專利名稱：生物素的發(fā)酵生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的發(fā)酵方法。
生物素是動(dòng)物、植物和微生物營(yíng)養(yǎng)的必需維生素之一，并且是非常重要的醫(yī)藥或食品添加劑。
對(duì)生物素的發(fā)酵生產(chǎn)有很多研究。已知埃希氏菌屬菌株是可用于上述方法的微生物〔參閱日本專利公開(Kokai)No.149091/1986，WO87/01391和日本專利公開(Kokai)No.155081/1987〕。除了上述菌株，已知還有芽胞桿菌屬菌株〔日本專利公開(Kokai)No.180174/1991〕，沙雷氏菌屬菌株〔日本專利公開(Kokai)No.27980/1990〕和短桿菌屬菌株〔日本專利公開(Kokai)No.240489/1991〕。但這些方法還不適于工業(yè)應(yīng)用，這是由于從營(yíng)養(yǎng)物轉(zhuǎn)化成生物素的低的碳利用率，以及在某些情況下直接中間產(chǎn)物脫硫生物素的聚積。因而必須改進(jìn)脫硫生物素轉(zhuǎn)化成生物素的效率。已知一種使用大腸桿菌靜止細(xì)胞系統(tǒng)的從脫硫生物素到生物素的轉(zhuǎn)化反應(yīng)(Antimicrob.Agents Chemother.21，5，1982)和一種使用大腸桿菌無(wú)細(xì)胞提取物的從脫硫生物素到生物素的轉(zhuǎn)化反應(yīng)〔J.Biol.Chem.，270，19158(1995)；Biosci.Biotechnol.Biochem.，56，1780(1992)；Eur.J.Biochem.，224，173(1994)；Arch.Biochem.Biophys.，326，48(1996)〕。根據(jù)這些文獻(xiàn)，已證實(shí)諸如鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶和黃素氧化還原蛋白以及生物素合成酶的蛋白質(zhì)因子參與了從脫硫生物素到生物素的形成。然而，在這些條件下只觀察到從脫硫生物素的生物素生成的有限效果。很容易使人推測(cè)另外一種未知蛋白質(zhì)參與了這種將脫硫生物素更有效地轉(zhuǎn)化為生物素的反應(yīng)。
再者，使用球形芽胞桿菌(Bacillus Sphaericus)的純化的生物素合成酶和光致還原的脫氮核黃素作為人工電子供體而不是使用鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶和黃素氧化還原蛋白的生理電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)進(jìn)行的轉(zhuǎn)化反應(yīng)最近已有報(bào)道〔Biochem.Biophys Res.Commun.，217，1231(1995)〕。但該報(bào)道的反應(yīng)效率對(duì)于將該反應(yīng)用于生物素的工業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)還不是足夠地高。
本發(fā)明的一個(gè)目的是尋找一種從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的更有效的方法。并且為了這一目的已闡明了各種蛋白質(zhì)因子。我們發(fā)現(xiàn)，nifu和nifs基因產(chǎn)物(下文稱作NIFU和NIFS)(它們被認(rèn)為參與固氮酶金屬簇核心形成所必需的鐵和硫化物的運(yùn)動(dòng)〔J.Bacteriology，175，6737(1993)〕)對(duì)于從脫硫生物素大量生成生物素來(lái)說(shuō)非常有效。本發(fā)明就是基于這些發(fā)現(xiàn)。
因而，本發(fā)明提供了從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的方法，包括將脫硫生物素與含有bioB基因產(chǎn)物(它編碼生物素合成酶；下文稱作BIOB)和NIFU和/或NIFS的酶反應(yīng)系統(tǒng)接觸，從反應(yīng)混合物中分離所產(chǎn)生的生物素，尤其是這樣一種方法，其中BIOB得自于大腸桿菌以及NIFU和/或NIFS得自于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，或一種前述方法，其中該酶反應(yīng)混合物還含有S-腺苷甲硫氨酸，L-半胱氨酸和一種電子供應(yīng)系統(tǒng)，例如，其中該電子供應(yīng)系統(tǒng)包括NADPH，鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶和黃素氧化還原蛋白或其中該電子供應(yīng)系統(tǒng)包括脫氮核黃素或其功能等效組分。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述方法，其中該反應(yīng)是在pH6.0至8.5，優(yōu)選7.0至8.0，以及溫度為20至45℃，優(yōu)選25至40℃的范圍進(jìn)行的。
再者，本發(fā)明也提供了一種從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的發(fā)酵方法，包括在脫硫生物素的存在下并在一種水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種微生物，該微生物已被自身或包含于單個(gè)或互相獨(dú)立的幾個(gè)質(zhì)粒中的編碼BIOB和NIFU和/或NIFS的DNA序列轉(zhuǎn)化，從培養(yǎng)基中分離所產(chǎn)生的生物素，尤其是這樣一種方法，其中該微生物選自埃希氏菌屬并且特別是其中培養(yǎng)進(jìn)行1至5天，優(yōu)選1至3天，pH5至9，優(yōu)選6至8，并且溫度范圍為10至45℃，優(yōu)選25至40℃的方法。
