專利名稱：：用于hladr分型的探針系統(tǒng)和用該探針?lè)中偷姆椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及測(cè)定個(gè)體的II類HLA基因型的方法，尤其是對(duì)多態(tài)性HLA-DR基因的檢測(cè)。該方法特別可用于移植中的HLA分型、醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)等。HLA(人淋巴細(xì)胞抗原)系統(tǒng)是由人體主要組織相容性復(fù)合物編碼的，它通過(guò)區(qū)分自我和非自我在個(gè)體間器官移植中產(chǎn)生很大的限制。另外，大量疾病的素因中涉及HLA因子。因此HLA系統(tǒng)的抗原用于確定器官移植中供體和受體間的特征(F.H.BACH和J.J.VANROOD，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》，295，806-13頁(yè)(1976))以及確定對(duì)某些疾病的個(gè)體素質(zhì)的分型方法中。從遺傳角度看HLA系統(tǒng)已被充分表征，它由位于6號(hào)染色體短臂上約2厘摩(CM)空間中的一系列有或多或少多態(tài)性的基因座組成。該系統(tǒng)中的三個(gè)基因座(HLA-A、HLA-B和HLA-C)編碼一類共顯性表達(dá)的同種抗原(I類)。另一區(qū)域(HLA-D)(它實(shí)際上含有幾個(gè)基因)編碼具有相當(dāng)程度多態(tài)性的共顯性表達(dá)的第二類同種抗原(II類)。特別控制補(bǔ)體系統(tǒng)C2、C4成分和Bf因子的幾個(gè)其他基因座也屬于HLA系統(tǒng)(III)類。器官移植的成功大多取決于受體和供體間的HLA一致性(I類和II類)，因此HLA的分型一定要盡量準(zhǔn)確。這一要求主要涉及腎移植(P.J.Morris和A.Ting(1982)，《免疫學(xué)綜述》66，103-G.Opelz(1989)《移植進(jìn)展》，21，609-E.L.LAGAAIJ，P.H.Hennemann，M.Ruigrok等(1985)，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》，321，701)和骨髓移植(P.G.Beatty，R.A.Clift，E.M.Mickelson等(1985)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》313，765-J.M.Hows和B.A.Bradley(1990)《英國(guó)血液學(xué)雜志》76.1)。對(duì)于骨髓移植來(lái)說(shuō)，II類HLA抗原的完全一致性是移植成功的關(guān)鍵因素，即避免移植物排斥或患移植物-宿主疾病(P.G.Beatty，J.Hanson，G.M.Long-ton等(1991)《移植》51，443-R.C.Ash，J.T.Casper，C.R.Chitamber等(1990)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》322，485-C.Anasetti，D.Amos，P.G.Beatty等(1989)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》320，197)。HLA-D區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物的多態(tài)性通常用血清學(xué)技術(shù)在分析HLA基因細(xì)胞表面表達(dá)產(chǎn)物的同種抗血清基礎(chǔ)上來(lái)確定(J.J.VanRood和A.VanLeeuwen(1963)《臨床調(diào)查雜志》42，1382-J.J.VanRood，A.VanLeeuwen，J.J.Koning，A.B.VanOudAblas(1975)《組織抗原》5，73)，其準(zhǔn)確性和可重復(fù)性取決于所供血清的批次。但既使在最好的條件下，也有大量的等位基因不能由這些血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)到。血清學(xué)分析的這種局限性主要由以下原因造成缺乏單特異性同種抗血清，不能完全分辨緊密相關(guān)的特異性間的交叉反應(yīng)性(例如DR3和DRw13)，或者II類HLA分子在細(xì)胞(例如白血病細(xì)胞)表面的表達(dá)改變。利用分子生物學(xué)現(xiàn)在了解到存在比以前設(shè)想的多得多的HLA基因，尤其是許多不同的等位基因。這種多樣性現(xiàn)由不同基因和等位基因的DNA序列來(lái)表征。根據(jù)HLA命名委員會(huì)的最近報(bào)道(見(jiàn)，HLA系統(tǒng)因子的WHO命名委員會(huì)(1990)《免疫遺傳學(xué)》31，131-和J.G.Bodmer，S.G.E.Marsh，E.D.Albert，W.F.Bodmer，B.Dupont，H.A.Erlich，B.Mach，W.R.Mayr，P.Parham，T.Sasazuki，G.M.T.Schrender，J.L.Strominger，A.Svejgaard和P.I.Terasaki(1991)《組織抗原》37，97)，II類HLA的多態(tài)性分布如下DRB1座47個(gè)等位基因，DRB3座4個(gè)等位基因，DRB4座1個(gè)等位基因，DRB5座4個(gè)等位基因，DQB1座17個(gè)等位基因，DQA1座13個(gè)等位基因，DPB1座21個(gè)等位基因，DPA1座4個(gè)等位基因。許多這些血清學(xué)分析遺漏的等位基因只有在DNA水平才能被識(shí)別。血清學(xué)分型的局限性可由DR4的血清特異性得到說(shuō)明，它現(xiàn)在被分成11個(gè)亞型(DRB1*0401-0411)(見(jiàn)，J.G.Bodmer，S.G.E.Marsh，E.D.Albert，W.F.Bodmer，B.Dupont，H.A.Erlich，B.Mach，W.R.Mayr，P.Parham，T.Sasazuki，G.M.T.Schreuder，J.L.Stro-minger，A.Svejgaard和P.I.Terasaki(1991)《組織抗原》37，97)，這些只有在DNA序列水平才能識(shí)別。與之相似，DRw6的特異性可用幾種同種抗血清進(jìn)一步分為DRw13和DRw14，實(shí)際上它含有10個(gè)等位基因序列(DRB1*1301-1305和DRB1*1401-1405)(見(jiàn)上文引用的BodmerJ.G.的文章)，這些也只有用DNA序列進(jìn)行基因型分析才能識(shí)別?；蛐头治鍪且环N在基因水平直接分析II類HLA系統(tǒng)多樣性的新方法?；蛐头治龌诜肿与s交的理論，提出的第一種方法是所謂的“RFLP”技術(shù)，即利用限制性酶將DNA切成片段，并分析由這些酶產(chǎn)生的特異DNA片段的大小(見(jiàn)，C.T.Wake，E.O.Long和B.Mach(1982)《自然》300，372-J.Bhme，M.Andersson，G.Andersson，E.Miller，P.A.Peterson和L.Rask(1985)《免疫學(xué)雜志》135，2149-J.L.Bidwell，E.A.Bidwen，D.A.Savage，D.Middle-ton，P.T.Klouda和B.A.Bradley(1988)《移植》45，640)。RFLP只能使部分血清學(xué)方法檢不到的等位基因差異得以識(shí)別，這種技術(shù)仍有局限性。實(shí)際上，只有差別核苷酸位于分析中所用限制酶的識(shí)別位點(diǎn)時(shí)該方法才能識(shí)別帶有不同序列的等位基因，因此將有大量II類HLA等位基因不能被這種分析方法所識(shí)別。而且，RFLP分析僅僅指出編碼序列中的修飾，而不能提供關(guān)于這種修飾的確切性質(zhì)的信息。最后，這一技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因?yàn)樗婕跋喈?dāng)大量的核酸用數(shù)種限制酶消化、電泳以及轉(zhuǎn)移至濾膜。DR1、DR4、DRw8、DRw11或DRw13特異性的亞型不能由RFLP檢測(cè)到，也可以說(shuō)明RFLP技術(shù)的局限性。已提出了一種II類HLA基因型分析的新技術(shù)，該方法稱為“用寡核苷酸分型”。由于對(duì)II類HLA基因的DNA序列的了解，尤其是迄今最具多態(tài)性的DRβ基因的DNA序列，人們可以利用對(duì)該基因序列中給定位置特異的寡核苷酸作為雜交方法分析多態(tài)性的示蹤物。選擇這些寡核苷酸使其具有最大可能的報(bào)道性，能根據(jù)序列不同鑒別不同的等位基因。實(shí)際上可以檢測(cè)到任何序列差異，甚至單一核苷酸的差異。利用寡核苷酸的分型技術(shù)可以應(yīng)用于DNA，如Angelini等的文章中所述，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83卷，4489-4493頁(yè)(1986)，也可以應(yīng)用于RNA(見(jiàn)，C.Ucla，J.J.VanRood，J.Gorski和B.Mach(1987)《臨床調(diào)查雜志》80，1155)。這種新方法是基于利用核酸典型特征進(jìn)行分子雜交的原理，這些特征是通過(guò)氫鍵與互補(bǔ)序列相互作用從而形成穩(wěn)定的雜交體，其配對(duì)法則是已知的，即DNA中A-T，G-C和RNA中的A-U、G-C。這樣，相應(yīng)于已知等位基因DNA或RNA的合成寡核苷酸可用作探針，來(lái)檢別樣品中的含有與探針互補(bǔ)序列的稱為靶標(biāo)的核酸序列。標(biāo)記靶標(biāo)和探針間所形成的雜交體可以對(duì)樣品中的靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和定量。利用任何已知標(biāo)記物，如酶的、化學(xué)的或放射活性的標(biāo)記物進(jìn)行這種標(biāo)記。在這些原理的基礎(chǔ)上，Angelini等在以上引用的文章中第一次提出了用寡核苷酸在II類HLA分型中的應(yīng)用，其中利用所謂的“SOUTHERN”技術(shù)將靶DNA沉積在尼龍膜上，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行檢測(cè)。隨后這一技術(shù)被用于檢測(cè)常規(guī)血清法測(cè)不出的II類HLA等位基因(見(jiàn)，J.M.Tiercy，J.Gorski，M.Jean-net和B.Mach(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，198-J.M.Tier-cy，J.Gorski，H.Bétuel，A.C.Freidel，L.Gebhrer，M.Jeannet和B.Mach(1989)《人體免疫學(xué)》24，1)。對(duì)II類HLA分型的另一直接應(yīng)用描述在專利申請(qǐng)PCTWO89/11547中，其中使用所謂的“斑點(diǎn)印跡”技術(shù)。所謂的“反向斑點(diǎn)印跡”法是這些技術(shù)的一種改良，它是將核苷酸探針結(jié)合在紙膜、硝基纖維素或兩者的混合物上，用標(biāo)記的靶標(biāo)進(jìn)行雜交檢測(cè)。這一技術(shù)已用于HLA-DQA的分型和地中海1β-貧血突變的檢測(cè)(R.K.Saiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，6230-6234頁(yè)(1989))。如上文所述和以上引述的出版物和專利申請(qǐng)中解釋的那樣，細(xì)胞分型需要檢測(cè)基因組中的點(diǎn)突變、涉及建立對(duì)檢測(cè)和區(qū)分同源序列(單一核苷酸不同)足夠敏感的探針，發(fā)現(xiàn)使用短探針是必需的，一般少于30個(gè)核苷酸，這些探針使試驗(yàn)具有很大的特異性同時(shí)保持良好的敏感性。