專利名稱：通過導(dǎo)入矮牽牛屬轉(zhuǎn)錄因子PetSPL2的基因以縮短花序節(jié)間的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼可改變植物特性之轉(zhuǎn)錄因子的基因及其用途，本發(fā)明更具體地涉及得自Petunia hybrida的新基因，即PetSPL2基因，與其相關(guān)的基因，及其用途。
為了闡明控制植物特性，如花的形態(tài)發(fā)生的調(diào)控機制，已使用擬南芥(Arabidopsis thaliana)，金魚草(Antirrhinum majus)和Petunia hybrida進行了分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方面的研究。其中特別優(yōu)選Petunia hybrida用作研究對象是因為下列原因作為園藝植物具有較高價值；種類多樣；易于轉(zhuǎn)化；因其花大而易于觀察；和遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)的積累(H.Takatsuji，“決定植物形狀的分子機制”，細胞技術(shù)，植物細胞技術(shù)系列(SHUJUNSHA)，p96-106)。
已從上述植物的花器官有所改變的突變體中分離出導(dǎo)致突變的基因，結(jié)果，逐漸明白轉(zhuǎn)錄因子在花的分化和形態(tài)發(fā)生方面起著重要的作用，例如，擬南芥的SUPERMAN是具有鋅指基元作為DNA結(jié)合區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子。已知在基因已突變的SUPERMAN突變體中，雄蕊的數(shù)目顯著增加，而雌蕊是有缺陷的(THE IDEN，1997-4(Vol.51，No.4)，p34-38)。
為了理解控制植物特性的機制，重要的是鑒定參與這種控制的新的轉(zhuǎn)錄因子。通過使用基因工程方法可將控制花的形態(tài)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子的基因?qū)胫参?。使用基因?qū)敕ㄋ弥参锏幕ň哂行碌奶匦?，通過常規(guī)的繁殖方法未曾得到或也不可能得到這種新特性。據(jù)認為具有這種新特性的植物具有園藝學(xué)價值。
本發(fā)明的基因所具有的DNA選自a)或b)a)具有序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第190位-第807位之核苷酸序列的DNA；或b)在嚴(yán)格條件下能與a)之DNA雜交，并編碼能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
本發(fā)明的基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子選自i)或ii)i)具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的第1位-第206位之氨基酸序列的轉(zhuǎn)錄因子；或ii)所具有的氨基酸序列為i)中的一個或多個氨基酸缺失，取代或添加所致，并能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子。
在本發(fā)明的一個實施方案中，植物的特性選自植物高度和節(jié)間長度之一。
生產(chǎn)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的方法包括的步驟有將上述基因?qū)胫参锛毎?；和由具有?dǎo)入基因的植物細胞再生植物體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，植物屬于雙子葉植物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，植物屬于茄科。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，植物屬于矮牽牛屬。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，基因被摻入植物表達載體。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是通過上述方法產(chǎn)生的。
因此，本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)提供了編碼能改變植物特性，尤其是植物高度和節(jié)間長度之轉(zhuǎn)錄因子的基因；(2)提供了通過導(dǎo)入基因而生產(chǎn)特性有所改變之植物的方法；和(3)提供了轉(zhuǎn)基因植物。
參照附圖，閱讀并理解下列詳細的描述后，本發(fā)明的這些和其它優(yōu)點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。


圖1表示PetSPL2基因的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列。
圖2圖解表示PetSPL2高表達載體(pBIN-35S-PetSPL2)。