本發(fā)明使用的酶反應(yīng)體系包括BIOB，NIFU和/或NIFS作為蛋白質(zhì)因子。對(duì)于上述反應(yīng)的BIOB來(lái)說(shuō)，可使用含有BIOB的細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞提取物或通過(guò)常規(guī)的酶分離方法部分或完全純化的BIOB。具有生物素合成酶活性的任何種類的BIOB均可用于該反應(yīng)，但優(yōu)選使用大腸桿菌BIOB。如果需要，通過(guò)下述步驟可獲得大量的純化的BIOB。構(gòu)建大腸桿菌的基因文庫(kù)，它含有覆蓋全長(zhǎng)bioB基因編碼區(qū)的適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段。因?yàn)橐阎竽c桿菌bioB基因位于一段1.3Kb的NcoI-HaeIII片段〔J.Biol.Chem.，263，19577(1988)〕中，可方便地使用該兩個(gè)限制性內(nèi)切酶。用于這一目的的一系列載體質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)商業(yè)途徑獲得?？蓮腜harmacia Biotech Co.獲得的載體質(zhì)粒pTrc 99A是現(xiàn)有技術(shù)通常使用的可誘導(dǎo)質(zhì)粒之一。然后，從上述大腸桿菌菌株的混合培養(yǎng)物中提取來(lái)自基因文庫(kù)的混合雜種質(zhì)粒DNA，并用于轉(zhuǎn)化bioB基因缺陷型大腸桿菌突變體。大腸桿菌R875〔bioB17J.Bacteriol.，112，830(1972)〕適用于這一目的。顯示生物素原養(yǎng)型的克隆是基于目的bioB基因的表達(dá)進(jìn)行選擇的。該克隆應(yīng)含有bioB基因并進(jìn)行表達(dá)。任何顯示該性質(zhì)的雜種質(zhì)粒均可用于獲得BIOB。被稱為pTrc EBI的雜種質(zhì)粒是目的質(zhì)粒之一。為獲得大量的BIOB，將用適當(dāng)?shù)募?xì)胞學(xué)方法被pTrc EBI轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109(Takara Shuzo Co.，Shiga，日本)在具誘導(dǎo)作用的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所產(chǎn)生的BIOB可用一般的層析技術(shù)進(jìn)行分離?；蛘?，大腸桿菌bioB基因表示質(zhì)?？筛鶕?jù)日本專利公開(Kokai)No.149091/1986或日本專利公開(Kokai)No.236493/1995所公開的已知方法構(gòu)建。
對(duì)上述反應(yīng)的NIFU和NIFS來(lái)說(shuō)，含有上述NIFU和NIFS蛋白質(zhì)的細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞提取物，或通過(guò)常規(guī)酶分離方法部分純化的NIFU和NIFS均可使用。任何一種具有從脫硫生物素形成生物素效能的NIFU和NIFS均可用于該反應(yīng)。但優(yōu)選使用肺炎克雷伯氏菌的NIFU和NIFS。肺炎克雷伯氏菌M5al是一種具有nifU和nifS基因的已明確定性的菌株。肺炎克雷伯氏菌的nifU和nifS基因是通過(guò)下述步驟獲得的。首先用限制性內(nèi)切酶(例如BamH1)切割的DNA片段構(gòu)建肺炎克雷伯氏菌M5al的基因文庫(kù)。因?yàn)橐阎窝卓死撞暇旧wDNA的一個(gè)2.5KbBamH1片段含有目的nifU和nifS基因〔J.Bacteriol.，169，4024(1987)〕，收集長(zhǎng)度為2.3-2.6Kb的片段，并將其連接于能在適當(dāng)微生物中復(fù)制的任何載體質(zhì)粒。載體質(zhì)粒pUC19(Takara Shuzo Co.)以及大腸桿菌JM109是構(gòu)建基因文庫(kù)的適合的質(zhì)粒和宿主微生物組合之一。然后，目的克隆可用常規(guī)方法進(jìn)行選擇，例如使用基于公開的nifU和nifS基因DNA序列而制備的合成寡核苷酸探針進(jìn)行集落雜交。隨后，含有nifU和nifS基因的DNA片段可亞克隆進(jìn)其它表達(dá)載體質(zhì)粒。該可誘導(dǎo)的載體質(zhì)粒(例如pTrc 99A)可有利地用于nifU和nifS基因的表達(dá)。大腸桿菌JM109(pKNnifO4)是表達(dá)nifU和nifS基因的合適克隆之一?；谝压_的bioB，nifS和nifU的DNA序列(可從任何已知的序列數(shù)據(jù)庫(kù)，例如European Bioinformatics Institute(Hinston Hall，Cambridge，GB)獲得)。編碼這些基因的DNA序列也可用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法進(jìn)行合成構(gòu)建，例如參閱EP747 483。使用公知的PCR技術(shù)，基于公開的序列可從任何一種微生物中分離編碼BIOB、NIFU或NIFS任何一種的DNA序列。這樣的微生物可從列于“Industrial Property”〔(1991)1，29-40〕雜志的任何一個(gè)已知的保藏機(jī)構(gòu)獲得，例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。
本發(fā)明所用的微生物的培養(yǎng)可用已知的方法進(jìn)行。含有可同化碳源、可消化氮源、無(wú)機(jī)鹽和微生物生長(zhǎng)所需的其它營(yíng)養(yǎng)物的水性培養(yǎng)基可用作本發(fā)明的水性培養(yǎng)基?？墒褂美缙咸烟恰⒐?、乳糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、糊精或甘油作為碳源?？墒褂美珉恕⒍狗?、玉米漿、肉青、硫酸銨、硝酸銨、尿素或任一種這些物質(zhì)的混合物作為氮源。此外，可使用鈣、鎂、鋅、錳、鈷或鐵的硫酸鹽、鹽酸鹽或磷酸鹽作為無(wú)機(jī)鹽。并且，如果需要，常規(guī)營(yíng)養(yǎng)因子或防沫劑，例如動(dòng)物油，植物油或礦物油也可包括在該水性培養(yǎng)基中。如果所獲得的微生物具有抗生素抗性標(biāo)記，相關(guān)的抗生素也可包括于該培養(yǎng)基中。如果目的基因的表達(dá)可受異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)，該化合物也可存在于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基合適的pH值為5至9，優(yōu)送6至8。合適的培養(yǎng)溫度范圍為10-45℃，優(yōu)選25-40℃。培養(yǎng)時(shí)間通常為1至5天，優(yōu)選1至3天。
