專利名稱：抗病毒植物的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及抗病原體的植物抗性，特別涉及其中對入侵病原體如病毒在被入侵作出反應(yīng)而引發(fā)對病原產(chǎn)生抗性的植物，在這樣植物上所用的DNA構(gòu)建物以及在植物體中引入病毒誘生抗性的方法。
病毒感染植物時常使植物在生長過程中產(chǎn)生有害反應(yīng)、不期望的形態(tài)變異和減產(chǎn)等等。這樣的侵染經(jīng)常導(dǎo)致被侵染的植物對其他病原體及植物蟲害更大的感病性。
病毒顆粒通常含有相對少量的遺傳物質(zhì)(單鏈或雙鏈的RNA或DNA)，外被一種或多種蛋白所保護，在有一些病毒類型中蛋白也會被寄主所產(chǎn)生的脂類膜所包被，構(gòu)成了感染性顆粒。病毒的增殖依賴于寄主細胞因而被視為細胞內(nèi)寄生物。
植物已發(fā)展了很多防御機制以限制病毒感染的效應(yīng)。例如，所謂水平或局部抗性其本質(zhì)是多基因控制，所謂垂直抗性其本質(zhì)是單基因控制的。
在育種計劃中，水平抗性難以成功地導(dǎo)入植物，然而，垂直抗性在育種計劃中比較容易地在植物中增生。編碼抗病毒的基因以消極的組成型地起作用，即不需要誘導(dǎo)基因表達。組成型地表達的抗病毒性包括無寄主抗性作用的方式耐受性即抑制病害的發(fā)生，免疫性即抑制病毒的轉(zhuǎn)運或出現(xiàn)抗病毒因子等等?；蛘呤牵参镏芯幋a抗病毒的基因能夠通過誘導(dǎo)一個或數(shù)個為表達編碼抗病毒基因而主動地打開，這種體系的實例包括過敏反應(yīng)。
已報導(dǎo)植物中所謂過敏反應(yīng)(HSR)一般特征認為植物細胞在鄰接的細胞被入侵病原體侵染后不久死亡。病原體穿越侵染細胞或向侵染細胞移動由于被入侵細胞的周圍細胞或被侵染細胞的壞死而被限制或阻斷。此外，過敏(HSR)包含階梯式附加的或次生的防御反應(yīng)，以及一些蛋白和次生代謝物的蓄積，從而引起抵抗病原體攻擊的抗性水平全面地提高。通常認為對入侵生物體的過敏反應(yīng)也牽涉植物細胞中抗性基因的產(chǎn)物，該產(chǎn)物可以識別引發(fā)體(elicitor)因子，即病原體的無毒基因的產(chǎn)物，并與之相互作用。抗性植物中，引發(fā)體(elicitor)因子的識別引發(fā)了過敏反應(yīng)因而將病原體感染限制在單個細胞或幾個細胞中，或至多也只限制在緊鄰的一些植物細胞之內(nèi)。
過敏介導(dǎo)的抗病毒感染的一個實例是煙草植物攜有抗煙草花葉病毒群例如煙草花葉病毒(TMV)及西紅柿花葉病毒(TOMV)的N′抗性基因。迄今，已鑒定了二十余種顯性HSR型抗性基因。它們出現(xiàn)在包括煙草、蕃茄、土豆、胡椒、萵苣等很多重要的農(nóng)作物中。
盡管抗某些病毒的抗性資源表面上很豐富，但很多植物對重要的病毒病原體，仍然缺乏有效的抗性基因[Fraser，R.S.S.(1992).Euphytica 63175]。搜尋野生型種質(zhì)采集品中，僅鑒定了有數(shù)幾個抗病毒抗性的合適資源，它們能夠成功地被導(dǎo)入到重要的農(nóng)作物中。許多重要的農(nóng)作物包括但不限于西紅柿、胡椒、黃瓜、甜瓜，萵苣等等品種，缺乏對黃瓜花葉病毒(CMV)的垂直抗性基因，就是一個實例。
植物育種者們一直試圖培育出種類繁多的對于特定病毒品系有耐受性或抗性的作物品種。過去，具有抗病毒特性的基因，從與商用植物相近的野生型通過育種轉(zhuǎn)移到商用品種中。將野生存在的抗性從野生型基因庫中轉(zhuǎn)移到栽培品種是一個麻煩的過程，首先必須從來源(供體)植物品種中鑒定抗性(載體)基因，然后將其結(jié)合到商用品種的基因庫中。以此方法產(chǎn)生的抗性或耐受性，其典型活性僅僅抗所述的那個病毒的一種，最多抗幾個品系。更進一步的缺點是，這種育種計劃通?；ㄙM很長時間，數(shù)以年計，才能得到農(nóng)業(yè)上有用的植物。
或者，采用所謂的″交叉—保護″方法。交叉—保護是這樣一種現(xiàn)象一種植物被一種病毒品系侵染之后，可以保護此植物不被第二種與此病毒相關(guān)品系的重侵染。交叉—保護方法首先必須包括使用無毒病毒品系去侵染植物，以抑制同一種病毒的有毒品系的繼發(fā)侵染。然而使用天然的交叉—保護方法有幾個缺點。第一這方法勞動強度大因為需要把作物逐一接種，其次帶有無毒株如突變成有毒株，而有毒株本身成為作物致病因子的風險。另外可能的風險是，一種植物品種的無毒病毒品系對另一植物品種可能成為有毒品系。
遺傳工程的交叉保護是一種抗病毒形式，表現(xiàn)型上與自然交叉—保護相類似。但需通過表達來自遺傳操作過的植物基因組的病毒外殼蛋白的遺傳信息來實現(xiàn)。已經(jīng)知道，轉(zhuǎn)基因植物基因組的煙草花葉病毒品系U1(TMV-U1)的外殼蛋白的基因達，用任一TMV品系侵染后都能使其癥狀發(fā)展遲延。同樣在苜?；ㄈ~病毒(AMV)，馬鈴薯病毒X(PVX)，以及黃瓜花葉病毒(CMV)獲得了外殼蛋白介導(dǎo)的保護。對某些植物病毒，如黃矮病毒來說，在轉(zhuǎn)基因植物中難以獲得可檢測的量的相應(yīng)的外殼蛋白，所以，通常對病毒抗性低。此外，任何一個能稱得起的保護都要求植物持續(xù)地制造外殼蛋白，因而使植物增加能量的負擔。這種局限性使這一技術(shù)的商用價值仍不明顯。
另一個用遺傳工程方法得到抗病毒的實例包括導(dǎo)入植物病毒的衛(wèi)星RNA，其中整合進去的遺傳物質(zhì)的表達，修飾了植物病毒或改變其影響。
本發(fā)明的一個目的，就是在植物中對本領(lǐng)域已熟知的用工程方法得到抗病毒性提供另一種更可靠的用工程方法得到抗病毒性策略，它基于入侵病原體在植物寄主中定居之前，直接病原體在植物靶組織中誘導(dǎo)分子表達。
本發(fā)明的另一個目的是，將遺傳工程植物轉(zhuǎn)化技術(shù)同植物組織中自然存在的植物病毒防御機制結(jié)合起來。
詳細說明按照本發(fā)明所述，提供一種能夠直接或間接編碼反義RNA分子的植物病毒DNA結(jié)構(gòu)物，而這種反義RNA分子有與入侵病毒所編碼的依賴于RNA的RNA多聚酶相互作用的能力，這樣，作為它同所說的入侵病毒編碼的依賴于RNA的RNA多聚酶相互作用的結(jié)果，至少會產(chǎn)生一種引發(fā)(eliciting)因子。
在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種能夠編碼一種正義RNA分子的植物病毒重組DNA結(jié)構(gòu)物而這種正義RNA分子能夠同侵染病毒所編碼的依賴于RNA的RNA多聚酶起相互作用，這種相互作用的結(jié)果是，正義RNA分子至少能夠編碼一種引發(fā)因子，它在植物被所說侵染病毒侵染時，在植物體內(nèi)引出天然的植物防御。
這種植物病毒DNA結(jié)構(gòu)物可以從任一能夠侵染植物的病毒源中得出。然而，這種植物病毒DNA優(yōu)先考慮從任一已知侵襲、被懷疑侵襲、或能夠侵襲具有農(nóng)業(yè)價值植物品種的病毒源中得到。它可以是經(jīng)過修飾適于表達的天然植物病毒DNA，也可以人工合成獲得。這種植物病毒DNA在植物細胞中，應(yīng)有編碼轉(zhuǎn)錄與病毒RNA(即正義)互補的RNA序列(即反義)的能力。另外，這種植物病毒DNA應(yīng)該含有這樣的一個部分或其片段，當其轉(zhuǎn)錄生成反義RNA，以及進一步轉(zhuǎn)錄生成正義RNA時，通過轉(zhuǎn)譯正義RNA，能夠生成至少一種足以引出對抗侵染病毒的天然植物防御機制的引發(fā)(eliciting)因子或其一部分。合適的植物病毒DNA或RNA源可從能夠侵染這樣一些植物種類的植物病毒中得到，例如西紅柿、胡椒、甜瓜、萵苣、花椰菜、硬花甘藍、卷心菜、芽甘藍、甜菜、玉米、甜玉米、洋蔥、胡蘿卜、韭菜、黃瓜、煙草等等，也包括來源于侵染裝飾作物的植物種類的植物病毒衍生植物病毒DNA或RNA源，例如鳳仙花屬、秋海棠、牽牛花、天竺葵屬(天竺葵、堇菜、仙客來、馬鞭草、蔓長春花、萬壽菊、報春花、圣保羅草等。
反義RNA分子含有所說的植物病毒DNA的一部分中的至少一個順反子或與其當?shù)囊徊糠?，而且還能從所說的反義RNA分子中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正義RNA分子，在植物細胞中正義RNA分子編碼產(chǎn)生至少一個引發(fā)因子或其一部分。反義RNA能夠從所說的植物病毒DNA中直接轉(zhuǎn)錄，或從所說的DNA衍生而來的正義RNA轉(zhuǎn)錄。這樣，從正義RNA轉(zhuǎn)錄反義RNA，按本發(fā)明的目的認為是所說的DNA的間接轉(zhuǎn)錄。座落于反義RNA分子上的順反子或幾個順反子或其一部分的如此的定位或極性，使得植物病毒DNA結(jié)構(gòu)物在轉(zhuǎn)錄之后引發(fā)因子不會直接被編碼到順反子或幾個順反子或其一部分的遺傳密碼座落在反義RNA分子的互補鏈上，即正義RNA上。當侵染病毒所編碼的依賴于RNA的RNA多聚酶催化反義病毒RNA序列進行復(fù)制，產(chǎn)生正義RNA分子時，編碼引發(fā)(eliciting)因子的順反子就能夠被翻譯。
此中反義RNA也包括那些可以描述成具有雙義特征的RNA分子，如來源于托斯普病毒(tospoviruses)等的RNA分子。這種情形下，反義RNA至少包含一個順反子，與所說植物病毒DNA的一部分相對應(yīng)，能夠從所說的反義RNA中轉(zhuǎn)錄出正義RNA分子，這種RNA分子在植物細胞中能夠編碼并生成至少一種引發(fā)因子或其一部分。