圖3表示檢測被PetSPL2基因轉(zhuǎn)化的Petunia hybrida中PetSPL2基因之mRNA的變性瓊脂糖凝膠電泳圖的放射自顯影。
圖4表示野生型Petunia hybrida(右)和被PetSPL2基因轉(zhuǎn)化的Petunia hybrida(左)的植物體形態(tài)學(xué)圖。
圖5表示野生型Petunia hybrida(左)和被PetSPL2基因轉(zhuǎn)化的Petunia hybrida(右)的節(jié)間圖。
下文中將詳細描述本發(fā)明。
本文所用術(shù)語“轉(zhuǎn)錄因子”指的是與基因的DNA調(diào)控區(qū)域結(jié)合以控制mRNA合成的蛋白質(zhì)。已知一些轉(zhuǎn)錄因子在它們的DNA結(jié)合區(qū)域具有被稱為鋅指基元的高度保守的氨基酸序列。
本發(fā)明的基因編碼能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子，這種基因可以具有下列DNA中的任一種a)具有序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第190位-第807位之核苷酸序列的DNA；或b)在嚴(yán)格條件下能與a)之DNA雜交，并編碼能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
本發(fā)明基因也可具有編碼能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子，并與a)的DNA有約60％或更多，優(yōu)選約70％或更多，更優(yōu)選約80％或更多，再更優(yōu)選約90％或更多的同源性的DNA。
優(yōu)選本發(fā)明的基因含有a)的DNA。
本發(fā)明的基因也編碼下列轉(zhuǎn)錄因子中的任一種i)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第1位-第206位之氨基酸序列的轉(zhuǎn)錄因子；或ii)所具有的氨基酸序列為i)中的一個或多個氨基酸缺失，取代或添加所致，并能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子。
經(jīng)缺失，取代或添加的氨基酸的數(shù)目約為130或更少，優(yōu)選約為60或更少，更優(yōu)選約為30或更少，再更優(yōu)選約為20或更少，再更優(yōu)選10或更少。
優(yōu)選本發(fā)明的基因編碼i)的轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明中特別優(yōu)選的基因是PetSPL2基因。圖1表示此基因的cDNA序列(SEQ ID NO1)及其推定的氨基酸序列(SEQ IDNO2)。
“植物特性”的改變指的是植物至少一個特性的任何改變。植物特性包括但不限于植物高度和植物節(jié)間長度中的至少一個。通過將導(dǎo)入本發(fā)明基因而得到的植物的特性與導(dǎo)入基因前植物(野生型或園藝型)的特性相比較即可評估這些變化。
植物高度改變的例子包括但不限于矮化和半矮化，優(yōu)選比導(dǎo)入基因前的植物標(biāo)準(zhǔn)高度矮約1/2或更少，更優(yōu)選矮約1/3或更少。
節(jié)間的長度改變的例子包括但不限于節(jié)間的縮短。節(jié)間縮短包括繁殖枝條(即花序)之節(jié)間和營養(yǎng)枝條(即葉序)之節(jié)間的任何縮短，花序的縮短是特別優(yōu)選的改變的例子。優(yōu)選節(jié)間長度的改變與導(dǎo)入基因前植物標(biāo)準(zhǔn)節(jié)間相比，達到的長度約為1/2或更少，更優(yōu)選約為1/5或更少，最優(yōu)選約為1/10或更少。
改變的植物特性的例子是矮化和節(jié)間縮短的聯(lián)合，更優(yōu)選為矮化和花序節(jié)間縮短的聯(lián)合。
通過例如用植物基因組DNA作為模板，使用一對對應(yīng)于由已知轉(zhuǎn)錄因子的基因編碼的氨基酸序列保守區(qū)域的簡并引物進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用由此得到的擴增DNA片段作為探針篩選相同植物的基因組文庫即可分離出本發(fā)明的基因。一對引物的例子包括5’-CARGCNYTN GGNGGNCAY-3’(SEQ ID NO3)或5’-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3’(SEQ ID NO4)與5’-ARNCKNARYTCNARRTC-3’(SEQ ID NO5)的聯(lián)合，其中N是肌苷，R是G或A，Y是C或T，K是T或G。
根據(jù)廠商對商購試劑盒和儀器的說明，或根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法可進行PCR。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知生產(chǎn)基因文庫的方法，用于與探針雜交的嚴(yán)格條件，和克隆基因的方法，例見Maniatis等，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約(1989)。