對(duì)于從培養(yǎng)的細(xì)胞中制備無(wú)細(xì)胞提取物來(lái)說(shuō)，可以使用諸如超聲處理、在玻璃珠存在下或用弗氏壓碎器的細(xì)胞破碎的一般方法進(jìn)行。在細(xì)胞破碎后，將所得溶液離心以分離細(xì)胞碎片，其上清液即可用作無(wú)細(xì)胞提取物。
酶反應(yīng)系統(tǒng)中含有作為反應(yīng)組分的存在于上述制備的無(wú)細(xì)胞提取物中的BIOB和NIFU和/或NIFS蛋白質(zhì)或其部分純化物。除上述蛋白質(zhì)以外，加入脫硫生物素作為該反應(yīng)的底物。加入的脫硫生物素的量根據(jù)所用的酶反應(yīng)系統(tǒng)可有所不同。D-型脫硫生物素和D-和L-型脫硫生物素均可用作底物。S-腺苷甲硫氨酸、L-半胱氨酸和一種電子供應(yīng)系統(tǒng)，例如脫氮核黃素或脫氮核黃素的功能等效組分的加入可刺激該反應(yīng)。除了電子供應(yīng)系統(tǒng)脫氮核黃素或其功能等效組分(特別是作為人工電子供體)可用于該反應(yīng)外，鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶和黃素氧化還原蛋白以及NADPH一起也可用作該反應(yīng)的生理電子供應(yīng)系統(tǒng)。根據(jù)所用的酶反應(yīng)體系，這些添加組分的最適濃度可有所不同。但總的來(lái)說(shuō)，我們建議，S-腺苷甲硫氨酸為50μM-2mM，L-半胱氨酸為10μm-2mM，脫氮核黃素為10-1000μM。
為了反應(yīng)的進(jìn)行，可使用對(duì)生物素的形成沒(méi)有負(fù)作用的緩沖液。優(yōu)選使用Tris-HCl緩沖液。該酶反應(yīng)適宜在pH范圍為6.0至8.5，優(yōu)選在7.0至8.0的范圍內(nèi)進(jìn)行。合適的反應(yīng)溫度為20-45℃，優(yōu)選25-40℃。如果使用脫氮核黃素來(lái)刺激反應(yīng)，適合使用距反應(yīng)混合物約10cm遠(yuǎn)處放置的熒光燈進(jìn)行光還原啟動(dòng)。溫育時(shí)間可以在30分鐘和3小時(shí)之間。只要酶仍有活性可以進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的溫育。
除了上述酶反應(yīng)系統(tǒng)外，也可直接使用nifU和nifS基因。例如，可以將前文所述制備的bioB、nifU和nifS基因置于一個(gè)質(zhì)?；蚨鄠€(gè)互相獨(dú)立的質(zhì)粒中，通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入宿主微生物例如大腸桿菌中。然后，從脫硫生物素生產(chǎn)生物素可在生長(zhǎng)系統(tǒng)、靜止系統(tǒng)以及如果需要在使用上述微生物無(wú)細(xì)胞提取物的酶反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行。任何一種被修飾的共同過(guò)量表達(dá)bioB、nifU和nifS基因的大腸桿菌菌株均可有利地用于本發(fā)明。在這些菌株中，特別優(yōu)選大腸桿菌JMl09(pTrcEB1，pKNnif05)菌株和大腸桿菌JM109(pKNnif06)菌株。
在上述條件下從脫硫生物素生產(chǎn)的生物素可容易地進(jìn)行回收。為了這一目的，可以使用通常用于將某種產(chǎn)品從其溶液中提取出來(lái)的方法，該方法應(yīng)適合于生物素的各種性質(zhì)。例如，將固體物質(zhì)從溶液中移出之后，將濾液中的生物素吸附于活性碳上，然后洗脫并用離子交換樹脂進(jìn)一步純化?；蛘?，將濾液直接加到離子交換樹脂上，洗脫后，將所需產(chǎn)品從乙醇和水的混合物中重結(jié)晶。
下述實(shí)施例將更加詳細(xì)地介紹本發(fā)明；但應(yīng)理解本發(fā)明的范圍并不限于這些特定的實(shí)施例。實(shí)施例中提及的并附于本文后面的附圖總述于下

圖1大腸桿菌bioB基因的克隆策略。
圖2pTrc EB1的結(jié)構(gòu)。
圖3純化的大腸桿菌BIOB SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖4純化的大腸桿菌BIOB的吸收光譜。
圖5肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS簇的克隆策略以及pKNnif02的結(jié)構(gòu)。
圖6具有肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS簇的中間質(zhì)粒pKNnif03的構(gòu)建。
圖7nifU和nifS基因表達(dá)質(zhì)粒pKNnif04的構(gòu)建。
圖8nifU和nifS基因表達(dá)質(zhì)粒pKNnif05的構(gòu)建。
圖9bioB、nifU和nifS基因表達(dá)質(zhì)粒pKNnif06的構(gòu)建。
實(shí)施例1大腸桿菌bioB基因的克隆和表達(dá)(1)總DNA的制備將大腸桿菌HB101在37℃〔J.Mol.Biol.，41，459(1969)；TakaraShuzo Co.〕培養(yǎng)于100ml Luria液體培養(yǎng)基(LB)(1％胰胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl；pH7.5)中10小時(shí)，并離心收集細(xì)菌細(xì)胞。用酚方法從細(xì)胞中提取總DNA(基因融合實(shí)驗(yàn)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1984，pp.137-139；Sambrook et al.1989“分子克隆”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，得到0.7mg的總DNA。
