專利名稱：：大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因及含該基因的新實(shí)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)的基因治療領(lǐng)域，具體地說是涉及克隆大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD，cytosinedeaminase，E.C.3.5.4.1)基因，通過酶活性分析篩選得高表達(dá)活性克隆，含CD基因及含嵌合CD基因真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建。此類真核重組表達(dá)載體用以產(chǎn)生“假型”病毒及該類“假型”病毒用作惡性腫瘤基因治療的用途。目前，腫瘤的傳統(tǒng)療法是手術(shù)、放療和化療聯(lián)合使用，對提高腫瘤療效取得了一定的進(jìn)展，但對于多數(shù)腫瘤如肝癌、腦瘤、肺癌等其治療效果不盡人意，故臨床上對新療法的出現(xiàn)有迫切需求。腫瘤治療中的新一代療法，生物治療中的基因治療具有現(xiàn)有療法不具備的優(yōu)點(diǎn)，如更好的選擇性、多重目的性等。因此，惡性腫瘤基因治療將會成為現(xiàn)有療法的一種補(bǔ)充，并成為綜合療法的一員。因此，各國生命科學(xué)工作者都競相展開了有關(guān)腫瘤基因治療的研究工作，其中胞嘧啶脫氨酶基因用于基因治療就是其中的研究方向之一。依據(jù)一種對人體無毒或極低毒性的藥物前體經(jīng)相關(guān)酶代謝后生成對細(xì)胞具有代謝毒性的產(chǎn)物事實(shí)，為腫瘤基因治療提出了病毒介導(dǎo)的酶-藥物前體治療方案。胞嘧啶脫氨酶具有催化胞嘧啶脫氨形成脲嘧啶的功能。哺乳類生物細(xì)胞一般不產(chǎn)生這種酶，而許多真菌、細(xì)菌類細(xì)胞能夠生成該酶。細(xì)胞內(nèi)表達(dá)CD基因的微生物將5-氟胞嘧啶(5-FC，5-fluorocytosine)代謝成為對細(xì)胞具有殺滅毒性的產(chǎn)物5-氟脲嘧啶(5-FU，5-fluorouracil)?，F(xiàn)已知大腸桿菌編碼的CD是以同一單體的多聚體形式行使其功能的。該酶的全酶分子量為210,000道爾頓；單體多肽分子量為58,000道爾頓；在pH7-9范圍內(nèi)，于40℃情況下可保持活性數(shù)月。1992年CraigA.Mullen等報(bào)道了5-FC對有CD基因?qū)氲恼婧瞬溉轭惣?xì)胞殺傷性研究(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，33～37，1992)。1993年ElizabethA.Austin和BrianE.Hubcr報(bào)道了大腸桿菌CD基因的DNA序列(MolecularPharmacology43，380～387，1993)。同年BrianE.Huber等報(bào)道了5-FC對活體外和活體內(nèi)有CD基因?qū)氲娜私Y(jié)腸癌細(xì)胞殺傷性研究數(shù)據(jù)，其結(jié)果表明CD基因可望于惡性腫瘤基因治療上取得療效(CancerResearch，53，4619～4626，1993；GeneTherapyforNeoplasticDisease，716，104～114，1994)。本發(fā)明目的是利用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法克隆、篩選出高表達(dá)活性的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因，構(gòu)建含CD基因及含嵌合CD基因的真核重組表達(dá)載體。將上述真核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞，以產(chǎn)生可應(yīng)用于惡性腫瘤基因治療的“假型”病毒用作基因治療用途。本發(fā)明主要包括四個(gè)方面，它們分別為提供了一種具有高表達(dá)活性的胞嘧啶脫氨酶基因；提供了含CD基因及嵌合CD基因的真核重組表達(dá)載體；提供了包有含CD基因，嵌合CD基因真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”病毒；“假型”病毒與藥物前體同時(shí)用作惡性腫瘤基因治療的用途。本發(fā)明第一方面是提供了一種具有高表達(dá)活性的胞嘧啶脫氨酶基因，其在原核細(xì)胞(大腸桿菌細(xì)胞)中的表達(dá)活性明顯高于已報(bào)道的CD基因(ElizabethA.Austin和BrianE.HuberMolecularPharmacology，43，380～387，1993)。本發(fā)明按相關(guān)文獻(xiàn)所報(bào)道的CD基因DNA序列(CraigA.Mullen等Proc.Natl.Acad.SCi.USA，89，33～37，1992；ElizabethA.Austin等，MolecularPharmaclogy，43，380～387，1993)，設(shè)計(jì)了兩對引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，考慮到“GTG”為弱起始密碼子，“ATG”為強(qiáng)起始密碼子，故將起始密碼子“GTG”人為地突變?yōu)椤癆TG”，DNA序列分析證實(shí)了這一結(jié)果。第一對引物為PI和PIII組成，PI(引物I)5′AAAAGAATTCTGGTTACCGGGAATTGTTCCGGTCAACGCGGTATTAGG3′；PIII(引物III)5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTCAACCTTTCTAATCCAT3′。第二對引物為PII和PIII組成，PII(引物II)5′TCACCCCAATTCAGGCTAGCAATGTCG3′；PIII(引物III)5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTCAACGTTTGTAATCGAT3′。第一對引物用來克隆帶啟動區(qū)域的CD基因，第二對引物用來克隆CD基因的閱讀框架且將起始密碼子“GTG”突變?yōu)椤癆TG”?；蚩寺∫詷?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法進(jìn)行，以大腸桿菌株H-30的基因組DNA為模板；通過PCR方法克隆出CD基因。為篩選高表達(dá)活性CD基因，先構(gòu)建重組克隆載體pUC18-CD，獲得重組克隆載體pUC18-CD后，組建原核重組表達(dá)載體pBV220-CD，組建過程見圖1。DH5α[pBV220-CD]已于1995年6月5日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO.M95031。將含有原核重組表達(dá)載體pBV220-CD的單克隆菌落接種于LB+Amp(含氨芐青霉素的一種大腸桿菌培養(yǎng)基)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使CD基因在大腸桿菌中表達(dá)，測定CD活性，篩選得高表達(dá)活性克隆。對CD進(jìn)行活性分析之前，進(jìn)行了CD單體多肽的SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析，這樣從單體多肽的分子量大小及CD基因在大腸桿菌中表達(dá)狀態(tài)水平上鑒定了CD基因的表達(dá)情況。電泳結(jié)果見圖2，其表明，表達(dá)的單體多肽分子量大小為58.0kD左右與預(yù)期結(jié)果一致，相關(guān)陰性對照組未見有單體多肽的蛋白條帶，這亦表明出現(xiàn)的表達(dá)蛋白條帶是CD基因的表達(dá)產(chǎn)物，即CD基因獲得了表達(dá)。從蛋白水平表明CD基因在大腸桿菌中已獲得表達(dá)后，進(jìn)行CD活性分析，以便篩選高表達(dá)活性克隆。CD活性分析參照文獻(xiàn)(ElizabethA.Auatin等，MolecularPharmacology43，380～387.1993)中所采用的酶活性分析方法。通過Bradford法測定11個(gè)含原核重組表達(dá)載體pBV200-CD克隆，1個(gè)含原核表達(dá)空載體PBV220克隆，1個(gè)宿主菌(大腸桿菌)DH5α克隆的細(xì)胞抽提液蛋白量值。