通過本領(lǐng)域已知的核苷酸序列分析法或通過商購的自動化測序儀可測定所得基因的核苷酸序列。
本發(fā)明的基因并不限于分離自天然基因組的基因，也包括合成的多核苷酸。通過例如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法修飾上述已測序的基因即可得到合成的多核苷酸。
通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可將本發(fā)明的基因連接到適當(dāng)?shù)闹参锉磉_載體中，并通過已知的基因重組技術(shù)將所述載體導(dǎo)入植物細胞中。被導(dǎo)入的基因摻入植物細胞的DNA中，植物細胞的DNA包括植物細胞的多種細胞器(如線粒體，葉綠體等)以及染色體中所含的DNA。
“植物”包括單子葉植物和雙子葉植物，優(yōu)選的植物是雙子葉植物。雙子葉植物包括Archichlamiidae和Sympetalidae，優(yōu)選Sympetalidae植物。Sympetalidae植物的例子包括龍膽目(Gentianales)，茄目(Solanales)，野芝麻目(Lamiales)，水馬齒目(Callitrichales)，車前目(Plantaginales)，風(fēng)鈴草目(Campanulales)，玄參目(Scrophulariales)，茜草目(Rubiales)，川斷續(xù)目(Dipsacales)，紫宛目(Asterales)等，優(yōu)選茄目植物。茄目植物的例子包括茄科(Solanaceae)，田基麻科(Hydrophyllaceae)，花忍科(Polemoniaceae)，菟絲子科(Cuscutaceae)，旋花科(Convolvulaceae)等，優(yōu)選茄科。茄科包括矮牽牛屬，曼陀羅屬(Datura)，煙草屬(Nicotiana)，茄屬(Solanum)，番茄屬(Lycopersicon)，辣椒屬(Capsicum)，酸漿屬(Physali)s和枸杞屬(Lycium)等，優(yōu)選矮牽牛屬，曼陀羅屬和煙草屬的植物，更優(yōu)選矮牽牛屬。矮牽牛屬植物的例子包括P.hybrida，P.axillaris，P.inflata，P.violacea等，特別優(yōu)選P.hybrida植物。除非另有說明，“植物”指的是具有花和/或果實的植物體和得自該植物體的種子。
“植物細胞”的例子包括得自如葉和根的植物器官，愈傷組織的細胞，和經(jīng)培養(yǎng)的細胞的懸浮液。
本文所用的術(shù)語“植物表達載體”指的是核酸序列，其中調(diào)控本發(fā)明基因表達的多種調(diào)控元件，如啟動子，互相連接以使其在植物宿主細胞中發(fā)揮作用。優(yōu)選植物表達載體包括植物啟動子，終止子，藥物抗性基因和增強子。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道隨著宿主細胞類型的不同，植物表達載體和調(diào)控元件的類型也會有所不同。本發(fā)明所用植物表達載體可另外含有T-DNA區(qū)域，T-DNA區(qū)域使得基因能被有效導(dǎo)入植物基因組，尤其是當(dāng)使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物時更是如此。
本文所用術(shù)語“植物啟動子”指的是在植物中行使功能的啟動子。優(yōu)選組成型啟動子以及在包括花的植物體部分選擇性地起作用的組織特異性啟動子。植物啟動子的例子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子和胭脂氨酸合成酶啟動子。
本文所用術(shù)語“終止子”指的是位于編碼蛋白質(zhì)之基因區(qū)域的下游的序列，該序列涉及mRNA轉(zhuǎn)錄的終止和polyA序列的加入。已知終止子有利于mRNA的穩(wěn)定性，從而影響基因的表達水平。這種終止子的例子包括但不限于CaMV 35S終止子和胭脂氨酸合酶基因的終止子(Tnos)。
為了便于選擇轉(zhuǎn)基因植物，需要“藥物抗性基因”，用于本發(fā)明的這種藥物抗性基因的例子包括但不限于賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NPTII)基因，和賦予潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。
“增強子”可用于增強所需基因的表達水平，優(yōu)選的增強子是含有上述CaMV 35S啟動子之上游序列的增強子區(qū)域，在一個植物表達載體中可使用一個以上的增強子。
通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)可產(chǎn)生本發(fā)明的植物表達載體，構(gòu)建植物表達載體的優(yōu)選載體的例子包括但不限于pBI-型載體或pUC-型載體。