短探針的使用使得具有廣泛的選擇性。對(duì)于涉及探針與固體載體結(jié)合的試驗(yàn)，存在小于30個(gè)核苷酸的短探針在這種固體載體上固定的問(wèn)題。R.K.SAIKI等在上文所引述的文章中提出一種方法將400個(gè)堿基的多(dT)尾與含15-20個(gè)堿基探針的3′末端偶聯(lián)，然后通過(guò)紫外線照射將探針借該尾固定在尼龍濾膜上，使胸腺嘧啶堿基與尼龍中存在的伯胺共價(jià)偶聯(lián)。但這一方法還不能令人完全滿意，因?yàn)榇嬖谔禺愋詥?wèn)題。事實(shí)上，探針的胸腺嘧啶堿基也能在紫外照射下與載體反應(yīng)，從而使雜交的效力降低。另外，出于工業(yè)化原因，希望發(fā)展一種具有高特異性和良好靈敏性但操作簡(jiǎn)便、迅速、廉價(jià)、能夠自動(dòng)化并可用于個(gè)體分型的分型方法?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)了一種測(cè)定個(gè)體HLA-DR基因型的新方法，該方法克服了上述缺點(diǎn)，但能檢測(cè)并區(qū)分僅單一核苷酸區(qū)別的同源序列。利用一套選擇的核苷酸探針實(shí)施本發(fā)明方法，使得用最小數(shù)目的探針實(shí)現(xiàn)分型。這一套探針尤其具有可以在單一溫度下工作的優(yōu)點(diǎn)，特別是在37℃下(如在下文實(shí)驗(yàn)部分將看到的，也可能在其他溫度下工作)。這一套探針也形成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的該套探針(將在下文定義)可以以檢測(cè)探針形式(用標(biāo)準(zhǔn)示蹤劑標(biāo)記)用于Southern類技術(shù)，或優(yōu)選以捕捉探針形式(三明治或反向斑點(diǎn)印跡技術(shù))使用并固定在固體載體上，固定方法為直接被動(dòng)結(jié)合(吸附)或借助于配體如疏水性配體吸附(見(jiàn)，例如歐洲專利申請(qǐng)0,405,913)，或通過(guò)建立至少一個(gè)共價(jià)鍵，同樣可為直接共價(jià)鍵或借助于能與載體共價(jià)結(jié)合的配體(見(jiàn)，例如專利申請(qǐng)PCTWO88/01,302)探針的固定化可用已知方法進(jìn)行，或用以下文將描述的其他方法進(jìn)行。本發(fā)明的探針(核苷酸探針)將主要以核苷酸序列的形式描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，甚至對(duì)于在一定溫度下檢測(cè)點(diǎn)突變的探針，也可以設(shè)想一定范圍內(nèi)的各種長(zhǎng)度(核苷酸數(shù)目)的探針，特別是借助于使用或多或少對(duì)雜交復(fù)合體穩(wěn)定性有利的溶液和緩沖液。因而，本發(fā)明探針用一般認(rèn)為是最長(zhǎng)的序列來(lái)定義(特別是希望它在較低溫度如37℃下工作時(shí))，同時(shí)指明對(duì)在所述溫度下仍可使用、甚至對(duì)點(diǎn)突變?nèi)詫⒚舾械淖疃绦蛄?。專業(yè)人員顯然知道每個(gè)具體核苷酸探針有其相應(yīng)的互補(bǔ)探針，后者自然能夠起捕捉探針或檢測(cè)探針的作用。因此本發(fā)明包括具有下文所述探針互補(bǔ)序列的探針。專業(yè)人員還清楚，一套探針中識(shí)別某一具體特異性X的某一探針一般可以由一個(gè)兩探針系統(tǒng)來(lái)替代，其中之一識(shí)別特異性X和Y，另一個(gè)識(shí)別特異性X和Z，此時(shí)用XY探針和用XZ探針均為陽(yáng)性反應(yīng)則可推斷存在特異性X。因此，本發(fā)明包括其中一個(gè)或多個(gè)探針被這種兩探針或多探針的等價(jià)系統(tǒng)替代的探針系統(tǒng)，正如下文將要定義的。自然，這種系統(tǒng)組合可應(yīng)用于兩個(gè)以上的特異性。本發(fā)明涉及可用于HLADR類型測(cè)定的寡核苷酸分型技術(shù)的核苷酸探針，所述探針選自下列各種-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGGC.上述四個(gè)序列分別編號(hào)為101、102、103和104。探針101識(shí)別DRB1*01型。探針102識(shí)別DRB1*02型。探針103識(shí)別DRB4*01型，及探針104識(shí)別DRB1*1305型。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括選自探針101至104的至少一個(gè)探針的一套核苷酸探針或HLA分型試劑盒。本發(fā)明還涉及包括選自下列各種的至少一個(gè)探針的一套核苷酸探針-GTGGACAACTACTG-GATACTTCTATCACCAA-GCCTGATGAGGAGTAC-TGGCAGGGTAAGTATAAG-GGGCCCTGGTGGACA-TGCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-CTGGAAGACGAGCG-TGGAAGACAAGCGG-TGCGGAGCACTGGA-AACCAGGAGGAGAACGTG-ACTCTACGGGTGAGTG-GACACCTATTGCAGAC-下劃線的部分相當(dāng)于最小序列。上述13個(gè)序列分別編號(hào)為105-117。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，探針111以其完全的形式使用，包括3′-末端的兩個(gè)未劃線的T。其特異性與探針45的相同。探針115優(yōu)選以劃線序列加上5′-末端未劃線的兩個(gè)A的形式使用。其特異性與探針28的相同。探針105-110、112-114、116和117優(yōu)選以下文試驗(yàn)部分以編號(hào)43、9、10、14、17、44、46、48、47、24和27相稱的探針形式使用。本發(fā)明特別涉及如上所定義的一套探針，其特征在于其還包括至少一種下列探針(劃線部分相當(dāng)于最佳序列)-GAGGAGGACTTGCGCT-TACGGGGCTGTGGAG-GGAGCTGCGTAAGT-TTCCTGGAGAGACAC-GGGAGAGATACTTCC.以上五個(gè)序列分別編號(hào)為118-122。所述序列特別以編號(hào)42、42bis、52、37和55的探針形式使用。上述特異探針尤其可用作捕捉探針或檢測(cè)探針。它們優(yōu)選以固定化或可固定在固體載體上的捕捉探針形式使用。本發(fā)明的主題還在于按標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸分型技術(shù)測(cè)定個(gè)體HLA-DRβ類型的方法，其中如上所定義的一套探針中至少部分探針相繼地或同時(shí)用作捕捉探針或檢測(cè)探針。在自動(dòng)化方法中，同時(shí)使用這些成套探針。在其他情形下，顯然可以一個(gè)接一個(gè)地使用這些探針，并在收集的信息足以分型時(shí)停止該方法。因而本發(fā)明的方法主要包括以下步驟--按照所選擇的具體技術(shù)，使含有個(gè)體HLA-DR基因多態(tài)區(qū)的靶核酸樣品與以上定義的一套探針中的至少一部分接觸，--按已知方法在預(yù)定條件下保溫，使每個(gè)探針的雜交只在靶標(biāo)含有與所述探針完全互補(bǔ)的序列時(shí)才發(fā)生，及--按標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)確定所用的每個(gè)探針雜交與否。然后用所收集的信息按預(yù)先建立的分型表確定類型，考慮所用探針和已知HLA-DR類型和/或相關(guān)亞型的列表來(lái)確定。使用分型表簡(jiǎn)化了這一工作，即按所觀察到的陽(yáng)性反應(yīng)(雜交)，該表直接給出類型和/或亞型。對(duì)于本發(fā)明的此套探針，這種表在下文試驗(yàn)部分給出(見(jiàn)表6)。本發(fā)明尤其涉及其中所述探針用作捕捉探針的上述方法，該方法的特征在于其包括以下步驟a)將每個(gè)捕捉探針固定在固體載體上，b)在若靶標(biāo)中存在與探針互補(bǔ)的序列則可雜交的條件下，使每個(gè)固定化捕捉探針與含有至少一種靶核酸片段的液體介質(zhì)接觸，及c)檢測(cè)可能形成的任何雜交體的存在。當(dāng)然，本發(fā)明探針可用于檢測(cè)RNA和DNA的靶片段。而且顯然可以使用上述探針以外的所有適當(dāng)探針作為檢測(cè)探針，尤其是下文實(shí)施例5中描述的探針之一。當(dāng)捕捉探針?lè)浅６虝r(shí)，即小于20個(gè)核苷酸，特別是小于17個(gè)核苷酸，需要實(shí)施改善探針與固體結(jié)合的手段。這樣探針與載體的結(jié)合是以探針與配體共價(jià)連接形成的衍生物形式進(jìn)行的，所述配體能幫助與固體載體的結(jié)合。配體可以包含疏水部分，但尤其包含至少一種極性功能團(tuán)，例如氨基。該功能團(tuán)可通過(guò)建立共價(jià)鍵用于結(jié)合探針和固體載體。當(dāng)極性功能團(tuán)不與載體反應(yīng)時(shí)，配體通過(guò)吸附于載體(甚至載體是疏水性的)來(lái)改進(jìn)結(jié)合。配體例如選自蛋白質(zhì)和分別由下式I和II代表的化合物其中Z代表含2-12個(gè)碳原子由一個(gè)或多個(gè)選自羥基和/或氨基的基團(tuán)取代或未取代的直鏈或支鏈烷基或鏈烯基，M+尤其代表堿金屬離子或銨離子。該配體優(yōu)選與捕捉探針核苷酸序列的5′-末端連接；其中n為1-4的整數(shù)，優(yōu)選n＝1或4。該配體優(yōu)選與捕捉探針核苷酸序列的3′-末端連接。當(dāng)配體為蛋白質(zhì)時(shí)，例如選擇白蛋白，優(yōu)選牛血清白蛋白，它可以與捕捉探針核苷酸序列的5′或3′末端連接。本發(fā)明的載體可以是能使本發(fā)明的核苷酸序列或衍生物通過(guò)被動(dòng)吸附或共價(jià)結(jié)合而固定化的任何載體。該載體可由常用材料制得，例如硝基纖維素、尼龍、紙、或優(yōu)選使用疏水性材料，如苯乙烯聚合物或含10％(重量)苯乙烯單位的苯乙烯共聚物。本發(fā)明固體載體例如可以是如下形式微滴定板、片狀、管狀、錐形、孔狀等。按照本發(fā)明方法，含核酸的樣品得自其HLA-DR基因型待測(cè)的個(gè)體。含HLA-DR核酸的任何類型的組織均可用于本發(fā)明。例如可以使用個(gè)體樣品中的核酸經(jīng)化學(xué)方法、酶法或其他方法裂解后所得核酸(DNA或RNA)片段。但是增加先期進(jìn)行的靶DNA或RNA擴(kuò)增步驟對(duì)本發(fā)明的寡核苷酸分型法有利。雖然通過(guò)序列特異性寡核苷酸雜交分析HLA多態(tài)性的原理仍相同，但選擇性的擴(kuò)增步驟使靶序列富集，從而簡(jiǎn)化了該技術(shù)(R.K.Saiki，T.L.Bugawan，G.T.Horn，K.B.Mullis和H.A.Erlich(1986)《自然》324，163-J.M.Tiercy，M.Jeannet和B.Mach(1990)《歐洲免疫學(xué)雜志》20，237)。可以從DNA或從RNA進(jìn)行擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，樣品中HLA-DR靶序列的擴(kuò)增可按任何已知方法進(jìn)行，該方法使序列足量擴(kuò)增以使得通過(guò)核酸與探針的雜交能夠檢測(cè)出靶序列。樣品中核酸一般為DNA，通常為基因組DNA。但用其他核酸如信使RNA或克隆的DNA也可以實(shí)施本及明，而且個(gè)體樣品中的核酸可以是單鏈或雙鏈形式。當(dāng)然，如果核酸是雙鏈形式則需要進(jìn)行變性步驟以獲得單鏈核酸。本發(fā)明中所使用的探針是序列特異性寡核苷酸(SSO)，在適當(dāng)條件下能與其互補(bǔ)序列特異性結(jié)合。