紫外分光光度法測定上述克隆的一定量細(xì)胞抽提液和胞嘧啶混合物在一定溫度下于一定時(shí)內(nèi)，285nm處吸光度變化情況。據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，利用朗伯-比耳定律，經(jīng)公式S.A.=&Delta;AP.Q.&times;48.17]]>S.A.胞嘧啶脫氨酶活性，單位為以nmol為單位的脲嘧啶生成量/毫克細(xì)胞抽提蛋白/分鐘△A吸光度的降低值P.Q.以毫克為單位的蛋白量值計(jì)算出每個(gè)克隆CD活性，結(jié)果見表1。11個(gè)克隆中第1，2，6，7，9，10，11號克隆有活性，活性最高的克隆為11號克隆。表2為已報(bào)道的(ElizabethA.Austin和BrianE.Huber，MolecularPharmacolgy，43,380～387,1993)CD活性數(shù)據(jù)。比較表1、表2中CD活性，不難發(fā)現(xiàn)，我們所克隆到的CD基因的表達(dá)活性，尤其是第11號克隆表達(dá)活性明顯高于已報(bào)道的CD基因的表達(dá)活性。本發(fā)明的克隆、篩選高表達(dá)活性CD基因方法是以達(dá)到優(yōu)化篩選表達(dá)活性基因的目的。本方法可描述為以下步驟用已知的標(biāo)準(zhǔn)PCR法克隆出CD基因→構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pBV220-CD，并使CD基因在原核細(xì)胞(大腸桿菌)中獲得表達(dá)→測定不同克隆的酶活性，篩選得到高活性克隆第11號克隆→對第11號克隆進(jìn)行DNA序列分析，得本發(fā)明克隆的CD基因DNA核苷酸序列。經(jīng)上述克隆、篩選方法得到高表達(dá)活性克隆，如上述的第11號克隆后，對該克隆進(jìn)行DNA序列分析。DNA序列分析采取標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行，DNA序列分析結(jié)果見圖3。本發(fā)明克隆到的高表達(dá)活性CD基因DNA序列與已報(bào)道的CD基因相比較，存在16個(gè)位點(diǎn)堿基改變，引起肽鏈中氨基酸改變的位點(diǎn)有5個(gè)，結(jié)果見表3。這些堿基位點(diǎn)的改變來自不同種源的CD基因多態(tài)性及PCR法克隆CD基因過程中引起的堿基變化。這樣本發(fā)明提供了高表達(dá)活性的CD基因及其整個(gè)閱讀框架的1284個(gè)堿基序列。本發(fā)明的克隆、篩選高表達(dá)活性CD基因方法適用于全部以大腸桿菌基因組DNA為模板，克隆具有表達(dá)活性的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因，而且所克隆出的CD基因DNA序列與本發(fā)明所提供的CD基因DNA序列同源率不小于50％。本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供了含CD基因的真核重組表達(dá)載體，具體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒兩類重組表達(dá)載體。重組表達(dá)載體的構(gòu)建過程采用已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)。以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN，腺病毒載體pAdE1CMV為例說明組建含CD基因的真核重組表達(dá)載體。將CD基因組裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN的5′LTR中相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件下游，得重組體pLCDSN，構(gòu)建過程見圖4；CD基因組裝入腺病毒載體pAdE1CMV的CMV啟動子下游，得重組體pAdE1CMV-CD，構(gòu)建過程見圖5。XL1-Blue[pAdE1CMV-CD]已于1996年11月25日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO.M96021。獲得上述真核重組表達(dá)載體基礎(chǔ)上，構(gòu)建嵌合CD基因的真核重組表達(dá)載體。具體說明，以下列實(shí)例加以闡述。為了使CD基因在用作惡性腫瘤基因治療用途上起到更好的治療效果，本發(fā)明構(gòu)建腫瘤組織特異性表達(dá)的嵌合CD基因。即利用腫瘤組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如增強(qiáng)子)和轉(zhuǎn)錄啟始元件(如啟動子)，構(gòu)建CD基因的嵌合體。增強(qiáng)子包括，肝細(xì)胞癌特異表達(dá)的AFP(甲胎蛋白)增強(qiáng)子，肺癌特異表達(dá)的SLPI(分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制物)增強(qiáng)子，結(jié)腸癌等特異表達(dá)的CEA(癌胚抗原)增強(qiáng)子等；啟動子包括，肝細(xì)胞癌特異表達(dá)的AFP(甲胎蛋白)啟動子，肝癌相關(guān)癌基因啟動子，如IGF-I，IGF-II基因的啟動子等。腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的嵌合基因真核重組表達(dá)載體中，基因的表達(dá)調(diào)控是受腫瘤組織特異的相關(guān)增強(qiáng)子和啟動子調(diào)控的，而非利用真核表達(dá)空載體上原有的轉(zhuǎn)錄元件，為達(dá)到此目的，采取兩種措施。其一為，對腺病毒空載體pAdE1CMV，使CMV啟動子從載體上缺失；其二為，對逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體pLXSN，將嵌合基因“反裝”在3′LTR上游處。嵌合CD基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體pLNAFP-CD構(gòu)建過程見圖6，采用已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)。XL1-Blue[pLNAFP-CD]已于1996年11月25日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO.M96022。在構(gòu)建嵌合CD基因的同時(shí)，我們構(gòu)建了同時(shí)含HSV-TK基因和CD基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLTK-IRES-CDSN，構(gòu)建過程見圖7，采用已知的標(biāo)準(zhǔn)DNA重組技術(shù)。XL1-Blue[pLTK-IRES-CDSN]已于1996年11月25日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO.M96023。將上述組建好的含有CD基因，嵌合CD基因或同時(shí)含CD基因和TK基因的真核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入相關(guān)的包裝細(xì)胞中，產(chǎn)生內(nèi)部含有真核重組表達(dá)載體的“假型”病毒。以這些“假型”病毒或相關(guān)“包裝細(xì)胞”用作癌癥治療用途，這是本發(fā)明的第三個(gè)方面。具體地講，本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供含CD基因用于癌癥治療的新實(shí)體。含CD基因的新實(shí)體，在本發(fā)明中專指內(nèi)部包有CD基因、嵌合CD基因或同時(shí)含CD基因和TK基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或能產(chǎn)生感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的＂包裝細(xì)胞＂。將上述構(gòu)建好的真核重組表達(dá)載體以磷酸鈣共沉淀或相關(guān)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)入相應(yīng)的包裝細(xì)胞中。