專利名稱：：脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種利用新的脆壁克魯維酵母基因構(gòu)建的重組多核苷酸載體和可用于該載體轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株，以及脆壁克魯維酵母高效的轉(zhuǎn)化方法。脆壁克魯維酵母(Kluyveromyecsfragilis)是食品工業(yè)中一種重要的生產(chǎn)菌株，它傳統(tǒng)地應(yīng)用于生產(chǎn)乙醇、乳糖酶和單細(xì)胞蛋白等產(chǎn)品。近年的研究發(fā)現(xiàn)，這種酵母菌具有生長(zhǎng)迅速、生物量大、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單和蛋白分泌能力強(qiáng)的生理特點(diǎn)。因此它具有被發(fā)展成為一種能大量表達(dá)異源蛋白的基因工程生產(chǎn)菌株的潛在價(jià)值。要把脆壁克魯維酵母發(fā)展成一個(gè)生產(chǎn)異源蛋白的基因工程生產(chǎn)菌株，首先必須建立脆壁克魯維酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。一個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)最基本的組成要素包括1.合適的受體菌株；2.適合于這個(gè)菌株的重組載體；3.便于分離篩選轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記；4.將該載體引入受體細(xì)胞的有效方法。雖然在乳酸克魯維酵母(Kluyveromyecslactis)的某些菌株中(Bianchi，M.M.etalCurrentGenetics1987，12185-192)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyecsmarxianus)的某些菌株中(Iborra，F(xiàn).CurrentGenetics1993，24181-183)已建立了高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，但到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)有人報(bào)道在脆壁克魯維酵母(KluyveromyecsfragilisCBS397)中建立起高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)(通過(guò)光盤檢索1966-1996年間的Medline)。Das，S等人在J.Bacteriology(1984)1581165-1167中敘述了脆壁克魯維酵母(KluyveromyecsfragilisC21)的轉(zhuǎn)化方法。但是他們使用的載體是pGL2，采取的是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，得到的轉(zhuǎn)化效率非常低(20個(gè)轉(zhuǎn)化子/每10微克質(zhì)粒DNA)。Chen，X.J.等人在CurrentGenetics(1989)1695-98中報(bào)道了用pKD1衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多種酵母菌株的研究，其中包括對(duì)脆壁克魯維酵母K.fragilisCBS397，K.fragilisATCC36907和SaccharomycesfragilisATCC12424的轉(zhuǎn)化嘗試。結(jié)果在上述三個(gè)菌株中都沒(méi)得到轉(zhuǎn)化子。以往人們未能在脆壁克魯維酵母建立起高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的主要原因有以下幾方面1.沒(méi)有合適的受體菌株；2.缺乏理想的載體；3.缺少有效的選擇標(biāo)記；4.沒(méi)有適合于脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化方法。這些都是建立脆壁克魯酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的難點(diǎn)所在。國(guó)際上長(zhǎng)期以來(lái)在脆壁克魯維酵母中未能建立起高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，嚴(yán)重限制了它在遺傳工程中的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的目的在于建立一種能夠解決上述難點(diǎn)的脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。發(fā)明者應(yīng)用現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的理論和方法針對(duì)上述難點(diǎn)開展研究，最終很好地解決了這些問(wèn)題，并創(chuàng)立了脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其中包括(1).構(gòu)建了合適的脆壁克魯維酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體菌株K.fragilisHKY0039；(2).利用脆壁克魯維酵母的26SrRNA基因片斷構(gòu)建了脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)和pGEr-11；(3).建立了利用上述載體對(duì)脆壁克魯維酵母典型菌株和基因突變菌株的高效轉(zhuǎn)化方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明提出的脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括適合于高效轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株、用于該菌株的重組多核苷酸載體以及將該載體引入脆壁克魯維酵母受體菌株的高效方法。其中(1).所述的受體菌株為脆壁克魯維酵母的典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397和其突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039(CCTCC編號(hào)為No.M97003)。(2).所述的重組多核苷酸載體為帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片斷序列的pPru16(X1)(CCTCCNo.M97005)和pGEr-11(CCTCCNo.M97004)之任一種。(3).所述的轉(zhuǎn)化方法是利用上述重組多核苷酸載體轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397或其突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039(CCTCC編號(hào)為No.M97003)并得到轉(zhuǎn)化菌株的方法。下面對(duì)本