通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如用農(nóng)桿菌感染植物細胞的方法或直接將載體導(dǎo)入細胞的方法，可將植物表達載體導(dǎo)入植物細胞中。使用農(nóng)桿菌的方法可參照例如Nagel等，Microbiol.Lett.，67，325，1990，根據(jù)此方法，首先通過例如電穿孔用植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，然后通過眾所周知的方法，如葉盤法用經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌感染植物細胞。直接將植物表達載體導(dǎo)入細胞的方法的例子包括但不限于電穿孔法，微粒槍法，磷酸鈣法和聚乙二醇法，這些方法是本領(lǐng)域熟知的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)選擇適于欲轉(zhuǎn)化的特定植物的方法。
可根據(jù)其藥物抗性，如卡那霉素抗性選擇其中已導(dǎo)入植物表達載體的細胞，然后使用常規(guī)方法使細胞再生為植物體。
通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法可確證本發(fā)明的被導(dǎo)入基因在再生植物體中的表達，例如通過Northern印跡分析可進行這種確證。更具體地說，從所得植物的葉中提取總RNA，對總RNA進行變性的瓊脂糖凝膠電泳，然后將RNA印跡到適當(dāng)?shù)哪ど?。印跡可與經(jīng)標(biāo)記的RNA探針雜交，所述探針與被導(dǎo)入基因的一部分互補，從而檢測出得自本發(fā)明基因的mRNA。
本發(fā)明的植物是通過上述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選轉(zhuǎn)基因植物被改變的特性(即植物的高度和/或節(jié)間的長度)包括在已知的野生型或園藝型中未曾發(fā)現(xiàn)過的特性。也優(yōu)選植物經(jīng)改變的特性在園藝學(xué)上有價值。另外，優(yōu)選植物經(jīng)改變的特性在隨后的傳代過程中穩(wěn)定保守。
實施例下文中，將通過下列說明性的實施例描述本發(fā)明。用于下列實施例的限制性酶，質(zhì)粒等可購自廠商。實施例1PetSPL2基因的分離將擬南芥SUPERMAN基因編碼的蛋白質(zhì)與特別地在大豆根瘤中表達的GmN479基因編碼的蛋白質(zhì)(Kouchi等，私人通訊)進行比較，根據(jù)共存于兩種蛋白質(zhì)中的氨基酸序列合成3個用于PCR的不同簡并引物?；?’至3’方向的兩個引物的核苷酸序列分別為5’-CARGCNYTNGGNG GNCAY-3’(引物1，對應(yīng)于氨基酸序列QALGGH；SEQ ID NO3)和5’-YTNGGNGGNCAYATGAAY-3’(引物2，對應(yīng)于氨基酸序列LGGHMN；SEQ ID NO4)，基因3’至5’方向的引物的核苷酸序列為5’-ARNCKNARYTCNARRTC-3’(引物3，對應(yīng)于氨基酸序列DLELRL；SEQ ID NO5)，其中N是肌苷，Y是C或T，R是G或A，K是T或G。
使用根據(jù)Boutry，M.和Chua N.H.(1985)EMBO J.4，2159-2165所述方法提取的矮牽牛屬(Petunia hybrida var.Mitchell)基因組DNA作為模板，用引物1和引物3在下列條件下進行第一套PCR94℃10分鐘，接著進行30次94℃30秒，50℃30秒和72℃60秒的循環(huán)，然后72℃7分鐘。另外，用引物2和引物3進行第二套PCR，使用的模板是第一套PCR產(chǎn)物的一部分，反應(yīng)條件與第一套PCR中所用的相同。將擴增的DNA片段插入TA克隆載體(Invitrogen生產(chǎn))，然后根據(jù)常規(guī)方法將所述載體導(dǎo)入E.coli。從被轉(zhuǎn)化的E.coli中提取質(zhì)粒并測定DNA片段的核苷酸序列。結(jié)果表明所得DNA片段內(nèi)編碼了SUPERMAN和GmN479中共同含有的鋅指基元部分，衍生此DNA片段的基因被稱為PetSPL2基因。在相同系列的實驗中，闡明了所含核苷酸序列類似于PetSPL2的3個其它DNA(PetSPL1，3和4基因)的存在。有關(guān)PetSPL3基因的細節(jié)參見日本專利申請10-65921。
為了克隆PetSPL2基因的cDNA，使用上述DNA片段和GENETRAP cDNA篩選試劑盒(BRL生產(chǎn))篩選使用BRL試劑盒已在pSPORT質(zhì)粒載體(BRL生產(chǎn))中制備的矮牽牛屬(Petuniahybrida var.Mitchell)花蕾的cDNA文庫。通過篩選此cDNA文庫得到幾個PetSPL2基因的克隆，因此分離出得自矮牽牛屬的PetSPL2基因的cDNA。實施例2分析PetSPL2基因的核苷酸序列和氨基酸序列實施例1所得克隆中最長的克隆含有PetSPL2基因的約1.0kb的cDNA片段。測定此cDNA片段的DNA核苷酸序列(SEQ IDNO1)，由所得DNA核苷酸序列中所含的開放閱讀框推定蛋白質(zhì)的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