如果一種具體探針可用于識(shí)別一種獨(dú)特的等位基因，則稱該探針為ASO，即等位基因特異性寡核苷酸。由于各種DRβ等位基因間的不同性質(zhì)，單一探針自身可能無(wú)法識(shí)別一種DRβ特異性等位基因。根據(jù)本發(fā)明方法，從一套探針的結(jié)合模式來(lái)推斷等位基因的身份，其中每個(gè)單一探針對(duì)HLA-DR基因的不同部分特異。選擇對(duì)應(yīng)于已知等位基因DNA序列的多個(gè)探針的結(jié)果是，本發(fā)明寡核苷酸分型方法的特異性使得可以識(shí)別DRB1、DRB3和DRB5基因座的所有等位基因。當(dāng)然，本發(fā)明方法可能用于識(shí)別其他極端多態(tài)性基因座如DQB1和DPB1的等位基因。因?yàn)榈任换虿町愔饕挥诰幋aHLA分子第一功能區(qū)(aa5-94)的外顯子中，選擇與該區(qū)域中特異序列互補(bǔ)的探針。如果有新的等位基因被發(fā)現(xiàn)，就立即將其列在II類HLA序列的登記表中，這使得報(bào)道性示蹤物的集合不斷更新，因而本方法適于檢測(cè)任何新的等位基因。為了使II類HLA完全分型法合理化，已提出首先用有限數(shù)目的探針進(jìn)行第一步DR屬分型，這可以識(shí)別主要HLA-DR特異性，即HLA-DR1-DRw18。這一步驟對(duì)許多臨床應(yīng)用已經(jīng)足夠了(見(jiàn)B.Mach和J.M.Tiercy(1991)《人體免疫學(xué)》30，278)。在這第一步結(jié)果的基礎(chǔ)上，第二步可能選擇出產(chǎn)生DRβ微多態(tài)性、檢測(cè)DQB1多態(tài)性和需要時(shí)鑒定DPB1等位基因所需的特異性探針。用寡核苷酸分型技術(shù)對(duì)HLA-DR1-DRw18特異性的分析，可以代替DR血清學(xué)方法用于組織相容性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)的DR分型，特別是進(jìn)行腎移植等待者名單中病人的DR分型或潛在腎提供者的分型，計(jì)劃進(jìn)行骨髓移植的白血病病人、其家庭成員或無(wú)關(guān)的潛在提供者的DR分型，對(duì)登記志愿捐獻(xiàn)骨髓者的大量DR分型，用于在例如胰島素依賴性糖尿病中確定疾病與HLA系統(tǒng)的聯(lián)系，應(yīng)用于預(yù)見(jiàn)醫(yī)學(xué)或者用于親子鑒定試驗(yàn)中和其他法醫(yī)鑒定中。以下是本申請(qǐng)中所用幾個(gè)術(shù)語(yǔ)的定義“基因型”指?jìng)€(gè)體的一系列基因方面的特征，與“表現(xiàn)型”相反，后者包括分析基因表達(dá)產(chǎn)物(尤其是蛋白質(zhì))而呈現(xiàn)的個(gè)體特征?！暗任换颉敝赶嗤虻牟煌问剑鼈?cè)诤怂嵝蛄兄写嬖诓町?。這些差異表現(xiàn)在DNA、RNA和蛋白質(zhì)中?！岸鄳B(tài)性”表示由于相同基因存在不同等位基因而引起的人群中的多樣性。本文所用“寡核苷酸”指引物、探針、待檢測(cè)的核酸片段等。可用任何適當(dāng)?shù)囊阎椒ㄖ苽溥@些寡核苷酸?！昂塑账崽结槨敝柑烊籇NA或RNA片段，或天然或合成的寡核苷酸，或合成的DNA或RNA片段，可以是未修飾的也可以含有一人或多個(gè)修飾堿基如肌苷(用字母I代表)、5-甲基脫氧胞苷、5-(二甲氨基)-脫氧尿苷、脫氧尿苷、2，6-二氨基嘌呤、5-溴脫氧尿苷或其他能雜交的修飾堿基。另外，在本申請(qǐng)中，當(dāng)捕捉探針的序列有下劃線時(shí)，這代表用于本發(fā)明分型方法的最佳序列。當(dāng)然，這些最佳序列可以在3′和/或5′末端延長(zhǎng)至少一個(gè)堿基。這種情況下，這些可以任意增加的堿基示于括號(hào)中，這例如可以在閱讀以下的描述時(shí)看到。最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)工作條件(諸如雜交和洗滌溫度、雜交緩中液和/或洗滌緩沖液的性質(zhì))和分型表來(lái)改變所用序列的長(zhǎng)度。以下非限定性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案，在閱讀了以下參照實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明后將會(huì)更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例1這里舉例給出的本發(fā)明所用配體可以是市售的化合物，如下表1中所示表1NMTr＝單甲氧基三苯甲基DMTr＝二甲氧基三苯甲基Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基CPG＝控孔玻璃珠L(zhǎng)CAA＝長(zhǎng)鏈烷基胺(間隔臂)按照下述一般操作方法進(jìn)行氨基磷酸酯(phosphoramidite)配體與寡核苷酸的連接按照制造商的說(shuō)明，在應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(APPLIEDBIOSY-SEMS)自動(dòng)合成儀381A上用氨基磷酸酯化學(xué)方法合成寡核苷酸。將氨基磷酸酯配體溶解在無(wú)水乙腈中達(dá)0.2M的濃度，并置于合成儀的X位，當(dāng)寡核苷酸的合成結(jié)束時(shí)，按照標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)合成方法在寡核苷酸的5′-端加上配體。當(dāng)配體帶有二甲氧基三苯甲基保護(hù)基時(shí)(如對(duì)于化合物d)，合成結(jié)束后還需要用三氯乙酸脫去三苯甲基的脫保護(hù)步驟。在33％NH4OH中55℃脫保護(hù)過(guò)夜，然后在-20℃乙醇中沉淀后，真空干燥寡核苷酸并溶于1ml水中。對(duì)于代號(hào)為b和c的化合物，脫保護(hù)后按制造商(分別為CLONTECH和GLEN)的說(shuō)明另外進(jìn)行一步單甲氧基三苯甲基的裂解步驟。對(duì)于代號(hào)為e和f的化合物，按標(biāo)準(zhǔn)方法從與二氧化硅連接的配體開(kāi)始自動(dòng)合成。配體與寡核苷酸的連接通過(guò)寡核苷酸的3′-末端進(jìn)行。在5′或3′末端修飾的寡核苷酸均在BrownleeRP18柱(10mm×25cm)上經(jīng)反相高壓液相色譜(HPLC)純化。條件流速4.6ml/分梯度30分鐘內(nèi)10％-30％的緩中液B。3分鐘內(nèi)35％-100％的緩沖液B。緩中液A和B的性質(zhì)如下緩沖液A0.1M醋酸三乙基銨(TEAA)，pH7.00緩沖液B50％緩中液A+50％CH3CN。實(shí)施例2寡核苷酸與牛血清白蛋白(BSA)的連接如實(shí)施例1中所述合成了帶有氨基連結(jié)臂2(在表1中代號(hào)為a)的寡核苷酸將3×10-8mol寡核苷酸真空干燥并溶解在0.1M硼酸鈉緩中液(pH9.3)25μl中，加入含30mg/mlDITC(1，4-亞苯基二異硫氰酸酯，F(xiàn)luka78480)的DMF溶液500μl。加入3ml水后室溫下攪拌該混合物1.5小時(shí)。用丁醇(3×3ml)提取該溶液后，將剩余水相(500μl)真空干燥，然后與400μl硼酸鹽緩中液(0.1M，pH9.3)中的1×10-7mol(6.6mg)BSA(Pierce30444)混合。室溫下攪拌過(guò)夜后，偶聯(lián)物在AX300柱(BROWNLEE4.6×100mm)上用NaCl梯度進(jìn)行離子交換HPLC而純化(表1)。將偶聯(lián)物峰洗脫液對(duì)水(2×1升)透析，真空濃縮，溶于1ml水中于-20℃保存。色譜條件梯度25分鐘內(nèi)10％-56％緩沖液B′2分鐘內(nèi)56-100％緩沖液B′。緩沖液A′和B′的性質(zhì)A′＝20mM磷酸鈉，pH7.00/20％CH3CNB′＝緩沖液A′+1MNaCl或2MNaCl。實(shí)施例3表2顯示DRβ基因不同等位基因的氨基酸排列對(duì)比，以表明突變氨基酸相對(duì)于選定保守序列(稱為“DRCONS”)的位置。這些突變相應(yīng)于DNA中的非沉默突變，即引起氨基酸變化的突變。實(shí)際上已知DNA中三聯(lián)堿基將要編碼的氨基酸。在第三位的突變一般不引起氨基酸的變化，而第二堿基的改變很可能引起氨基酸的改變，第一堿基的突變總是引起氨基酸的變化。因而在不同等位基因的分型中，相應(yīng)于非沉默突變的DNA突變最常用。但檢測(cè)沉默型突變也是可能的，例如為了區(qū)分兩個(gè)密切相關(guān)的等位基因。表3顯示了所有迄今已知和文獻(xiàn)中出版的等位基因的DRβ基因核苷酸排列對(duì)比(相對(duì)表2中的相同保守序列)。用于指稱不同等位基因的命名規(guī)則是由第五次組織相容性會(huì)議上提出的(Leiden，荷蘭，1991)。表2中括號(hào)中的代號(hào)是以前的命名。表2102030405060708090*****************DRCONSPRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRB1*0101(Dw1)----W-L-F------------L-E-CI-----S----------------------------------------------------------DRB1*0102(Dw20)----W-L-F------------L-E-CI-----S------------------------------------------------AV--------DRB1*0103(DwBON)----W-L-F------------L-E-CI-----S------------------------------I--DE-----------------------DRB1*1501(Dw2)----W-P-R-----------------------S----------F-------------------I---A--------------V--------DRB1*1502(Dw12)----W-P-R-----------------------S----------F-------------------I---A-----------------------DRB1*1601(DW21)----W-P-R-----------------------S------------------------------F--D------------------------DRB1*1602(Dw22)----W-P-R-----------------------S------------------------------L--D------------------------DRB1*0301(DRw17)-----YST-------------Y-----H----N----------F-----------------------K-GR--N--------V--------DRB1*0302(DRw18)-----YST---------------E---H----N----------------------------------K-GR--N-----------------DRB1*0401(Dw4)------V-H-------------------H--------------------------------------K-----------------------DRB1*0402(Dw10)------V-H-------------------H----------------------------------I--DE--------------V--------DRB1*0403(Dw13TAS------V-H-------------------H-----------------------------------------E-----------V--------