。22％的樣品對(duì)于一種或多種毒性因子被發(fā)現(xiàn)檢測(cè)為陽性。具有2例EHEC、5例ETEC、8例EaggEC、1例EIEC和16例EPEC。這指1/5患有腹瀉的兒童可能患有由致病性大腸桿菌導(dǎo)致的腹瀉。這些數(shù)目比所有其它常規(guī)篩選的細(xì)菌胃腸道致病原組高很多。在這組中觀察到僅2例沙門氏菌并且沒有彎曲菌。
令人感興趣的是，診斷帶有EHEC的兩名兒童為嚴(yán)重患病，一名患有出血性結(jié)腸炎，另一名發(fā)展成HUS，并被在危重監(jiān)護(hù)病房中治療。
總的來講，這些研究表明在兒童中以及還在成人中的大部分腹瀉疾病與在標(biāo)準(zhǔn)微生物方法中被誤診為共生菌群的致病性大腸桿菌相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的TaqManTM方法首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)這些重要的致病原的直接、快速、特異和敏感檢測(cè)。而且，用該方法檢測(cè)的毒性基因不局限于大腸桿菌，它們還可自由地轉(zhuǎn)移至其它腸細(xì)菌中。對(duì)這些細(xì)菌中的毒性基因的檢測(cè)還通過本文公開的TaqManTM-PCR檢測(cè)。該分析法僅需要最少的后PCR檢測(cè)時(shí)間，因此可在18小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，并且消除了PCR交叉污染的問題。
根據(jù)本發(fā)明，大腸桿菌毒性因子/毒素基因被用作PCR擴(kuò)增的靶。根據(jù)公開的序列設(shè)計(jì)PCR引物和熒光原探針。特別選擇了用于大腸桿菌和相關(guān)腸細(xì)菌致病組檢測(cè)的八個(gè)不同的引物和探針組，參見表1。
在表2中詳細(xì)描述了引物的序列和它們的位置以及GenBank登記號(hào)。EHEC sltI的檢測(cè)是基于sltI同源基因排序后的共有引物和探針序列(GenBank登記號(hào)Z36899，Z36900和Z36901)(77，78)。sltII變異體的檢測(cè)是基于同源基因的公開的序列(GernBank登記號(hào)M76738，Z37725，L11079，X67515，M59432，M29153，M36727和M21534)(79-83)。對(duì)于sltI的擴(kuò)增，降解的引物組證實(shí)是最佳的。ETEC的診斷是基于熱不穩(wěn)定(LT)(84)或熱穩(wěn)定毒素(ST)(36)的擴(kuò)增，EaggEC基于pCVD432質(zhì)粒序列(40，50)、EIEC基于inv質(zhì)粒序列(38，48)、EPEC基于大腸桿菌附著和脫落基因(EAF質(zhì)粒)(37，85)或?qū)τ贓HEC附著和脫落蛋白為大腸桿菌基因(eae)(86)。使用大腸桿菌parC基因特異性引物進(jìn)行完整DNA制備物的PCR對(duì)照擴(kuò)增(拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，Genbank登記號(hào)M58408)(87)。
寡核苷酸探針和它們的Genbank參考示于表3中。將寡核苷酸探針設(shè)計(jì)成GC含量為40-60％，在5’末端沒有G核苷酸，探針長度為27至30bp。探針在大多數(shù)5’和大多數(shù)3’堿基處分別與熒光報(bào)道染料(例如6-羧基-熒光素[FAM]；λem＝518nm)和熒光猝滅染料(6-羧基四甲基乙基羅丹明[TAMRA]；λem＝582nm)共價(jià)結(jié)合。所有引物和探針從Perkin Elmer，德國獲得。
通過從帶有LT、ST、inv-質(zhì)粒、pCVD342、EAF、eae、sltI和sltII基因的大腸桿菌對(duì)照菌株中分離DNA來優(yōu)化TaqManTM-PCR(參見表1)。為了最大PCR產(chǎn)物產(chǎn)率(如瓊脂糖凝膠電泳所證實(shí))和RO值(RQ＝FAM熒光強(qiáng)度/TAMRA熒光強(qiáng)度)使用上述致病性大腸桿菌對(duì)照菌株調(diào)節(jié)MgCl2濃度。在5.2mmol的MgCl2濃度、35次循環(huán)、55℃的退火溫度和65℃的延伸溫度下獲得所使用的所有引物/熒光探針的最佳PCR反應(yīng)。65℃的延伸溫度被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生較高的RQ值，這可能是由于在Taq聚合酶降解前較低的模板/熒光探針解離速率。
大腸桿菌sltI基因被用作建立PCR和分析探針相對(duì)于PCR引物的不同位置的靶序列。引物被設(shè)計(jì)在sltI基因的保守區(qū)退火(參見上文)。比較位于引物上游132bp的sltI和位于距引物21bp的sltI-N1兩個(gè)探針。用探針sltI-N1(RQm＝6.3800)獲得的RQ值被可重復(fù)性地發(fā)現(xiàn)比在相同的大腸桿菌sltI對(duì)照DNA的模板濃度下用探針sltI-NO(RQm＝0.9620)產(chǎn)生的RQ值。通常，而且緊鄰(4-20bp)兩個(gè)PCR引物中的一個(gè)的其它靶基因特異的探針一致產(chǎn)生比位于聚引物更遠(yuǎn)距離的探針更高的RQ值。