核苷酸序列的比較表明PetSPL2基因與SUPERMAN，PetSPL1和PetSPL4基因分別表現(xiàn)出58％，67％和51％的核苷酸序列同源性。PetSPL2基因與PetSPL3基因表現(xiàn)出52％的核苷酸序列同源性。這種核苷酸序列的比較僅在每個基因的編碼區(qū)內(nèi)進行。
PetSPL2推定的氨基酸序列含有與SUPERMAN類似的單個TFIIIA-型鋅指基元，以此為基礎(chǔ)，假定PetSPL2為轉(zhuǎn)錄因子。PetSPL2在全長氨基酸序列上與SUPERMAN和PetSPL3分別表現(xiàn)出約37％和23％的同源性。
表1將SUPERMAN和各種PetSPL的鋅指基元之氨基酸序列進行了比較，PetSPL2與SUPERMAN的鋅指基元的氨基酸同源性(約100％)與PetSPL1與SUPERMAN的相應(yīng)同源性(約100％)相同，但高于PetSPL3與SUPERMAN的相應(yīng)同源性(約76％)(其中假定鋅指基元由第4個C延伸至第24個H以計算氨基酸序列的同源性)。表1也顯示出SUPERMAN與各種PetSPL的C末端疏水區(qū)的比較。表1鋅指
C-末端疏水區(qū)
從上述結(jié)果可推定PetSPL2是新的轉(zhuǎn)錄因子，它與SUPERMAN的關(guān)系比與PetSPL3的關(guān)系更近，并屬于不同于PetSPL3的一類轉(zhuǎn)錄因子。實施例3構(gòu)建含有編碼PetSPL2之多核苷酸的植物表達載體依次將含有質(zhì)粒pBI221(購自Clontech)之CaMV 35S啟動子的DNA片段(HindIII-XbaI片段)和含有NOS終止子的DNA片段(SacI-EcoRI片段)插入質(zhì)粒pUCAP的多克隆位點(Van Engelen，F(xiàn).A.等，Transgenic Res.4288-290(1995))，產(chǎn)生pUCAP35S。另一方面，在KpnI和SacI位點(皆為載體中的位點)裂解含有PetSPL2的pSPORT/PetSPL2質(zhì)粒，并插入pUCAP35的KpnI和SacI位點之間。再用AscI和PacI裂解此重組質(zhì)粒，將所得的編碼PetSPL2的DNA片段導(dǎo)入二元載體pBINPLUS(Van Engelen，F(xiàn).A.等，(1995)，文獻同上)的AscI和PacI位點中。
如圖2a所示，構(gòu)建的PetSPL2基因高表達載體(pBIN-35S-PetSPL2)包括CaMV 35S啟動子區(qū)(P35S；0.9kb)，編碼PetSPL2的本發(fā)明多核苷酸(PetSPL2；1.0kb)和胭脂氨酸合酶的終止子區(qū)(Tnos；0.3kb)。圖2中，Pnos和NPTII分別表示胭脂氨酸合成酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因的啟動子區(qū)。LB和RB分別表示T-DNA左邊界和T-DNA的右邊界。實施例4將PetSPL2基因?qū)氚珷颗偌毎?1)根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化于28℃，在含有250μg/ml鏈霉素和50μg/ml利福平的L培養(yǎng)基中培養(yǎng)根瘤農(nóng)桿菌LBA4404系(購自Clontech)。根據(jù)Nagel等(1990)(文獻同上)的方法制備此菌株的細胞懸浮液。通過電穿孔將實施例3中構(gòu)建的PetSPL2基因高表達載體導(dǎo)入上述菌株。(2)將編碼PetSPL2的多核苷酸導(dǎo)入矮牽牛屬細胞在YEB培養(yǎng)基(D.M.Glover編，DNA克隆，IPL出版社，第2版，p78)中振蕩培養(yǎng)(28℃，200rpm)(1)中所得的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404系，接著用無菌水稀釋20倍。在此稀釋溶液中培養(yǎng)矮牽牛屬(Petunia hybrida var.Mitchell)的葉切片，2-3天后，使用含有羧芐青霉素的培養(yǎng)基除去農(nóng)桿菌，然后通過每過2周即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，在選擇培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)這些葉切片?？敲顾乜剐孕誀畋挥米鬟x擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的矮牽牛屬細胞的標(biāo)志，所述抗性是由得自pBINPLUS的，與上述PetSPL2基因一起導(dǎo)入的NPTII基因的表達所賦予的。使用常規(guī)方法由經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞誘導(dǎo)愈傷組織，然后重新分化成植物體。實施例5PetSPL2基因在PetSPL2轉(zhuǎn)化植物中的表達從實施例4中所得的14株被PetSPL2轉(zhuǎn)化的矮牽牛的葉中提取總RNA，根據(jù)常規(guī)方法對10μg各種提取物進行變性的瓊脂糖凝膠電泳并印跡到Genescree plus濾膜(由DuPont制造)上。使用DIGRNA標(biāo)記試劑盒(由Boeringer Mannheim制備)標(biāo)記PetSPL2反義RNA。