DRB1*0404(Dw14)------V-H-------------------H-----------------------------------------------------V--------DRB1*0405(Dw15)------V-H-------------------H-----------------------S--------------------------------------DRB1*0406(KT2)------V-H-------------------H---S-------------------------------------E-----------V--------DRB1*0407(Dw13JHA------V-H-------------------H-----------------------------------------E--------------------DRB1*0408------V-H-------------------H--------------------------------------------------------------DRB1*0409------V-H-------------------H-----------------------S--------------K-----------------------DRB1*0410-----------------H-----------------------S-----------------------------V-DRB1*0411-----------------H-----------------------S-----------------E-----------V-DRB1*0701(Dw17)----W-G-YK----------Q--E-L------F-------------------V--S------I--D--GQ---V-----------------DRB1*0702(DB1)----W-G-YK----------Q--E-L------F-------------------V--S------I--D--GQ---V-----------------DRB1*0801(MADURA)-----YSTG--Y----------------------------------------S---------F--D---L-------------DRB1*0802(SPL)-----YSTG--Y--------------------------------------------------F--D---L---------------------DRB1*0803(TAB)-----YSTG--Y----------------------------------------S---------I--D---L---------------------DRB1*0804-----YSTG--Y--------------------------------------------------F--D---L-------------V-------DRB1*0901(Dw23)--------Y-H-GI-----N-------------------V--S------F--R---E---V-----------------DRB1*1001-----EV-F------------L-E-RVH-----A-Y-----------------------------R-------------------------DRB1*1101(SVEIG)-----YST----------------------------------F----------E--------F--D-------------------------DRB1*1102(JVM)-----YST----------------------------------F----------E--------I--DE---------------V--------表2(續(xù))102030405060708090*****************DRCONSPRFLEQxKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRB1*1103(UA-S2)-----YST-----------------------------------F----------E--------F--DE--------------V--------DRB1*1104(TUBO)-----YST-----------------------------------F----------E--------F--D---------------V--------DRB1*1201(HERLUF)-----YSTG--Y--------------H-H----LL--------F---------V--S------I--D--------------AV--------DRB1*1202-----YSTG--Y--------------H-H----LL--------F---------V--S------F--D--------------AV--------DRB1*1301(HHK)-YST--------------------H----N---------F-------------------I--DE--------------V--------DRB1*1302(WT46)-----YST--------------------H----N---------F-------------------I--DE-----------------------DRB1*1303(HAG)-----YST---------------------------------------------S---------I--DK-----------------------DRB1*1304YST-----YST-----------------------------------F---------S---------I--DE--------------V--------DRB1*1305(DES.DI)-----YST--------------------H----N---------F-------------------F--D------------------DRB1*1401(TEM)-----YST--------------------H----F-------------------A--H---------R---E-----------V--------DRB1*1402(AMALA)-----YST----------------E---H----N---------------------------------------------------------DRB1*1403(J×6)-----YST----------------E---H----N--------------------------------D---L--------------------DRB1*1404-----YSTG-------------------H----F-------------------A--H---------R---E-----------V--------DRB1*1405---YST---Q----------------H----F--------------------------------R---E-----------V-DRB3*0101(52a)-----LR---------------Y-----H----FL------------------V--S----------K-GR--N-----------------DRB3*0201(52b1)-----LL-----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N--------V--------DRB3*0202(52b2)-----LL-----------------E-H-H-----A------------R-------------------K-GQ--N-----------------DRB3*0301(52c)-----LL-----------------E---H----F-------------------V--S----------K-GQ--N--------V--------DRB4*0101------A-C----L-------WN-I--I------A-YN--L---Q---------------------R---E------Y----V--------DRB5*0101(Dw2)----Q-D-Y---------------H-DI-----DL----------------------------F--D------------------------DRB5*0102(Dw12)----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------F--D------------------------DRB5*0201(Dw21)----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------I---A-------------AV--------DRB5*0202(Dw22)----Q-D-Y---------------H-GI-----N-----------------------------I---A-------------AV--------表31015202530354045RFLEQXKSECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEEYVRFDSDVGEYRADRconsCACGTTTCTTGGAGCAGxxTAAGTCTGAGTGTCATTTCTTCAATGGGACGGAGCGGGTGCGGTTCCTGGACAGATACTTCTATAACCAGGAGGAGTACGTGCGCTTCGACAGCGACGTGGGGGAGTACCGGGCGDRB3*0101---------------T-CG----------------------------------------------A----------------C---------------T-C---------------------------------DRB3*0201---------------T-CT-----------------------------------------------------G---C-----C------------------CDRB3*0202---------------T-CT-----------------------------------------------------G---C-----C------------------CDRB3*0301---------------T-CT-----------------------------------------------------G---------C---------------TDRB1*0301--------------T-CTC--C-------------------------------------------A----------------C--------------A------------------------------T-----DRB1*0302--------------T-CTC--C--------------------------------------------------G---------C--------A------------------------------------DRB1*1101--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1102--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