具體地講，對逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體來說，是將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞PA317中；用相應(yīng)的抗代謝藥物(本發(fā)明使用的是G418[新霉素的一種類似物])來篩選轉(zhuǎn)導(dǎo)有逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體的“包裝細(xì)胞”PA317(pLCDSN)陽性克隆，包裝細(xì)胞PA317(pLCDSN)已于1995年6月5日保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNO.C95016；對腺病毒重組表達(dá)載體來講，是將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞293中，用挑選“噬斑”的方法得含有目的基因重組“假型”腺病毒，并用該類腺病毒感染“293”細(xì)胞，以產(chǎn)生大量內(nèi)部含有目的基因的“假型”腺病毒用于惡性腫瘤基因治療用途。用于惡性腫瘤基因治療用途的“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒或能產(chǎn)生“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的“包裝細(xì)胞PA317”應(yīng)用于醫(yī)療時(shí)，“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶前述逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體以感染的方式將目的基因整合入被感染細(xì)胞的染色體上，由于該類重組表達(dá)載體不僅缺失了包裝成完整病毒的位點(diǎn)(ψ位點(diǎn))，而且丟失了gag，pol和env基因，這樣使得該類“假型”病毒僅具有一次性感染能力，使產(chǎn)生野生型病毒的可能性降低到極低的限度?！凹傩汀毕俨《緮y帶“目的”基因以感染的方式將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入被感染細(xì)胞中，“目的”基因是以獨(dú)立于染色體之外的方式進(jìn)行表達(dá)而行使其功能。對有CD基因表達(dá)的細(xì)胞(包括原核和真核細(xì)胞)，5-氟胞嘧啶對該類細(xì)胞能產(chǎn)生“誘導(dǎo)性”殺滅毒性；而對無CD基因表達(dá)的細(xì)胞，5-氟胞嘧啶對細(xì)胞則不能產(chǎn)生“誘導(dǎo)性”殺滅毒性。具體地講，對有CD基因表達(dá)的“包裝細(xì)胞PA317(pLCDSN)”(Northern分析有CD基因表達(dá)，見圖8)，大腸肝菌DH5a(CD活性分析顯示，該類細(xì)胞有CD基因表達(dá))在5-氟胞嘧啶存在下，這些細(xì)胞被殺滅。例如5-氟胞嘧啶對有CD基因表達(dá)的大腸桿菌DH5α“誘導(dǎo)”殺傷表型情況總結(jié)于表5。用本發(fā)明產(chǎn)生的內(nèi)部含有逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體的“假型”病毒感染真核細(xì)胞，隨后給予5-氟胞嘧啶，對被感染的真核細(xì)胞亦產(chǎn)生殺滅毒性，具體地講，用“包裝細(xì)胞”PA317產(chǎn)生的“假型”病毒(即用培養(yǎng)“包裝細(xì)胞”PA317的培液上清，其中含有“假型”病毒)感染NIH/3T3，肝癌細(xì)胞7721等細(xì)胞系，對被感染的細(xì)胞給予不同劑量的5-氟胞嘧啶，觀察到殺傷性表型。殺傷性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)于表4。由表4的5-FC對不同細(xì)胞的“誘導(dǎo)”殺傷作用數(shù)據(jù)，可以得出如下的結(jié)論。對有CD基因?qū)氲恼婧思?xì)胞，5-FC具有顯著的“誘導(dǎo)”殺傷作用，克隆分析結(jié)果顯示無克隆存活。對沒有CD基因?qū)氲恼婧思?xì)胞，5-FC對細(xì)胞不存在“誘導(dǎo)”殺傷作用。含CD基因的新實(shí)體與藥物前體同時(shí)用作惡性腫瘤基因治療的用途是本發(fā)明的第四個(gè)方面，例如，前述的“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒和“假型”腺病毒與藥物前體5-氟胞嘧啶同時(shí)用于被醫(yī)治惡性腫瘤患者，給藥途徑的具體臨床實(shí)例視具體情況選擇靜脈注射或?qū)嶓w瘤定位注射中的一種。又例如產(chǎn)生“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的“包裝細(xì)胞PA317”與藥物前體5-氟胞嘧啶聯(lián)合使用時(shí)，采取的給藥劑型為對實(shí)體腫瘤定位注射能產(chǎn)生“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的“包裝細(xì)胞PA317”，數(shù)天后再給被醫(yī)治患者使用藥物前體5-氟胞嘧啶，藥物前體給藥途徑視具體情況選擇靜脈注射或?qū)嶓w瘤定位注射中的一種。藥物前體劑量范圍為每天每千克患者體重0.2到27毫克。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明首次克隆出具有高表達(dá)活性的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因。酶活性分析結(jié)果顯示本發(fā)明所克隆的CD基因的表達(dá)活性明顯高于已報(bào)道的CD基因的表達(dá)活性。本發(fā)明又提供了含CD基因或嵌合CD基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或能產(chǎn)生感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的“包裝細(xì)胞”的新實(shí)體，與藥物前體5-氟胞嘧啶同時(shí)用作惡性腫瘤基因治療的用途。含CD基因的“假型”病毒感染真核細(xì)胞后，在藥物前體5-FC存在情況下，對真核細(xì)胞產(chǎn)生顯著的殺滅毒性。又構(gòu)建了對腫瘤組織有特異性表達(dá)的嵌合CD基因。又將CD基因與HSV-TK基因同時(shí)構(gòu)建成重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這樣于腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種外源基因，提高了目的基因在醫(yī)療上的治療效果，起到了單一“假型”病毒一次性給藥而行使聯(lián)合治療的效果。表1.pBV220-CD重組表達(dá)載體所表達(dá)的CD活性[a]含有不同質(zhì)粒的克隆CD活性[b]緩沖溶液A[c]0緩沖溶液B[d]0DH5αpBV220pBV220-CD[克隆1]28,805pBV220-CD[克隆2]23,218pBV220-CD[克隆3]0pBV220-CD[克隆4]0pBV220-CD[克隆6]27,492pBV220-CD[克隆7]1,345pBV220-CD[克隆8]0pBV220-CD[克隆9]352pBV220-CD[克隆10]33,127pBV220-CD[克隆11]36,028pBV220-CD[克隆12]0注[a]利用脲嘧啶對胞嘧啶在285nm處摩爾消光系數(shù)差值1.038×103M-1cm-1計(jì)算胞嘧啶脫氨酶活性，所示數(shù)字為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。[b]CD活性單位為生成的脲嘧啶nmol數(shù)/mg細(xì)胞抽提蛋白/min。[c]緩沖溶液A含有細(xì)胞抽提液，不含底物。[d]緩沖溶液B含有底物，不含細(xì)胞抽提液。表2已報(bào)道的CD活性數(shù)據(jù)</tables>注[a].CD活性單位為生成的脲嘧啶nmol數(shù)/mg細(xì)胞抽提蛋白/min。