根據(jù)試劑盒的說明，用經(jīng)標(biāo)記的RNA進行雜交和濾膜的洗滌，洗滌后，室溫下將濾膜暴露于XAR膠片(Kodak產(chǎn))1小時，圖3表示檢測13株矮牽牛之PetSPL2基因mRNA的變性瓊脂糖凝膠電泳圖像的放射性自顯影，這些結(jié)果表明13株獨立的矮牽牛轉(zhuǎn)化體中有4株在高表達啟動子的控制之下以高水平表達了PetSPL2mRNA。實施例6以高水平表達PetSPL2基因的矮牽牛轉(zhuǎn)化體的表型在以高水平表達PetSPL2基因的4株獨立的矮牽牛轉(zhuǎn)化體中的3株(除1株表達水平相對較低的矮牽牛)中普遍觀察到下述表型，與上述3株矮牽牛相比，剩下的1株矮牽牛以相對較低的水平表達PetSPL2基因。在植物體中觀察到的最顯著的變化是花序節(jié)間長度的縮短(即對節(jié)間伸長的抑制)和與之相關(guān)的矮化(圖4；左圖表示PetSPL2-轉(zhuǎn)化的矮牽牛，右圖表示野生型矮牽牛)，相對于營養(yǎng)階段而言，在繁殖階段即花序中觀察到的變化更為明顯?；ㄐ虻墓?jié)間長度表現(xiàn)出比野生型的矮1/10(圖5；左圖表示野生型矮牽牛的節(jié)間，右圖表示PetSPL3-轉(zhuǎn)化的矮牽牛的節(jié)間)，其它變化是葉變圓，花適度變小等(圖4)。
至于涉及控制花序節(jié)間伸長的基因，已報道了擬南芥的ERECTA基因(Torii等，1996，植物細胞，8735)。然而，ERECTA基因與本發(fā)明的PetSPL2基因之間在核苷酸序列水平或氨基酸序列水平上都沒有顯著的同源性。已知一些涉及植物激素合成及其控制的基因(rolA，等)可縮短節(jié)間的長度，然而已知這些與植物激素相關(guān)的基因表現(xiàn)出多種作用并能控制節(jié)間的伸長(Dehio等，1993，植物分子生物學(xué)，231199)。
從上述結(jié)果看，被PetSPL2-轉(zhuǎn)化的矮牽牛由于節(jié)間長度的縮短而變得更加矮化，以使花的外形與野生型的相比有顯著改變。因此，可以理解導(dǎo)入PetSPL2基因是有用的，尤其是對于觀賞花卉或節(jié)間長度趨于伸長的園藝型花卉更是有用?；ㄍ庑蔚娘@著改變可賦予植物新的觀賞價值。另外，對植物高度的抑制作用在使植物抗移動方面具有顯著的園藝學(xué)價值，而且，其中導(dǎo)入了PetSPL基因的果樹有望使其外形顯得更加結(jié)實，這是有意義的，因為它使果實收獲工作更加有效。
根據(jù)本發(fā)明，提供了編碼能改變植物形態(tài)學(xué)等的轉(zhuǎn)錄因子的基因。通過利用本發(fā)明的基因，可產(chǎn)生具有經(jīng)改變之特性的植物，所產(chǎn)生的植物在園藝學(xué)上是有用的，因為它所提供的特性在野生型和園藝型中未曾發(fā)現(xiàn)過或很少發(fā)現(xiàn)過。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明范圍和精神的情況下，多種其它的修飾是顯而易見的并易于做到。因此，本文所附權(quán)利要求書的范圍不想局限于本文所示的說明書，相反權(quán)利要求書應(yīng)被廣義地解釋。
序列表<110>農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所長<120>通過導(dǎo)入矮牽牛屬轉(zhuǎn)錄因子PetSPL2的基因以縮短花序節(jié)間的方法<130>J198412287<150>JP10-224852<151>1998-08-07<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>997<212>DNA<213>Petunia hybrida，var.Mitchell<220>1<220>CDS<222>(190)..(807)<400>CCCAGTGCCA TTTTTTCTCT CTAGTCAAGC TCTCTATATC ATCATCACTA TTCCCTTGGC 60TGCAGTAACA CTCCTATTTA ACCCTCACAA AAAAATTACC AGAGGGCAGC AAAAAATGCT 120TGAACATAAT TATTATACTT ACTATTAAGC TAGATTTCCT CTTGATCTTG CTAGGTTTGA 180CTGGAGAAA ATG GCA GGC ATG GAT AGA AAC AGT TTC AAC AGT AAG TAC TTC 231Met Ala Gly Met Asp Arg Asn Ser Phe Asn Ser Lys Tyr Phe5 10AAA AAC AAA AGC ATC ATG GCA AGA CAG ATG GAG TAC TTG AAT AAC AAC 279Lys Asn Lys Ser Ile Met Ala Arg Gln Met Glu Tyr Leu Asn Asn Asn15 20 25 30AAT GGC GAC AAT AAC AAC AAC AAT AAT GTT ACA AGC TCA TTA CGA GAT 327Asn Gly Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Asp35 40 45AAT TAT GGA AAT GAA GAT CAT TTA CTT GGT GGA CTA TTC TCT TGG CCT 375Asn Tyr Gly Asn Glu Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Trp Pro