正義病毒RNA分子能直接或間接地編碼至少一種引發(fā)(eliciting)因子或其一部分，而這種引發(fā)因子能在植物細胞中表達，且具有天然的或工程過的植物防御引發(fā)活力。正義RNA分子與病毒反義RNA互補，在植物細胞中，經(jīng)轉(zhuǎn)譯能直接或間接生成至少一種引發(fā)體(elicitor)因子。這樣，病毒正義RNA分子可以看作反義RNA分子的互補RNA分子。
此中正義RNA也包括那些被描述為具有雙義特征的RNA分子。在這種情形下，正義RNA含有至少一個順反子，與所說植物病毒DNA的一部分相當，它能夠在植物細胞中直接編碼并生成至少一個引發(fā)因子或該因子的一部分。
植物細胞中表達的引發(fā)因子的量應(yīng)該足以引出對抗侵染病毒的植物細胞的防御反應(yīng)，結(jié)果導(dǎo)致自然的或工程過的植物反應(yīng)，使有效地阻斷或限制病毒進一步的活動。因而，正義RNA分子，無論是反義RNA互補物還是雙義RNA都必須能產(chǎn)生引發(fā)體因子。這種引發(fā)體因子無論是通過直接轉(zhuǎn)譯，還是通過產(chǎn)生亞基因組RNA，都會引發(fā)出或激發(fā)出天然的或經(jīng)工程的植物防御反應(yīng)。正義RNA依據(jù)植物防御反應(yīng)類型/被引發(fā)的植物防御反應(yīng)，最終編碼出一個或多個引發(fā)體因子。病毒正義RNA序列優(yōu)先含有這樣一個序列其中至少有一個病毒順反子被至少一個能夠在植物細胞中表達編碼引發(fā)體因子的順反子所取代，且具有在植物組織中有激發(fā)天然或工程過的植物防御反應(yīng)的活力。
引發(fā)因子可以是來自上述的植物病毒DNA的正義RNA順反子轉(zhuǎn)譯而來的任一因子，可以是蛋白、多肽、肽或其片段等等。最好的引發(fā)因子的實例包括所謂的引發(fā)體的蛋白和/或細胞抑制蛋白。
引發(fā)體蛋白是這樣的蛋白，假如在植物組織中出現(xiàn)，能夠引出，激發(fā)，或誘導(dǎo)高度敏感反應(yīng)(HSR)，HSR是一種針對入侵病原體，如病毒的天然的植物防御機制。引發(fā)體蛋白可來自植物病毒，例如外殼蛋白，細胞至細胞間移動所涉及的蛋白，蝸牛酶，依賴于RNA的RNA聚合酶等。另外引發(fā)體蛋白也可以從其他植物病原體如細菌、真菌、線蟲等等為來源或衍生。
細胞抑制蛋白是這樣一種蛋白，如果它在植物組織中出現(xiàn)，就對植物細胞產(chǎn)生有害作用，從而導(dǎo)致細胞生長被抑制例如細胞分裂，及/或細胞死亡。細胞抑制因子包括但不局限于核糖核酸酶、蛋白酶、核糖體抑制蛋白，細胞壁降解蛋白等。
正義和反義RNA分子也被視為植物病毒RNA，因為它們是從上述的植物DNA結(jié)構(gòu)物衍生而來，其中當然也包含植物病毒的基因組或基因組的一個片段。在這樣的植物病毒RNA里，所選定的核苷酸片段可以被另一片段取代，或被刪除。核苷酸的取代及/或刪除或核苷酸組成的片段的取代或刪除應(yīng)該以不妨礙RNA分子在病毒侵染的植物細胞內(nèi)增殖或復(fù)制能力為準。另外，取代及/或刪除核苷酸、取代/或刪除密碼子或核苷酸組成的片段應(yīng)該以不妨礙入侵病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶識別能力，和對RNA分子(在正義或負義的RNA定位)的作用力為度，從而能開始如上描述的事物的順序，生產(chǎn)出有效量的、能引發(fā)自然的、或工程過的植物的防御反應(yīng)的引發(fā)體因子。合適的植物病毒RNA分子包括，但不限于這些選定病毒群的基因組RNA分子或其片段，選定的病毒群，包括馬鈴薯Y病毒群、馬鈴薯X病毒群、煙草花葉病毒群、黃矮病毒群、或者是黃瓜花葉病毒群、雀麥花葉病毒群、托斯普病毒群(tospoviruses)等。
植物病毒DNA在一個啟動子控制之下表達，在植物中起功能作用，而且包括一個在植物中起作用的終止子。
啟動子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游的核苷酸序列，且含有轉(zhuǎn)錄所需的全部調(diào)節(jié)區(qū)域，適用于本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)物的啟動子包括病毒的、真菌的、細菌的、動物及植物來的，能夠在植物細胞中起功能作用的啟動子。最適用的啟動子應(yīng)能夠使DNA在所有植物的活組織中表達。主張采用的啟動子應(yīng)該能使病毒的植物DNA以足夠的速率表達，以生產(chǎn)出的編碼至少一種引發(fā)體因子的RNA的量，該引發(fā)因子在病毒侵染轉(zhuǎn)化過的植物時，能引發(fā)天然的植物防御反應(yīng)。所要求的需轉(zhuǎn)錄的RNA的量隨植物種類而變化。合適的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)以及19S(CamV19S)啟動子，燕脂堿合成酶及章魚堿合成酶啟動子，熱休克蛋白80(hsp80)啟動子等。
終止子被認為是(A)病毒DNA的下游DNA序列，編碼一段能轉(zhuǎn)錄出自身催化，自我剪切的RNA序列隨著(B)轉(zhuǎn)錄單位末端的一段DNA序列為轉(zhuǎn)錄終止發(fā)出信號，終止子序列就從重組病毒的RNA序列上釋放出來。這些因子是一段3′端非翻譯序列，含有多聚腺苷化信號，它的作用能使新生的轉(zhuǎn)錄物的3′端加上多聚腺苷序列。下面所述序列實例(A)包括自我剪切RNA分子或核酶如核糖核酸酶P、四膜蟲L-19插入序列、撞水鮫核酶、肝炎δ(delta)病毒RNA，脈孢菌線粒體VS RNA等等[Symons，R.H.(1992).Ann.Rev.Biochem.61641]。下面所述的序列(B)可以從真菌、細菌、動物及/或植物中分離到。例如特別適用于本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)物包括根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的燕脂堿合成酶的多聚腺苷化信號、CaMV的35S多聚腺苷化信號以及來自玉米(Zea mays)的玉米醇溶蛋白多聚腺苷化信號。
在合適的雜交條件下，按照堿基配對原則，一段DNA或RNA序列能夠和另一段DNA或RNA序列形成氫鍵復(fù)合物叫做互補。適合本發(fā)明的目的雜交條件包括但不局限于這些例如，在含有5X標準檸檬酸鹽(SSC)，0.5％十二烷基磺酸鈉(SDS)，5 x Denhardt′s溶液，50％甲酰胺及100μg/ml載體DNA或RNA的緩沖體系(以后均采用此體系)中42℃溫育16小時。接著在含有1xSSC和0.1％SDS的緩沖液中，65℃洗3次，每次約1小時。這樣才獲得的RNA或DNA分子的雜交信號，例如通過放射自顯影閱讀，出現(xiàn)的條帶給專業(yè)人員觀看已足夠清晰說明，獲得的RNA或DNA分子能有效地用于構(gòu)建適于本發(fā)明應(yīng)用的植物病毒DNA結(jié)構(gòu)。當然，這樣的RNA或DNA分子應(yīng)該具有本文所敘述的要求的活性。因而，置換和/或刪除核苷酸、密碼子或者由核苷酸組成的片段應(yīng)該不干擾本發(fā)明的DNA構(gòu)建物具有的上述編碼負義RNA分子的能力。該負義RNA分子如本文所述具有識別入侵病毒的依賴于RNA的RNA多聚酶的能力，并與之相互作用，從而引發(fā)了文中所述的事件順次發(fā)生，導(dǎo)致產(chǎn)生有效量的，能引發(fā)天然的或工程過的植物防御反應(yīng)的引發(fā)因子。
本發(fā)明采用的合適的雜交條件包括在緩沖體系49℃溫育約16小時，以及在含有0.1xSSC及0.1％SDS的緩沖液里在55℃清洗3次，每次約1小時。更合用的雜交條件包括在緩沖體系中55℃溫育16小時，以及在含有0.1xSSC及0.1％SDS緩沖液里65℃清冼3次，每次約1小時。當然，任何在這樣的雜交條件下經(jīng)受實驗的RNA或DNA分子應(yīng)該具有文中所述的所要求的活性。
本發(fā)明也提供了能夠?qū)⒈景l(fā)明的DNA構(gòu)建物導(dǎo)入植物細胞的運載體，以及制備這種運載體的方法。這里采用的運載體一詞是指，借助于它的DNA分子或其片段能整合到寄主生物體的運載工具中。合適的運載工具包括質(zhì)粒、用微注射法或粒子槍導(dǎo)入的裸露的DNA等等。[Offringa(1992).PhD thesis，State University Leiden，The Netherlands，Ch1pages 7-28]文中采用的植物一詞是廣義的，指分化植物以及未分化植物材料，后者在合適的條件下能發(fā)育成為成熟的植物，如原生質(zhì)體、植物細胞、種籽、胚等，其子代和其部分例如這樣的植物的插條和果實。
本發(fā)明進一步提供了其基因組包含了本發(fā)明的DNA結(jié)構(gòu)的植物，以及生產(chǎn)這種植物的方法。
按照本發(fā)明所載，植物減低了對致病的各個病毒的感病性，而且沒有在這里討論過的用傳統(tǒng)方法或遺傳工程方法獲得的植物的缺點局限性。
本發(fā)明將由下述無局限性的實施例及附屬圖例說明。
圖一.病原體與植物編碼蛋白相互作用，使誘導(dǎo)出HSR反應(yīng)的圖解說明。
圖二.煙草或西紅柿植物抗黃瓜花葉病毒(CMV)的圖解說明，這二種植物通過表達CMV負義RNA3分子而獲得，其中RNA分子的MP基因被編碼引發(fā)體西紅柿花葉病毒外殼蛋白(ToMV CP或P30)或細胞抑制蛋白(RNase T1)的基因所取代。
圖三.煙草或西紅柿植物抗CMV的圖解說明，這二種植物通過表達CMV正義RNA3分子而獲得，其中RNA分子的MP基因被編碼引發(fā)體(ToMV cp或P30)或細胞抑制蛋白(RNase T1)基因所取代。
序列ID1嵌合黃瓜花葉病毒RNA3的核苷酸序列。