發(fā)明內(nèi)容進(jìn)一步作具體說(shuō)明1.構(gòu)建了合適的營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體菌株K.fragilisHKY0039以往人們?cè)谶M(jìn)行脆壁克魯維酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化研究時(shí)，由于沒(méi)有現(xiàn)成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體菌株可供利用，所以不得不用帶有抗生素抗性基因(如抗G418的基因Tn903)的載體去轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母的野生型菌株。因?yàn)镚418(Geneticin)是一種氨基糖苷類抗生素，不同的菌株對(duì)它的天然抗性有很大差異。當(dāng)用量不足時(shí)，許多非轉(zhuǎn)化菌落也混雜于轉(zhuǎn)化子中間；而當(dāng)用量過(guò)多時(shí)，由于其藥物的毒性作用，許多真正的轉(zhuǎn)化子也難以生長(zhǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化頻率偏低。所以在轉(zhuǎn)化子的篩選中使用并不方便。此外，G418價(jià)格昂貴，而且需依賴進(jìn)口，實(shí)非一般單位長(zhǎng)期使用所能承受。根據(jù)前人的研究，一定濃度的5-氟乳清酸(5-fluorooroticacid，5-FOA)能抑制野生型酵母菌的生長(zhǎng)，而不影響某些尿嘧啶合成基因突變(如ura3，ura5)酵母菌株的生長(zhǎng)(Boeke，.J.D.etal.，Mol.Gen.Genet.1984，197345-346)。本發(fā)明利用酵母菌的這個(gè)生理特點(diǎn)，對(duì)脆壁克魯維酵母的典型菌株(KluyveromyecsfragilisCBS397)進(jìn)行了突變改造，得到了它的突變菌株K.fragilisHKY0039(CCTCCNo.M97003)。這個(gè)突變菌株的遺傳特點(diǎn)是帶有嘧啶合成代謝途徑中ura3基因功能缺陷的表型。它的乳清酸核苷5_磷酸脫羧酶(orotidine-5’-Pdecarboxylase，4.1.1.23)是沒(méi)有功能的。因此它在沒(méi)有尿嘧啶(uracil)的合成培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。這就首次在脆壁克魯維酵母中建立了一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體菌株。利用它可以非常簡(jiǎn)便、有效地在合成培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因?yàn)橹灰ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)化方法把帶有正常URA3基因的載體引人該營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體細(xì)胞，就能依靠基因功能補(bǔ)償?shù)淖饔檬贡晦D(zhuǎn)化細(xì)胞獲得在無(wú)尿嘧啶的合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。所以，本發(fā)明構(gòu)建的K.fragilisHKY0039菌株是至今第一個(gè)可以在合成培養(yǎng)基上通過(guò)基因功能補(bǔ)償作用進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選的脆壁克魯維酵母受體菌株。它的建立為創(chuàng)建脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)奠定了有利的基礎(chǔ)。K.fragilisHKY0039突變菌株的構(gòu)建與鑒定方法如下1).突變菌株的構(gòu)建將YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時(shí)的脆壁克魯維酵母(K.fragilisCBS397)細(xì)胞用無(wú)菌NS溶液洗滌。然后懸浮于NS溶液，置于一塊無(wú)菌培養(yǎng)皿中。在無(wú)菌室內(nèi)打開培養(yǎng)皿蓋子，用230nM波長(zhǎng)的紫外線燈照射。取被照射過(guò)的菌液，轉(zhuǎn)接入YEPD培養(yǎng)基內(nèi)，于30℃搖床培養(yǎng)12-14小時(shí)。細(xì)胞經(jīng)NS溶液洗滌后，均勻涂布在SDUF選擇培養(yǎng)基，置于28-30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7-10天。凡能在SDUF選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落就是發(fā)生了尿嘧啶合成基因突變的細(xì)胞。2).突變菌株的鑒定對(duì)得到的突變菌株必須作進(jìn)一步檢驗(yàn)，以排除雜菌污染的可能。這些檢驗(yàn)包括細(xì)胞顯微形態(tài)的觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)譜的驗(yàn)證和回復(fù)突變率的測(cè)定等。此外，由于有兩種尿嘧啶合成基因的突變(ura3和ura5)都可產(chǎn)生這種表型，而我們需要的只是ura3基因突變菌株，所以還需用帶URA3基因的載體去轉(zhuǎn)化已得到的這些突變菌株。只有能經(jīng)該載體轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化子的菌株，才是真正的ura3基因突變菌株。本突變菌株鑒定所用的轉(zhuǎn)化載體pPru16(X1)和轉(zhuǎn)化方法都是本發(fā)明的組成部分(下詳)。經(jīng)過(guò)上述所有步驟的鑒定結(jié)果表明，我們成功地構(gòu)建了脆壁克魯維酵母的ura3基因突變菌株K.fragilisHKY0039。脆壁克魯維酵母ura3基因突變菌株K.fragilisHKY0039的特征如下1.在顯微鏡下，YEPE培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞形態(tài)以橢圓形為主，間或有少量卵園形和園筒形細(xì)胞。細(xì)胞以出芽方式增殖，生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞通常有1-2個(gè)或更多的芽體。2.在YEPD固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)為白色或乳白色園形突起，表面光滑。3.能以乳糖為唯一碳源生長(zhǎng)。在以乳糖為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的菌落中心突起，邊緣略有扇形溝槽。4.不能在缺尿嘧啶的酵母基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。5.能在含0.005％尿嘧啶和0.1％5-氟乳清酸的酵母基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。6.該菌ura3基因的回復(fù)突變頻率為10-8。