表3H-30-CD-11基因DNA及其氨基酸序列與BrianE.Huber所報(bào)導(dǎo)的CD基因相異位點(diǎn)比較CD基因報(bào)導(dǎo)的改變的改變的位點(diǎn)[a]堿基堿基氨基酸[b]49GAGlu→Lys183AG315AC456CT707AGHis→Arg1074CT1076CGAla→Gly1077AC1080GA1083GA1104CT1121GTSer→Ile1124CTAla→Val1125CA1155GA1221CT[a]第一號堿基為起始密碼子的第一位堿基。[b]‘→’意為CD肽鏈中氨基酸變化。表45-FC對不同細(xì)胞的“誘導(dǎo)”殺傷作用[a、c]注[a]本表提供的是克隆分析數(shù)據(jù)。進(jìn)行克隆分析時(shí)，含有10個(gè)及10個(gè)以上的細(xì)胞群落計(jì)數(shù)為1只克隆。本實(shí)驗(yàn)中所用的G418濃度為1毫克/毫升。所示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。“(-)”，意為細(xì)胞培養(yǎng)液中不含有G418或/和5-FC。表5.pBV220-CD重組表達(dá)載體所表達(dá)的CD活性及5-FC對相應(yīng)克隆“誘導(dǎo)”殺傷表型[a]注[a]利用脲嘧啶對胞嘧啶在285nm處摩爾消光系數(shù)差值1.038×103M-1cm-1計(jì)算胞嘧啶脫氨酶活性，所示數(shù)字為三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。CD活性單位為生成的脲嘧啶nmol數(shù)/mg細(xì)胞抽提蛋白/min。緩沖溶液A含有細(xì)胞抽提液，不含底物。緩沖溶液B含有底物，不含細(xì)胞抽提液?！啊鳌币鉃闊o克隆生成，該欄中所示數(shù)據(jù)為氨卞青霉素和5-FC陽性的瓊脂平板上所長出的克隆數(shù)。圖1.重組載體pBV220-CD的構(gòu)建。圖2.SDS-PAGE分析含有不同質(zhì)粒的DH5α克隆細(xì)胞抽提液1.蛋白分子量標(biāo)記，2.不含質(zhì)粒的克隆，3.含pBV220的克隆，4-14.分別為含重組質(zhì)粒pBV220-CD的克隆12，11，10，9，8，7，6，4，3，2，1。″→″示意所表達(dá)的單體多肽位置。圖3.CD基因DNA及氨基酸序列。每組別的第四行為基因文庫中CD基因的堿基序列，第一行為本發(fā)明所克隆的CD基因堿基序列，相同的堿基以″·″替代，第三行為基因文庫中CD基因的氨基酸序列，第二行為本發(fā)明所克隆的CD基因的氨基酸序列，相同的氨基酸以″·″替代。圖4.逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體pLDSN的構(gòu)建。圖5.腺病毒重組表達(dá)載體pAdE1CMV-CD的構(gòu)建。圖6.嵌合CD基因逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體pLNAFP-CD的構(gòu)建。圖7.同時(shí)含HSV-TK基因和CD基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLTK-IRES-CDSN的構(gòu)建。圖8.Northern雜交結(jié)果顯示CD基因在mRNA水平于PA317細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄，[A]圖為電泳結(jié)果，[B]圖為雜交結(jié)果。1、2、3泳道分別代表“PA317[pLCDSN]”(PA317陽性克隆)，含空載體PA317(PA317[pLXSN])，沒有轉(zhuǎn)導(dǎo)pLXSN和/或pLCDSN的PA317細(xì)胞。″→″示意雜交信號。圖9.瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示兩次PCR所擴(kuò)增出的DNA片段與預(yù)期結(jié)果相一致。第1泳道為第一次PCR產(chǎn)物，第2泳道為X174/HaeIIIDNA大小標(biāo)記，第3泳道為第二次PCR產(chǎn)物。圖10.瓊脂糖凝膠電泳分析EcoRI和BamHI雙酶切重組克隆載體pUC18-CD，結(jié)果顯示有插入DNA片段釋放。第1，4泳道各別為DNA大小標(biāo)記λHindIII和×174/HaeIII；第2，3泳道各別為重組克隆載體pUC18-CD6，pUC18-CD11經(jīng)雙酶切的產(chǎn)物。本發(fā)明通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1PCR方法克隆CD基因設(shè)計(jì)了如下的兩對引物第一對引物為PI和PIII組成，PI(引物I)5′AAAAGAATTCTGGTTACCGGGAATTGTTCCGGTCAACGCGGTATTAGG3′；PIII(引物III)5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTCAACGTTTGTTAATCGAT3′。第二對引物為PII和PIII組成，PII(引物II)5′TGACGCGAATTCAGGCTAGCAATGTCG3′；PIII(引物III)5′AAAAAGGATCCCGCTGTAACCCAGTCGTTAACGTTTGTAATCGAT3′。第一次pCR以第一對引物(由PI和PIII組成)及模板(大腸桿菌株H-30基因組DNA)擴(kuò)增出帶5′UAS的CD基因。PCR反應(yīng)混合物中各組份含量為雙重去離子水29.5微升10X緩沖液10微升四種dNTP混合物(每種16微升濃度為1.25毫摩爾濃度)引物I(100皮摩爾)2.5微升引物III(100皮摩爾)2.5微升模板DNA(大腸桿菌株H-30基因組DNA)(1微克)39微升TaqDNA聚合酶(Perkin-ElmerCentus公司產(chǎn)品)0.5微升(5單位/微升)反應(yīng)按如下程序進(jìn)行第1-5個(gè)循環(huán)條件為93℃(1分鐘)，52℃(30秒)，72℃(2分鐘)；第6-30個(gè)循環(huán)條件為93℃(1分鐘)，52℃(1分鐘)，72℃(2分鐘)。第二次PCR以第二對引物(由PII和PIII組成)及模板(第一次PCR產(chǎn)物)擴(kuò)增出CD基因閱讀框架。PCR反應(yīng)混合物中各組份含量為雙重去離子水47.5微升10X緩沖液10微升四種dNTP混合物(每種濃度為1.25毫摩爾濃度)16微升引物II(100皮摩爾)2.5微升引物III(100皮摩爾)2.5微升模板DNA(第一次PCR產(chǎn)物)[4拉克]21微升TaqDNA聚合酶(Perkin-ElmerCentus公司產(chǎn)品)0.5微升(5單位/微升)反應(yīng)按如下程序進(jìn)行第1-5個(gè)循環(huán)條件為93℃(1分鐘)，42℃(1分鐘)，72℃(2分鐘)；第6-30個(gè)循環(huán)條件為93℃(1分鐘)，56℃(30秒)，72℃(2分鐘)。兩次PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，出現(xiàn)了預(yù)期的條帶(見圖9)。實(shí)施例2.構(gòu)建重組克隆載體pUC18-CD第二次PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，將1.33Kb左右的DNA條帶凝膠塊割下，經(jīng)″電洗脫法″分離、純化出目的DNA片段。引物設(shè)計(jì)時(shí)，第二對引物的PII上設(shè)計(jì)了EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，PIII上設(shè)計(jì)了BamHI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。因此純化出的前述DNA片段和克隆載體pUC18分別經(jīng)EcoRI和BamHI消化(EcoRI，BamHI為美國Stratagene公司產(chǎn)品)，內(nèi)切酶消化的反應(yīng)條件參照提供該酶的公司使用說明書提示的條件進(jìn)行。克隆載體pUC18經(jīng)EcoRI和BamHI消化后，再經(jīng)CIAP(小牛腸衣膜堿性磷酸酶)[CIAP購自Promega公司)處理，反應(yīng)條件按照提供該酶的公司提示的反應(yīng)條件進(jìn)行。經(jīng)上述處理的第二次PCR產(chǎn)物(DNA片段)及克隆載體pUC18分別經(jīng)酚，氯仿等體積各抽提一次，再經(jīng)等體積氯仿抽提一次。