由于報(bào)道了粗的細(xì)菌裂解物可包含可能干擾PCR進(jìn)行的抑制因子，因此檢測(cè)了DNA制備對(duì)進(jìn)行TaqManTM-PCR的影響。因此，在McConkey平板上培養(yǎng)過夜后收集細(xì)菌。通過煮沸接種在0.9％NaCl溶液中的細(xì)菌或通過用商業(yè)上的自旋制備法(參見實(shí)施例，材料和方法)分離基因組DNA來制備DNA。當(dāng)比較兩種制備法時(shí)，TaqManTM-PCR的RQ值和靈敏度沒有不同。從來自105包含通過煮沸或通過自旋制備法制備的EHEC的sltI或sltII的DNA的PCR擴(kuò)增獲得的RQ值是可相比較的。
TaqManTM-PCR法依賴于水解后從探針釋放的游離的報(bào)道染料(FAM)的檢測(cè)。因此，探針濃度也應(yīng)通過影響在PCR循環(huán)中降解的探針部分對(duì)分析的進(jìn)行產(chǎn)生影響。在100pmol-0.1pmol范圍內(nèi)滴定探針的濃度并測(cè)定ΔRQ值。取決于擴(kuò)增的靶基因，最佳探針濃度在10pmol至20pmol之間變化。
為了檢測(cè)TaqManTM-PCR法的靈敏度，以對(duì)數(shù)步驟稀釋將包含sltI或sltII的EHEC稀釋在包含為107cfu的大腸桿菌菌株ATCC11775的懸液中。在最佳條件下進(jìn)行PCR，將來自溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠的結(jié)果與TaqManTM結(jié)果比較。包含sltI的EHEC菌株的最小檢測(cè)極限在107中為103cfu。對(duì)于sltII檢測(cè)極限，發(fā)現(xiàn)在107腸細(xì)菌中為103.5cfu。通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)和通過TaqMan方法對(duì)一個(gè)信號(hào)的測(cè)定這兩種方法產(chǎn)生可相比較的結(jié)果，即在瓊脂糖凝膠中可見ΔRQ值在ΔRQ閾值之上的PCR產(chǎn)物帶，而且也在瓊脂糖凝膠中ΔRQ值在ΔRQ閾值周圍的PCR產(chǎn)物在檢測(cè)極限之下。在對(duì)于所有毒性因子/毒素的最佳檢測(cè)試驗(yàn)后，建立TaqManTM-PCR用于對(duì)常規(guī)生物樣品的致病性大腸桿菌的存在的檢測(cè)中。將TaqManTM-PCR結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行比較。
下面的實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明。然而，它不被認(rèn)為是限制性的。
實(shí)施例1.使用根據(jù)本發(fā)明的方法檢測(cè)來自患有腹瀉的兒童的底樣中的致病性大腸桿菌的流行為了說明TaqManTM-PCR的進(jìn)行和檢測(cè)致病性大腸桿菌的出現(xiàn)，對(duì)100份來自0至10歲的具有臨床腹瀉癥狀的兒童的底樣進(jìn)行篩選。在下面第2項(xiàng)中將詳細(xì)描述試驗(yàn)中所采用的材料和方法。
從1996年6月至10月進(jìn)行樣品的收集。本研究中的所有樣品來自Bavaria南部區(qū)。將底樣鋪在McConkey瓊脂上，保溫過夜并收集腸細(xì)菌。分離DNA并用作包含sltI、sltII、LT、ST、EAF質(zhì)粒、eae基因、inv質(zhì)粒和pCVD432特異性的引物和熒光探針的PCR反應(yīng)中的模板。為了證實(shí)來自各制備的DNA的完整性，建立包含用于大腸桿菌parC基因擴(kuò)增的引物和內(nèi)熒光探針的對(duì)照PCR反應(yīng)。作為陽性分析對(duì)照，在各分析中進(jìn)行一個(gè)PCR反應(yīng)，其中存在來自陽性對(duì)照菌株的DNA的各毒性因子/毒素。使用該可靠的方法，可獲得所有靶基因的特異和靈敏的檢測(cè)。對(duì)100個(gè)來自患有腹瀉的兒童的底樣的系統(tǒng)分析產(chǎn)生22個(gè)樣品，其中可檢測(cè)三分之一或三分之二的致病性大腸桿菌毒性因子/毒素。詳細(xì)地說，2名病人帶有EHEC(一名帶有出血性結(jié)腸炎，以名發(fā)展成HUS)。3名病人檢測(cè)為ETEC陽性，16名為EPEC陽性，1名為EIEC陽性和8名為EaggEC陽性(參見表4)。患有出血性結(jié)腸炎的病人被檢測(cè)為sltI和eae陽性，發(fā)展成HUS的病人檢測(cè)為sltI，SltII，和eae陽性。一名病人同時(shí)帶有 ETEC(LT+，ST+)，EPEC(eae+)和EaggEC(pCVD342+)，一名病人被檢測(cè)為EIEC(inv+)和EaggEC(pCVD342)陽性，兩份底樣包含EPEC(eae+)和EaggEC(pCVD342)。