所用培養(yǎng)基及試劑成分YEPD培養(yǎng)基2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeastextract)NS溶液0.85％氯化鈉(NaCl)SDF選擇培養(yǎng)基0.7％酵母基礎(chǔ)氮源(yeastnitrogenbasew/oaminoacids)，2％葡萄糖(glucose)，0.005％尿嘧啶(uracil)，0.1％5-氟乳清酸(5-FOA)2.構(gòu)建了脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)和pGEr-11以往人們?cè)谶M(jìn)行脆壁克魯維酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化研究時(shí)使用的載體主要是游離型的穿梭質(zhì)粒載體。它主要由DNA復(fù)制系統(tǒng)，選擇標(biāo)記和一些用于克隆的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)構(gòu)成。它一般含有大腸桿菌和酵母菌這兩種不同的DNA復(fù)制系統(tǒng)，因而能在這兩種不同的宿主中復(fù)制。其中，酵母的復(fù)制系統(tǒng)可來(lái)源于酵母染色體或酵母天然質(zhì)粒的自我復(fù)制序列(AutonomoursReplicatingSequences，ARS)。而選擇標(biāo)記則必須與被轉(zhuǎn)化菌株的基因型相匹配。如果沒(méi)有現(xiàn)成的營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體菌株可供利用，就不得不用抗生素抗性基因作為選擇標(biāo)記。例如，Das，S等人使用的載體pGL2就是借用來(lái)源于乳酸克魯維酵母染色體的ARS。而Chen，X.J.等人使用的pKD1衍生質(zhì)粒則利用了果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)天然質(zhì)粒pKD1的DNA復(fù)制系統(tǒng)。這兩種復(fù)制系統(tǒng)在實(shí)際使用中都表現(xiàn)出較強(qiáng)的宿主專一性。即，在不同的酵母宿主中它們的DNA復(fù)制效率有明顯的差異。這也是前人在轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母時(shí)，或是轉(zhuǎn)化頻率極低，或是根本得不到轉(zhuǎn)化子的重要原因之一。此外，他們都是利用G418抗性基因作為選擇標(biāo)記，這也增加了轉(zhuǎn)化子篩選的難度。本發(fā)明在構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母的新型載體時(shí)，采取了不同與前人的技術(shù)路線。這主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面1).采用脆壁克魯維酵母的rRNA基因片段序列作為介導(dǎo)載體與受體細(xì)胞基因組DNA之間進(jìn)行整合的靶序列酵母的rRNA基因在每個(gè)細(xì)胞的基因組中大約有150-200份拷貝。因此，利用rRNA基因片段構(gòu)建成的整合載體就能利用它所攜帶的rRNA基因片段與受體細(xì)胞基因組內(nèi)的rRNA基因之間發(fā)生同源重組，從而介導(dǎo)該載體有效地整合到受體細(xì)胞染色體上并隨染色體DNA同步復(fù)制。這種類型的整合載體以往曾在釀酒酵母(Lopes，T.S.etal.，Gene1989，79199-206)和乳酸克魯維酵母的轉(zhuǎn)化中報(bào)道過(guò)(Ronald，J.M.etal.，CurrentGenetics1992，21365-370)，但至今未在脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化中報(bào)道過(guò)。其原因之一，是因?yàn)橹两駴](méi)有其他人克隆到脆壁克魯維酵母的rRNA基因；其原因之二，是因?yàn)橹两駴](méi)有其他人建立起高效的脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化方法。眾所周知，整合轉(zhuǎn)化頻率要比一般轉(zhuǎn)化頻率低得多，沒(méi)有高效的轉(zhuǎn)化方法是很難得到整合型轉(zhuǎn)化子的。我們利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的DNA重組技術(shù)克隆到了脆壁克魯維酵母的26SrRNA基因片段，測(cè)定了它的核苷酸序列(見(jiàn)附圖1)，并首次成功地用它構(gòu)建了脆壁克魯維酵母的整合型載體pPru16(X1)和pGEr-11。A.脆壁克魯維酵母26SrRNA基因的克隆方法制備脆壁克魯維酵母典型菌株K.fragilisCBS397的基因組總DNA，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切后，先用瓊脂糖凝膠電泳分離，再印漬轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以放射性同位素α-32pdATP標(biāo)記的釀酒酵母26SrRNA基因片段作為探針進(jìn)行分子雜交。根據(jù)雜交信號(hào)確定脆壁克魯維酵母26SrRNA基因在膠上的位置，割膠回收該區(qū)域的DNA并與克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用釀酒酵母26SrRNA基因片段作為探針雜交篩選陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化子，并對(duì)該克隆進(jìn)行DNA抽提、純化和DNA序列測(cè)定。將測(cè)定結(jié)果與釀酒酵母26SrRNA基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明我們成功地克隆到了脆壁克魯維酵母26SrRNA基因中一個(gè)3.9kb的EcoRI片段。B.脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)的構(gòu)建將脆壁克魯維酵母26SrRNA基因3.9kbEcoRI片段用DNA限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII同時(shí)酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收約1.2kbrDNA片段，與已經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化的載體pPU連接(pPU是我們以pUC19質(zhì)粒為基本框架構(gòu)建的含有釀酒酵母URA3基因的質(zhì)粒載體)構(gòu)建成脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)(CCTCCNo.M97005)，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖2。該載體適合于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母ura3基因突變菌株，它具有以下特征1.該載體為5.5kb的雙鏈環(huán)狀DNA。