加入1/10倍體積的3NNaAC(pH5.2)及2.5倍體積的無水乙醇于-20℃情況下過夜沉淀出目的DNA片段及克隆載體pUC18。各以10μ1TE溶液(由發(fā)明人工作室配制)溶解所得的沉淀，各取1ul經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳監(jiān)定出插入片段(第二次PCR產(chǎn)物，即CD基因)和克隆載體(pUC18)的質(zhì)量數(shù)值。依據(jù)插入DNA片段與克隆載體的摩爾數(shù)之比為2∶1，插入DNA片段為50ng至100ng左右計(jì)算出所需克隆載體及插入DNA片段的體積。依前述沉淀核酸的方法共沉淀克隆載體及插入DNA片段于同一1.5ml離心管中。加入7微升雙重去離子水溶解沉淀，再加入2微升5×連接酶緩沖液和1微升(T4連接酶)(1個(gè)單位/微升，連接酶由Boehringer-Mannheim公司提供)于16℃保溫12小時(shí)。按標(biāo)準(zhǔn)的分子生物方法制備工程菌XL1-Blue(由發(fā)明人工作室提供該菌株)的感受態(tài)細(xì)胞。以2ul上述連接反應(yīng)混合物加到100ul感受態(tài)細(xì)胞中，按標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue。得到相應(yīng)抗性的單克隆菌落后，挑選單克隆菌落于相應(yīng)抗性培養(yǎng)基中于37℃振搖12小時(shí)后，以標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法抽提質(zhì)粒。以連接反應(yīng)時(shí)所用的相同內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化所得的質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定出目的DNA條帶出現(xiàn)，提示得到重組質(zhì)粒pUC18-CD，即CD基因已組裝入pUC18載體中(見圖10)。實(shí)施例3構(gòu)建重組表達(dá)載體pBV220-CD重組表達(dá)載體pBV220-CD構(gòu)建過程基本與構(gòu)建重組克隆載體pUC18-CD相同。不同之處僅為所使用的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞為DH5α(DH5α由發(fā)明人工作室提供)，內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化的對象為重組克隆載體pUC18-CD和原核表達(dá)空載體pBV220。連接反應(yīng)時(shí)的插入DNA片段為重組克隆載體pUC18-CD經(jīng)EcoRI和BamHI消化時(shí)所釋放的CD基因DNA片段，純化該DNA片段的方法為重組克隆載體pUC18-CD經(jīng)EcoRI和BamHI消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，將含目的DNA片段條帶(1.33Kb左右)的凝膠割下。用″電洗脫純化法″分離純化出目的CD基因的DNA片段。構(gòu)建重組表達(dá)載體pBV220-CD時(shí)，選用了重組克隆載體pUC18-CD的第1，2，3，4，6，7，8，9，10，11，12號克隆提供插入片段，所得的重組表達(dá)載體pBV220-CD亦相應(yīng)地為第1，2，3，4，6，7，8，9，10，11，12號克隆。我們將得到的11種重組表達(dá)載體pBV220-CD的克隆用于表達(dá)，篩選高表達(dá)活性克隆。實(shí)施例4.CD基因在原核細(xì)胞(大腸桿菌DH5α)中表達(dá)及CD酶活性測定將得到的11種含重組表達(dá)載體pBV220-CD的DH5α克隆用于表達(dá)。具體操作如下首先從Amp抗性瓊脂平板上挑選每種克隆的單包菌落接種于Amp抗性的LB培養(yǎng)基中，于30℃振搖培養(yǎng)12小時(shí)后，將培養(yǎng)物以1∶100倍釋稀至Amp抗性的LB培養(yǎng)基中。30℃振搖培養(yǎng)5小時(shí)后，立即轉(zhuǎn)入42℃水浴中振搖培養(yǎng)4.5小時(shí)。收集細(xì)菌沉淀，將沉淀重懸于50mMTris·HCl(pH7.3)中，超聲粉碎細(xì)菌，離心去除殘?jiān)蒙锨逡河糜诿富钚詼y定。酶活性檢測所設(shè)置的反應(yīng)條件依據(jù)胞嘧啶經(jīng)胞嘧啶脫氨酶催化脫氨形成脲嘧啶時(shí)，反應(yīng)混合物吸光度在285nm處有所降低的事實(shí)進(jìn)行的。CD活性分析所采取的反應(yīng)條件如下1ml分析混合物中Tris-HCl(pH7.3)為50mM，細(xì)胞裂解液2ul，胞嘧啶為0.5mM，37℃保溫25分鐘后終止反應(yīng)。每只克隆的蛋白量值通過Bradford法來測定，平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次，取其平均值作為每只克隆的細(xì)胞抽提液蛋白量值。利用紫外分光光度計(jì)測量不同克隆的反應(yīng)混合物于反應(yīng)開始的○點(diǎn)與25分鐘時(shí)吸光度降低值。平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次，取其平均值作為每只克隆的反應(yīng)混合物吸光度降低值。經(jīng)公式，S.A.=&Delta;AP.Q&times;48.17]]>(S.A.胞嘧啶脫氨酶活性，單位為以nmol為單位的胞嘧啶生成量/毫克細(xì)胞抽提蛋白/分鐘；△A吸光度降低值；P.Q.以毫克為單位的蛋白量值)計(jì)算出每只克隆的CD活性，結(jié)果見表1。實(shí)施例5.CD基因DNA序列分析在測定CD活性基礎(chǔ)上，選擇了表達(dá)活性最高的克隆H-30-CD11，組建了pBluescriptSK(-)重組克隆及亞克隆。應(yīng)用Sanger雙脫氧末端終止法測定它的全基因DNA序列。CD基因DNA序列分析實(shí)施具體步驟如下1、CD基因pBluescriptSK(-)重組克隆及亞克隆組建將表達(dá)活性最高的克性H-30-CD11的重組表達(dá)載體pBV220-CD和測序用載體SK(-)同時(shí)進(jìn)行限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI的消化。如前述組建重組表達(dá)載體pBV220-CD步序類同，組建了用于測序的重組質(zhì)粒SK/CD。與組建重組表達(dá)載體pBV220-CD步驟不同之處為，組建用于測序的重組質(zhì)粒SK/CD時(shí)，轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的感受態(tài)細(xì)胞為工程菌XLl-Blue。得重組克隆SK/CD基礎(chǔ)上，組建亞克隆。亞克隆組建步驟如下以內(nèi)切酶EcoRI消化重組克隆SK/CD得線性DNA片段，然后以外切酶Ba131(購自Boehringcr-Mannheim公司)消化上述線性DNA片段。分別以不同時(shí)間段終止反應(yīng)，得到三種不同長度的線性DNA片段，純化并沉淀所得的DNA片段。使沉淀溶解后以DNA多聚酶IKlenow片段(購自Boehri-nger-Mannheim公司)及dNTP補(bǔ)平頭后，再用內(nèi)切酶BamHI消化上述所得到的DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳分離內(nèi)切酶消化產(chǎn)物，″電泳洗脫法″純化出自完整的3′端至缺失的5′端的CD基因不同長度的部分DNA片段。它們的大小分別為1.0kb，0.75kb，0.55kb左右，命名為B、C、E片段。以限制性內(nèi)切酶EcoRV和BamHI消化測序用載體SK，如同組建重組克隆SK/CD方法，組建得三種亞克隆SK/B，SK/C，SK/E。2.CD基因DNA序列分析組建好重組克隆SK/CD及亞克隆SK/B，SK/C，SK/E基礎(chǔ)上。利用上述克隆的重組質(zhì)粒雙鏈DNA為測序反應(yīng)的模板，用美國U.S.B.公司測序試劑盒，放射性同位素采用35S標(biāo)記E的dATP，測序操作過程為先制備好聚丙烯酰胺凝膠電泳用凝膠，然后進(jìn)行測序反應(yīng)；最后進(jìn)行電泳，放射自顯影。具體詳細(xì)步驟參照U.S.B.公司產(chǎn)品使用說明進(jìn)行。