將來自帶有EHEC的兩名病人的腸細(xì)菌與sltI和sltII基因探針雜交以檢測(cè)TaqManTM-PCR的準(zhǔn)確性和特異性。在其中TaqManTM-PCR為sltI陽性的病人1的情況下，可僅發(fā)現(xiàn)與sltI雜交的菌落。其中TaqManTM-PCR為sltI、sltII陽性的病人2的菌落與用于sltI和sltII的探針雜交。挑取陽性菌落，生物化學(xué)定型為大腸桿菌。
抗體敏感性檢測(cè)表明EHEC菌株對(duì)廣譜青霉素、頭胞菌素和回旋酶抑制劑敏感。
2.材料和方法a)細(xì)菌菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)和DNA制備為了準(zhǔn)確的PCR擴(kuò)增，許多EHEC、ETEC、EPEC、EIEC和EaggEC大腸桿菌菌株被用作對(duì)照，它們由H.Karch，Wurzburg，德國和H.Beutin，柏林，德國(參見表1)友善提供。作為不帶有這些毒性基因的菌株，使用大腸桿菌ATCC11775。為了TaqManTM-PCR的最優(yōu)化，37℃下，在McConkey瓊脂上(Becton Dickinson，德國)培養(yǎng)陽性對(duì)照。過夜培養(yǎng)后，收集細(xì)菌并重新懸浮于0.9％NaCL溶液中。將濁度調(diào)至McFarland0.5。通過煮沸(95℃，10分鐘)制備或使用QiaAmp組織試劑盒自旋制備柱(Qiagen，德國)分離DNA。10ul DNA懸液被用于PCR。在將適宜量的用于鋪展在mcConkey平板上后，進(jìn)行來自人或牛的底樣的致病性大腸桿菌的檢測(cè)。過夜培養(yǎng)后，收集來自McConkey平板的表面的所有細(xì)菌菌落并如上所詳細(xì)描述地進(jìn)行處理。
b)PCR循環(huán)在薄壁的0.2ml“光學(xué)PCR試管”中，在70ul最終體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)(Perkin Elmer，德國)。反應(yīng)混合物包含10ul細(xì)菌裂解液，5.25ul 25mmol MgCl2，7ul 10×PCR緩沖液，40pmol引物，20pmol特異性熒光探針，150uM各種dATP，dTTp，DGTP，dCTP(Perkin Elmer)，1UAmpliTaq-聚合酶(Perkin Elmer)。Perkin Elmer 9600型熱循環(huán)儀被用于PCR循環(huán)。通過94℃下加熱5分鐘進(jìn)行細(xì)菌DNA的起始變性。所有循環(huán)均包括94℃，15秒的變性步驟，55℃，30秒的退火和65℃，30秒的延伸。進(jìn)行35次循環(huán)。
c)后PCR加工循環(huán)完成后，使用裝有平板計(jì)數(shù)器的Perkin Elmer LS50B發(fā)光分光光度計(jì)測(cè)定報(bào)道染料，F(xiàn)AM和猝滅染料，TAMRA的熒光強(qiáng)度并在光學(xué)試管中校正PCR反應(yīng)的熒光測(cè)定值。如(74)所描述地計(jì)算ΔRQ值。根據(jù)三份無模板對(duì)照的平均值之上的99％置信區(qū)間計(jì)算ΔRQ閾值值(ΔRQ閾值＝6,95×std無模板對(duì)照的平均值)。如果給出ΔRQ樣品＞ΔRQ閾值，PCR反應(yīng)被計(jì)為陽性。為了證實(shí)TaqManTM-PCR測(cè)定的靈敏度，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將15ul樣品與2ul樣品緩沖液一起上樣。在2％包含溴化乙啶的瓊脂糖凝膠中以100V，35分鐘將PCR產(chǎn)物分離。在紫外線下可見DNA，使用EagleEyeII系(Stratagene)獲得數(shù)字圖象資料。
d)PCR擴(kuò)增的證實(shí)將從各陽性對(duì)照菌株的模板獲得的PCR產(chǎn)物直接亞克隆至TA克隆載體中(Invitrogen，德國)以證實(shí)PCR擴(kuò)增的特異性。在用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染(CaCl2方法)DH5α細(xì)菌后，在包含青霉素(Sigma，德國)的LB平板中選擇包含質(zhì)粒分細(xì)菌。用Qiagen DNA純化柱(Quiagen，德國)純化質(zhì)粒DNA。采用與4種染料結(jié)合的二脫氧核苷酸對(duì)插入物進(jìn)行PCR循環(huán)測(cè)序(DNA染料終止子循環(huán)測(cè)序試劑盒，Perkin Elmer，德國)。用AppliedBiosystems373A型號(hào)(Applied BioSystems，德國)獲得序列。使用McDNAsis程序(Appligene，英國)將插入序列與如表1所參考的公開序列比較。序列比較證實(shí)PCR產(chǎn)物與各毒性因子或毒素相同。