1103--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1104--------------T-CTC--C-----------------------------------------------------------------A----------------------------------------T-----DRB1*1201--------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------A------G---C------------------CT-C-----------------------------T-----DRB1*1202--------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------A------G---C------------------CT-C-----------------------------T-----DRB1*1301--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1302--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1303--------------T-CTC--C--------------------------------------------------------------------A-------------------------------------------DRB1*1304--------------T-CTC--C--------------------------------------------------------------------A-------------------------------------------DRB1*1305--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C-----------A--------------------------------T-----DRB1*1401--------------T-CTC--C-------------------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*1402--------------T-CTC--C--------------------------------------------------G----------C-----------A--------------------------------------DRB1*1403--------------T-CTC--C--------------------------------------------------G----------C-----------A--------------------------------------DRB1*1404--------------T-CTC--C-GG-------T--------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*1405--------------T-CTC--C------------A------------------------------------------------C------------T-------------------------------------DRB1*0801--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*0802--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*0803--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----A-----------------------------------DRB1*0804--------------T-CTC--C-GG-------T-----------------------------------------------------------A-----------------------------------------DRB1*04-----------------GT---ACA------------------C-------------------------------------------C----A-----------------------------------------DRB1*0406-----------------GT---ACA------------------C-------------------------------------------C----A-------C---------------------------------DRB4*0101-----------------GC-----G-------------C-----------------A---T--AA----AT-------A-------------A---------C-----A-A----T---C-----------A--DRB1*07--------C--TG----GG-----A-A----------------C-----------------A---------A---CT----------------------T----------------------------------DRB1*0901-----C--------------------AT---C-----GG-A-------------A-----A-----------------------------------DRB1*1001--------------G--GT-----T------------------C---------------------G-----A---CG-G--C----------A---------C-----A---------------DRB1*0101-----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB1*0102-----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB1*0103-----------TG----CT-----T---A------------------------------------G-----A----G-A-------------A------C------------------------DRB5*0101-----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----G--A-------------A-----G--T----------------------DRB5*0102-----------C-----GA-----A------------------C-------------------------------GG-A-------------A-----A-------------------------DRB5*0201/02-----------C-----GA-----A------------------C-------------------------C-----GG-A-------------A-----A-------------------------DRB1*1501-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------T-----DRB1*1502-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------T-----DRB1*1601-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------------DRB1*1602-------C--TG-----CC----AGG-------------------------------------------------------------------C------------------------------表3(續(xù))505560657075808590VTELGRPDAEYWNSQKDLLEQ×RA×VDTYCRHNYGVGESFTVQRRDRconsGTGACGGAGCTGGGGCGGCCTGATGCCGAGTACTGGAACAGCCAGAAGGACCTCCTGGAGCAGA×GCGGGCCG×GGTCGACACCTACTGCAGACACAACTACGGGGTTGGTGAGAGCTTCACAGTGCAGCGGCGADRB3*0101----------------------TC-------C--------------------------------A------G-CG---------AT------------------------------------------------DRB3*0201----G-----------------------------------------------------------A------G-CA---------AT-------------------------TG---------------------DRB3*0202----G-----------------------------------------------------------A------G-CA---------AT------------------------------------------------DRB3*0301----------------------TC-------C--------------------------------A------G-CA---------AT-------------------------TG---------------------DRB1*0301----------------------------------------------------------------A------G-CG---------A--------------------------TG---------------------DRB1*0302----------------------------------------------------------------A------G-CG---------A-------------------------------------------------DRB1*1101-------------------------AG------------------------T-------AG-C-G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1102-------------------------AG------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1103-------------------------AG------------------------T-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1104-------------------------AG------------------------T-------AG-C-G---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1201----------------------TC-------C