實(shí)施例6.CD基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體pLXSN和第11號原核重組表達(dá)載體pBV220-CD經(jīng)內(nèi)切酶EcoRI和BamHI消化，空載體pLXSN經(jīng)CIAP處理，″電泳洗脫法″純化、回收CD基因DNA片段的操作同實(shí)施例2。插入的CD基因DNA片段和載體pLXSN在T4DNA連接酶作用下于16℃保溫12小時(shí)，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受細(xì)胞的具體操作同實(shí)施例2。組建過程見圖4。CD基因借助于5′LTR中相關(guān)調(diào)控元件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。實(shí)施例7.CD基因的腺病毒重組表達(dá)載體構(gòu)建用于DNA序列分析的重組克隆SK/CD經(jīng)內(nèi)切酶BamHI消化后，再經(jīng)DNA聚合酶IKlenow片段和dNTP補(bǔ)平頭后，經(jīng)內(nèi)切酶HindIII消化?！咫娪鞠疵摲ā宸蛛x出CD基因DNA片段的操作同實(shí)施例2，經(jīng)上述處理的CD基因DNA片段5′端為內(nèi)切酶HindIII的粘性末端，3′端為補(bǔ)平的內(nèi)切酶BamHI平端。腺病毒載體pAdElCMV經(jīng)內(nèi)切酶HindIII和HpaI消化，經(jīng)CIAP處理的操作同實(shí)施例2。插入的CD基因DNA片段和載體pAdE1CMV在T4DNA連接酶作用下于16℃保溫12小時(shí)，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的具體操作同實(shí)施例2。將CD基因組裝入腺病毒載體pAdE1CMV的CMV啟動子下游。構(gòu)建了CD基因的腺病毒重組表達(dá)載體pAdE1CMV-CD。組建過程見圖5。實(shí)施例8嵌合CD基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLNAFP-CD構(gòu)建不含抗性基因neo的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLCD經(jīng)BamHI消化。含抗性基因neo的重組質(zhì)粒SK/neo經(jīng)BamHI，HindIII消化后回收、純化neo基因DNA片段。neo基因DNA片段和載體pLCD在T4DNA連接酶作用下于16℃保溫12小時(shí)的具體操作同實(shí)施例2。連接產(chǎn)物加上1個(gè)單位DNA多聚酶Klenow片段，dNTP終濃度為1mM，于37℃保溫1小時(shí)補(bǔ)平頭。補(bǔ)平頭后再加入T4DNA連接酶，于16℃保溫12小時(shí)。經(jīng)HindIII消化的連接產(chǎn)物及含粘性末端HindIII，XhoIAFP增加子/啟動子，在T4DNA連接酶存在時(shí)于16℃保溫12小時(shí)。連接產(chǎn)物經(jīng)DNA多聚酶Klenow片段補(bǔ)平頭同前述。補(bǔ)平頭產(chǎn)物在T4DNA連接酶存在時(shí)，于16℃保溫12小時(shí)，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的具體操作同實(shí)施例2。組建過程見圖6。CD基因借助于AFP的順式調(diào)控元件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。實(shí)施例9同時(shí)含CD基因和HSV-TK基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLTK-IRES-CDSN構(gòu)建質(zhì)粒pBluescriptSK(-)經(jīng)XhoI，BamHI消化后，與帶粒性末端的XhoI，BamHI的IRES[內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)]，在T4DNA連接酶作用于16℃保溫12小時(shí)。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的具體操作同實(shí)施例2。得重組質(zhì)粒SK/IRES后，重組質(zhì)粒SK/IRES經(jīng)XhoI，XbaI消化，回收、純化帶粒性末端XhoI，XbaI的IRES，IRES與帶粒性末端XbaI、EeoRI適配子在T4DNA連接作用下于16℃保溫12小時(shí)。重組載體pLCDSN經(jīng)EcoRI，BamHI雙酶切，回收純化CD基因。重組載體pLTKSN經(jīng)BamHI消化后與CD基因及IRES和適配子的連接產(chǎn)物在T4DNA連接酶作用下于16℃保溫12小時(shí)。連接產(chǎn)物在DNA多聚酶Klenow片段作用下補(bǔ)平頭同實(shí)施例8。補(bǔ)平頭產(chǎn)物在T4DNA連接酶作用下于16℃保溫12小時(shí)，連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的具體操作同實(shí)施例2。組建過程見圖7。CD基因和TK基因同時(shí)于同一載體獲得表達(dá)。實(shí)施例105-FC對有CD表達(dá)活性的原核細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)殺滅毒性試驗(yàn)將實(shí)施例3中測定CD活性時(shí)的大腸桿菌培養(yǎng)物以1∶104倍稀釋。取40微升稀釋液與160微升LB(一種大腸桿菌培養(yǎng)基)混合后，將混合物涂于含5-FC的LB+Ampagar(氨卞抗性LB瓊脂)平板上。30℃培養(yǎng)2小時(shí)，42℃培養(yǎng)4小時(shí)，緊接著37℃培養(yǎng)10小時(shí)，對照實(shí)驗(yàn)為5-FC陰性氨卞抗性LB瓊脂平板，其它條件類同。另外設(shè)置有大腸桿菌內(nèi)不含重組表達(dá)載體和僅含有空載體pBV220的對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為5-FC對有CD活性的克隆產(chǎn)生誘導(dǎo)殺傷毒性，使得5-FC陽性的平板上幾乎未見菌落出現(xiàn)，而5-FC陰性的平板與對照組，不含重組質(zhì)粒的克隆和僅含空載體pBV220的克隆的平板上所出現(xiàn)的細(xì)菌克隆數(shù)相當(dāng)。無CD活性的克隆的，其5-FC陽性的平板上所長出的克隆數(shù)幾乎與5-FC陰性平板上相當(dāng)。低活性克隆與高活性克隆相比較，其5-FC陽性平板上亦幾乎未見有細(xì)菌克隆出現(xiàn)。不同克隆的酶活性及殺傷表型總結(jié)于表5。實(shí)施例115-FC對有CD活性的真核細(xì)胞產(chǎn)生“誘導(dǎo)”殺滅毒性試驗(yàn)本實(shí)試中培養(yǎng)細(xì)胞用的培養(yǎng)基成分為在DEMEM(培養(yǎng)細(xì)胞用的一種商業(yè)化的基本培養(yǎng)基)基礎(chǔ)上添加了體積比為10％的經(jīng)熱滅活的胎牛血清，2毫摩爾濃度谷氨酰胺，每毫升50單位濃度的青霉素，每毫升50微克濃度的鏈霉素。培養(yǎng)細(xì)胞條件為5％CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，實(shí)施例6構(gòu)建好的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體pLCDSN用標(biāo)準(zhǔn)的磷酸鈣共沉淀方法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317(包裝細(xì)胞PA317是一種商業(yè)化的用于包裝“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的經(jīng)基因工程改造的NIH/3T3細(xì)胞，復(fù)制缺限性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組已穩(wěn)定整合入該細(xì)胞染色體中。