e)TaqManTM技術(shù)的靈敏度為了確定TaqManTM方法的靈敏度，在包含107cfu大腸桿菌參考菌株ATCC11775的溶液中進(jìn)行陽性對(duì)照菌株的系列對(duì)數(shù)步驟的稀釋。通過煮沸法(參見上文)制備或通過使用設(shè)計(jì)用于基因組細(xì)菌DNA分離的自旋制備柱(Qiagen，德國)純化DNA。純化根據(jù)制造商的方法進(jìn)行。使用在107大腸桿菌中為103cfu和在107大腸桿菌中為103.5cfu檢測(cè)包含sltI的菌株和和sltIII的菌株的檢測(cè)極限。
f)菌落雜交和EHEC細(xì)菌的分離將EHEC細(xì)菌菌株和來自在sltI或sltIITaqManTM-PCR中檢測(cè)為陽性的病人的底樣進(jìn)行菌落雜交。簡(jiǎn)單地說，將細(xì)菌平板接種在McConkey瓊脂平板上以致可見單個(gè)菌落。將細(xì)菌在尼龍膜(Genescreen Plus，NEN，德國)上進(jìn)行印跡，裂解(1％SDS)，變性(0.5M NaOH，1.5M NaCl)，中和(1MTRIS，1.5M NaCl)，并洗滌(20×SSC)。80℃下將膜烘焙2小時(shí)。sltI或sltII特異性DNA探針被熒光素(Gene-Images隨機(jī)引物標(biāo)記模件，Amersham，德國)標(biāo)記。此后，將濾器與標(biāo)記的探針雜交。通過采用抗FITC過氧化物酶mAb和ECL檢測(cè)模件(Gene-Images CDP-Star檢測(cè)模件，Amersham，德國)的非放射性檢測(cè)系統(tǒng)證實(shí)雜交。挑取與探針和非雜交菌落雜交的細(xì)菌菌落，通過TagMan-PCR證實(shí)并檢測(cè)抗生物素敏感性。
抗生物素敏感性試驗(yàn)在菌落雜交中檢測(cè)了sltI或sltII或兩者毒性基因后，從McConkey平板中挑取EHEC和非EHEC大腸桿菌，并根據(jù)腸細(xì)菌的NCCLS指南進(jìn)行MIC試驗(yàn)。

表1大腸桿菌菌株-毒性因子/毒性


表2用于致病性大腸桿菌檢測(cè)的引物。W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。

表3用于致病性大腸桿菌檢測(cè)的TaqManTM探針

表4患有腹瀉的兒童底樣中的致病性大腸桿菌的頻率。
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權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)樣品中致病性大腸桿菌的方法，包括使用一組致病性大腸桿菌的毒性因子/毒素特異性的寡核苷酸引物將從所述樣品中分離的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物選自與編碼熱不穩(wěn)定毒素，或熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的用于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；與編碼熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；與pCVD432質(zhì)粒雜交的用于腸聚集性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；與inv質(zhì)粒雜交的用于腸侵染性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；與EAF質(zhì)?；騟ae基因雜交的用于腸致病性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物；和/或與編碼志賀氏樣毒素sltI或sltII的基因雜交的用于腸出血性大腸桿菌特有的DNA序列擴(kuò)增的引物，接著使用常規(guī)方法檢測(cè)和鑒定擴(kuò)增的產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的熱不穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3′和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-25′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質(zhì)粒雜交的引物組為EA-15′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv質(zhì)粒雜交的引物組為EI-15′TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質(zhì)粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae質(zhì)粒雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與編碼志賀氏樣毒素sltI的基因雜交的引物組為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′uTCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；和與編碼志賀氏樣毒素sltII的基因雜交的引物組為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SltII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAAKCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2的方法，其中具有另外5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶被用于DNA擴(kuò)增中，并且在大多數(shù)5’堿基處被熒光染料標(biāo)記和大多數(shù)3’堿基出被熒光猝滅染料標(biāo)記的在靶DNA中雜交的寡核苷酸探針包括在擴(kuò)增方法中；所述標(biāo)記的寡核苷酸探針對(duì)由所述聚合酶的5’-3’外切核酸酶降解敏感以產(chǎn)生可通過熒光原檢測(cè)法檢測(cè)的片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中用于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的熱不穩(wěn)定毒素檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′；用于腸產(chǎn)毒性大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′；用于腸聚集性大腸桿菌特有的熱穩(wěn)定毒素檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′；用于pCVD432質(zhì)粒檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′；用于inv質(zhì)粒檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′用于EAF質(zhì)粒檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′；用于eae基因檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′；用于志賀氏樣毒素sltI基因檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′；和用于志賀氏樣毒素slt II基因檢測(cè)的標(biāo)記的寡核苷酸探針為5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′。
5.根據(jù)權(quán)利要求3-4的方法，其中熒光報(bào)道染料為6-羧基-熒光素、四氯-6-羧基熒光素或六氯-6-羧基熒光素和熒光猝滅染料為6-羧基四甲基羅丹明。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的方法，其中PCR擴(kuò)增方法由MgCl2濃度為5.2mmol，退火溫度為55℃和延伸溫度為65℃的35次PCR循環(huán)組成。
7.可用于致病性大腸桿菌的毒性因子和/或毒素特異性的DNA的PCR擴(kuò)增的一組引物，選自與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素或熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的一組引物；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的一組引物；與腸聚集性大腸桿菌的pCVD432質(zhì)粒雜交的一組引物；與腸侵染性大腸桿菌的inv質(zhì)粒雜交的一組引物；與腸致病性大腸桿菌的EAF質(zhì)粒或eae基因雜交的一組引物；和與編碼腸出血性大腸桿菌的志賀氏樣毒素sltI或sltII的基因雜交的一組引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的引物組，其中與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為LT-15′GCG TTA CTA TCC TCT