專利名稱：乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)和分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵生產(chǎn)乳酸和從含乳酸的溶液分離乳酸的方法。
背景技術(shù)：
歐洲專利號(hào)230.021敘述了連續(xù)發(fā)酵葡萄糖生成乳酸，然后通過電透析從溶液提取乳酸的方法，其中通過以同樣于它形成的速度除去乳酸，控制發(fā)酵罐中的pH，發(fā)酵罐的內(nèi)容物在電透析單元中再循環(huán)。將酵母提取物和無機(jī)鹽用作營養(yǎng)。這一系統(tǒng)的缺點(diǎn)是已知發(fā)酵罐液體中的細(xì)菌吸收到電透析的膜上，引起電透析單元中的電阻增加，導(dǎo)致極大增加了電透析過程的動(dòng)力消耗。
Boyaval等人(生物技術(shù)通訊，第9卷，第3冊(cè)，207-212，1987)敘述了利用三階段發(fā)酵過程的乳酸發(fā)酵反應(yīng)器，該過程包括在第一時(shí)期生產(chǎn)生物量和乳酸，在第二階段通過超濾分離和濃縮細(xì)胞，在第三階段通過電透析濃縮乳酸和純化。但是，據(jù)報(bào)道，這一系統(tǒng)顯示了超濾膜的阻塞導(dǎo)致滲透流速的大幅度限制的缺點(diǎn)。
美國專利號(hào)4,110175也敘述了電解純化有機(jī)酸包括乳酸的常用方法。在美國專利號(hào)5,002,881中敘述了這一方法的改進(jìn)的版本，其中通過發(fā)酵含葡萄糖的培養(yǎng)基作為乳酸銨形成乳酸，這使利用超濾從發(fā)酵液體中分離乳酸銨成為可能，因?yàn)閬碜猿瑸V的滯留物回到了發(fā)酵罐。在這種方法中，在隨后的電透析過程中沒有細(xì)菌吸收到膜上，所以，動(dòng)力消耗就低了。用于這一專利的微生物是凝結(jié)芽胞桿菌，該細(xì)菌具有的特性是不需要含有酵母提取物或玉米漿的特殊營養(yǎng)培養(yǎng)基，而這些營養(yǎng)已知是當(dāng)利用乳酸細(xì)菌時(shí)維持乳酸發(fā)酵所必需的。在電透析之前，通過逆滲透(RO)濃縮發(fā)酵罐液體，并且隨后在電透析單元中處理濃縮的液體，其中通過單獨(dú)操作中的雙性膜從乳酸銨形成乳酸。在這一操作中，在同一時(shí)間形成了氫氧化銨，并且可以作為中和乳酸的介質(zhì)回到發(fā)酵罐。但是，在這一過程中，利用氨基酸作為發(fā)酵細(xì)菌的營養(yǎng)，導(dǎo)致的缺點(diǎn)是耗價(jià)相對(duì)高。另外的缺點(diǎn)是用于濃縮的RO將導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化的有機(jī)物質(zhì)(殘留的葡萄糖和氨基酸)包括在利用雙性膜(bipolar membrane)的電透析處理中，這樣它們降低了該方法的效率。同樣，得到的產(chǎn)物可能不是熱穩(wěn)定的，因?yàn)樵谌樗嶂写嬖跉埩舻奶恰?br> 美國專利號(hào)，4,698,303敘述了從乳清蛋白形成氨基酸和在乳清中乳糖的發(fā)酵中將乳清蛋白作為營養(yǎng)的用途。但是，美國4,698,303具有的缺點(diǎn)是需要從乳清蛋白獨(dú)立水解生產(chǎn)氨基酸，進(jìn)行的水解作為獨(dú)立的酸酶解過程，然后將水解產(chǎn)物作為營養(yǎng)進(jìn)料到膜發(fā)酵罐中。
本發(fā)明的簡(jiǎn)要公開本發(fā)明的目的是提供以簡(jiǎn)單和廉價(jià)的方法生產(chǎn)和分離乳酸的方法，以便克服上面的過去的方法的缺點(diǎn)。
因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及通過乳酸形成細(xì)菌從發(fā)酵罐中的含糖發(fā)酵液體發(fā)酵乳酸的方法，其中存在乳清蛋白，或?qū)⑷榍宓鞍鬃鳛槿樗嵝纬杉?xì)菌的營養(yǎng)底物加入其中，該方法包括在發(fā)酵過程中，至少加入一種水解蛋白質(zhì)的酶到發(fā)酵罐中，以致蛋白質(zhì)到氨基酸的水解與糖發(fā)酵成有機(jī)酸同時(shí)發(fā)生，并且分離發(fā)酵形成的乳酸。