2.帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片段作為酵母整合轉(zhuǎn)化時(shí)介導(dǎo)載體與受體細(xì)胞染色體DNA之間同源重組的靶序列。3.帶有釀酒酵母的URA3基因，作為酵母轉(zhuǎn)化時(shí)的選擇標(biāo)記。4.帶有氨卞青霉素抗性基因，作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)的選擇標(biāo)記。5.帶有大腸桿菌質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起始區(qū)，使該載體能在大腸桿菌中高拷貝地?cái)U(kuò)增。6.帶有多個(gè)可用于分子克隆操作的DNA限制性內(nèi)切酶單切位點(diǎn)，如BamHI，EcoRI，SacI，SmaI，SalI和SphI等。7.用XbaI將該載體切成線性后再轉(zhuǎn)化酵母，可大幅度提高轉(zhuǎn)化頻率。C.脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11的構(gòu)建將脆壁克魯維酵母26SrDNA基因3.9kbEcoRI片段用DNA限制性內(nèi)切酶BamHI和BglII同時(shí)酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收約1.2kbrDNA片段，與已經(jīng)BamHI酶切并去磷酸化的載體pGE連接(pGE是我們以pUC19質(zhì)粒為基本框架構(gòu)建的含有G418抗性基因的質(zhì)粒載體)構(gòu)建成脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11(CCTCCNo.M97004)，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖3。該載體適合于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母野生型菌株，它具有以下特征1.該載體為4.9kb的雙鏈環(huán)狀DNA。2.帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片段作為酵母整合轉(zhuǎn)化時(shí)介導(dǎo)載體與受體細(xì)胞染色體DNA之間同源重組的靶序列。3.帶有G418抗性基因，作為酵母轉(zhuǎn)化時(shí)的選擇標(biāo)記。4.帶有氨卞青霉素抗性基因，作為大腸桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)的選擇標(biāo)記。5.帶有大腸桿菌質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起始區(qū)，使該載體能在大腸桿菌中高拷貝地?cái)U(kuò)增。6.帶有多個(gè)可用于分子克隆操作的DNA限制性內(nèi)切酶單切位點(diǎn)，如BamHI，EcoRI，SacI，SmaI，SalI和SphI等。7.用NcoI將該載體切成線性后再轉(zhuǎn)化酵母，可大幅度提高轉(zhuǎn)化頻率。2).采用釀酒酵母的URA3基因作為選擇標(biāo)記釀酒酵母的URA3基因已被證明能在多種宿主的ura3基因缺陷株中產(chǎn)生功能補(bǔ)償作用，因此許多酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的載體都采用它作為選擇標(biāo)記。用URA3基因作為選擇標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在于(1).便于轉(zhuǎn)化釀酒酵母的URA3基因很小，只有1.1kb。因此不會(huì)象某些選擇標(biāo)記那樣過(guò)于增大載體規(guī)模以致影響到細(xì)胞對(duì)載體DNA的攝入效率。(2).便于篩選帶UR3基因的載體被引入ura3基因缺陷細(xì)胞后，便通過(guò)功能補(bǔ)償作用使受體細(xì)胞獲得在無(wú)尿嘧啶合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。因此凡是轉(zhuǎn)化之后能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞就是真正的轉(zhuǎn)化子。不會(huì)發(fā)生在使用抗性選擇標(biāo)記時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)的由于抗生素加入量過(guò)多或過(guò)少而引起轉(zhuǎn)化結(jié)果含糊不清的狀況。(3).便于使用利用URA3基因作為轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，其選擇培養(yǎng)基的配制非常簡(jiǎn)便。只需在蒸餾水中加入適量的酵母基本氮源和碳源即成。無(wú)須其他任何價(jià)格昂貴的添加物。盡管用URA3基因作為選擇標(biāo)記有諸多優(yōu)點(diǎn)，然而至今沒(méi)有其他人報(bào)道在脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中用它作為構(gòu)建載體的選擇標(biāo)記。原因在于要利用URA3基因作為載體的選擇標(biāo)記，必須具備一個(gè)不可缺少的前提條件。即必須先要有ura3基因缺陷的受體菌株可資利用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)脆壁克魯維酵母典型菌株K.fragilisCBS397進(jìn)行改造得到了ura3基因功能缺陷的脆壁克魯維酵母突變菌株K.fragilisHKY0039，這為在脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中利用URA3基因作為選擇標(biāo)記提供了重要的前提條件，為創(chuàng)建脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)奠定了有利的基礎(chǔ)。3.建立了利用前述載體對(duì)脆壁克魯維酵母典型菌株和突變菌株的高效轉(zhuǎn)化方法對(duì)于酵母與真菌類低等真核生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，目前國(guó)際上常用的有三種方法。即原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法和完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。這三種方法各有利弊。原生質(zhì)體法的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化頻率較高，不需要特殊的儀器設(shè)備。缺點(diǎn)是操作步驟繁瑣，通常需要4-5個(gè)小時(shí)，并且影響轉(zhuǎn)化成敗的因素很多，技術(shù)要領(lǐng)也較難掌握。其中酶解細(xì)胞壁的處理是關(guān)鍵，酶處理過(guò)度或不足都會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化結(jié)果。