序列ID2西紅柿花葉病毒(ToMV)外殼蛋白(相當于序列ID1的123-600位核苷酸)氨基酸序列。
序列ID3對應(yīng)于序列ID1的897-1550位核苷酸的黃瓜花葉病毒外殼蛋白的氨基酸序列。
序列ID4嵌合黃瓜花葉病毒RNA3的核苷酸序列。
序列ID5對應(yīng)于序例ID4的123-437位核苷酸的核糖核酸酶T1(RNase T1)的氨基酸序列序列ID6編碼西紅柿花葉病毒(To MV)P30的嵌合黃瓜花葉病毒RNA3的核苷酸序列。
序列ID7對應(yīng)于序列ID No.6的123-914位核苷酸的ToMV的P30的氨基酸序列。
序列ID8嵌合西紅柿斑點枯萎病毒S RNA，它編碼ToMV的外殼蛋白，以及在相反極性上編碼無結(jié)構(gòu)蛋白NSp的核苷酸序列。
序列ID9無結(jié)構(gòu)蛋白NSP(相反極性)在對應(yīng)序列ID的1141-2543位核苷酸的氨基酸序列。
實施例這里所有黃瓜花葉病毒(CMV)，西紅柿斑點枯萎病毒(TSMV)及西紅柿斑點病毒(ToMV)來自RNA的序列都以DNA序列列出，唯一目的在于一致性。主張這樣做僅是出于方便。
植物轉(zhuǎn)化研究中所用栽培品種煙草(Nicotiana tabacum)及西紅柿Lycopersicon esculentum在標準溫室條件下生長。無菌分離塊材料在含有合適的植物激素及合適蔗糖濃度的標準MS培養(yǎng)基[Murashige and skoog(1962).physiol.plant 15473]中生長。
E.coli細菌在37℃標準LB培養(yǎng)基中進行搖床培養(yǎng)。根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株在補充了0.1％葡萄糖的MinA培養(yǎng)基中生長[Ausubel et al.(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Green Publishing Associates and WileyIhter-sciences，New York，Chichester，Brisbane，Toronto，and Singapore]。
在所有的克隆步驟中，E.coli JM83(F-，△(Ias-pro)，ara，rpsL， 80，dlacZM15)品系是重組質(zhì)粒首先選用的受體株。二元體載體是被聯(lián)合到根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumfaciens)LBA4404中，該菌株含有Ti質(zhì)粒vir區(qū)[Hoekema et al(1983).Nature 303179]，在標準三親株交配中用含有pRK2013質(zhì)粒[Figurski and Helinski，(1979).Prec.Natl.Acad.Sci.USA761648]的E.coli HB101作為輔助菌株。合用的根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens受體菌在含有利福平(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的培養(yǎng)基上進行抗性選擇。
將片段克隆到載體pUC19[Yanish-perron et al(1985).Gene 33103].pBluescript(stratagene).pBIN19[Beven etal(1984).Nucl.Acids Res.128711]或其衍生載體中，限制性內(nèi)切酶分析DNA、對E.coli受體菌株轉(zhuǎn)化、小規(guī)模及大規(guī)模制備質(zhì)粒DNA、缺刻翻譯、體外轉(zhuǎn)錄、DNA序列分析、Southern印跡轉(zhuǎn)移和DNA凝膠電泳都按標準步驟進行[Maniatis et al(1982)分子克隆(Molecular Cloning)實驗手冊(A Laboratory Manual)ColdSpring Harbor Laboratary， New York；Ausubel et al supra.(1987)]。
DNA擴增所采用的多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)按Taq多聚酶(PerkinElmer Cetus)供應(yīng)商推薦的方法進行。通過反轉(zhuǎn)錄擴增RNA及隨后的標準DNA擴增都按供應(yīng)商(Perkin Elmer Cetus)推薦的基因擴增用RNA的多聚酶鏈式反應(yīng)(Gene Amp RNA PCR)方法進行。
實施例1黃瓜花葉病毒(CMV)顆粒及其遺傳物質(zhì)的分離從南瓜中分離到CMV血清型I，通過機械通道在南瓜中保存。病毒基本上按照Francki等人[(1979)CMI/AAB Descr.of PlantViruses 213]的步驟從全面感染的南瓜葉中被純化。用苯酚抽提到的250μl體積中大約有100μg病毒，然后用苯酚和氯仿混合液抽提，最后用氯仿抽提，經(jīng)乙醇沉淀后再離心收集RNA，然后把沉淀溶于20μl水中。
實施例2西紅柿花葉病毒(ToMV)顆粒及其遺傳物質(zhì)的分離從西紅柿中分離ToMV，通過機械通道保存在煙草中。病毒基本上按Hollings & Huttinga[(1976)CMI/AAB Descr.of PlantViruses 156]的方法從全面感染的煙草葉中純化。體積300微升中大約有200μg病毒，先用苯酚，然后用苯酚氯仿混合液，最后用氯仿抽提，用乙醇沉淀RNA，離心收集。然后把沉淀溶于50μl水中。
實施例3黃瓜花葉病毒(CMV)RNA3的分子克隆以純化過的CMV RNA為基礎(chǔ)進行PCR反應(yīng)的RWA中分離到CMVRNA3序列(Perkin Elmer Cetus Supra)。設(shè)計了兩個引物，Zupo69(5′TTTGGATCCA CGTGGTCTCC TTTTGGAG 3′)，它互補于CMV RNA 3(Seq.Id No.1)的3′末端的前16個核苷酸，以及ZUP068(5′TTTGGATCCG TAATCTTACC ACT 3′)它和CMV RNA 3(Seq.Id.No.1)5′端的前14個核苷酸相同。兩個引物均含有BamHI內(nèi)切酶切點，使能進一步克隆經(jīng)擴增的DNA分子。純化過的CMV RNA進行基因擴增RNA多聚酶鏈式反應(yīng)(Gene Amp RNAPCR)，生成的PCR片段是從瓊脂糖凝膠上分離到并把它克隆到經(jīng)SmaI內(nèi)切酶切后而線性化的pUC19質(zhì)粒上，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pIU181。
實施例4西紅柿斑點枯萎病毒TSWV S RNA的分子克隆通過在單一E.eoRI內(nèi)切酶切位點上融合eDNA克隆的520及614生成pTSMV-S1[De Haan er al(1990)J.Gen Virol.711001]，以構(gòu)建出包含幾乎完整的TSWV S RNA特異序列的cDNA克隆。將純化的pTSWV-S1 DNA為基礎(chǔ)進行RNA的PCR反應(yīng)(Perkin Elmer CetuSsupra)，分離到完整的TSWV S RNA序列。設(shè)計了兩個引物，IUP2505′(TTTGGATCCAGAGCAATCGTGTCAATTTTGTGTTCATACCTTAAC)3′包含36個核苷酸，和TSWV S RNA(Seq.Id.No.8)的5′末端的前36個核苷酸相同，以及ZUP2515′(TTTGGATCCA GAGCAATTGT GTCAGAATTT TGTTCATAATCAAACCTCAC TT)3′包含43個核苷酸，和TSWV S RNA(Seq.Id.No.8)的3′末端的前43個核苷酸互補。兩個引物均含有BamHI內(nèi)切酶位點，從而使能進一步克隆擴增過的DNA分子。得到的PCR片段是從瓊脂糖凝膠上分離到，并把它克隆到SmaI內(nèi)切酶線性化的pUC19質(zhì)粒上，產(chǎn)生重組質(zhì)粒pTSWV-S2。
實施例5西紅柿斑點病毒(ToMV)的外殼蛋白(CP)和蛋白30(P30)基因的分子克隆采用以RNA的PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)方法分離到對應(yīng)于ToMV外殼蛋白(CP)和P30的基因序列。引物ZUP112跨越ToMV RNA的CP基因翻譯起始位點兩端5′GTATTAACC TGGCTTACTC 3′(包括13個核苷酸，和Seq.Id.No.1的121-133位核苷酸相同。)以及引物ZUP113跨越ToMV RNA的CP基因翻譯終止密碼子的兩端5′GCACCCATGG ATTTAAGATG 3′(包括16個核苷酸，和Seq.Id.No.1的595-610位核苷酸互補，以及引物ZUP117跨越ToMV RNA的P30基因翻譯起始密碼子的兩端5′TATTTCTCCA TGGCTCTAGT 3′(包括13個核苷酸，和Seq.Id.No.6的121-133位核苷酸相同)，以及引物ZUP118跨越ToNV RNA的P30基因翻譯終止密碼子的兩端5′GAGTAAGCCA TGGTTAATAC 3′(包括13個核苷酸，和Seq.Id.No.6的911-923位核苷酸互補)引物均含有Nco I限制性內(nèi)切酶位點，可以進一步克隆經(jīng)擴增的DNA分子。純化的ToMV RNA須經(jīng)用RNA的多聚酶鏈式反應(yīng)進行基因擴增(Gene AMP RNA)，生成的多聚酶鏈式反應(yīng)后的(PCR)片段從瓊脂糖凝膠分離到，并克隆到經(jīng)SmaI酶切而線性化pUC19質(zhì)粒上，生成重組質(zhì)粒pZU183(含有CP基因)以及pZU206(含有P30基因)。