-------------------A-------AG-C-G---C-----C------------T--------------------C--TG---------------------DRB1*1202----------------------TC-------C-------------------T-------AG-C-G---C-----C------------T--------------------C--TG---------------------DRB1*1301---------------------------------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1302---------------------------------------------------A-------AG-CGA---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1303---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-A---------C-------------------------------------------------G---------DRB1*1304---------------------AGC---------------------------A-------AG-CGA---------C------------------------------------TG---------------------DRB1*1305---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1401----------------------C---G---C------------------------------G--G---------A------------T-----------------------TG---------------------DRB1*1402----------------------------------------------------------------G---------C-----------------------------------------------------------DRB1*1403---------------------AGC-----------------------------------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*1404----------------------C---G---C------------------------------G--G----------A-----------T-----------------------TG---------------------DRB1*1405--------------------------T----------------------------------G--G----------A-----------T-----------------------TG---------------------DRB1*0801---------------------AGC---------------------------T-------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*0802---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------CT------------------------------------------------G---------DRB1*0803---------------------AGC---------------------------A-------AG-C-G---------CT----------------------------------------------------------DRB1*0804---------------------------------------------------T-------AG-C-G---------CT-----------------------------------TG---------------------DRB1*0401----------------------------------------------------------------A----------C----------------------------------------------------------0402---------------------------------------------------A-------AG-CGA----------C-----------------------------------TG---------------------0403----------------------------------------------------------------G----------A-----------------------------------TG---------------------0404----------------------------------------------------------------G----------C-----------------------------------TG---------------------0405---------------------AGC----------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------0406----------------------------------------------G----------A-----------------------------------------------------TG---------------------0407----------------------------------------------------------------G----------A----------------------------------------------------------0408----------------------------------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------DRB4*0101-----------------------C--T----------------------------------G--G----------A-------------------T---------------TG---------------------DRB1*07-----------A----------TC-------C--------------A-------------G-C-G-------G-CA----------GTG---------------------------------------------DRB1*0901----------------------T--------C--------------T--------------G--G----------A----------GTG------------------------------------------A--DRB1*1001-------------------------------------------------------------G--G---T------C----------------------------------------------------------DRB1*0101----------------------------------------------------------------G----------C----------------------------------------------------------DRB1*0102----------------------------------------------------------------G----------C--------------------------------C--TG---------------------DRB1*0103----------------------------------------------A------------AG-C-G----------C----------------------------------------------------------DRB5*0101-----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB5*0102-----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB5*0201/02-----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C-----------------------------------C--TG---------------------DRB1*1501-----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C--------------------------------------TG---------------------qDRB1*1502-----------------------C--T-------------------A----------------GC----------C-------------------------------------------------------------DRB1*1601-----------------------C--T-------------------T------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------DRB1*1602-----------------------C--T--------------------------------AG-C-G---C------C-------------------------------------------------------------實(shí)施例4利用上述兩種途徑，合成的寡核苷酸要么如實(shí)施例1中所述帶有配體并列在表4中，要么如實(shí)施例2中所述與BSA連接并列在表5中。表4</tables>**X代表按前文表1中所用命名系統(tǒng)的配體，**tr表示在實(shí)施例1中所述條件(BROWNLEERP18柱(4.6mm×25cm)，流速1m1/分)下，寡核苷酸的HPLC保留時(shí)間(分)。***序列33，34和34bis中的字母I代表肌苷。表5*TR表示在實(shí)施例2中所述條件下與BSA相連寡核苷酸的HPLC保留時(shí)間(分)。(1M)指緩中液B含1MNaCl(2M)指緩沖液B含2MNaCl。**按應(yīng)用生物系統(tǒng)(APPLIEDBIOSYSEMS)公司的說(shuō)明，通過(guò)測(cè)定260nm處的吸光度用紫外光度法以皮可摩爾對(duì)寡核苷酸定量。用BRADFORD法(BRADFORDM.M.，分析生物化學(xué)，72，248(1976))以皮可摩爾測(cè)定BSA。oligo/BSA比是這兩個(gè)值之比。在本實(shí)施例中建立了捕捉探針寡核苷酸，它們可以以不帶配體或帶有配體或與例如BSA連接的形式來(lái)合成。