整個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作過(guò)程必須在低溫和等滲透壓的條件下進(jìn)行。另外，轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)也很緩慢，通常需5-7天才能觀察到結(jié)果。電擊轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便省時(shí)，操作過(guò)程通常只需2小時(shí)左右，只要所選定的條件得當(dāng)，一般可以達(dá)到很高的轉(zhuǎn)化頻率。此法的不足之處，一是需要配備特定的儀器設(shè)備。二是對(duì)細(xì)胞預(yù)處理和電沖擊的條件控制要求很嚴(yán)格，而這些因素在不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)化條件中各不相同，較難掌握，常常導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的失敗。完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法是一種最簡(jiǎn)便有效的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法。它既不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行酶解處理，也不需要特定的儀器設(shè)備。整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程通常只需2小時(shí)即可完成。轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)也較快，一般只需2-3天就能觀察到結(jié)果。不足之處是它的轉(zhuǎn)化頻率往往不如前面兩種方法的高。而且，不同的酵母細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化條件的要求也各不相同。處理不好易造成轉(zhuǎn)化失敗。以上三種方法在乳酸克魯維酵母轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用都已有報(bào)道(Bianchietal.，1987，Curr.Genet.12，185-192；Meilhoc，E.，etal.，1990，Bio/Technology8，223-227.Sanchezetal.，1993，Appl.Environ.Microbiol.59，2087-2092.Menart&amp;Bolotin-Fukuharain“Genetics，Biochemistry，andMolecularBiologyofNon-ConventionalYeasts”editedbyK.Wolf(SpringerVerlag)p.30)。然而，以往人們?cè)谶M(jìn)行脆壁克魯維酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化時(shí)，都是采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法(Das，S.etal.，J.Bacteriology1984，1581165-1167.Chen，X.J.etal.，CurrentGenetics1989，1695-98)，結(jié)果轉(zhuǎn)化頻率很低或沒(méi)有轉(zhuǎn)化子。這除了有上面已經(jīng)分析過(guò)的受體細(xì)胞和載體兩方面的原因以外，沒(méi)有掌握脆壁克魯維酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最佳條件也是一個(gè)很重要的原因。本發(fā)明在深入研究分析了各種不同酵母轉(zhuǎn)化方法的利弊后，根據(jù)脆壁克魯維酵母的特點(diǎn)對(duì)以往的酵母完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法加以改進(jìn)。創(chuàng)立了利用前述載體對(duì)脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化方法。其操作過(guò)程主要分為四個(gè)步驟1).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)2).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備3).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化4).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選下面分別對(duì)這些步驟中影響脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化效率的主要因素和具體操作進(jìn)行說(shuō)明1).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)是制備高質(zhì)量感受態(tài)細(xì)胞的前提。用于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞處于何種生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)于轉(zhuǎn)化效率有重要影響。通常情況下，細(xì)胞接種于培養(yǎng)基后，其生長(zhǎng)過(guò)程先后經(jīng)歷了延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期這樣幾個(gè)階段。因?yàn)樵诓煌纳L(zhǎng)階段中，細(xì)胞代謝和分裂的狀態(tài)不同，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組份也有不同的變化。因此，并非任何生長(zhǎng)階段的細(xì)胞都是最適于進(jìn)行轉(zhuǎn)化的。只有處在某一特定生長(zhǎng)期的細(xì)胞才適合于制備感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)周期中的這一轉(zhuǎn)化最適時(shí)態(tài)是依被轉(zhuǎn)化物種和所用轉(zhuǎn)化方法的不同而異的。例如，有的菌適合于在對(duì)數(shù)期制備感受態(tài)細(xì)胞，而有的菌適合于在穩(wěn)定期等等，各不相同。對(duì)于每一種菌都需要通過(guò)周密的研究才能找到其轉(zhuǎn)化的最適生長(zhǎng)時(shí)態(tài)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脆壁克魯維酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最適生長(zhǎng)時(shí)態(tài)是在穩(wěn)定期。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至OD6005-6(每毫升約5×107細(xì)胞)時(shí)制備感受態(tài)細(xì)胞的效果最佳。2).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備是決定轉(zhuǎn)化成敗的重要因素之一。