實施例6核糖核酸酶T1基因的合成對應(yīng)于核糖核酸酶T1的基因序列在產(chǎn)商用DNA合成儀上合成(Pharmacia LKB，Gene assembler plus)，作為引物ZUP110(含有與Seq.Id No.4的121-293位核苷酸相同的核苷酸)5′TTTCCATGGC ATGCGACTAC ACTTGCGGTT CTAACTGCTA CTCTTCTTCAGACGTTTCTA CTGCTCAAGC TGCCGGATAT AAACTTCACG AAGACGGTGAAACTGTTGGA TCTAATTCTT ACCCACACAA ATACAACAAC TACGAAGGTTTTGATTTCTC TGTGAGCTCT CCCTAC 3′以及引物ZUP111(含有與Seq.Id.No.4 278-446位核苷酸互補的核苷酸)5′GGGCCATGGT TATGTACATT CAACGAAGTT GTTACCAGAA GCACCAGTGTGAGTGATAAC ACCAGCATGT TGGTTGTTTT CGTTGAAGAC GACACGGTCAGCACCTGGAG AAGGACCAGA GTAAACATCA CCGCTAGAGA GGATAGGCCATTCGTAGTAG GGAGAGCTCA C 3′兩個引物均含有No.I限制性內(nèi)切酶位點，使能進一步克隆經(jīng)擴增的DNA分子。引物退火之后，并經(jīng)受標準的DNA的多聚酶鏈式(PCR)反應(yīng)。擴增后的DNA片段從瓊脂糖凝膠上分離到，并把它克隆到經(jīng)SmaI酶切而線性化pUC19質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒pZU230。
實施例7構(gòu)建表達載體pZU-A35S花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動子片段從重組質(zhì)粒pZ027中分離出來，該質(zhì)粒從PUC-19衍生載有444堿基對(bp)的HindIII-PstI片段，它就為CaMV Cabb-S病毒株[Franck et al(1980).Cell21285-294]的35S啟動子的HincII內(nèi)切酶位點-HphI內(nèi)切酶粒點之間的區(qū)域。不同品系之間CaMV株的核苷酸序列十分相似。35S啟動子片段以472堿基對(bp)EcoRI-PstI片段形式從pZ027質(zhì)粒上切下來，包括多聚接頭區(qū)的一部分，437堿基對(bp)的非轉(zhuǎn)錄區(qū)，轉(zhuǎn)錄起始位點及7個堿基對(bp)的非翻譯引導(dǎo)區(qū)但不含有任何35S的翻譯啟動子。35S啟動子片段用T4連接酶連接到E.coRl-PstI線性化pZ0008質(zhì)粒上。質(zhì)粒pZ0008載有以270bp PstI-HindIII片段形式出現(xiàn)的胭脂堿合成酶(NOS)多聚腺苷化信號。形成的重組質(zhì)粒pZU-A載有35S啟動子，唯一的PstI內(nèi)切酶位點及NOS終止子[Gielen etal(1991)Bio/Technology 101363]實施例8所產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄本在用黃瓜花葉病毒(CMV)感染時能復(fù)制的植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建使用兩個引物，將CMV負義RNA3的5′末端直接與CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點相融合，ZUP148，5′CCACGTCTTC AAAGCAG3′(與CaMV35S啟動子的核苷酸互補)以及ZUP146，5′CTTCGCACCT TCGTGGGGGC TCCAAAAGGA GACCACCTCTCCAAATGAAA 3′(含有與Seq.Id.No.1的1860-1827位核苷酸互補的核苷酸)以pZU-A為模板進行標準DNA多聚酶鏈式反應(yīng)。擴增的DNA片段用E.coRV內(nèi)切酶切，并把它克隆到含E.coRV酶切后而線性化的pZU-A質(zhì)粒中。生成的質(zhì)粒以Bstxl和Pstl酶切，并在瓊脂糖凝膠上純化。PZU181用PstI和BstXI酶切之后，在瓊脂糖凝膠上純化得到2.1kb長DNA插入片段，隨后把它克隆到經(jīng)凝膠純化的pZU-A質(zhì)粒衍生物上，形成pCMV3AS-1質(zhì)粒。
以pCMV3AS-1為模板，對兩個DNA片段進行PCR擴增，使pCMV3AS-1的運動蛋白(MP)編碼域被含單一NcoI克隆位點片段取代，肝炎Hepatitisδ病毒RNA的斧頭結(jié)構(gòu)被克隆到CMV負義RNA3的3′末端的下游。第一個DNA片段使用引物ZUP505′AGCTGCTAAC GTCTTATTAA G 3′(含有與序列(Seq)Id.No.11020-1039位核苷酸互補的核苷酸)以及ZUP3295′GTCTTTAGCA CCATGGTG 3′(含有與序列(Seq)Id.No.1604-612位核苷酸相同的核苷酸)DNA片段用NruI及NcoI酶酶切。并從瓊脂糖凝膠上分離到411bp長的DNA片段位在片段(Seq)Id.No.1的607-1016。第二個DNA片段用引物ZUP327
5′GGAGAGCCAT GGCTCGGG 3′(含有與序列(Seq).Id.No.1的115-126位核苷酸互補的核苷酸)以及ZUP350擴增，該引物用核苷酸合成，含有與反基因組肝炎與病毒RNA互補的核苷酸，(正如Perrotta AT & Been MD(1991)Nature VoL 350(4)pp434-436所描述)，同與片段(Seq)Id.No.1的1-14位核苷酸相同的核苷酸(該引物的3′末端)相連接。
5′TTTCTGCAGATCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCGTAATCTT ACCACT) 3′該DNA片段用PstI及NcoI酶酶切，并從瓊脂糖凝膠分離得208bp長的DNA片段。所得到的兩個片段都克隆到pCMV3AS-1中，用PstI和NruI酶切并線性化，以得到pCV3AS-2。編碼引發(fā)體(elicitor)(實施例5)或細胞抑制蛋白(實施例6)的基因可作為NcoI酶切DNA片段克隆到pCMV3AS-2的單一NcoI位點上。形成的pCV3AS-2衍生質(zhì)粒用HindIII酶酶切，含有嵌合基因的DNA片段就可從瓊脂糖凝膠上分離出來，并連接到HindIII酶切線性化的pBIN19上，分別形成二元體植物轉(zhuǎn)化載體pBINCMV3-CP、pBINCMV3-P30和pBINCMV3-T1。
實施例9在感染西紅柿斑點枯萎病病毒(TSWV)時能復(fù)制所生成轉(zhuǎn)錄本的植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建。
使用兩個引物ZUP148(實施例8)和引物ZUP255，以pZU-A為模板進行標準DNA PCR反應(yīng)，使反義西紅柿斑點枯萎病毒(TSWV)S RNA的5′末端直接和CaMV 35S啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點融合。ZUP2555′ACACAATTGC TCTCCTCTCC AAATGAAA 3′(含有與序列(Seq).Id.No.8的2608-2621位核苷酸相同的核苷酸)
擴增的DNA片段用E.coRV酶切，并克隆到E.coRV酶切線性化過的質(zhì)粒pZU-A上。生成的質(zhì)粒用MunI和PstI酶切，并在瓊脂糖凝膠上純化。pTSWV-S2用Pstl和MunI酶切，取2.9kb的插入DNA片段在瓊脂糖凝膠上純化，然后把它克隆到凝膠上純化過的pZU-A質(zhì)粒衍生物上，形成pTSWVSAS-1質(zhì)粒。
通過以pTSWVSAS-1質(zhì)粒為模板，用PCR擴增兩個DNA片段，pTSWVSAS-1質(zhì)粒的N編碼域被含單一NcoI酶切的克隆位點取代，肝炎(Hepatitis)病毒RNA的斧形結(jié)構(gòu)克隆到反義TSMV S RNA 的3′末端下游。第一個DNA片段用引物ZUP252擴增5′GACCCGAAAG GGACCAATTT C 3′(含有與Seq Id.No.8911-930位核苷酸互補核苷酸)以及ZUP2535′TTTCCATGGC TGTAAGTTAA ATT 3′(含有與Seq Id.No.8636-655位核苷酸互補核苷酸)用BalI和NcoI酶切該DNA片段，并從瓊脂凝膠上分離得269bp堿基對長的DNA片段(Seq Id.No.8的636-911位)。第二個DNA片段用引物ZUP2545′TTTCCATGGT GATCGTAAAA G 3′(含有與Seq.Id.No.8的140-157位核苷酸互補的核苷酸)以及ZUP255擴增。ZUP255是用核苷酸人工合成的引物含有與反基因組肝炎δ病毒RNA(正如Perrotta AT和Been MD(1991)Nature Vol 350(4)pp434-436中所描述互補核苷酸，并連接到與片段(Seq)Id.No.8的1-14核苷酸(引物的3′末端相同的核苷酸上