本發(fā)明的另一方面涉及從含乳酸的發(fā)酵液體分離乳酸的方法。
本發(fā)明的詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明，通過生產(chǎn)乳酸的細(xì)菌培養(yǎng)物，在發(fā)酵罐中，將含有含糖溶液和乳清蛋白，例如來自乳清蛋白濃縮物的生產(chǎn)的乳清滲透物以及蛋白質(zhì)水解酶，下面稱為蛋白酶，的混合物的無菌生長培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)的發(fā)酵。
根據(jù)本發(fā)明，在利用的含糖溶液中的“糖”可以是任何用于乳酸發(fā)酵的適當(dāng)?shù)奶?，例如單糖，如葡萄糖，果糖，或半乳糖，二糖，如蔗糖，麥芽糖，纖維二糖，或乳糖，或多糖。當(dāng)然，可以利用不同的糖的混合物。糖可以適當(dāng)?shù)貋碓从诶缛榍鍧B透物，但也可以來源于任何其它來源。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過加入與乳酸形成可溶于水的鹽，的氨，通常是氨氣形式，在約pH5-7的范圍內(nèi)，發(fā)酵液體中的pH基本保持恒定。雖然通過其它堿，例如NaOH，Ca(OH)2，或CaCO3，維持需要的pH值是可能的，但這是較不優(yōu)選的，其中有幾個(gè)原因，在這些原因中，有發(fā)酵液體中不期望鈣離子的事實(shí)，和氨比堿如NaOH更加廉價(jià)的事實(shí)。另外，利用氨作為堿的優(yōu)點(diǎn)是它提供了乳酸細(xì)菌需要的氮源，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這導(dǎo)致細(xì)菌的生長比例如NaOH導(dǎo)致的生長更加良好。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將發(fā)酵液體進(jìn)行超濾過程，該過程保留了含有細(xì)菌培養(yǎng)物和未水解乳清蛋白的滯留物，并且允許溶解的物質(zhì)通過，包括發(fā)酵過程中形成的乳酸。當(dāng)氨作為如上所述的堿加入時(shí)，乳酸可以例如是乳酸銨形式。
然后，在離子交換單元中，優(yōu)選地利用首先結(jié)合二價(jià)離子的螯合樹脂，優(yōu)選地處理來自超濾過程的滲透物，以致利用鈉離子替代滲透物中存在的鈣和鎂離子以及可能的鐵離子，因此，防止了鹽的沉淀，例如鈣鹽如磷酸鈣，這種鹽可能在隨后的滲透物的電透析處理中導(dǎo)致膜的慢慢的不可逆的剝落。另外，除去鐵離子導(dǎo)致最后的乳酸產(chǎn)物無色。
然后，在電透析過程中，優(yōu)選地2-步電透析過程，其中第一步利用了常規(guī)的電透析膜，優(yōu)選地用來濃縮來自離子交換操作的得到的洗脫物。
隨后，優(yōu)選地將濃縮物進(jìn)行第二個(gè)電透析過程，其中雙性膜將鹽分離形成乳酸，無機(jī)酸和氫氧化銨溶液。因此，在同樣于美國專利號(hào)5,002,881中敘述的兩個(gè)獨(dú)立的流，堿硫和酸流中，乳酸銨轉(zhuǎn)化成氫氧化銨和乳酸。但是，本發(fā)明代表的是簡(jiǎn)化的過程，因?yàn)樵诒景l(fā)明中的進(jìn)料流沒有含有可能堵塞二極電透析膜的有機(jī)物質(zhì)。存在的無機(jī)鹽也是在這一步驟中分開的，陽離子作為氫氧化物在堿流中，陰離子在酸流中。
這一二步電透析過程的優(yōu)點(diǎn)是在第一電透析步驟中除去的有機(jī)組成如殘留的糖和氨基酸將不干擾后面的第二個(gè)(二極)電透析步驟，在第二個(gè)步驟中，乳酸銨轉(zhuǎn)化成乳酸。
通常，將含有氫氧化銨的溶液以調(diào)節(jié)pH到設(shè)定的值，例如pH范圍約5.0-7.0，優(yōu)選地，約5.5-6.5，更優(yōu)選地約5.5-6.0的量回流到反應(yīng)器。優(yōu)選地，將酸溶液導(dǎo)入強(qiáng)陽離子交換劑，其中利用氫離子交換陽離子。然后，在弱陰離子的離子交換劑中，以吸收乳酸的氫氧化物形式，優(yōu)選地處理來自陽離子交換操作的洗脫物。然后，例如利用0.5摩爾/升的磷酸洗脫吸收的乳酸，磷酸只洗脫濃縮和非常純化形式的乳酸和易揮發(fā)的脂肪有機(jī)酸，而其它陰離子保留在陰離子交換柱中。