這種合成寡核苷酸序列的選擇要考慮實(shí)施例3表3中所述不同等位基因DNA序列的排列對(duì)比。利用選擇用作例如捕捉探針的這些寡核苷酸能夠建立一種分型表，如表6中所示。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很顯然用其他寡核苷酸可以建立其他分型表。表6<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="1284">探針1543910141744454648472824275237554242bis類別DRB1*0101DRB1*0102DRB1*0103+++++DRB5*0101DRB5*0102DRB5*0201/0202+++++DRB1*0301DRB1*0302+++ou+++++DRB1*0401-0412DRB1*0402+++DRB1*1101/1104DRB1*1102/1103+++++DRB1*12001/1202++++DRB1*1301DRB1*1302DRB1*1303DRB1*1304DRB1*1305+++ou++++++++++DRB1*1401DRB1*1402DRB1*1403DRB1*1404DRB1*1405++++++++++++++++DRB1*0701/0702+DRB1*0801-0804++DRB1*0901+DRB1*1001+</table></tables>表6中括號(hào)中的代號(hào)是1991年組織相容性會(huì)議前對(duì)DRB5等位基因亞型的命名。十號(hào)意指表6中該行的亞型與相應(yīng)列中的探針雜交。利用表6可以很容易地解析各種探針?biāo)媒Y(jié)果(雜交或不雜交)，例如用探針43、14、28和37得陽(yáng)性反應(yīng)的靶標(biāo)相應(yīng)于DRB1*0301/DRB1*07型。實(shí)施例5檢測(cè)探針的制備按照實(shí)施例2，活化并真空干燥的寡核苷酸與0.1M硼酸鈉緩沖液(pH9.3)200μl中的1.25×10-7mol(5mg)辣根過(guò)氧化物酶(BOEHRINGERMANHEIM413470)混合。純化方法相同偶聯(lián)物保存在-20℃50mMTris-HCl緩中液，pH7.0，40％甘油中。表7中列出了用于HLA-DR檢測(cè)的不同偶聯(lián)物。</tables>*Tr表示在實(shí)施例2中所述條件下與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)相連寡核苷酸的HPLC保留時(shí)間(分)。(2M)指緩沖液B含有2MNaCl。**按應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的說(shuō)明，通過(guò)測(cè)定260nM處的吸光度用紫外光度法以皮可摩爾定量寡核苷酸。按ATORM.A.，《生物學(xué)化學(xué)雜志》，31，14954(1987)的方法在402nM處檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶。oligo/HRP比是這兩個(gè)值之比。***序列D2中的字母I指肌苷。序列D1中的(GT)指在該位置存在G和T兩種堿基的等摩爾混合物。實(shí)施例6遺傳材料的制備按以下實(shí)驗(yàn)方法在應(yīng)用生物系統(tǒng)儀器上從全血提取核酸將2-6ml全血加在TE緩中液(10mMTris-HCl，pH8.00，1mMED-TA)(加足至6m1)中并置于30ml萃液漏斗中。加入蛋白酶K的溶液(840單位，20mMTris-HCl，pH8.5中)。整個(gè)混合物在55℃攪拌保溫1小時(shí)。用苯酚/氯仿混合物同時(shí)萃取(8.5ml)2次除去存在的過(guò)量蛋白。于60℃攪拌混合物20分鐘，除去有機(jī)相后再進(jìn)行苯酚萃取。37℃下用氯仿(9.5ml)提取10分鐘除去過(guò)量的苯酚。加入0.5ml3M醋酸鈉(pH5.5)和13.5ml異丙醇沉淀水相中的DNA，然后回收在濾膜上。然后將DNA溶在1ml蒸餾水中，在260nM處分光光度法檢測(cè)。實(shí)施例7DNA擴(kuò)增按照下述步驟用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)(MULLIS和FALOONA《酶學(xué)方法》155卷，335-350頁(yè))進(jìn)行酶法擴(kuò)增將總體積100μl下述緩沖液中的0.1-0.2μg純化或未純化的DNA加入Eppendorf管中-10倍濃縮的PCR緩沖液10μl(500mMKCl、100mMTris-HCl、pH8.3(20℃)、15mMMgCl2、0.1％明膠)-0.5μMdNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)2μl-相當(dāng)于25pmol的每種引物2μl-Taq聚合酶(PerkinElmerCétus)1.5單位-蒸餾水(加足至100μl)-石蠟油50μl將此管置于熱循環(huán)儀(Thermocycler，PerkinElnerCétus)中，在其中進(jìn)行如下溫度循環(huán)35個(gè)-95℃變性0.5分鐘-55℃雜交0.5分鐘-72℃延伸0.5分鐘所用引物具有下列序列引物1＝5′-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3′引物2＝5-TCGCCGCTGCACTGTGAAG-3′實(shí)施例8將給定DR特異性的捕捉探針寡核苷酸在3×PBS(0.45MNaCl、0.15M磷酸鈉，pH7.0)中的0.15μM濃度的溶液100μl置于聚苯乙烯微滴定板(Nunc439454)的一個(gè)孔中。填充的孔數(shù)等于分型所需數(shù)目。每次都應(yīng)加入陽(yáng)性對(duì)照以檢驗(yàn)擴(kuò)增步驟以及檢測(cè)步驟的效力。用作陽(yáng)性對(duì)照的捕捉探針存在于迄今已知的所有等位基因上，并具有下述序列5′-GGGGAGTACCGGGCGGTGACGGAGCTGGGGCGGCCT-3′用PBS/吐溫300μl(0.15MNaCl、0.05M磷酸鈉、pH7.0；0.5％吐溫20(Merek822184))洗板3次。如實(shí)施例7中所述的擴(kuò)增產(chǎn)物(100μl)與2NNaOH10μl室溫下攪拌5分鐘進(jìn)行變性。向此溶液中相繼加入2N醋酸10μl和體積等于n×50μl(n是分型所需捕捉探針的數(shù)目)的PEG緩中液(0.1M磷酸鈉，pH7.0，0.5MNaCl，0.65％吐溫20，0.14mg/ml鮭魚精子DNA(SigmaD9156)，2％PEG4000(Merck807490))。每孔中分配該溶液50μl，然后加入PEG緩中液中15nM濃度的檢測(cè)探針(寡核苷酸-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)物)50μl。該板在37℃下保溫1小時(shí)，用3×300μlPBS/吐溫洗滌。向每孔中加入OPD緩沖液(0.05M檸檬酸，0.1MNa2HPO4，pH4.93)中4mg/mlOPD底物(鄰苯二胺，劍橋醫(yī)學(xué)生物技術(shù)貨號(hào)/456)100μl(臨用前向其中加入30體積稀釋度為1/1000的H2O2)。反應(yīng)20分鐘后，用1NH2SO4100μl封阻酶活性，在Axia微讀數(shù)器(bioMérieux)上讀取492nm處的讀數(shù)。實(shí)施例9按實(shí)施例6中描述的方法制備的6種DNA用實(shí)施例7中所述方法擴(kuò)增。分型操作中包括下列捕捉探針5′a-GATACTTCTATCACC3′＝在5′末端帶有配體的DR3特異性的寡核苷酸(編號(hào)545)，5′GATACTTCTATCACC3′＝不帶配體的相同序列的寡核苷酸(編號(hào)545nu)，5′a-TGGACAACTACTG3′＝5′-末端帶有配體的DR4特異性的寡核苷酸(編號(hào)546)，5′TGGACAACTACTG3′＝不帶配體的相同序列的寡核苷酸(編號(hào)546nu)。按照實(shí)施例8中所述一般方法進(jìn)行分型操作。探針D1和D2(表7)的50％/50％混合物用作檢測(cè)探針。結(jié)果示于下表8中表8不帶配體的兩個(gè)探針沒(méi)能區(qū)分這些DNA的特異性，而帶有配體a的相同序列能夠鑒別這些DNA的DR2和DR4特異性。實(shí)施例10按實(shí)施例6所述方法制備的24種DNA用實(shí)施例7中所述方法擴(kuò)增。按照實(shí)施例8中所述一般方法進(jìn)行分型操作。探針D1和D2(表7)的50％/50％混合物用作檢測(cè)探針。在分型操作中包含下表9中所列的捕捉探針。表9</tables>分型結(jié)果示于表10中表10探針154391014174445464847OLIGON°563603571-BSA545398591595574-BSA556-BSA555-BSA867-BSA756-BSADNA編號(hào)580,0170,0250,7180,0130,0291,0060,0720,0330,0220,0180,0150,016590,5090,0240,0360,0160,0290,9290,0720,0310,0250,0180,0370,018630,0140,0210,0300,0110,0240,0500,0300,0330,023＞2,5000,0160,024660,0120,0270,0660,0150,0230,9920,0980,0310,0240,0220,0600,016670,4680,0890,0350,042＞2,5000,0540,0300,0320,028＞2,5000,0420,015680,0170,0490,0370,0250,0170,8260,0680,0310,024＞2,5000,1200,016700,5040,0180,0270,0200,0760,0160,0170,0330,0310,0170,0701,674710,0110,0170,0310,025＞2,5000,0190,0300,0320,030＞2,5000,0200,021720,4591,3730,0460,0250,0310,0850,0150,0440,0370,0170,0170,019730,3530,8900,0340,0180,0160,0480,0210,0440,0340,0190,0150,017750,0190,0520,6251,1130,0440,0430,0230,0330,0380,0190,0180,017780,0150,0370,6250,0150,0320,5890,0460,0340,0310,0150,0480,019790,0140,0120,4250,0130,0300,0100,0150,0330,028＞2,5000,0390,017800,0180,7520,0410,0250,0160,4480,0400,0450,0300,0210,0360,016830,0140,9590,0300,0220,0170,0420,5360,0500,0280,0730,0230,021840,0070,0130,0230,3990,0150,0130,0140,0310,0281,2100,0420,016850,0150,0130,4680,0140,0100,0180,0160,0760,034＞2,5000,0120,019860,0190,7470,0350,9390,0230,0560,0180,0410,0290,0210,0700,021870,0161,1900,0350,0160,0130,0460,0140,0430,029＞2,5000,0250,019890,0120,0320,0260,9560,0150,0210,0180,0320,0280,0170,0140,019900,3550,0350,0311,0280,0420,0380,0230,0350,0360,0170,0160,022910,8660,0080,0160,0140,0400,0360,0150,0140,0320,0200,0180,019920,4010,0150,0190,0130,0100,0120,0260,0210,0190,0180,0140,025950,0100,0110,0480,0370,0100,0170,0230,0420,0161,9311,9730,024</table>表3Δn×d(μm)反射率(％)比較例0.3020.80.3222.20.3423.2實(shí)施例0.3623.70.3824.10.4024.30.4224.30.4424.20.4624.00.4823.90.5023.5比較例0.5223.20.5422.90.5622.7</table></tables>所述方法使我們對(duì)24種試驗(yàn)DNA進(jìn)行了清楚無(wú)疑的分類。