(2)基因組文庫(kù)制備如圖1所示，將3μg的總DNA用NcoI和HaeIII完全消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離1.2-1.5kb的片段。用DNA連接試劑盒(TakaraShuzo Co.，Japan)根據(jù)制造商的說(shuō)明，將該DNA片段與用NcoI和SmaI消化的載體質(zhì)粒pTrc 99A(Pharmacia Bio tech Co.，Pharmacia，Uppsala，Sweden)相連接。通過(guò)適當(dāng)?shù)募?xì)胞學(xué)方法(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1982，pp.252-253)將該連接混合物轉(zhuǎn)移至大腸桿菌菌株JM109〔基因33，103(1985)〕，并在LB培養(yǎng)基瓊脂平板上將該菌株進(jìn)行氨芐青霉素抗性篩選(100μg/ml)。獲得了在強(qiáng)雜種色氨酸/乳糖啟動(dòng)子〔基因69，301-315(1988)；以下稱“trc啟動(dòng)子”〕下游具有插入的基因組DNA片段的3000個(gè)單個(gè)克隆，并將其作為基因組文庫(kù)。
將具有基因組文庫(kù)的氨芐青霉素抗性菌株在37℃下，在含有100μg/ml氨芐青霉素的50ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)，離心收集細(xì)菌細(xì)胞。用堿變性方法從細(xì)菌細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA庫(kù)(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1982，pp.90-91)。
(3)篩選具有大腸桿菌bioB基因的雜種質(zhì)粒用適當(dāng)細(xì)胞學(xué)方法將質(zhì)粒DNA庫(kù)轉(zhuǎn)移至大腸桿菌bioB缺陷型突變體R875〔J.Bacteriol.112，830-839(1972)〕。為獲得攜帶bioB基因的克隆，在含有100μg/ml氨芐青霉素，0.075U/ml抗生物素蛋白和0.1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培養(yǎng)基瓊脂平板上篩選氨芐青霉素抗性和生物素原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體。
將所獲得的轉(zhuǎn)化體之一在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從細(xì)胞中提取雜種質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶分析分離的質(zhì)粒。該雜種質(zhì)粒具有含有bioB基因的1.3kb的NcoI-HaeIII片段，并被命名為pTrc EB1(見圖2)。將具有該質(zhì)粒的大腸桿菌菌株JM109命名為大腸桿菌JM109(pTrc EB1)。
(4)大腸桿菌中bioB基因的表達(dá)在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中將大腸桿菌JM109(pTrc EB1)在37℃預(yù)培養(yǎng)過(guò)夜。將0.1ml的該預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至試管中的5ml同一種培養(yǎng)基中。37℃培養(yǎng)3小時(shí)后，以2mM的濃度加入IPIG以誘導(dǎo)trc啟動(dòng)子，并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。收集細(xì)菌細(xì)胞并用鹽水洗滌。經(jīng)超聲處理破碎細(xì)胞，并將總細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以證實(shí)bioB基因的表達(dá)，這是根據(jù)Laemmli描述的方法進(jìn)行的〔Nature，227，680-685(1970)〕。BIOB以約2％總細(xì)胞蛋白質(zhì)的量被過(guò)量產(chǎn)生。
實(shí)施例2BIOB的分離將大腸桿菌JM109(pTrc EB1)細(xì)胞用含有100μg/ml氨芐青霉素的2L Terrific液體培養(yǎng)基(TB；每升含24g酵母提取物/Difco，12g胰胨/Difco，4g甘油，2.31g KH2PO4，12.54g K2HPO4)在37℃需氧培養(yǎng)3小時(shí)。在加入1mM IPTG后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)以誘導(dǎo)BioB蛋白質(zhì)的表達(dá)。8000xg離心20分鐘收集細(xì)胞，用含有0.1M NaCl和1mM EDTA的20mM Tris-HCl/pH8.1(下文稱為TB)洗滌，用不含1mM EDTA的同一種緩沖液洗滌并貯存于-80℃直至使用。除非另有說(shuō)明，所有的柱操作均是在室溫下進(jìn)行，其它的操作是在4-10℃進(jìn)行。BIOB被示蹤為相當(dāng)于柱層析上紅帶的SDS-PAGE蛋白質(zhì)帶(分子量為37kDa)。用含有5mM 2-巰基乙醇(下文稱作2-ME)的約60ml TB將細(xì)胞解凍，并在0.25mM苯甲基磺酰氟，10μg/ml脫氧核糖核酸酶I和10μg/ml核糖核酸酶A的存在下通過(guò)弗氏壓碎器進(jìn)行破碎，并通過(guò)15000xg離心30分鐘除去細(xì)胞碎片。用含有5mM 2-ME的TB將溶液增容至200ml，并在該溶液中加入相同體積的(200ml)含有20％硫酸銨(w/v)的TB。加入1mM EDTA后，溶液中的蛋白質(zhì)被加樣至已用含有2mM 2-ME和10％硫酸銨平衡的Pheny1-Toyopearl 650M(4.4×10cm；Tosoh，Tokyo，Japan)上，用同一種緩沖液洗滌并用不含10％硫酸銨的同一種緩沖液洗脫。將洗脫液用含有2mM2-ME的TB稀釋4倍，并加樣至已用含2mM 2-ME的TB平衡過(guò)的Q-Sepharose(4.4×10cm，Pharmacia)上。用同一種緩沖液洗滌后，用1200ml的0-0.5M線性梯度NaCl進(jìn)行洗脫。收集位于0.3M NaCl濃度周圍的BIOB峰，加入硫酸銨至10％(w/v)并將該溶液加樣至已用含有2mM 2-ME和10％(w/v)硫酸銨平衡過(guò)的Phenyl-Toyopearl6505(2.2×Scm，Tosoh)上。用同一種緩沖液洗滌后，用250ml的10-0％(w/v)線性梯度硫酸銨進(jìn)行洗脫。