5′TTTCTGCAGA TCTTAGCCAT CCGAGTGGAC GTGCGTCCTCCTTCGGATGC CCAGGTCGGA CCGCGAGGAG GTGGAGATGC CATGCCGACCCAGAGCAATC GTGTC 3′用pstI和NcoI酶切DNA片段，并從瓊脂糖凝膠分離到245bp的DNA片段上。所得到的兩個片段都克隆到pTSWVSAS-1質(zhì)粒中，用PstI和BalI酶切線性化，生成pTSWVSAS-2編碼引發(fā)體elicitor(實施例5)或細胞抑制蛋白(實施例6)的基因作為NcoI酶切的DNA片段克隆到pTSWVSAS-2的單一NcoI酶切位點上。生成的pTSWVSAS-2衍生質(zhì)粒用XbaI酶切，并把含有嵌合基因的DNA片段從瓊脂糖凝膠上分離出來，再連接到XbaI酶切線性化pBIN-19質(zhì)粒上，分別生成二元體植物轉(zhuǎn)化運載體質(zhì)粒pBINTSWVS-CP(Seq Id.No.8)、pBINTSWVS-P30和pBINTSWVS-T1。
實施例10選擇合用的寄主植物1)煙草學名為Nicotina tabacum var.Samsun EN，一種攜有N.sylvestris的N′基因的煙草栽培品種，當受到西柿花葉病毒(ToMV)侵染時表現(xiàn)出高度敏感反應(yīng)。ToMV的外殼蛋白CP在該寄主中引出強的過敏反應(yīng)的防御反應(yīng)。
2)西紅柿學名Lycopersicon esculentum var.ATV847，是商用雜交品系Yaiza和Gemma的親本品系。是一種攜有抗ToMV的Tm-22抗性基因的西紅柿品系。已經(jīng)證實西紅柿花葉病毒(ToMV)的蛋白30(P30)在resistag30nt基因型中引起高度敏感(HS)反應(yīng)[Fraser(1986)CRC Crit.Rev.Plant Sci3257；keen(1990)，Ann.Rev.Genet.24447]。
實施例11二元運載體在煙草和西紅柿植物材料中的轉(zhuǎn)化將二元運載體轉(zhuǎn)入植物材料的方法已完善地建立起來，且已為專業(yè)人員所熟識。由于所用的土壤桿菌(Agrobacterium)品系不同、分離塊材料來源不同、所依賴的再生體系不同、以及所采用栽培品種和植物種類不同，所以也存在有步驟操作的不同。
上述二元植物轉(zhuǎn)化運載體按下面步驟用于植物轉(zhuǎn)化實驗。二元運載體構(gòu)建物通過三親株交配轉(zhuǎn)入受體根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumfaciens)菌株中。接著對在外一接合體進行Southern分析以證實該構(gòu)建物已合適轉(zhuǎn)入受體菌株中，用選出的根癌土壤桿菌接種到無菌分離塊上并共同培養(yǎng)，用合適的抗生素選擇性殺死根癌土壤桿菌，在含有卡那霉素的選擇性培養(yǎng)基上以能否生長選出轉(zhuǎn)化細胞，轉(zhuǎn)移組織塊到誘生枝條的培養(yǎng)基中，把選出的枝條轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基中，把小植物轉(zhuǎn)移到土壤。從轉(zhuǎn)基因植物中分離總DNA進行Southern分析，檢測結(jié)構(gòu)的完整性，通過Northern分析和/或酶分析以及對蛋白進行Western blot分析，檢測插入進去的嵌合基因的合適功能。[Ausubel et al supra，(1987)]。
實施例12嵌合序列在煙草及西紅柿植物細胞中的表達按下面程式從再生植物葉中提取RNA。將200mg葉子在液氮中研成細末。加入800μlRNA抽提緩沖液(100mM Tris.Hcl(pH8.0)，500mM NaCl，2mM EDTA，200mMβ巰基乙醇，0.4％SDS)用苯酚抽提勻漿。經(jīng)乙醇沉淀收集核酸。將核酸重新懸浮于含0.5ml10MTris.HCl(pH8.0)，1mMEDTA溶液中加入LiCl，使其終濃度為2M。冰上放置4小時后，離心收集RNA。把這RNA重新懸浮于含400μl10mMTris HCI(pH8.0)1mM EDTA液中經(jīng)乙醇沉淀，最后，把沉淀的RNA重新懸浮于50μl10mM Tris·HCl(pH8.0)1mM EDTA中。RNA在二醛/瓊脂糖凝膠上分離開，印跡到基因屏幕紙上(Greenscreen)，如van Grinsven等人所描述[(1986).Theor.Appl.Gen.7394-101]。用[32P]、[35S]或非放射標記技術(shù)標記的DNA或RNA探針來探測重組病毒RNA序列，根據(jù)Northern分析，可以確定在上再生植物嵌合重組病毒基因表達到何種程度。
用重組病毒DNA序列轉(zhuǎn)化過的植物在接種各種病毒之后也進行蛋白印跡(western blot)分析。按照Laemmli[(1970).Nature24429]方法，通過在樣品緩沖液中研磨從轉(zhuǎn)化植物葉中抽提蛋白?；旧先鏛aemmli supra所描述(1970)那樣，把蛋白一份50μg在12.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，然后Towbin等所描述的(1979，Proc.Natl Acad.Sci，USA764350)把分開的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，又根據(jù)上述Towbin等的方法(1979)用對純化的西紅柿花葉病毒顆?；?qū)兓腜30蛋白作用所產(chǎn)生的抗血清與轉(zhuǎn)移蛋白反應(yīng)。根據(jù)western印跡分析的結(jié)果，確認轉(zhuǎn)化植物在接種了各自的病毒之后，確實表達了激發(fā)體(elicitor)蛋白的。
實施例13煙草及西紅柿植物對黃瓜花葉病毒(CMV)或西紅柿斑點枯萎病毒(TSWV)感染的抗性轉(zhuǎn)化植物在標準隔離條件下的溫室中生長，以防止病原體感染。植物轉(zhuǎn)化體自身傳粉并收獲種子。分析子代植物插入基因的分離，然后通過機械接種感染CWV或TSWV。從用CMV或TSWV全面感染的植株中獲取組織，在5倍體積冰冷的接種緩沖液10mM磷酸緩沖液中研碎、摻入金剛砂粉末、在大約5周齡幼苗的最初兩個完全舒展的葉子上涂擦接種，在接種后3周內(nèi)，監(jiān)測接種植株癥狀的發(fā)展。
含有CMV相關(guān)或TSWV相關(guān)DNA序列的植物，與未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對照植株相比，表現(xiàn)出對CMV或TSWV感染的感病性下降。后者在接種后7天之內(nèi)，表現(xiàn)出嚴重的全株性的CMV或TSWV癥狀。
序列一覽表序列ID No.1序列類型核苷酸序列長度1860個核苷酸鏈型單鏈分子類型編碼西紅柿花葉病毒(ToMV)的外殼蛋白(CP)的嵌合黃瓜花葉病毒RNA3。GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT 60GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG 120CCATGGCTTA CTCAATCACT TCTCCATCGC AATTTGTGTT TTTGTCATCT GTATGGGCTG 180ACCCTATAGA ATTGTTAAAC GTTTGTACAA ATTCGTTAGG TAACCAGTTT CAAACACAGC 240AAGCAAGAAC TACTGTTCAA CAGCAGTTCA GCGAGGTGTG GAAACCTTTC CCTCAGAGCA 300CCGTCAGATT TCCTGGCGAT GTTTATAAGG TGTACAGGTA CAATGCAGTT TTAGATCCTC 360TAATTACTGC GTTGCTGGGG TCTTTCGATA CTAGGAATAG AATAATCGAA GTAGAAAACC 420AGCAGAATCC GACAACAGCT GAAACGTTAG ATGCTACCCG CAGGGTAGAC GACGCTACGG 480TTGCAATTCG GTCTGCTATA AATAATTTAG TTAATGAACT AGTAAGAGGT ACTGGACTGT 540ACAATCAAAA TACTTTTGAA AGTATGTCTG GGTTGGTCTG GACCTCTGCA CCTGCATCTT 600AAATCCATGG TGTATTAGTA TATAAGTATT GTGAGTCTGT ACATAATACT ATATCTATAG 660TGTCCTGTGT GAGTTGATAC AGTAGACATC TGTGACGCGA TGCCGTGTTG AGAAGGGAAC 720ACATCTGGTT TTAGTAAGCC TACATCACAG TTTTGAGGTT CAATTCCTCA TACTCCCTGT 780TGAGTCCCTT ACTTTCTCAT GGATGCTTCT CCGCGAGATT GCGTTATTGT CTACTGACTA 840TATAGAGAGT GTGTGTGCTG TGTTTTCTCT TTTGTGTCGT AGAATTGAGT CGAGTCATGG 900ACAAATCTGA ATCAACCAGT GCTGGTCGTA ACCGTCGACG TCGTCCGCGT CGTGGTTCCC 960GCTCCGCCCC CTCCTCCGCG GATGCTAACT TTAGAGTCTT GTCGCAGCAG CTTTCGCGAC1020TTAATAAGAC GTTAGCAGCT GGTCGTCCAA CTATTAACCA CCCAACCTTT GTAGGGAGTG1080AACGCTGTAA ACCTGGGTAC ACGTTCACAT CTATTACCCT AAAGCCACCA AAAATAGACC1140GTGGGTCTTA