作為如上所述的離子交換過程的替代，可以將酸溶液導(dǎo)入第三個(gè)電透析階段。在這種情況中，利用，例如甲酸將酸溶液的pH值調(diào)節(jié)到約1.5到約2.5，優(yōu)選地，約2.0到約2.2，以便從無機(jī)酸分離乳酸。這一強(qiáng)酸溶液的電透析使得乳酸從帶電的無機(jī)酸分離，并且在稀釋的流中與大多數(shù)甲酸和小量的乙酸一起回收。
雖然，根據(jù)本發(fā)明分離乳酸的過程優(yōu)選地含有上面敘述的步驟的聯(lián)合，即，超濾，利用螯合樹脂的離子交換，第一個(gè)電透析，第二個(gè)電透析，和陽離子和陰離子交換或第三個(gè)透析，和并且優(yōu)選地如上所述順序，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是在這一過程中的一個(gè)或多個(gè)步驟，如果需要或有利的話，可以在一定的情況中減去，并且/或者這些步驟的順序可以某些情況下改變。
最后，將乳酸純化和濃縮到需要的濃度，例如利用降膜式多時(shí)期真空蒸發(fā)器?？蛇x地，通過其它已知的方法，例如，在壓縮式蒸發(fā)器中進(jìn)行乳酸的濃縮，其中將甲酸和乙酸與水一起蒸發(fā)掉。
本發(fā)明利用了乳清蛋白，乳清蛋白可以通過任何適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆獬砂被嵋员闾峁┌l(fā)酵的營養(yǎng)。許多這樣的蛋白酶是市場(chǎng)可得的，其中的一個(gè)例子是Flavourzyme，從Novo Norkisk A/S，丹麥可以得到。作為乳酸形成細(xì)菌，可以利用任何適當(dāng)?shù)娜樗嵝纬杉?xì)菌，或不止一個(gè)乳酸細(xì)菌的聯(lián)合，例如乳桿菌屬，如瑞士乳桿菌，德氏乳桿菌，干酪乳桿菌，嗜酸乳桿菌，或德氏乳桿菌保加利亞種。乳酸形成細(xì)菌如乳桿菌屬的各種可以單個(gè)利用或與另一個(gè)微生物一起利用，例如作為與例如唾液鏈球菌嗜熱亞種的共培養(yǎng)物。
不同乳酸細(xì)菌如瑞士乳桿菌的不同菌株的用途使形成L(+)，L(-)，或D(-)以及L(+)/(-)和D(-)的混合物成為可能。在下面，術(shù)語“乳酸”打算指這些類型的乳酸或其混合物的任何一種。
根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)酵罐中直接加入酶，而不需要其它安排，如降低pH，降低pH是美國4,698,303中敘述的過程所必需的。在發(fā)酵罐中直接加入蛋白水解酶的乳酸生產(chǎn)方法迄今為止沒有肯定已經(jīng)公開或提出。
作為本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，直接在發(fā)酵罐中加入蛋白水解酶而沒有任何不利影響是可能的，發(fā)酵和水解可以發(fā)生在同一容器中，即發(fā)酵罐中，這產(chǎn)生比美國4,698,303公開的更加簡(jiǎn)單和更加廉價(jià)的方法。另外，當(dāng)利用本發(fā)明時(shí)，保持了美國4,698,303中公開的方法的優(yōu)點(diǎn)。特定地，超濾膜可與發(fā)酵罐偶聯(lián)，而沒有被蛋白質(zhì)阻塞，因?yàn)樗庾饔美昧酥苯蛹尤氲桨l(fā)酵罐中的酶，這一加入過程如此快以致在任何真正的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存可能發(fā)生之前，蛋白質(zhì)就水解成肽和氨基酸了。