收集位于6％硫酸銨濃度周圍的BIOB峰，用Centriprep-30(Amicon)濃縮至約3ml，并通過(guò)用含有2mM 2-ME和0.25M NaCl的TB平衡過(guò)的HiPrep Sephacryl S200HR26/60(Pharmacia)。收集具紅色的BIOB峰，用同一體積的含有2mM 2-ME的TB稀釋并加樣至已用相同緩沖液平衡過(guò)的RESOURCE Q6ml(Pharmacia)上。洗滌后，用120ml 0-0.5M線性梯度NaCl進(jìn)行洗脫。收集具紅色的BIOB峰。貯存前，用含有1mM二硫蘇糖醇(下文稱作DTT)的50mM Tris-HCl/pH8.1將BIOB再一次稀釋至蛋白質(zhì)終濃度為約1mg/ml，并在室溫下用100μM FeCl3和50μM Na2S厭氧溫育2小時(shí)。通過(guò)用含有0.2mM DTT的0.1M Tris-HCl/pH7.5平衡過(guò)的Sephadex G-25(M，1.5×18cm，Pharmacia)除去多余的離子和DTT。將BIOB蛋白質(zhì)濃縮至蛋白質(zhì)終濃度為20-30mg/ml并貯存于-80℃。上述制備的BioB蛋白質(zhì)的純度估計(jì)為80％以上，并在SDS-PAGE上具有約37kDa分子量的單一蛋白質(zhì)帶(見圖3)。上述制備的BioB蛋白質(zhì)顯示了鐵-硫蛋白質(zhì)典型的吸收光譜圖形(見圖4)。
實(shí)施例3克雷伯氏菌nifU和nifS基因的克隆和表達(dá)(1)總DNA的制備將肺炎克雷伯氏菌菌株M5a1〔Nature，237，102(1972)〕在37℃在50ml LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10小時(shí)，離心收集細(xì)菌細(xì)胞。用酚方法提取總DNA。
(2)基因組文庫(kù)制備肺炎克雷伯氏菌nifU的nifS基因克隆的操作過(guò)程示于圖5。用BamHI完全消化總DNA(2μg)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳獲得2.3-2.6kb的DNA片段。用BamHI完全消化載體質(zhì)粒PUC19(TakaraShuzo Co.)，然后用堿性磷酸酶處理以避免自連接。用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo Co.)將上述制備的基因組DNA片段與切割的pUC19連接，用適當(dāng)細(xì)胞學(xué)方法將該連接混合物轉(zhuǎn)移至大腸桿菌菌株JM109中。在LB培養(yǎng)基瓊脂平板上篩選氨芐青霉素抗性(100μg/ml)菌株。獲得2000個(gè)具有基因組DNA片段的單個(gè)克隆作為基因組文庫(kù)。
(3)篩選具有肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS基因的克隆根據(jù)Maniatis等人描述的方法(分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1982，pp.326-328)進(jìn)行集落雜交來(lái)篩選具有肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS基因的克隆。
將瓊脂平板上生長(zhǎng)的克隆轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Hy bondN，AmershamCo.)上并用堿溶解。變性的DNA被固定至膜上。根據(jù)制造商的說(shuō)明用DIG DNA標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)(Boehringer MannheimCo.，Mannheim，Germany)進(jìn)行雜交。合成兩個(gè)具有部分nifU和nifS基因序列的寡核苷酯。該序列如下所示nifU探針(見第10頁(yè)序列)nifS探針(見第10頁(yè)序列)用DIG寡核苷酸3’-末端標(biāo)記試劑盒(Boehringer MannheimCo.)將這些寡核苷酸的3’-末端進(jìn)行標(biāo)記，將標(biāo)記的寡核苷酸混合物用作雜交的探針。用DIG發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim Co.)檢測(cè)雜交的克隆。獲得26個(gè)攜帶nifU和nifS基因的候選物。
選出4個(gè)候選物，并將具有該候選物的轉(zhuǎn)化體在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。用堿變性方法從細(xì)胞中提取雜種質(zhì)粒并用限制性酶(BamHI，VspI和ScaI)進(jìn)行分析。用ALFred DNA測(cè)序儀(Pharmacia Biotech Co.)確定插入 DNA片段兩端的300-400個(gè)核苷酸的序列。被確定的序列與Beynon〔J.Bacteriol.169，4024-4029(1987)〕公開的肺炎克雷伯氏菌nifU，S簇的核苷酸序列相同。這些結(jié)果顯示，所獲得的克隆具有肺炎克雷伯氏菌nifU，S簇。將nifU，S簇以與乳糖(lac)啟動(dòng)子在載體中的相同方向插入的雜種質(zhì)粒命名為pKNnif01。將具有以lac啟動(dòng)子相反方向插入的nifU，S簇的雜種質(zhì)粒命名為DKNnif02(見圖5)。
(4)雜種質(zhì)粒pKNnif03的構(gòu)建(見圖6)將載體質(zhì)粒pBluescript II-SK+(Toyobo Co.，Tokyo，Japan)用HincII和BamHI完全消化。將雜種質(zhì)粒pKNnif02用VspI完全消化。將切割的pKNnif02用DNA平頭化試劑盒(Takara Shuzo Co.，Japan)進(jìn)行平頭化并用BamHI完全消化。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳獲得一個(gè)含有nifU，S簇的2.4kb的片段。將該2.4kb的片段用DNA連接試劑盒插入切割的pBluescript II-SK+中，得到雜種質(zhì)粒pKNnif03。