50 55 60CCA AGA TCT TAT ACA TGT AGC TTT TGT AAA AGG GAA TTT AGA TCT GCT 423Pro Arg Ser Tyr Thr Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala65 70 75CAA GCT CTT GGT GGA CAC ATG AAT GTT CAT AGA AGA GAT AGA GCC ATT 471Gln Ala Leu Gly Gly His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Ile80 85 90TTG AGA CAA TCA CCA CCT AGA GAT ATT AAT AGG TAT TCT CTT CTA AAC 519Leu Arg Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn95 100 105 110CTT AAT CTT GAA CCA AAC CCT AAC TTT TAC CCT AGT CAT AAC CCT AGT 567Leu Asn Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser115 120 125TTT TCA AGA AAA TTC CCA CCT TTT GAA ATG AGG AAA TTA GGA AAA GGA 615Phe Ser Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly130 135 140GTT GTT CCA AAC AAT CAC TTG AAA AGT GCC AGA GGG CGT TTT GGA GTT 663Val Val Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val145 150 155GAG AAA ATT GAC TCT TTC ATG CAA GAA AAA GAA TGT ACT ACT ACA GTG 711Glu Lys Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val160 165 170ATC AAG AAG TCC GAG TTT CTA AGA TTG GAC TTG GGA ATT GGG TTG ATC 759Ile Lys Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile175 180 185 190AGT GAA TCA AAG GAA GAT TTA GAT CTT GAA CTT CGA CTG GGA TCC ACT 807Ser Glu Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr195 200 205TAACTATATC TAATTTTTAC GGCATTAAGG TTTGTAAATT GAGTCGACAG CTTAGTCAAA 867ACTACTTATG CACTTTAATA TGGCTTCTTG TGCTATATTT ATTTATTTTA CATGGCTGTA 927TCTAGGTTTG CATTTTAAGA TTTAGTACCT TGTCAGATTA AAAGAAAACG AAAGTTAAAT 987TAAAAAAAAA997<210>2<211>206<212>PRT<213>Petunia hybrida var. Mitchell<400>2Met Ala Gly Met Asp Arg Asn Ser Phe Asn Ser Lys Tyr Phe Lys Asn5 1015Lys Ser Ile Met Ala Arg Gln Met Glu Tyr Leu Asn Asn Asn Asn Gly20 25 30Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Val Thr Ser Ser Leu Arg Asp Asn Tyr35 40 45Gly Asn Glu Asp His Leu Leu Gly Gly Leu Phe Ser Trp Pro Pro Arg50 55 60Ser Tyr Thr Cys Ser Phe Cys Lys Arg Glu Phe Arg Ser Ala Gln Ala65 70 75 80Leu Gly Gly His Met Asn Val His Arg Arg Asp Arg Ala Ile Leu Arg85 90 95Gln Ser Pro Pro Arg Asp Ile Asn Arg Tyr Ser Leu Leu Asn Leu Asn100 105 110Leu Glu Pro Asn Pro Asn Phe Tyr Pro