TTACGGTAAA AGGTTGTTAT TACCTGATTC AGTCACGGAA TATGATAAGA1200AACTTGTTTC GCGCATTCAA ATTCGAGTTA ATCCTTTGCC GAAATTCGAT TCTACCGTGT1260GGGTGACAGT CCGTAAAGTT CCTGCCTCCT CGGACTTATC CGTTGCCGCC ATCTCTGCTA1320TGTTTGCGGA CGCCGCATTT GGAGTCCAAG CTAACAACAA ATTGTTGTAT GATCTTTCGG1380CGGGAGCCTC ACCGGTACTG GTTTATCAGT ACATGCGCGC TGATATAGGT GACATGAGAA1440AGTACGCCGT CCTCGTGTAT TCAAAAGACG ATGCGCTCGA GACGGACGAG CTAGTACTTC1500ATGTTGACAT CGAGCACCAA CGCATTCCCA CATCTAGAGT ACTCCCAGTC TGATTCCGTG1560TTCCCAGAAC CCTCCCCCCG ATTTCTGTGG CGGGAGCTGA GTTGGCAGTT CTGCTATAAA1620CTGTCTGAAG TCACTAAACG TTTTACGGTG AACGGGTTGT CCATCCAGCT TACGGCTAAA1680ATGGTCAGTC GTGGAGAAAT CCACGCCAGC AGATTTACAA ATCTCTGAGG CGCCTTTGAA1740ACCATCTCCT AGGTTTTTTC GGAAGGACTT CGGTCCGTGT ACCTCTAGCA CAACGTGCTA1800GTCTTAGGGT ACGGGTGCCC CTTGTCTTCG CACCTTCGTG GGGGCTCCAA AAGGAGACCA1860序列ID No.2序列類型氨基酸序列長度159個氨基酸鏈 單鏈分子類型西紅柿花葉病毒(ToMV)的外殼蛋白(對應(yīng)于片段(Seq)ID.No.1的123-599位核苷酸)。Met Ala Tyr Ser Ile Thr Ser Pro Ser Gln Phe Val Phe Leu Ser 15Ser Val Trp Ala Asp Pro Ile Glu Leu Leu Asn Val Cys Thr Asn 30Ser Leu Gly Asn Gln Phe Gln Thr Gln Gln Ala Arg Thr Thr val 45Gln Gln Gln Phe Ser Glu Val Trp Lys Pro Phe Pro Gln Ser Thr 60Val Arg Phe Pro Gly Asp Val Tyr Lys Val Tyr Arg Tyr Asn Ala 75Val Leu Asp Pro Leu Ile Thr Ala Leu Leu Gly Ser Phe Asp Thr 90Arg Asn Arg Ile Ile Glu Val Glu Asn Gln Gln Asn Pro Thr Thr 105Ala Glu Thr Leu Asp Ala Thr Arg Arg Val Asp Asp Ala Thr Val 120Ala Ile Arg Ser Ala Ile Asn Asn Leu Val Asn Glu Leu Val Arg 135Gly Thr Gly Leu Tyr Asn Gln Asn Thr Phe Glu Ser Met Ser Gly 150Leu Val Trp Thr Ser Ala Pro Ala Ser 159序列ID No.3序列類型氨基酸序列長度218個氨基酸鏈 單鏈分子類型黃瓜花葉病毒外殼蛋白對應(yīng)片段(Seq).ID No.1897-1550位核苷酸Met Asp Lys Ser Glu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn Arg Arg Arg 15Arg Pro Arg Arg Gly Ser Arg Ser Ala Pro Ser Ser Ala Asp Ala 30Asn Phe Arg Val Leu Ser Gln Gln Leu Ser Arg Leu Asn Lys Thr 45Leu Ala Ala Gly Arg Pro Thr Ile Asn His Pro Thr Phe Val Gly 60Ser Glu Arg Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ile Thr Leu 75Lys Pro Pro Lys Ile Asp Arg Gly Ser Tyr Tyr Gly Lys Arg Leu 90Leu Leu Pro Asp Ser Val Thr Glu Tyr Asp Lys Lys Leu Val Ser 105Arg Ile Gln Ile Arg Val Asn Pro Leu Pro Lys Phe Asp Ser Thr 120Val Trp Val Thr Val Arg Lys Val Pro Ala Ser Ser Asp Leu Ser 135Val Ala Ala Ile Ser Ala Met Phe Ala Asp Gly Ala Ser Pro Val 150Leu Val Tyr Gln Tyr Ala Ala Phe Gly Val Gln Ala Asn Asn Lys 165Leu Leu Tyr Asp Leu Ser Ala Met Arg Ala Asp Ile Gly Asp Met 180Arg Lys Tyr Ala Val Leu Val Tyr Ser Lys Asp Asp Ala Leu Glu 195Thr Asp Glu Leu Val Leu His Val Asp Ile Glu His Gln Arg Ile 210Pro Thr Ser Arg Val Leu Pro Val 218序列ID No.4序列類型核苷酸序列長度1696個核苷酸鏈 單鏈分子類型編碼Rnase T1的嵌合黃瓜花葉病毒RNA3GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT60GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG 120CCATGGCATG CGACTACACT TGCGGTTCTA ACTGCTACTC TTCTTCAGAC GTTTCTACT180CTCAAGCTGC CGGATATAAA CTTCACGAAG ACGGTGAAAC TGTTGGATCT AATTCTTACC 240CACACAAATA CAACAACTAC GAAGGTTTTG ATTTCTCTGT GAGCTCTCCC TACTACGAAT 300GGCCTATCCT CTCTAGCGGT GATGTTTACT CTGGTGGTTC TCCAGGTGCT GACCGTGTCG 360TCTTCAACGA AAACAACCAA CTAGCTGGTG TTATCACTCA CACTGGTGCT TCTGGTAACA 420ACTTCGTTGA ATGTACATAA CCATGGTGTA TTAGTATATA AGTATTGTGA GTCTGTACAT 480AATACTATAT CTATAGTGTC CTGTGTGAGT TGATACAGTA GACATCTGTG ACGCGATGCC 540GTGTTGAGAA GGGAACACAT CTGGTTTTAG TAAGCCTACA TCACAGTTTT GAGGTTCAAT 600TCCTCATACT CCCTGTTGAG TCCCTTACTT TCTCATGGAT GCTTCTCCGC GAGATTGCGT 660TATTGTCTAC TGACTATATA GAGAGTGTGT GTGCTGTGTT TTCTCTTTTG TGTCGTAGAA 720TTGAGTCGAG TCATGGACAA ATCTGAATCA ACCAGTGCTG GTCGTAACCG TCGACGTCGT 780CCGCGTCGTG GTTCCCGCTC CGCCCCCTCC TCCGCGGATG CTAACTTTAG AGTCTTGTCG 840CAGCAGCTTT CGCGACTTAA TAAGACGTTA GCAGCTGGTC GTCCAACTAT TAACCACCCA 900ACCTTTGTAG GGAGTGAACG CTGTAAACCT GGGTACACGT TCACATCTAT TACCCTAAAG 960CCACCAAAAA TAGACCGTGG GTCTTATTAC GGTAAAAGGT TGTTATTACC TGATTCAGTC 1020ACGGAATATG ATAAGAAACT TGTTTCGCGC ATTCAAATTC GAGTTAATCC TTTGCCGAAA 1080TTCGATTCTA CCGTGTGGGT GACAGTCCGT AAAGTTCCTG CCTCCTCGGA CTTATCCGTT 1140GCCGCCATCT CTGCTATGTT TGCGGACGGA GCCTCACCGG TACTGGTTTA TCAGTACGCC 1200GCATTTGGAG TCCAAGCTAA CAACAAATTG TTGTATGATC TTTCGGCGAT GCGCGCTGAT 1260ATAGGTGACA TGAGAAAGTA CGCCGTCCTC GTGTATTCAA AAGACGATGC GCTCGAGACG 1320GACGAGCTAG TACTTCATGT TGACATCGAG CACCAACGCA TTCCCACATC TAGAGTACTC 1380CCAGTCTGAT TCCGTGTTCC