(5)雜種質(zhì)粒pKNnif04的構(gòu)建(見圖7)將載體質(zhì)粒pTrc99A用KpnI和BamHI完全消化。將雜種質(zhì)粒pKNnif03用KpnI和BamHI完全消化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳獲得一個(gè)含有nifU，S簇的2.4kb的KpnI-BamHI片段。用DNA連接試劑盒將該2.4kb的片段與切割的pTrc99A連接。最終得到在trc啟動(dòng)子下游插入了nifU，S簇的雜種質(zhì)粒pKNnif04。具有該雜種質(zhì)粒的大腸桿菌菌株JM109被命名為大腸桿菌JM109(pKNnif04)。
(6)克雷伯氏菌nifU和nifS基因的表達(dá)將大腸桿菌JM109(pKNnif04)在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)。將0.1ml該預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至試管中的5ml同一種培養(yǎng)基中。30℃培養(yǎng)3小時(shí)后，以1mM的濃度加入IPTG以誘導(dǎo)trc啟動(dòng)子，并繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。收集細(xì)菌細(xì)胞并用鹽水洗滌。經(jīng)超聲處理破碎細(xì)胞，并根據(jù)Laemmli描述的方法〔Nature，227，680-685(1970)〕將總細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE以證實(shí)nifU和nifS基因的表達(dá)。
實(shí)施例4制備具有/沒(méi)有NIFU和NIFS的大腸桿菌的無(wú)細(xì)胞提取物在含有100μg/ml氨芐青霉素的Terrific液體培養(yǎng)基(見實(shí)施例2)中將大腸桿菌JM109(pKNnif04)和大腸桿菌JM109(pTrc 99A)細(xì)胞在30℃需氧培養(yǎng)3小時(shí)。加入1mM IPTG后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)NifU和NIFS的表達(dá)。8000xg離心20分鐘收集細(xì)胞，用含有0.1MNaCl和1mM EDTA的TB洗滌一次，用不含1mM EDTA的同種緩沖液洗滌兩次并貯存于-80℃直至使用。
按如下所述制備每一菌株的無(wú)細(xì)胞提取物。解凍細(xì)胞并懸浮于相對(duì)于細(xì)胞溫重的約2倍體積的含有0.2mM 2-ME的0.1M Tris-HCl/pH7.5中。將懸液中的細(xì)胞脫氣，用氬氣清洗并在有氬氣的密封試管中用超聲處理器(Bioruptor，Cosmo Bio)破碎。100000xg離心30分鐘除去不溶性物質(zhì)。得到的上清液被用作無(wú)細(xì)胞提取物。用6％三氯乙酸進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀和用丙酮洗滌蛋白質(zhì)后，通過(guò)BCA蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)(PIERCE，Rockford，IL61105，USA)確定該無(wú)細(xì)胞提取物的總蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)上述方法得到了蛋白質(zhì)濃度約為30mg/ml的無(wú)細(xì)胞提取物。在相同蛋白質(zhì)濃度下與具有pTrc 99A的大腸桿菌JM109相比，表達(dá)NIFU和NIFS的大腸桿菌JM109(pKNnif04)的無(wú)細(xì)胞提取物顯示明顯的紅色。將無(wú)細(xì)胞提取物在有氬氣的密封試管中貯存于一80℃。
實(shí)施例5體外酶反應(yīng)(DAF系統(tǒng))酶反應(yīng)混合物在50μl的總體積中含有100μM脫硫生物素，1000μMS-腺苷甲硫氨酸〔SAM〕，200μML-半胱氨酸，50μM脫氮核黃素〔DAF〕，0.6mg/ml(16μM)BIOB蛋白質(zhì)，20mg蛋白質(zhì)/ml的大腸桿菌JM109(pKNnif04)和大腸桿菌JM109(pTrc99A)的無(wú)細(xì)胞提取物混合物，以及0.1M Tris-HCl/pH7.5。通過(guò)在黑暗條件下重復(fù)進(jìn)行輕微吸氣和氬氣壓力使存在于300μl錐形底玻璃試管中的酶反應(yīng)混合物處于厭氧條件。用位于10cm遠(yuǎn)的20W熒光燈泡進(jìn)行光照射，在30℃啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)80分鐘后，在95℃加熱終止反應(yīng)，通過(guò)用胚芽乳桿菌(Lactobacillus Plantarum)(ATCC 8014)進(jìn)行微生物分析來(lái)確定所產(chǎn)生的生物素。將從大腸桿菌JM109(pKNnif04)和大腸桿菌JM109(pTrc99A)得到的兩種無(wú)細(xì)胞提取物以不同的比率并以反應(yīng)混合物中20mg/ml的恒定蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行混合。與從表達(dá)NIFU和NIFS蛋白質(zhì)的大腸桿菌JM109(pKNnif04)得到的無(wú)細(xì)胞提取物的比率增加相一致，觀察到生物素的產(chǎn)量顯著增加。
當(dāng)從大腸桿菌JM109(pKNnif04)得到的無(wú)細(xì)胞提取物的含量為64％時(shí)，其生物素的產(chǎn)量比對(duì)照高約1.8倍(見表1)。
表1
<p>附注A＝大腸桿菌JM109(pTrc 99A)的無(wú)細(xì)胞提取物B＝大腸桿菌JM109(pKNnif04)的無(wú)細(xì)胞提取物實(shí)施例6共同表達(dá)bioB、nifU和nifS基因的大腸桿菌菌燥的構(gòu)建(1)雜種質(zhì)粒pKNnif05的構(gòu)建(見圖8)將載體質(zhì)粒pMW218(Nippon Gene Co.，Tokyo，Japan)用KpnI和BamHI完全消化。用DNA連接試劑盒將從實(shí)施例3中的雜種質(zhì)粒pKNnif03得到的攜帶nifU，S簇的2.4kb KpnI-BamHI片段與切割的pMW218連接。最終得到了在lac啟動(dòng)子的下游插入了nifU，S簇的雜種質(zhì)粒pKNnif05。