Ser His Asn Pro Ser Phe Ser115 120 125Arg Lys Phe Pro Pro Phe Glu Met Arg Lys Leu Gly Lys Gly Val Val130 135 140Pro Asn Asn His Leu Lys Ser Ala Arg Gly Arg Phe Gly Val Glu Lys145 150155 160Ile Asp Ser Phe Met Gln Glu Lys Glu Cys Thr Thr Thr Val Ile Lys165 170 175Lys Ser Glu Phe Leu Arg Leu Asp Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ser Glu180 185 190Ser Lys Glu Asp Leu Asp Leu Glu Leu Arg Leu Gly Ser Thr195 200 205<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>人工序列的描述引物<223><220><221>修飾的堿基<222>(3)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(6)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(9)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(12)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(15)<223>i<400>3CARGCNYTNGGNGGNCAY18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><221>Description of Artificial Sequenceprimer<220><221>修飾的堿基<222>(6)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(9)<223>i<400>4YTNGGNGGNCAYATGAAY18<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><221>引物<220><221>修飾的堿基<222>(3)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(6)<223>i<220><221>修飾的堿基<222>(12)<223>i<400>5ARNCKNARYTCNARRTC 1權(quán)利要求
1.一種基因，其具有選自a)或b)的DNAa)具有序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的第190位-第807位之核苷酸序列的DNA；或b)在嚴(yán)格條件下能與a)之DNA雜交，并編碼能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
2.一種基因，其編碼選自i)或ii)的轉(zhuǎn)錄因子i)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的第1位-第206位之氨基酸序列的轉(zhuǎn)錄因子；或ii)所具有的氨基酸序列為i)中的一個或多個氨基酸缺失，取代或添加所致，并能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子。
3.權(quán)利要求1的基因，其中植物的特性包括植物高度和節(jié)間長度中的一個。
4.生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括步驟將權(quán)利要求1的基因?qū)胫参锛毎缓陀删哂袑?dǎo)入基因的植物細胞再生植物體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中植物屬于雙子葉植物。
6.權(quán)利要求5的方法，其中植物屬于茄科。
7.權(quán)利要求6的方法，其中植物屬于矮牽牛屬。
8.權(quán)利要求4的方法，其中基因被摻入植物表達載體。
9.由權(quán)利要求4的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼DNA的基因,所述DNA選自a)或b):a)具有序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第190位—第807位之核苷酸序列的DNA;或b)在嚴(yán)格條件下能與a)之DNA雜交,并編碼能改變植物特性的轉(zhuǎn)錄因子的DNA。
文檔編號C12N15/82GK1244585SQ98119350
公開日2000年2月16日 申請日期1998年9月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月7日
發(fā)明者高辻博志, 中川仁 申請人:農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物資源研究所長