CAGAACCCTC CCTCCGATTT CTGTGGCGGG AGCTGAGTTG 1440GCAGTTCTGC TATAAACTGT CTGAAGTCAC TAAACGTTTT ACGGTGAACG GGTTGTCCAT 1500CCAGCTTACG GCTAAAATGG TCAGTCGTGG AGAAATCCAC GCCAGCAGAT TTACAAATCT 1560CTGAGGCGCC TTTGAAACCA TCTCCTAGGT TTTTTCGGAA GGACTTCGGT CCGTGTACCT 1620CTAGCACAAC GTGCTAGTCT TAGGGTACGG GTGCCCCTTG TCTTCGCACC TTCGTGGGGG 1680CTCCAAAAGG AGACCA 1696序列ID NO.5序列類型氨基酸序列長度105個氨基酸鏈 單鏈分子類型RNase T1，對應(yīng)于序列(Seq Id.No.4的123-437位Met Ala Cys Asp Tyr Thr Cys Gly Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Ser 15Asp Val Ser Thr Ala Gln Ala Ala Gly Tyr Lys Leu His Glu Asp 30Gly Glu Thr Val Gly Ser Asn Ser Tyr Pro His Lys Tyr Asn Asn 45Tyr Glu Gly Phe Asp Phe Ser Val Ser Ser Pro Tyr Tyr Glu Trp 60Pro Ile Leu Ser Ser Gly Asp Val Tyr Ser Gly Gly Ser Pro Gly 75Ala Asp Arg Val Val Phe Asn Glu Asn Asn Gln Leu Ala Gly Val 90Ile Thr His Thr Gly Ala Ser Gly Asn Asn Phe Val Glu Cys Thr 105序列ID No.6序列類型核苷酸序列長度2173個核苷酸鏈 單鏈分子類型嵌合黃瓜花葉病毒RNA3，編碼西紅柿花葉病毒(ToMV)的P30。GTAATCTTAC CACTCGTGTG TGTGCGTGTG TGTGTGTCGA GTCGTGTTGT CCGCACATTT 60GAGTCGTGCT GTCCGCACAT ATATTTTACC TTTTGTGTAC AGTGTGTTAG ATTTCCCGAG120CCATGGCTCT AGTTGTTAAA GGTAAGGTAA ATATTAATGA GTTTATCGAT CTGTCAAAGT180CTGAGAAACT TCTCCCGTCG ATGTTCACGC CTGTAAAGAG TGTTATGGTT TCAAAGGTTG240ATAAGATTAT GGTCCATGAA AATGAATCAT TGTCTGAAGT AAATCTCTTA AAAGGTGTAA300AACTTATAGA AGGTGGGTAT GTTTGCTTAG TTGGTCTTGT TGTGTCCGGT GAGTGGAATT360TCCCAGATAA TCGCCGTGGT GGTGTGAGTG TCTGCATGGT TGACAAGAGA ATGGAAAGAG420CGGACGAAGC CACACTGGGG TCATATTACA CTGCTGCTGC TAAAAAGCGG TTTCAGTTTA480AAGTGGTCCC AAATTACGGT ATTACAACAA AGGATGCAGA AAAGAACATA TGGCAGGTCT540TAGTAAATAT TAAAAATGTA AAAATGAGTG CGGGCTACTG CCCTTTGTCA TTAGAATTTG600TGTCTGTGTG TATTGTTTAT AAAAATAATA TAAAATTGGG TTTGAGGGAG AAAGTAACGA660GTGTGAACGA TGGAGGACCC ATGGAACTTT CGGAAGAAGT TGTTGATGAG TTCATGGAGA720ATGTTCCAAT GTCGGTTAGA CTCGCAAAGT TTCGAACCAA ATCCTCAAAA AGAGGTCCGA780AAAATAATAA TAATTTAGGT AAGGGGCGTT CAGGCGGAAG GCCTAAACCA AAAAGTTTTG840ATGAAGTTGA AAAAGAGTTT GATAATTTGA TTGAAGATGA AGCCGAGACG TCGGTCGCGG900ATTCTGATTC GTATTAACCA TGGTGTATTA GTATATAAGT ATTGTGAGTC TGTACATAAT960ACTATATCTA TAGTGTCCTG TGTGAGTTGA TACAGTAGAC ATCTGTGACG CGATGCCGTG 1020TTGAGAAGGG AACACATCTG GTgTTAGTAA GCCTACATCA CAGTTTTGAG GTTCAATTCC 1080TCATACTCCC TGTTGAGTCC CTTACTTTCT CATGGATGCT TCTCCGCGAG ATTGCGTTAT 1140TGTCTACTGA CTATATAGAG AGTGTGTGTG CTGTGTTTTC TCTTTTGTGT CGTAGAATTG 1200AGTCGAGTCA TGGACAAATC TGAATCAACC AGTGCTGGTC GTAACCGTCG ACGTCGTCCG 1260CGTCGTGGTT CCCGCTCCGC CCCCTCCTCC GCGGATGCTA ACTTTAGAGT CTTGTCGCAG 1320CAGCTTTCGC GACTTAATAA GAcGTTAGCA GCTGGTCGTC CAACTATTAA CCACCCAACC 1380TTTGTAGGGA GTGAACGCTG TAAACCTGGG TACACGTTCA CATCTATTAC CCTAAAGCCA 1440CCAAAAATAG ACCGTGGGTC TTATTACGGT AAAAGGTTGT TATTACCTGA TTCAGTCACG 1500GAATATGATA AGAAACTTGT TTCGCGCATT CAAATTCGAG TTAATCCTTT GCCGAAATTC 1560GATTCTACCG TGTGGGTGAC AGTCCGTAAA GTTCCTGCCT CCTCGGACTT ATCCGTTGCC 1620GCCATCTCTG CTATGTTTGC GGACGCCGCA TTTGGAGTCC AAGCTAACAA CAAATTGTTG 1680TATGATCTTT CGGCGGGAGC CTCACCGGTA CTGGTTTATC AGTACATGCG CGCTGATATA 1740GGTGACATGA GAAAGTACGC CGTCCTCGTG TATTCAAAAG ACGATGCGCT CGAGACGGAC 1800GAGCTAGTAC TTCATGTTGA CATCGAGCAC CAACGCATTC CCACATCTAG AGTACTCCCA 1860GTCTGATTCC GTGTTCCCAG AACCCTCCCT CCGATTTCTG TGGCGGGAGC TGAGTTGGCA 1920GTTCTGCTAT AAACTGTCTG AAGTCACTAA ACGTTTTACG GTGAACGGGT TGTCCATCCA 1980GCTTACGGCT AAAATGGTCA GTCGTGGAGA AATCCACGCC AGCAGATTTA CAAATCTCTG 2040AGGCGCCTTT GAAACCATCT CCTAGGTTTT TTCGGAAGGA CTTCGGTCCG TGTACCTCTA 2100GCACAACGTG CTAGTCTTAG GGTACGGGTG CCCCTTGTCT TCGCACCTTC GTGGGGGCTC 2160CAAAAGGAGA CCA2173序列ID No.7序列類型氨基酸序列長度264個氨基酸鏈 單鏈分子類型西紅柿花葉病毒(ToMV)的蛋白30(P30)，對應(yīng)于序列(Seq)ID No.6的123-914位Met Ala Leu Val Val Lys Gly Lys Val Asn Ile Asn Glu Phe Ile 15Asp Leu Ser Lys Ser Glu Lys Leu Leu Pro Ser Met Phe Thr Pro 30Val Lys Ser Val Met Val Ser Lys Val Asp Lys Ile Met Val His 45Glu Asn Glu Ser Leu Ser Glu Val Asn Leu Leu Lys Gly Val Lys 60Leu Ile Glu Gly Gly Tyr Val Cys Leu Val Gly Leu Val Val Ser 75Gly Glu Trp Asn Phe Pro Asp Asn Arg Arg Gly Gly Val Ser Val 90Cys Met Val Asp Lys Arg Met Glu Arg Ala Asp Glu Ala Thr Leu 105Gly Ser Tyr Tyr Thr Ala Ala Ala Lys Lys Arg Phe Gln Phe Lys 120Val Val Pro Asn Tyr Gly Ile Thr Thr Lys Asp Ala Glu Lys Asn 135Ile Trp Gln Val Leu Val Asn Ile Lys Asn Val Lys Met Ser Ala 150Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Leu Glu Phe Val Ser Val Cys Ile Val 165Tyr Lys Asn Asn Ile Lys Leu Gly Leu Arg Glu Lys Val Thr Ser 180Val Asn Asp Gly Gly Pro Met Glu Leu Ser Glu Glu Val Val Asp 195Glu Phe Met Glu Asn Val Pro Met Ser Val Arg Leu Ala Lys Phe 210Arg Thr Lys Ser Ser Lys Arg Gly Pro Lys Asn Asn Asn Asn Leu 225Gly Lys Gly Arg Ser Gly Gly Arg Pro Lys Pro Lys Ser Phe Asp 240Glu Val Glu Lys Glu Phe Asp Asn Leu Ile Glu Asp Glu Ala Glu 255Thr Ser Val Ala Asp Ser Asp Ser Tyr 264序列ID No.8序列類型核苷酸序列長度7621個核苷酸鏈 單鏈分子類型嵌合西紅柿斑點枯萎病毒S RNA，編碼西紅柿花葉病毒ToMV外殼蛋白及相反極性的非結(jié)構(gòu)蛋白NS。