用適當(dāng)細(xì)胞學(xué)方法將載體質(zhì)粒pMw218和雜種質(zhì)粒pKNnif05轉(zhuǎn)移至大腸桿菌JM109(pTrc EB1)，并在含有100μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化體。將具有雜種質(zhì)粒pTrcEB1和載體質(zhì)粒pMW218的大腸桿菌菌株JM109命名為大腸桿菌JM109(pTrcEB1和pMW218)。將具有雜種質(zhì)粒pTrc EB1和pKNnif05的大腸桿菌菌株JM109命名為大腸桿菌JM109(pTrcEB1，pKNnif05)。
(2)雜種質(zhì)粒pKNnif06的構(gòu)建(見圖9)將雜種質(zhì)粒pTrc EB1用BamHI完全消化并用堿性磷酸酶處理以避免自連接。將雜種質(zhì)粒pKNnif02用VspI完全消化。用DNA平頭化試劑盒將切割的pKNnif02平頭化并用DNA連接試劑盒與BamHI接頭(Takara Shuzo Co.)連接。用BamHI完全消化后，用瓊脂糖凝膠電泳獲得含有nifU，S簇的2.4kb的BamHI片段。用DNA連接試劑盒將該2.4kb的片段插入到切割的pTrc EB1中。最終獲得了在trc啟動(dòng)子下游插入了bioB、nifU和nifS基因的雜種質(zhì)粒pKNnif06。具有該雜種質(zhì)粒的大腸桿菌菌株JM109被命名為大腸桿菌JM109(pKNnif06)。
(3)大腸桿菌中bioB、nifU和nifS基因的共表達(dá)在含有100μg/ml氨芐青霉素和10μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中和含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中分別將大腸桿菌JM109(pTrc EB1，pKNnif05)和大腸桿菌JM109(pKNnif06)在30℃過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)。將0.1ml該預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至存在于試管中的5ml同一處培養(yǎng)基中。30℃培養(yǎng)3小時(shí)后，以1mM濃度加入IPTG誘導(dǎo)，并繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。收集細(xì)菌細(xì)胞并用鹽水洗滌。經(jīng)超聲處理破碎細(xì)胞，根據(jù)Laemmli描述的方法〔Nature，227，680-685(1970)〕將總細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE以證實(shí)bioB、nifU和nifS基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中共同大量產(chǎn)生了BIOB、NIFU和NIFS蛋白質(zhì)。
實(shí)施例7發(fā)酵生產(chǎn)生物素(1)由大腸桿菌JM109(pTrc EB1，pKNnif05)和大腸桿菌JM109(pKNnif06)生產(chǎn)生物素將大腸桿菌JM109(pTrc EB1，pMw218)和大腸桿菌JM109(pTrc Eb1，pKNnif05)接種于含有100μg/ml氨芐青霉素，10μg/ml卡那霉素和200μg/ml脫硫生物素的50ml PC培養(yǎng)基(2％甘油，5％蛋白酶胨，2％酪蛋白水解物，1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·4-6H2O，0.001％FeSO4·7H2O；pH7.0)中。并在30℃震蕩培養(yǎng)3小時(shí)。然后，以1mM的濃度加入IPTG來(lái)誘導(dǎo)trc啟動(dòng)子，并在30℃震蕩培養(yǎng)27小時(shí)。將大腸桿菌JM109(pTrc 99A)，大腸桿菌JM109(pTrc EB1)和大腸桿菌JM109(pKNnif06)接種于50ml含10μg/ml氨芐青霉素和20μg/ml脫硫生物素的PC培養(yǎng)基中，并以與上述相同的方式培養(yǎng)。
培養(yǎng)后，將1.5ml的培養(yǎng)液離心以除去細(xì)菌細(xì)胞，得到上清液。通過(guò)用胚芽乳桿菌(ATCC8014)的微生物檢測(cè)來(lái)測(cè)定上清液中生物素的產(chǎn)生。該4個(gè)菌株產(chǎn)生的生物素的平均量示于表2。
表2菌株編號(hào) 生物素(mg/L)JM109(pTrc 99A) 0JM109(pTrc EB1) 2.03JM109(pTrc EB1，pMW218) 2.61JM109(pTrc EB1，pKNnif05)4.00
JM109(pKNnif06) 4.71實(shí)施例8NIFU和NIFS的分離用1L含有100μg/ml氨芐青霉素的Terrific液體培養(yǎng)基將大腸桿菌JM109(pKTnif04)細(xì)胞在26℃需氧培養(yǎng)3小時(shí)。加入1mM IPTG后繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)以誘導(dǎo)NIFU和NIFS基因的表達(dá)。在8000xg離心20分鐘收集細(xì)胞(濕重5.4g)，用含有0.1M NaCl和1mM EDTA的20mMTris-HCl/pH7.4洗滌，用不含1mM EDTA的同種緩沖液洗滌兩次并貯存于-80℃直至使用。
除非另有說(shuō)明，所有的柱操作均是在室溫厭氧條件下進(jìn)行，其它操作是在4-10℃厭氧條件下進(jìn)行。NIFU和NIFS蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上被示蹤為蛋白質(zhì)帶。將細(xì)胞用含有5mM二硫蘇糖醇(下文稱作DTT)的約40ml 20mM Tris-HCl/pH7.4解凍，并在0.5mM苯甲基磺酰氟，10μg/ml脫氧核糖核酸酶I，10μg/ml核糖核酸酶A和5mM磷酸 吡哆醛的存在下通過(guò)弗氏破碎器進(jìn)行破碎。7700xg離心30分鐘除去細(xì)胞碎片并在48000xg離心30分鐘除去不溶性組分。將溶液用同一種緩沖液增容至50ml，并加入硫酸鏈霉素至終濃度1％(w/v)。48000xg離心20分鐘除去不溶性沉淀并向上清液中加入固體硫酸銨至30％飽和。室溫下輕微攪動(dòng)10分鐘后，48000xg離心10分鐘得到含有NIFU和NIFS蛋白質(zhì)的沉淀物。