專利名稱：從石蠟包埋組織中提取核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分子生物學(xué)特別是基因工程從石蠟包埋組織中提取核酸DNA進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增的方法。
自PCR技術(shù)1985年在美國(guó)問(wèn)世以來(lái)，被迅速?gòu)V泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域，對(duì)于此項(xiàng)技術(shù)大都建立在(1)直接應(yīng)用核酸DNA作模板進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增；(2)直接裂解微生物(如細(xì)菌、病毒、衣原體等)提取核酸DNA進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增；(3)將組織剪碎研磨，采用Saiki氏法提取核酸DNA再進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增。而對(duì)石蠟包埋組織中如何脫蠟，將這些組織中的核酸高質(zhì)量的分離純化，最終應(yīng)用于基因PCR擴(kuò)增以作為對(duì)核酸結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)一步分析有價(jià)值的研究材料，是目前急待解決的問(wèn)題。本發(fā)明經(jīng)過(guò)多年的試驗(yàn)、探索，研制出了一種從石蠟包埋組織中提取核酸DNA進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增的方法。
本發(fā)明的目的在于，研制出從石蠟包埋組織中提取核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法，該方法采用二甲苯脫蠟法或水浴脫蠟法，再提取核酸DNA進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增，通過(guò)試驗(yàn)證明，不管用二甲苯8脫蠟法還是用水浴脫蠟法都可分離到大分子核酸DNA，基因PCR擴(kuò)增效果也較好。由于石蠟包埋的病理標(biāo)本能得到長(zhǎng)期保存，因此本發(fā)明為能使腫瘤等疾病在基因水平上進(jìn)行回顧性分析，做出了一個(gè)良好開(kāi)端，該方法對(duì)進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)理論研究與臨床的配合，深入探討疾病的發(fā)生、演變及預(yù)后關(guān)系，正確評(píng)價(jià)臨床治療以及加深理解腫瘤生物學(xué)特性與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，都有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
本發(fā)明所述的從石蠟包埋組織中提取核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法，該方法在如何脫蠟均可采用二甲苯脫蠟法或水浴脫蠟法，其中二甲苯脫蠟法是將石蠟包埋組織塊切成薄片，加入二甲苯微微搖動(dòng)，換液3次，時(shí)間為12小時(shí)，用濃度為100％、90％、75％、50％、25％的乙醇呈梯度水化，間隔30分鐘浸洗一次，棄上清液，剪碎組織，加入含有十二烷基磺酸鈉和蛋白酶配制的溶液，置37℃恒溫水浴3天，等體積飽和酚萃取一次，用氯仿-異戊醇24∶1萃取兩次，加醋酸鈉，用兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀核酸DNA，離心，在TE緩沖液中溶解核酸DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其含量后，加入等體積的雙蒸水，經(jīng)RNase37℃水浴30分鐘，再次用氯仿-異戊醇萃取，用醋酸鈉、乙醇沉淀，離心沉淀，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將核酸DNA大片段切出，進(jìn)行電洗脫，洗脫后的核酸DNA經(jīng)沉淀后用雙蒸水溶解；水浴脫蠟法是將石蠟包埋組織塊切成薄片，加入生理鹽水，置65-72℃水浴，待石蠟溶化后，冷卻，夾去石蠟，重復(fù)5-10次，直至無(wú)石蠟為止，再將液體(含組織)倒入離心管中離心棄上清液，剪碎組織，加入含有十二烷基磺酸鈉和蛋白酶配制的溶液，置37℃恒溫水浴3天，等體積飽和酚萃取一次，用氯仿-異戊醇24∶1萃取兩次，加醋酸鈉，用兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀核酸DNA，離心，在TE緩沖液中溶解核酸DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其含量后，加入等體積的雙蒸水，經(jīng)RNase 37℃水浴30分鐘，再次用氯仿-異戊醇萃取，用醋酸鈉、乙醇沉淀，離心沉淀，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將核酸DNA大片段切出，進(jìn)行電洗脫，洗脫后的核酸DNA經(jīng)沉淀后用雙蒸水溶解。