利用在發(fā)酵罐中直接加入酶的另外的優(yōu)點(diǎn)是它使利用非常小孔大小例如，不大于約10,000道爾頓和優(yōu)選地更低的超濾器成為可能。因此，維持截?cái)嘀道缂s5000道爾頓的超濾器恒定的高流量是可能的，以致發(fā)酵產(chǎn)物乳酸的純化可以簡(jiǎn)化，因?yàn)樵趤碜耘悸?lián)發(fā)酵罐的超濾器的滲透物中的更高級(jí)的多聚物成分(主要是乳酸細(xì)菌產(chǎn)生的未水解的蛋白質(zhì)，葡聚糖和其它多糖)的含量比其它已知的系統(tǒng)要低。最后，超濾結(jié)合發(fā)酵的用途意味著加入的酶將保留在發(fā)酵罐中，它們不能通過膜，所以酶的作用的持久性更長，這使酶的消耗比其它乳酸發(fā)酵系統(tǒng)極大地節(jié)省成為可能。
本發(fā)明將進(jìn)一步在下面的非限制性的實(shí)施例中說明。
實(shí)施例在利用Koch S4-HFK-131螺旋通風(fēng)的膜的100升膜反應(yīng)器中進(jìn)行乳酸發(fā)酵。超濾膜的截?cái)嘀凳?千道爾頓，并且膜的總面積是7.3平方米。在膜中的入口和出口壓分別是4.4和2.9巴。
在甜乳清，乳清蛋白濃縮物和其它營養(yǎng)的基礎(chǔ)上，制成90升水溶液生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的組成如下9.5％重量的乳清蛋白4.0％重量的乳糖1.5％重量的酵母提取物0.3％重量的K2HPO40.04％重量的MgSO4，7H2O0.015％重量的MnSO4，4H2O0.1％重量的吐溫800.006％重量的鹽酸半胱氨酸將培養(yǎng)基加熱到70℃，45分鐘，并且冷卻到發(fā)酵溫度45℃。加入18克冷凍干燥瑞士乳桿菌培養(yǎng)物和53克Flavourzyme酶。在厭氧條件成批進(jìn)行發(fā)酵9小時(shí)。然后，開始進(jìn)行連續(xù)的發(fā)酵。水狀進(jìn)料培養(yǎng)基是基于乳清滲透物并且具有下面的組合物0.35％重量的乳清蛋白0.01％重量的Flavourzyme4.0％重量的乳糖利用氨氣調(diào)節(jié)反應(yīng)器中的pH到5.75。
通過反應(yīng)器內(nèi)容物的連續(xù)流出將生物量的濃度保持在約7-8％。在這一生物量濃度，在超濾器上滲透的流量在發(fā)酵過程中是恒定的，并且約為1升/分鐘(8.2升/(平方米×小時(shí))。在34天的連續(xù)的發(fā)酵過程中，未在超濾器上進(jìn)行原位清除(cleaning-in-place)。
發(fā)酵罐中的稀釋速度(D)在0.15和0.3/小時(shí)之間變化。這對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)量沒有影響，轉(zhuǎn)化產(chǎn)量在34天發(fā)酵過程中是恒定的99.5％或更多。在超濾滲透物中乳酸濃度為4.0％，在D＝0.3/小時(shí)的生產(chǎn)率是12克/升.小時(shí))。
在超濾后，乳酸的進(jìn)一步分離如上所述進(jìn)行，即利用帶有螯合樹脂的離子交換，第一個(gè)電透析，第二個(gè)電透析，和陽離子和陰離子交換的聯(lián)合。乳酸的整個(gè)回收率是非常高的，約為基于加入到發(fā)酵罐的糖的量的85-90％。
權(quán)利要求
1.借助于乳酸形成細(xì)菌在發(fā)酵罐中從含糖發(fā)酵液體發(fā)酵乳酸的方法，其中存在乳清蛋白，或者作為乳酸形成細(xì)菌的營養(yǎng)底物加入，該方法包括在發(fā)酵過程中，在發(fā)酵罐中至少加入一種蛋白質(zhì)水解酶，以致蛋白質(zhì)水解成氨基酸與糖發(fā)酵成有機(jī)酸同時(shí)發(fā)生，從發(fā)酵液中分離乳酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中通過在發(fā)酵液體中加入氨，維持發(fā)酵液體的pH在基本恒定的水平，因此在發(fā)酵液體中形成乳酸銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中從發(fā)酵液體分離乳酸包括超濾步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中利用阻止蛋白質(zhì)水解酶和未水解蛋白質(zhì)通過所述濾膜的截?cái)嘀档臑V膜進(jìn)行超濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中濾膜具有的截?cái)嘀挡怀^10,000道爾頓如約5000道爾頓。