實(shí)施例11本發(fā)明中所述HLA-DR分型方法中的優(yōu)選雜交溫度為37℃。但這一雜交溫度可以改變。下述實(shí)施例與實(shí)施例10相同，只是雜交溫度從37℃改為45℃。對(duì)11種DNA進(jìn)行分型。所用的捕捉探針示于下表11中表11</tables>分型結(jié)果示于表12中</tables>實(shí)施例12如實(shí)施例8中所述，HLA-DR分型中所用的優(yōu)選雜交緩沖液(稱為PEG緩沖液)具有如下組成0.1M磷酸鈉，pH7，0.5MNaCl，0.65％吐溫20，0.14mg/ml鮭魚精子DNA(SigmaD9156)，2％PEG4000(Merck807490)。使用了含有甲酰胺(終濃度10％)的相同緩中液。已知甲酰胺能使雜交溫度降低。如果在甲酰胺存在下仍在37℃下進(jìn)行雜交，則檢測(cè)特異性應(yīng)提高。對(duì)實(shí)施例10中所述的24種DNA進(jìn)行分型。所用的捕捉探針和所得值示于下表13中。表13表13(續(xù))<tablesid="table13"num="013"><tablewidth="1215">探針282427523742OLIGON°80210661068997-BSA10331060對(duì)照+DNA編號(hào)DNA編號(hào)分類580,0360,0050,0010,0040,2070,009＞2,50058DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0101-0102/DRB1*07DRB1*12/DRB1*1301DRB1*07/-DRB1*01/DRB1*11DRB1*07/DRB1*1302DRB1*1401/DRB1*0101-0102DRB1*11/DRB1*1301DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0101/DRB5*0101DRB1*0301/DRB1*04DRB1*0301/DRB1*07DRB1*0301/DRB1*1301DRB1*07/DRB5*0101DRB1*08/DRB5*0101DRB1*04/DRB1*1302DRB1*03/DRB1*13DRB1*04/DRB5*0201-0202DRB1*1301/DRB5*0201-0202DRB1*04/DRB1*12DRB1*0101/DRB1*04DRB1*0101/-DRB1*0101/DRB1*1402DRB1*1302/DRB1*1303590,0020,0060,0080,0040,0090,010＞2,50059630,0260,1150,0580,0290,2610,011＞2,50063660,0070,0050,0070,0080,0120,010＞2,50066670,0090,0050,0080,0090,2510,024＞2,50067680,0360,0060,0090,0100,0160,011＞2,50068700,0080,0040,0550,0080,1990,009＞2,50070710,0340,0030,0050,0090,5390,008＞2,50071720,0100,0090,0060,0040,0090,130＞2,50072730,0100,0090,0050,0050,0100,150＞2,50073750,0380,0080,0080,0210,0140,010＞2,50075780,0410,0070,0040,0070,2540,015＞2,50078790,0640,0070,0060,0280,3150,012＞2,50079800,0070,0080,0090,0080,0110,142＞2,50080830,0100,1660,0070,0090,0170,159＞2,50083840,0500,0060,0080,0100,0140,009＞2,50084850,0630,0090,0070,0360,0090,011＞2,50085860,0140,0080,0040,0110,0100,010＞2,50086870,0420,0070,0050,0280,0070,004＞2,50087890,0080,0680,0390,0050,2010,006＞2,50089900,0080,0110,0090,0060,0100,009＞2,50090910,0100,0100,0060,0080,0090,011＞2,50091920,0400,0070,0120,0280,0180,012＞2,50092950,0350,0080,0090,0300,0170,009＞2,50095</table></tables>優(yōu)選的雜交溫度為37℃、優(yōu)選的雜交緩沖液是PEG緩中液，但如實(shí)施例11和12中的結(jié)果所示，雜交溫度和雜交緩沖液都可以改變。從以上描述可以清楚看出，本發(fā)明綜合了下列優(yōu)點(diǎn)可以分辨所有等位基因的最佳特異性，實(shí)施簡(jiǎn)便，比血清分析的費(fèi)用低，操作迅速，擴(kuò)增后約90分鐘得到結(jié)果，相當(dāng)于總時(shí)間少于12小時(shí)，這對(duì)腎提供者是至關(guān)重要的，與個(gè)體分型的相容性，這對(duì)急診分型和在小實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用很重要，信號(hào)可用光密度定量，適當(dāng)時(shí)可用簡(jiǎn)單的計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)處理結(jié)果，適應(yīng)于自動(dòng)化系統(tǒng)。實(shí)施例13類似于上述方法，制備了相應(yīng)于編號(hào)為101、102、103、104、115和111的寡核苷酸的捕捉探針。當(dāng)這些探針用作捕捉探針時(shí)，它們識(shí)別說(shuō)明書中指出的那些特異性。另外，本發(fā)明的捕捉探針可與下列檢測(cè)探針一起使用-GCGGTGACGGAGCTGG-GAACAGCCAGAAGGAC.權(quán)利要求1.選自下組的核酸探針-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGC，或其互補(bǔ)序列。2.能進(jìn)行HLRDR分型的一套寡核苷酸探針，其包括至少一種選自下組的探針-TGGCAGCTTAAGTTT-CCTAAGAGGGAGTG-GCGAGTGTGGAACCT-AAGACAGGCGGGC，或其互補(bǔ)序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2的一套探針，其還含有至少一種選自下組的探針-GTGGACAACTACTG-GATACTTCTATCACCAA-GCCTGATGAGGAGTAC-TGGCAGGGTAAGTATAAG-GGGCCCTGGTGGACA-TGCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-CTGGAAGACGAGCG-TGGAAGACAAGCGG-TGCGGAGCACTGGA-AACCAGGAGGAGAACGTG-ACTCTACGGGTGAGTG-GACACCTATTGCAGAC，下劃線部分相當(dāng)于最小序列，或其互補(bǔ)序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3的一套探針，其含有選自下組的至少一種探針-TGGACAACTACT-GATACTTCTATCACC-CCTGATGAGGAGTA-GGCAGGGTAAGTATAAG-GGCCCTGGTGGA-GCGGTATCTGCACA-GGAGGAGGTTAAGTT-TGGAAGACGAGC-GGAAGACAAGCG-GCGGAGCACTGG-AACCAGGAGGAGAACGT-CTCTACGGGTGAGT-ACACCTATTGCAGA，或其互補(bǔ)序列。5.根據(jù)權(quán)利要求2或3的一套探針，其還含有選自下組的至少一種探針-GAGGAGGACTTGCGCT-TACGGGGCTGTGGAG-GGAGCTGCGTAAGT-TTCCTGGAGAGACAC-GGGGAGAGATACTTCC，或其互補(bǔ)序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5的一套探針，其含有選自下組的至少一種探針AGGAGGACTTGCGC-ACGGGGCTGTGGA-GAGCTGCGTAAGTTCCTGGAGAGACAC-GGAGAGATACTTC，或其互補(bǔ)序列。7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的一套探針，其含有探針-AACCAGIAGGAGAACGT.或其互補(bǔ)序列。8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的一套探針，其還含有下列探針的至少一種GCGGTGACGGAGCTGGGAACAGCCAGAAGGACCCGGGCGGTGACIGAGCTGGGGC，或其互補(bǔ)序列。9.按標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸分型技術(shù)從個(gè)體樣品測(cè)定個(gè)體HLA-DR類型的方法，其特征在于使用權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)定義的一套探針的至少一部分作為捕捉探針或檢測(cè)探針。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述探針選自權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)中提到的那些。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其特征在于所述探針用作捕捉探針。12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其特征在于它包括下列步驟--將每種捕捉探針固定在固體載體上，--在若靶標(biāo)中存在與探針互補(bǔ)的序列則可發(fā)生雜交的預(yù)定條件下，使每種固定化捕捉探針與含有至少一種核酸靶片段的液體介質(zhì)接觸，和--檢測(cè)可能形成的雜交體的存在。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于在37℃溫度下進(jìn)行每種固定化捕捉探針與含至少一種核酸靶片段的液體介質(zhì)接觸的步驟。全文摘要選自下組的核酸探針TGGCAGCTTAAGTTT，CCTAAGAGGGAGTG，GCGAGTGTGGAACCT，AAGACAGGCGGGC或其互補(bǔ)序列。這些探針可用于尤其在器官轉(zhuǎn)植前進(jìn)行個(gè)體的HLADR分型。文檔編號(hào)C12N15/09GK1159211SQ9619078公開(kāi)日1997年9月10日申請(qǐng)日期1996年6月3日優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日發(fā)明者P·A·阿里伯特,P·克洛斯,B·F·梅徹,B·F·曼德蘭德,J-M·蒂爾西申請(qǐng)人:比奧美希奧公司