當(dāng)帶有逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝位點(diǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入PA317中，其會行使“包裝機(jī)”功能，包裝出內(nèi)部包含有所轉(zhuǎn)導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體的“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒)。包裝細(xì)胞經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體pLDSN72小時(shí)后重新?lián)Q細(xì)胞培養(yǎng)基，另外加G418(一種新毒素類似物抗生素，購自GIBCO公司)至濃度為1毫克/毫升，使細(xì)胞在該條件下選擇性生長7天(其中每兩天換一次培養(yǎng)基)，7天后挑選陽性克隆。用陽性克隆的培養(yǎng)基上清中陽性克隆所產(chǎn)生的“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒感染NIH/3T3(一種小鼠成纖維細(xì)胞)細(xì)胞。實(shí)施步驟為在培養(yǎng)NIH/3T3細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入“包裝細(xì)胞PA317”陽性克隆的培養(yǎng)基上清，培養(yǎng)24小時(shí)，接著在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，重新?lián)QG418濃度為1毫克/毫升的培養(yǎng)基，選擇生培養(yǎng)7天(其中每兩天換一次培養(yǎng)基)，7天后挑選陽性克隆。得到上述陽性克隆基礎(chǔ)上，用Southern雜交來驗(yàn)證重組表達(dá)載體pLCDSN是否整合入包裝細(xì)胞PA317和被感染的細(xì)胞NIH/3T3中；以Northern雜交來分析所整合的CD基因，在mRNA水平是否被轉(zhuǎn)錄。Southern雜交和Norther雜交分析均采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。分別培養(yǎng)每種陽性克隆細(xì)胞，采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法抽提基因組DNA和總RNA。Southern雜交結(jié)果顯示重組表達(dá)載體已整合入PA317和NIH/3T3細(xì)胞中。Northern雜交結(jié)果顯示，在mRNA水平CD基因被轉(zhuǎn)錄，結(jié)果見圖8。證實(shí)重組表達(dá)載體pLCDSN已整入PA317和NIH/3T3細(xì)胞中；CD基因在mRNA水平已被轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上，進(jìn)行5-FC對該類陽性克隆細(xì)胞“誘導(dǎo)”殺傷性表型研究。在孔徑為4厘米的平底六孔培養(yǎng)板中，每個(gè)培養(yǎng)孔中加入5毫升培養(yǎng)基，加入的細(xì)胞量為103個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)孔。所加入G418量使其在培養(yǎng)基中的終濃度為1毫克/毫升；5-FC(購自美國U.S.B.公司)加入量是其在培養(yǎng)基中終濃度為63微克/毫升和126微克/毫升兩種。進(jìn)行表型研究時(shí)設(shè)置了相關(guān)對照組，它們分別為“空”的PA317細(xì)胞，整合有空載體pLXSN的PA317細(xì)胞及“空”的NIH/3T3細(xì)胞，整合有pLXSN的NIN/3T3細(xì)胞。將上述不同組別、不同培養(yǎng)條件的細(xì)胞培養(yǎng)5天后(每兩天換一次培養(yǎng)基)，進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)于表4。權(quán)利要求1.一種大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(CD)基因，其特征在于它是具有高表達(dá)活性的大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因，其DNA的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列如下1MetSerAsnAsnAlaLeuGlnThrIleIleAsnAlaArgLeuProGly1ATGTCGAATAACGCTTTACAAACAATTATTAACGCCCGGTTACCAGGC17LysGluGlyLeuTrpGlnIleHisLeuGlnAspGlyLysIleSerAla49AAAGAGGGGCTGTGGCAGATTCATCTGCAGGACGGAAAAATCAGCGCC33IleAspAlaGlnSerGlyValMetProIleThrGluAsnSerLeuAsp97ATTGATGCGCAATCCGGCGTGATGCCCATAACTGAAAACAGCCTGGAT49AlaGluGlnGlyLeuValIleProProPheValGluProHisIleHis145GCCGAACAAGGTTTAGTTATACCGCCGTTTGTGGAGCCGCATATTCAC65LeuAspThrThrGlnThrAlaGlyGlnProAsnTrpAsnGlnSerGly193CTGGACACCACGCAAACCGCCGGACAACCGAACTGGAATCAGTCCGGC81ThrLeuPheGluGlyIleGluArgTrpAlaGluArgLysAlaLeuLeu241ACGCTGTTTGAAGGCATTGAACGCTGGGCCGAGCGCAAAGCGTTATTA97ThrHisAspAspValLysGlnArgAlaTrpGlnThrLeuLysTrpGln289ACCCATGACGATGTGAAACAACGCGCCTGGCAAACGCTGAAATGGCAG113IleAlaAsnGlyIleGlnHisValArgThrHisValAspValSerAsp337ATTGCCAACGGCATTCAGCATGTGCGTACCCATGTCGATGTTTCGGAT129AlaThrLeuThrAlaLeuLysAlaMetLeuGluValLysGlnGluVal385GCAACGCTAACTGCGCTGAAAGCAATGCTGGAAGTGAAGCAGGAAGTC145AlaProTrpIleAspLeuGlnIleValAlaPheProGlnGluGlyIle433GCGCCGTGGATTGATCTGCAAATTGTCGCCTTCCCTCAGGAAGGGATT161LeuSerTyrProAsnGlyGluAlaLeuLeuGluGluAlaLeuArgLeu481TTGTCGTATCCCAACGGTGAAGCGTTGCTGGAAGAGGCGTTACGCTTA177GlyAlaAspValValGlyAlaIleProHisPheGluPheThrArgGlu529GGGGCAGATGTAGTGGGGGCGATTCCGCATTTTGAATTTACCCGTGAA193TyrGlyValGluSerLeuHisLysThrPheAlaLeuAlaGlnLysTyr577TACGGCGTGGAGTCGCTGCATAAAACCTTCGCCCTGGCGCAAAAATAC209AspArgLeuIleAspValHisCysAspGluIleAspAspGluGlnSer625GACCGTCTCATCGACGTTCACTGTGATGAGATCGATGACGAGCAGTCG225ArgPheValGluThrValAlaAlaLeuAlaHisArgGluGlyMetGly673CGCTTTGTCGAAACCGTTGCTGCCCTGGCGCACCGTGAAGGCATGGGC后續(xù)241AlaArgValThrAlaSerHisThrThrAlaMetHisSerTyrAsnGly721GCGCGAGTCACCGCCAGCCACACCACGGCAATGCACTCCTATAACGGG257AlaTyrThrSerArgLeuPheArgLeuLeuLysMetSerGlyIleAsn769GCGTATACCTCACGCCTGTTCCGCTTGCTGAAAATGTCCGGTATTAAC273PheValAlaAsnProLeuValAsnIleHisLeuGlnGlyArgPheAsp817