這一步驟主要是利用某些化學(xué)試劑在一定溫度條件下作用于受體細(xì)胞，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的細(xì)微變化，因而處于一種易于吸附和攝取DNA的感受狀態(tài)。在目前通用的各類轉(zhuǎn)化方法中，常用的主要試劑是某些堿性陽(yáng)離子(如鈣、鋰、銫等)的鹽溶液。這些鹽溶液的種類和濃度也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。因此，必須依據(jù)被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的物種品系不同，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)研究找到對(duì)該菌轉(zhuǎn)化最適合的試劑進(jìn)行處理。例如，目前對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)化常用的條件是以0.1M氯化鈣溶液在冰浴作用。Ito，H.等用于轉(zhuǎn)化釀酒酵母完整細(xì)胞的方法(Ito，H.etal.，JournalofBacteriology1983，153163-168)和Das，D.等用于轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母完整細(xì)胞的方法(Das，S.etal.，JournalofBacteriology1984，1581165-1167)中都是使用0.2M氯化鋰與70％聚乙二醇4000在30℃作用。本發(fā)明根據(jù)脆壁克魯維酵母的特點(diǎn)，采取在冰浴條件下先用1.2M山梨醇、二硫蘇糖醇和氯化鎂等試劑處理，再用0.1-0.4M醋酸鋰與40-70％聚乙二醇4000進(jìn)行處理的步驟。山梨醇溶液的作用是使細(xì)胞處于高滲透壓環(huán)境下。二硫蘇糖醇能修飾酵母細(xì)胞壁上的甘露糖蛋白復(fù)合物，改變其完整性，使胞壁產(chǎn)生微孔，利于高分子量的DNA穿透，具有保護(hù)載體DNA分子，減少其被核酸酶降解和促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA的作用。3).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化酵母的轉(zhuǎn)化是通過(guò)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)載體DNA的攝入實(shí)現(xiàn)的。在這一過(guò)程中，作用于細(xì)胞的溫度和時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化成敗的重要因素。本發(fā)明根據(jù)脆壁克魯維酵母的生理特點(diǎn)，先使細(xì)胞在冰浴作用30-60分鐘，然后再加入載體DNA在40-45℃作用20-60分鐘可達(dá)到最佳轉(zhuǎn)化效果。4).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選方法對(duì)轉(zhuǎn)化效率有直接的影響。而篩選方法是取決于被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳背景和所用轉(zhuǎn)化載體的選擇標(biāo)記的。目前在酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，對(duì)于野生型菌株的轉(zhuǎn)化通常必須用抗菌素進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)化子細(xì)胞由于攝入了帶有抗性基因的載體DNA，因而能在含有一定濃度抗菌素的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。常用于酵母轉(zhuǎn)化子篩選的抗菌素有G418和放線菌酮等。但因抗菌素對(duì)細(xì)胞的生理影響較大，因此轉(zhuǎn)化效率往往較低。對(duì)有基因功能缺陷的酵母突變菌株(如his3，lys2，trp1等)，則可以通過(guò)基因功能補(bǔ)償?shù)姆椒ㄟM(jìn)行篩選。例如，通過(guò)轉(zhuǎn)化將帶有正?；?如HIS3，LYS2，TRP1等)的載體導(dǎo)入相應(yīng)的酵母突變細(xì)胞，就能使被轉(zhuǎn)化細(xì)胞獲得載體上正?；蚬δ艿难a(bǔ)償。由于這種方法對(duì)于細(xì)胞的正常功能沒(méi)有影響，因而轉(zhuǎn)化效率通常較高。本發(fā)明構(gòu)建的兩種脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11和pPrul6(X1)分別帶有G418抗性基因和酵母URA3基因這樣兩種選擇標(biāo)記，因而可用于具有不同遺傳背景的脆壁克魯維酵母菌株的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法中所用培養(yǎng)基和化學(xué)試劑的成分如下1.受體菌培養(yǎng)使用YEPD液體培養(yǎng)基2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeastextract)。2.脆壁克魯維酵母ura3基因突變菌株(K.fragilisHKY0039)轉(zhuǎn)化篩選使用SD固體培養(yǎng)基0.7％酵母基礎(chǔ)氮源(yeastnitrogenbasew/oaminoacids)，2％葡萄糖(glucose)，1.5％瓊脂(agar)。3.脆壁克魯維酵母的典型菌株(K.fragilisCBS397)轉(zhuǎn)化篩選使用含G418的YEPD固體培養(yǎng)基2％葡萄糖(glucose)，2％水解蛋白胨(polypeptone)，1％酵母抽提物(yeastextract)，1.5％瓊脂(agar)。抗菌素G418的使用詳見(jiàn)“脆壁克魯維酵母完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法”。4.1.2M山梨醇溶液21.8g山梨醇(sorbitol)溶于87ml無(wú)菌雙重蒸餾水。5.1M二硫蘇糖醇溶液154.3mg二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，溶解于1ml無(wú)菌雙重蒸餾水，經(jīng)0.2μm微孔瀘膜過(guò)瀘除菌。6.TM溶液2.5mM三羥基氨基甲烷(Tris)pH8.0，2mM氯化鎂(MgCl2)。7.LAP溶液40％聚乙二醇4000(polyethylenglycol4000)，0.2M醋酸鋰(LiAc)。8.變性小牛胸腺DNA10mg小牛胸腺DNA溶解于1ml無(wú)菌雙重蒸餾水，經(jīng)超聲波變性處理。9.用于轉(zhuǎn)化的載體DNA純度應(yīng)為電泳純，濃度應(yīng)為每微升0.2-0.5μg之間，每次轉(zhuǎn)化用量范圍以0.2-1μg之間為宜，過(guò)多或過(guò)少都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效果。以上所有培養(yǎng)基和試劑(除1M二硫蘇糖醇溶液)都應(yīng)經(jīng)過(guò)15磅，20分鐘濕熱滅菌處理。