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5的任何一個(gè)所述的方法，其中乳酸的分離進(jìn)一步包括離子交換步驟以便除去鈣和鎂離子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中離子交換步驟利用了首先結(jié)合二價(jià)離子的螯合樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中的任何一個(gè)所述的方法，其中乳酸的分離進(jìn)一步至少包括電透析步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中電透析包括利用常規(guī)電透析膜的第一個(gè)電透析步驟，和利用雙性膜的第二個(gè)電透析步驟。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9中的任何一個(gè)所述的方法，其中乳酸的分離進(jìn)一步包括利用強(qiáng)陽離子交換劑的離子交換步驟和利用弱陰離子交換劑的離子交換步驟。
11.根據(jù)權(quán)利要求3-9的任何一個(gè)所述的方法，其中乳酸的分離進(jìn)一步包括第三個(gè)電透析步驟，其中含有乳酸的溶液的pH調(diào)節(jié)到范圍為約1.5到2.5的范圍的值。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中發(fā)酵液體含有乳酸銨，其中乳酸通過下面步驟分離-將發(fā)酵液體進(jìn)行超濾步驟，以便產(chǎn)生含乳酸銨的基本上無多聚物的滲透物，-將超濾的產(chǎn)物利用了螯合樹脂進(jìn)行離子交換，基本上除去鈣和鎂離子，-將離子交換的產(chǎn)物進(jìn)行利用常規(guī)電透析膜的第一個(gè)電透析，和利用雙性膜的第二個(gè)電透析以便轉(zhuǎn)化乳酸銨為乳酸和氫氧化銨，-將第二個(gè)透析的含有乳酸的產(chǎn)物進(jìn)行利用強(qiáng)陽離子交換劑的離子交換和利用弱陰離子交換劑的離子交換，或進(jìn)行第三個(gè)電透析步驟，其中含有乳酸的溶液的pH值調(diào)節(jié)到約1.5-2.5的范圍內(nèi)，和-濃縮得到的乳酸到需要的濃度。
13.從含有乳酸銨的溶液分離乳酸的方法，包括步驟-形成基本不含多聚物的含乳酸銨滲透物，-將所述的滲透物利用了螯合樹脂進(jìn)行離子交換，以除去鈣和鎂離子，-將離子交換的產(chǎn)物進(jìn)行利用常規(guī)電透析膜的第一個(gè)電透析，和利用雙性膜的第二個(gè)電透析，以便轉(zhuǎn)化乳酸銨成為乳酸和氫氧化銨，-將第二個(gè)透析的含有乳酸的產(chǎn)物進(jìn)行(1)利用強(qiáng)陽離子交換劑的離子交換和利用弱陰離子交換劑的離子交換或(2)第三個(gè)電透析步驟，其中含有乳酸的溶液的pH調(diào)節(jié)到約1.5-2.5的范圍內(nèi)，和-濃縮得到的乳酸到需要的濃度。
全文摘要
通過形成乳酸的細(xì)菌從發(fā)酵罐中的含糖發(fā)酵液體發(fā)酵乳酸的方法,其中存在乳清蛋白,在其中或作為乳酸形成細(xì)菌的營養(yǎng)底物加入乳清蛋白,其中在發(fā)酵過程中,在發(fā)酵罐中至少加入一種蛋白酶,以致蛋白質(zhì)到氨基酸的水解過程與糖發(fā)酵成有機(jī)酸的過程同時(shí)發(fā)生,并且其中從發(fā)酵液體分離來自發(fā)酵的乳酸。優(yōu)選地加入氨產(chǎn)生乳酸銨,并且通過包括超濾,離子交換,常規(guī)電透析和利用雙性膜電透析的方法優(yōu)選地分離乳酸。
文檔編號(hào)C12P7/56GK1247570SQ97181922
公開日2000年3月15日 申請(qǐng)日期1997年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月23日
發(fā)明者B·諾爾達(dá)爾 申請(qǐng)人:拉克塔斯坎有限公司