實(shí)施例1將石蠟包埋組織塊切成5-10μm厚的薄片，置于帶蓋的試劑瓶中，加入20ml二甲苯微微搖動(dòng)，換液3次，總時(shí)間為12小時(shí)，用濃度為100％、90％、75％、50％、25％的乙醇呈梯度水化，每次20ml，間隔30分鐘浸洗一次，棄上清液，剪碎組織，加入10ml含十二烷基磺酸鈉和蛋白酶K溶液，置37℃恒溫水浴3天，等體積飽和酚萃取一次，用氯仿-異戊醇24∶1萃取兩次，加醋酸鈉至0.3mol/l，用兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀核酸DNA，離心15分鐘，在500μl的TE緩沖液中溶解核酸DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其含量為430μg，加入等體積的雙蒸水，經(jīng)RNase 37℃水浴30分鐘，再次用氯仿-異戊醇萃取，用醋酸鈉、乙醇沉淀，離心沉淀，用200μl雙蒸水溶解，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將核酸DNA大片段切出，進(jìn)行電洗脫，洗脫后的核酸DNA經(jīng)沉淀后用雙蒸水溶解。
實(shí)施例2將石蠟包埋組織塊切成5-10μm厚的薄片，置于一燒杯中，加入生理鹽水50ml，置65-72℃水浴，待石蠟溶化后，取出燒杯冷卻，夾去石蠟，重復(fù)5-10次，直至無(wú)石蠟為止。將液體倒入離心管中，離心棄上清液，剪碎組織，加入10μl十二烷基磺酸鈉和蛋白酶K溶液，37℃恒溫水浴3天，等體積飽和酚萃取一次，用氯仿-異戊醇24∶1萃取兩次，加醋酸鈉至0.3mol/l，用兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀核酸DNA，離心15分鐘，在500μl的TE緩沖液中溶解核酸DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其含量為380μg，加入等體積的雙蒸水，經(jīng)RNase 37℃水浴30分鐘，再次用氯仿-異戊醇萃取，用醋酸鈉、乙醇沉淀，離心沉淀，用200μl雙蒸水溶解，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將核酸DNA大片段切出，進(jìn)行電洗脫，洗脫后的核酸DNA經(jīng)沉淀后用雙蒸水溶解。
權(quán)利要求
1.一種從石蠟包埋組織中提取核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法，其特征在于，該方法采用二甲苯脫蠟法首先將石蠟包埋組織塊切成薄片，加入二甲苯微微搖動(dòng)，換液3次，時(shí)間為12小時(shí)，用濃度為100％、90％、75％、50％、25％的乙醇呈梯度水化，間隔30分鐘浸洗一次，棄上清液，剪碎組織，加入含有十二烷基磺酸鈉和蛋白酶K配制的溶液，置37℃恒溫水浴3天，等體積飽和酚萃取一次，用氯仿-異戊醇24∶1萃取兩次，加醋酸鈉，用兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀核酸DNA，離心，在TE緩沖液中溶解核酸DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)其含量后，加入等體積的雙蒸水，經(jīng)RNase 37℃水浴30分鐘，再次用氯仿-異戊醇萃取，用醋酸鈉、乙醇沉淀，離心沉淀，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將核酸DNA大片段切出，進(jìn)行電洗脫，洗脫后的核酸DNA經(jīng)沉淀后用雙蒸水溶解，經(jīng)電泳檢測(cè)后，用基因PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。
2.一種從石蠟包埋組織中提取核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法，其特征在于，該方法采用水浴脫蠟法首先將石蠟包埋組織塊切成薄片，加入生理鹽水，置65-72℃水浴，待石蠟溶化后，冷卻，夾去石蠟，重復(fù)5-10次，直至無(wú)石蠟為止，再將液體(含組織)倒入離心管中離心，棄上清液，剪碎組織，加入含有十二烷基磺酸鈉和蛋白酶配制的溶液，置37℃恒溫水浴3天，等體積飽和酚萃取一次，用氯仿-異戊醇24∶1萃取兩次，加醋酸鈉，用兩倍體積無(wú)水乙醇沉淀核酸DNA，離心，在TE緩沖液中溶解核酸DNA，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)其含量后，加入等體積的雙蒸水，經(jīng)RNase 37℃水浴30分鐘，再次用氯仿-異戊醇萃取，用醋酸鈉、乙醇沉淀，離心沉淀，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將核酸DNA大片段切出，進(jìn)行電洗脫，洗脫后的核酸DNA經(jīng)沉淀后用雙蒸水溶液經(jīng)電泳檢測(cè)后，用基因PCR法進(jìn)行擴(kuò)增。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從石蠟包埋組織中提取核酸進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法,該方法采用二甲苯脫蠟法或水浴脫蠟法,再提取核酸DNA進(jìn)行基因PCR擴(kuò)增,采用該方法能充分利用石蠟包埋的病理標(biāo)本組織為能使腫瘤等疾病在基因水平上進(jìn)行回顧性分析,做出了一個(gè)良好開(kāi)端,并對(duì)進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)理論研究與臨床的配合,深入探討疾病的發(fā)生、演變及預(yù)后關(guān)系,正確評(píng)價(jià)臨床治療以及加深理解腫瘤生物學(xué)特性與臨床表現(xiàn)的關(guān)系,都有著十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12N15/10GK1221794SQ97125650
公開(kāi)日1999年7月7日 申請(qǐng)日期1997年12月31日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月31日
發(fā)明者孫文東 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院新疆化學(xué)研究所