實(shí)施例一脆壁克魯維酵母突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039的轉(zhuǎn)化(一).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)1.接種脆壁克魯維酵母突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039于YEPD(2％葡萄糖，2％水解蛋白胨，1％酵母抽提物)培養(yǎng)基中，30-37℃搖床培養(yǎng)至OD6005-6，細(xì)胞數(shù)約5×107/每毫升。2.取1.5毫升培養(yǎng)物在臺(tái)式離心機(jī)于15,000rpm離心，棄去上清液。3.用無(wú)菌蒸餾水洗滌細(xì)胞兩次。(二).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備1.細(xì)胞懸浮于200微升1.2M山梨醇溶液，加2微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻。置于冰浴10分鐘以上。2.反應(yīng)物在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.細(xì)胞懸浮于1毫升TM溶液(2.5mM三羥基氨基甲烷pH8.0，2mM氯化鎂)，在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。4.細(xì)胞懸浮于150微升TM溶液，置于冰浴30-60分鐘。5.反應(yīng)物在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。6.細(xì)胞懸浮于50微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻后再加入450微升LAP溶液(0.2M醋酸鋰，40％聚乙二醇4000)，混合均勻。(三).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1.每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)管中依次加入100微升感受態(tài)細(xì)胞，50微克變性小牛胸腺DNA，1微克轉(zhuǎn)化載體DNApPru16(X1)。混合均勻后置于42℃，30分鐘。2.轉(zhuǎn)化物在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.用無(wú)菌蒸餾水洗滌細(xì)胞一次，然后將細(xì)胞懸浮于100微升無(wú)菌蒸餾水。(四).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選1.把轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布于酵母固體選擇培養(yǎng)基(0.7％酵母基礎(chǔ)氮源，2％葡萄糖，1.5％瓊脂)上。2.置30℃恒溫培養(yǎng)箱中，三天后即可觀察結(jié)果。實(shí)施例二脆壁克魯維酵母典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397的轉(zhuǎn)化(一).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)1.接種脆壁克魯維酵母典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397于YEPD(2％葡萄糖，2％水解蛋白胨，1％酵母抽提物)培養(yǎng)基中，30-37℃搖床培養(yǎng)至OD6005-6，細(xì)胞數(shù)約5×107/每毫升。2.取1.5毫升培養(yǎng)物在臺(tái)式離心機(jī)于15,000rpm離心，棄去上清液。3.用無(wú)菌蒸餾水洗滌細(xì)胞兩次。(二).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備1.細(xì)胞懸浮于200微升1.2M山梨醇溶液，加2微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻。置于冰浴10分鐘以上。2.反應(yīng)物在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.細(xì)胞懸浮于1毫升TM溶液(2.5mM三羥基氨基甲烷pH8.0，2mM氯化鎂)，在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。4.細(xì)胞懸浮于150微升TM溶液，置于冰浴30-60分鐘。5.反應(yīng)物在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。6.細(xì)胞懸浮于50微升1M二硫蘇糖醇溶液，混合均勻后再加入450微升LAP溶液(0.2M醋酸鋰，40％聚乙二醇4000)，混合均勻。(三).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1.每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)管中依次加入100微升感受態(tài)細(xì)胞，50微克變性小牛胸腺DNA，1微克轉(zhuǎn)化載體DNApGEr-1?；旌暇鶆蚝笾糜?2℃，30分鐘。2.轉(zhuǎn)化物在臺(tái)式離心機(jī)于5,000rpm離心5分鐘，棄去上清液。3.用無(wú)菌蒸餾水洗滌細(xì)胞一次，然后將細(xì)胞懸浮于100微升無(wú)菌蒸餾水。(四).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選1.把轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂布在預(yù)先制備的酵母YEPD固體培養(yǎng)基底層平板上，再在其上覆蓋一層(約10ml，45℃保溫)YEPD固體培養(yǎng)基。待凝固后，置30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24小時(shí)。然后在上層培養(yǎng)基表面均勻涂布一定量的G418溶液，使整塊轉(zhuǎn)化平板的終濃度達(dá)到每毫升200微克。2.置30℃恒溫培養(yǎng)箱中，三天后即可觀察結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可以概括如下1.由于構(gòu)建了適合脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化的受體菌株HKY0039，因而可以在脆壁克魯維酵母中利用缺陷基因功能補(bǔ)償作為轉(zhuǎn)化子篩選的手段。2.克隆并利用了脆壁克魯維酵母的26SrDNA基因片斷作為介導(dǎo)載體與受體細(xì)胞基因組之間進(jìn)行同源整合的靶序列，因而可得到拷貝數(shù)多、穩(wěn)定性好的整合型轉(zhuǎn)化子。3.利用上述受體菌株和載體建立了適合于脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低廉，效果優(yōu)良的特點(diǎn)。使用本發(fā)明提供的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以使脆壁克魯維酵母的轉(zhuǎn)化頻率大幅度超過(guò)前人的結(jié)果，具體可見(jiàn)下表。