將該沉淀物重新懸浮于含有5mM DTT的20mMTris-HCl/pH7.4中，將48000xg離心30分鐘得到的上清液加樣至已用含5mMDTT的20mM Tris-HCl/pH7.4平衡過(guò)的RESOURCE Q(6ml，Pharmacia)上。用同一種緩沖液洗滌后，用150ml 0-0.5M線性梯度NaCl洗脫。NIFU和NIFS蛋白質(zhì)在0.3M NaCl周圍于20ml級(jí)分中共同洗脫出來(lái)，收集該級(jí)分，并用DM-30(Amicon)濃縮至3.5ml。將該濃縮的蛋白質(zhì)溶液與含有5mM DTT和0.25M NaCl的20mMTris-HCl/pH7.4一起通過(guò)HiPrep Sephacryl S-200 HR 26/60(Pharmacia)。全部的NIFS蛋白質(zhì)以與NIFU蛋白質(zhì)組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式被收回，部分NIFU蛋白質(zhì)以單體形式被回收。NIFU/S復(fù)合物在約140kDa分子量的位置被洗脫出來(lái)，NIFU單體在約35kDa分子量的位置被洗脫出來(lái)。將18ml含有NIFU/S復(fù)合物的級(jí)分和24ml含NIFU單體的級(jí)分用CentriPlus-30(Amicon)濃縮至3ml并貯存于-80℃。
實(shí)施例9純化的NIFU/S復(fù)合物和NIFU單體對(duì)生物素形成的影響沒(méi)有無(wú)細(xì)胞提取物的酶反應(yīng)混合物在50μl的總體積中含有100μM脫硫生物素，1000μMSAM，200μML-半胱氨酸，50μM脫氮核黃素，0.6μg/ml(16μM)BIOB蛋白質(zhì)，100mM DTT和0.1MTris-HCl/pH7.5。通過(guò)在黑暗條件下重復(fù)的輕微吸氣和氬氣壓力使300μl錐形玻璃試管中的酶反應(yīng)混合物處于厭氧條件。在30℃用置于10cm遠(yuǎn)的20W熒光燈泡進(jìn)行光照束啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)80分鐘后，在95℃加熱終止反應(yīng)，所產(chǎn)生的生物素通過(guò)使用胚芽乳桿菌(ATCC 8014)的微生物檢測(cè)來(lái)確定。
檢測(cè)純化的NIFU/S復(fù)合物和/或純化的NIFU單體的加入對(duì)酶反應(yīng)混合物的影響。加入13μM純化的NIFU/S復(fù)合物或30μM NIFU單體顯示生物素的產(chǎn)生提高了約4倍。同時(shí)加入13μM純化的NIFU/S復(fù)合物和30μMNIFU單體顯示生物素的產(chǎn)生提高了約9倍。(見表3)表3<
>
權(quán)利要求
1.一種從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的方法，包括將脫硫生物素與含有BIOB以及NIFU和/或NIFS的酶反應(yīng)系統(tǒng)接觸，并從反應(yīng)混合物中分離所產(chǎn)生的生物素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中BIOB得自大腸桿菌，NIFU和/或NIFS得自肺炎克雷伯氏菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中該酶反應(yīng)混合物還含有S-腺苷甲硫氨酸，L-半胱氨酸和一種電子供應(yīng)系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中該電子供應(yīng)系統(tǒng)含有NADPH，鐵氧化還原蛋白-NADP還原酶和黃素氧化還原蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中該電子供應(yīng)系統(tǒng)含有脫氮核黃素或其功能等效組分。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)的方法，其中反應(yīng)是在pH6.0至8.5，優(yōu)選7.0至8.0，溫度范圍為20-45℃，優(yōu)選25至40℃的條件下進(jìn)行的。
7.一種從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的方法，包括在一種水性培養(yǎng)基中，在脫硫生物素的存在下培養(yǎng)一種微生物，該微生物已被自身編碼BIOB和NIFU和/或NIFS的DNA序列或包含于單個(gè)或互相獨(dú)立的多個(gè)質(zhì)粒中的這種DNA序列轉(zhuǎn)化，從培養(yǎng)基中分離所產(chǎn)生的生物素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中該微生物選自埃希氏菌屬。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中培養(yǎng)進(jìn)行1至5天，優(yōu)選1至3天，并且是在pH5至9，優(yōu)選6至8，溫度范圍為10至45℃，優(yōu)選25至40℃的條件下進(jìn)行的。
10.本文前述的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的方法,包括將脫硫生物素與含有BIOB以及NIFU和/或NIFS的酶反應(yīng)系統(tǒng)接觸,并從反應(yīng)混合物中分離所產(chǎn)生的生物素,也涉及一種從脫硫生物素生產(chǎn)生物素的方法,包括在水性培養(yǎng)基中,在脫硫生物素的存在下培養(yǎng)一種微生物,該微生物已被自身編碼BIOB和NIFU和/或NIFS的DNA序列或包含于單個(gè)或互相獨(dú)立的多個(gè)質(zhì)粒中的這種DNA序列轉(zhuǎn)化,從培養(yǎng)基中分離所產(chǎn)生的生物素。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1170762SQ97109779
公開日1998年1月21日 申請(qǐng)日期1997年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月6日
發(fā)明者星野達(dá)雄, 朝倉(cāng)明, 喜安達(dá)也, 長(zhǎng)橋喜惠 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司