CTA TGT G3和LT-25′AGT TTT CCA TAC TGA TTG CCG C3′；與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為ST-15′TCC CTC AGG ATG CTA AAC CAG3′和ST-2a5′TCG ATT TAT TCA ACA AAG CAA C3′；與編碼腸聚集性大腸桿菌的熱穩(wěn)定毒素的基因雜交的引物組為EASTI-15′AAC TGC TGG GTA TGT GGC TGG3′和EASTI-25′TGC TGA CCT GCC TCT TCC ATG3′；與pCVD432質(zhì)粒雜交的引物組為EA-15′CTG GCG AAA GAC TGT ATC ATT G3′和EA-25′TAA TGT ATA GAA ATC CGC TGT T3′；與inv質(zhì)粒雜交的引物組為EI-15′TTT CTG GAT GGT ATG GTG AGG3′和EI-25′CTT GAA CAT AAG GAA ATA AAC3′；與EAF質(zhì)粒雜交的引物組為EP-15′CAG GGT AAA AGA AAG ATG ATA AG3′和EP-25′AAT ATG GGG ACC ATG TAT TAT C3′；與eae基因雜交的引物組為EPeh-15′CCC GGA CCC GGC ACA AGC ATA AG3′和EPeh-25′AGT CTC GCC AGT ATT CGC CAC C3′；與編碼志賀氏樣毒素sltI基因雜交的引物組為SltI-15′ATG AAA AAA ACA TTA TTA ATA GC3′和SltI-25′TCA CYG AGC TAT TCT GAG TCA AGC3′；與編碼志賀氏樣毒素sltII的基因雜交的引物組為SltII-15′ATG AAG AAG ATR WTT RTD GCR GYT TTA TTY G3′和SltII-25′TCA GTC ATW ATT AAA CTK CAC YTS RGC AAAKCC3′其中W為A/T，R為A/G，D為A/G/T，Y為C/T和K為G/T。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的引物組，除開用于靶DNA的擴(kuò)增的引物外，它還包含在大多數(shù)5’堿基處被熒光報(bào)告染料，如6-羧基-熒光素、四氯-6-羧基熒光素或六氯-6-羧基熒光素標(biāo)記和在大多數(shù)3’堿基處被熒光猝滅染料如6-羧基四甲基羅丹明標(biāo)記的標(biāo)記的寡核苷酸探針，并且具有選自下面的核苷酸序列5′AGC TCC CCA GTC TAT TAC AGA ACT ATG3′其與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的不穩(wěn)定毒素的基因雜交；5′ACA TAC GTT ACA GAC ATA ATC AGA ATC AG3′其與編碼腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的穩(wěn)定毒素的基因雜交；5′ATG AAG GGG CGA AGT TCT GGC TCA ATG TGC3′其與編碼粘附性大腸桿菌的穩(wěn)定毒素的基因雜交；5′CTC TTT TAA CTT ATG ATA TGT AAT GTC TGG3′其與pCVD432質(zhì)粒雜交；5′CAA AAA CAG AAG AAC CTA TGT CTA CCT3′其與inv質(zhì)粒雜交；5′CTT GGA GTG ATC GAA CGG GAT CCA AAT3′其與EAF質(zhì)粒雜交；5′TAA ACG GGT ATT ATC AAC AGA AAA ATC C3′其與eae基因雜交；5′TCG CTG AAT CCC CCT CCA TTA TGA CAG GCA3′其與志賀氏樣毒素sltI基因雜交；和5′CAG GTA CTG GAT TTG ATT GTG ACA GTC ATT3′其與志賀氏樣毒素sltII基因雜交。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法在診斷包括人的活動(dòng)物體的大腸桿菌感染中或在檢測(cè)消費(fèi)品，如肉、奶和蔬菜的大腸桿菌污染中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)樣品中致病性大腸桿菌的方法,包括使用致病性大腸桿菌特異性的寡核苷酸引物將從所述樣品中分離出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1258320SQ98804409
公開日2000年6月28日 申請(qǐng)日期1998年4月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月22日
發(fā)明者克勞斯·費(fèi)弗 申請(qǐng)人:巴法理安諾迪克研究協(xié)會(huì)有限公司