表1.本發(fā)明與前人方法對(duì)脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化效率的比較<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="760">菌株載體選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化子數(shù)/xugDNAK.fragilisATCC36907pCXJ-KanlG418原生質(zhì)體法0/5ugofplasmidDNAS.fragilisATCC12424pCXJ-KanlG418原生質(zhì)體法0/5ugofplasmidDNAK.fragilisCBS397pCXJ-KanlG418原生質(zhì)體法0/5ugofplasmidDNAK.fragilisC21pGL2G418完整細(xì)胞法20/10ugofplasmidDNAK.fragilisHKY0039pGEr-11G418完整細(xì)胞法5000/lugofplasmidDNAK.fragilisHKY0039pPru16(X1)URA3完整細(xì)胞法5000/lugofplasmidDNA</table></tables>圖1為脆壁克魯維酵母(KluyveromyecsfragilisCBS397)26S核糖體RNA基因片斷的脫氧核糖核酸(DNA)序列。圖2為脆壁克魯維酵母整合型載體pPru16(X1)結(jié)構(gòu)圖。圖3為脆壁克魯維酵母整合型載體pGEr-11結(jié)構(gòu)圖。權(quán)利要求1.一種脆壁克魯維酵母高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，包括適合于高效轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株、用于該菌株的重組多核苷酸載體以及將該載體引入脆壁克魯維酵母受體菌株的高效方法。其特征在于1).所述的受體菌株為脆壁克魯維酵母的典型菌株KluyveromyecsfragilisCBS397和其突變菌株Kluyveromyecs.fragilisHKY0039(CCTCC編號(hào)為No.M97003)。2).所述的重組多核苷酸載體為帶有脆壁克魯維酵母26SrRNA基因片斷序列的pPru16(X1)(CCTCCNo.M97005)和pGEr-11(CCTCCNo.M97004)之任一種。3).所述的轉(zhuǎn)化方法是利用上述重組多核苷酸載體轉(zhuǎn)化脆壁克魯維酵母典型菌株Kluyveromyecs.fragiliaCBS397或其突變菌株KluyveromyecsfragilisHKY0039(CCTCC編號(hào)為No.M97003)并得到轉(zhuǎn)化菌株的方法。2.根據(jù)權(quán)利1的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重組多核苷酸載體，其特征為帶有脆壁克魯維酵母中的26SrRNA基因片斷序列。該基因片斷序列是利用分子克隆技術(shù)從脆壁克魯維酵母基因組中克隆到的。3.根據(jù)權(quán)利1和2的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重組多核苷酸載體，其特征為脆壁克魯維酵母的26SrRNA基因片斷序列構(gòu)成該重組多核苷酸載體的組成部分。4.根據(jù)權(quán)利1-3的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的重組多核苷酸載體，其特征為帶有能在大腸桿菌中自主復(fù)制的多核苷酸序列和至少下述之一種選擇標(biāo)記尿嘧啶合成基因功能補(bǔ)償(URA3)的和抗G418的。5.根據(jù)權(quán)利14的要求，所述高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法，其特征為脆壁克魯維酵母完整細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。其操作過(guò)程分為四個(gè)步驟1).脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)；2).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備；3).脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；4).脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選。6.根據(jù)權(quán)利5的要求，所述脆壁克魯維酵母受體菌的培養(yǎng)，其特征為將脆壁克魯維酵母典型菌株或脆壁克魯維酵母突變菌株HKY0039接種于YEPE培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6005-6，細(xì)胞數(shù)約5×107/每毫升。7.根據(jù)權(quán)利5的要求，所述脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備，其特征為在冰浴條件下，先用1.2M的山梨醇、二硫蘇糖醇和氯化鎂等試劑處理，再用0.1-0.4M醋酸鋰與40-70％聚乙二醇4000進(jìn)行處理。8.根據(jù)權(quán)利5的要求，所述脆壁克魯維酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，其特征為先使細(xì)胞在冰浴作用30-60分鐘，然后再加入載體DNA在40-45℃作用20-60分鐘。9.根據(jù)權(quán)利5的要求，所述脆壁克魯維酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選，其特征為通過(guò)酵母URA3基因的功能補(bǔ)償作用或G418抗性基因的抗G418作用實(shí)現(xiàn)的。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的脆壁克魯維酵母基因-26SrRNA基因片斷序列；利用該序列構(gòu)建的重組多核苷酸載體；可被該載體轉(zhuǎn)化的脆壁克魯維酵母受體菌株以及脆壁克魯維酵母完整細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)化方法。以上內(nèi)容構(gòu)成脆壁克魯維酵母的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，它可以利用缺陷基因功能補(bǔ)償作為轉(zhuǎn)化子篩選的手段，因而具有操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)。作為本發(fā)明的例子是用于在脆壁克魯維酵母的典型菌株或其ura3突變菌株中高效獲得穩(wěn)定的抗氨基葡糖苷G418或尿嘧啶合成基因功能補(bǔ)償?shù)霓D(zhuǎn)化菌株。文檔編號(hào)C12N15/81GK1166527SQ9710640公開日1997年12月3日申請(qǐng)日期1997年4月24日優(yōu)先權(quán)日1997年4月24日發(fā)明者霍克克,唐南筠,袁漢英,王瓊慶,李育陽(yáng)申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)