TTTGTCGCCAACCCGCTGGTCAATATTCATCTGCAAGGACGTTTCGAT289ThrTyrProLysArgArgGlyIleThrArgValLysGluMetLeuGlu865ACGTATCCAAAACGTCGCGGCATCACGCGCGTTAAAGAGATGCTGGAG305SerGlyIleAsnValCysPheGlyHisAspAspValPheAspProTrp913TCCGGCATTAACGTCTGCTTTGGTCACGATGATGTCTTCGATCCGTGG321TyrProLeuGlyThrAlaAsnMetLeuGlnValLeuHisMetGlyLeu961TATCCGCTGGGAACGGCGAATATGCTGCAAGTGCTGCATATGGGGCTG337HisValCysGlnLeuMetGlyTyrGlyGlnIleAsnAspGlyLeuAsn1009CATGTTTGCCAGTTGATGGGCTACGGGCAGATTAACGATGGCCTGAAT353LeuIleThrHisHisSerGlyArgThrLeuAsnLeuGlnAspTyrGly1057TTAATCACCCACCACAGTGGCAGAACATTGAATTTGCAGGATTACGGT369IleAlaAlaGlyAsnIleValAsnLeuIleIleLeuProAlaGluAsn1105ATTGCCGCCGGAAACATCGTAAACCTGATTATCCTGCCGGCTGAAAAT385GlyPheAspAlaLeuArgArgGlnValProValArgTyrSerValArg1153GGATTTGATGCGCTGCGCCGTCAGGTTCCGGTACGTTATTCGGTACGT401GlyGlyLysValIleAlaSerThrGlnProAlaGlnThrThrValTyr1201GGCGGCAAGGTGATTGCCAGTACACAACCGGCACAAACCACCGTATAT417LeuGluGlnProGluAlaIleAspTyrLysArg***1249CTGGAGCAGCCAGAAGCCATCGATTACAAACGTTGA2.如權(quán)利要求1所述的CD基因，其特征在于它以大腸桿菌基因組DNA為模板，經(jīng)PCR法克隆出的具有表達(dá)活性的胞嘧啶脫氨酶基因，所克隆出的CD基因與權(quán)利要求1所述的CD基因的DNA序列有不小于50％的同源率。3.如權(quán)利要求1所述的CD基因，其特征在于所述大腸桿菌是為大腸桿菌株H-30。4.如權(quán)利要求1所述的CD基因，其特征在于該CD基因與原核克隆載體pUC18構(gòu)建原核重組克隆載體pUC18-CD。5.如權(quán)利要求1所述的CD基因，其特征在于含該CD基因的原核重組克隆載體pUC18-CD與原核表達(dá)載體pBV220構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pBV220-CD。6.如權(quán)利要求1所述的CD基因，其特征在于該CD基因與真核表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN或腺病毒載體pAdE1CMV，構(gòu)建真核重組表達(dá)載體。7.如權(quán)利要求6所述的CD基因，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體是pLCDSN。8.如權(quán)利要求6所述的CD基因，其特征在于所述腺病毒重組表達(dá)載體是pAdE1CMV-CD。9.如權(quán)利要求1所述的CD基因，其特征在于該CD基因構(gòu)建嵌合CD基因。10.如權(quán)利要求6、9所述的CD基因，其特征在于上述嵌合CD基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN構(gòu)建含有嵌合CD基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNAFP-CD。11.如權(quán)利要求6所述的CD基因，其特征在于該CD基因與HSV-TK基因構(gòu)建同時(shí)含CD基因和HSV-TK基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLTK-IRES-CDSN。12.如權(quán)利要求10所述的CD基因，其特征在于上述嵌合CD基因中包含肝細(xì)胞癌特異表達(dá)的AFP(甲胎蛋白)增強(qiáng)子和啟動子。13.如權(quán)利要求6、7、8、10、11所述的CD基因，其特征在于由CD基因構(gòu)建的所述的真核重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞PA317或包裝細(xì)胞293中，以產(chǎn)生內(nèi)部含有真核重組表達(dá)載體的“假型”病毒。14.如權(quán)利要求13所述的CD基因，其特征在于含CD基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體pLCDSN轉(zhuǎn)導(dǎo)入包裝細(xì)胞PA317中形成包裝細(xì)胞PA317(pLCDSN)，以產(chǎn)生“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒。15.如權(quán)利要求1所述的CD基因的應(yīng)用，其特征在于它是一種用作惡性腫瘤基因治療用途的含有CD基因、嵌合CD基因、或同時(shí)含CD基因和TK基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒或含有CD基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”腺病毒；或能產(chǎn)生感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的“包裝細(xì)胞”。16.如權(quán)利要求15所述的CD基因的應(yīng)用，其特征在于它是一種用作惡性腫瘤基因治療用途的含有CD基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒或能產(chǎn)生感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞PA317(pLCDSN)。17.如權(quán)利要求1所述的CD基因的應(yīng)用，其特征在于它是一種用作惡性腫瘤基因治療用途的含有CD基因、嵌合CD基因、或同時(shí)含CD基因和TK基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒或含有CD基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”腺病毒；或能產(chǎn)生感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的“包裝細(xì)胞”與藥物前體5-氟胞嘧啶聯(lián)合使用。18.如權(quán)利要求17所述的CD基因的應(yīng)用，其特征在于它是一種用作惡性腫瘤基因治療用途的含有CD基因的真核重組表達(dá)載體的感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒或能產(chǎn)生感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞PA317(pLCDSN)與藥物前體與氟胞嘧定聯(lián)合使用。全文摘要克隆出CD基因，經(jīng)酶活性分析篩選到高表達(dá)活性克隆。將CD基因、嵌合CD基因、同時(shí)將CD基因和HSV-TK基因組裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體，得到重組表達(dá)載體。以包有上述不同重組表達(dá)載體的感染性“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或能產(chǎn)生“假型”逆轉(zhuǎn)錄病毒的“包裝細(xì)胞”與5-FC用于癌癥治療，達(dá)到殺滅癌細(xì)胞或抑制其生長目的。文檔編號C12N15/79GK1161375SQ96116598公開日1997年10月8日申請日期1996年11月29日優(yōu)先權(quán)日1995年12月1日發(fā)明者顧健人,任圣俊,許秀蘭申請人:上海市腫瘤研究所