AGAGCAATCG TGTCAATTTT GTGTTCATAC CTTAACACTC AGTCTTACAA ATCATCACAT 60TAAGAACCTA AGAAACGACT GCGGGATACA GAGTTGCACT TTCGCACCTT GAGTTACATA 120CGGTCAAAGC ATATAACAAC TTTTACGATC ACCATGGCTT ACTCAATCAC TTCTCCATCG l80CAATTTGTGT TTTTGTCATC TGTATGGGCT GACCCTATAG AATTGTTAAA CGTTTGTACA 240AATTCGTTAG GTAACCAGTT TCAAACACAG CAAGCAAGAA CTACTGTTCA ACAGCAGTTC 300AGCGAGGTGT GGAAACCTTT CCCTCAGAGC ACCGTCAGAT TTCCTGGCGA TGTTTATAAG 360GTGTACAGGT ACAATGCAGT TTTAGATCCT CTAATTACTG CGTTGCTGGG GTCTTTCGAT 420ACTAGGAATA GAATAATCGA AGTAGAAAAC CAGCAGAATC CGACAACAGC TGAAACGTTA 480GATGCTACCC GCAGGGTAGA CGACGCTACG GTTGCAATTC GGTCTGCTAT AAATAATTTA 540GTTAATGAAC TAGTAAGAGG TACTGGACTG TACAATCAAA ATACTTTTGA AAGTATGTCT 600GGGTTGGTCT GGACCTCTGC ACCTGCATCT TAAATCCATG GCTGTAAGTT AAATTATAAA 660AAAGCCTATA AATATATAAA GCTTTCTTTA TCTTTATTGC TTGTGCTTGC TTAGTGTGTT 720AAATTTTAAA TAAGTGTGTT TAATTAAAGT TTGCTTTCTG TGTGTTGTGC TTAATAAATA 780ATAAAATAAC AAAAACAACG AAAACAAAAA ATAAATAAAA TAAAAATAAA ATAAAAATAA 840AATAAAATAA AAATAAAATA AAAAATAAAA AACAAAAAAC AAAAAACAAA AACAAAACCC 900AAATTTGGCC AAATTGGTCC CTTTCGGGTC TTTTTGGTTT TTCGTTTTTT AATTTTTTGT960TGTTTTTATT TCATTTTTTG ATTTTATTTT ATTTTAATTT TATTTTCATT TTTATTTTTT 1020GTTTTTATGG TTTCTACTAG ACAGGAGGAA TTTGAAAGAG ATGACAAACA GAGAAATAAT 1080TATAAGTAAA GAAAGAAAAT AAACATAACA TAATTAGAAA AAGCTGGACA AAGCAAGATT 1140ATTTTGATCC TGAAGCATAC GCTTCCTTAA CCTTAGATTC TTTCTTTTTG ATCCCGCTTA 1200AATCAAGCTT TAACAAAGAT TTTGCAACTG AAATAGATTG TGGAGAAATT TTAATTTCTC 1250CTCTGGCAAA GTCTATCTTC CATGAAGGGA TTTGGATGCT GTCTAAGTAA GACATAGTTT 1320GTGTGTTAGA TGGAAGACAT TCAAGTGTTT TTGAAAGGAA ATATTTCCTT TTGTAGGCAT 1380CTTCACTGTA ATTCAAGGTT CTTTCACCTA AATCTAACTT TCCAGGAGTT AGCTCAAGGT 1440TGTTCAAAGT GTAGATGATT ACATCTTCTT GCAAGTTAGT TGCAAAGAAC TTGTGCAAAG 1500ATGTGTGAGT TTCGAGCCAG AGCATTGGAA CCGATCCTTT GGGGTATGAA GGGTCATGAA 1560CAATGTTGTA AGGCTCCTTT AAATCAGAAA ACATCATTGA TAATTCAAAA GGAGCTTTGC 1620ATTTGCGAAT TGGGAGCTGA TGCTTGCAAA TAACAGTAAT GTTTAAAGCT GTCTCAACAC 1680TGTTATGGTT TGGAATGCAG GCAATAGATA AATAAAATGT TTTGTTTGTT TCATCTCCTG 1740CAACCTTGAA CAATTTCTGA ATGGAAACCT GCTTCAAAAC CTTTGGAACC CTTAGCCAGA 1800GGCTCAGCTT GAAATGAGAA TCAGTGGAAG CTTGAGAGTT AGGCATGATG TTGTTTTCTG 1860CTGACATGAG CAGAGATTTC ACTGCAAGAG AATTTACAGT TCTGTTGTTG CTTTCAACTT 1920GATTGAAATT TGGCTTGAAA CTGTACAGCC ATTCATGGAC ATTTCTGTTA GGAGATAGAA 1980CATTCACTTT GCCTAAAGCC TGATTATAGC ACATCTCGAT CTTATAGGTA TGCTCTTTGA 2040CACAAGACAA AGAGCCTTTG TTTGCAGCTT CAATGTATTT GTCATTGGGA ATTATGTCTT 2100TTTCTTGGAG CTGGAATCGG TCTGTAATAT CAGATCTGTT CATGATAGAT TCAATAGAGT 2160GGAGCTGGGC AGGAGACAAA ACCTTCAAAT GACCTTGATG TTTCACTCCG TTAGCATTGA 2220CTGTATTTGA GCAAACAGAT AGTGCCAGAA CAGAGTTATC AATATTGATG CTAAAATCAA 2280TATCATCAAA AATAGGGATA TACACATGCT GAGAAAGAAA TCTCTTCTTC TTCACAGGGA 2340AGATCCCTAC TTTGCAGTAT AGCCAAAGGA CTACTTTGCT TCTTGAATCA GAATACAGCT 2400GGGTCTGAAC TAGTTGAGAA CCAGTACCAA GTTCATGAAT CCAGTAAGAA TCTACAACAG 2460CTTTACCAGA TGCAGTTGAT CCCCAGACTG AAGCTCTTGT CTGAATGATC GACTCATAAA 2520CACTTGAAGA CATTATGGTT ATTGGTACTG TGTTCTTATT ACAGTATTGT GATTTTCTAA 2580GTGAGGTTTG ATTATGAACA AAATTCTGAC ACAATTGCTC T 2621序列ID No.9序列類型氨基酸序列長度464個氨基酸鏈 單鏈分子類型無結(jié)構(gòu)蛋白NSP，對應(yīng)于序列(Seq)ID No.8的1142-2533(以相反極性)位核苷酸。Mez Ser Ser Ser Val Tyr Glu Ser Ile Ile Gln Thr Arg Ala Ser 15Val Trp Gly Ser Thr Ala Ser Gly Lys Ala Val Val Asp Ser Tyr 30Trp Ile His Glu Leu Gly Thr Gly Ser Gln Leu Val Gln Thr Gln 45Leu Tyr Ser Asp Ser Arg Ser Lys Val Val Leu Trp Leu Tyr Cys 60Lys Val Gly Ile Phe Pro Val Lys Lys Lys Arg Phe Leu Ser Gln 75His Val Tyr Ile Pro Ile Phe Asp Asp Ile Asp Phe Ser Ile Asn 90Ile Asp Asn Ser Val Leu Ala Leu Ser val Cys Ser Asn Thr Val 105Asn Ala Asn Gly Val Lys His Gln Gly His Leu Lys Val Leu Ser 120Pro Ala Gln Leu His Ser Ile Glu Ser Ile Met Asn Arg Ser Asp 135Ile Thr Asp Arg Phe Gln Leu Gln Glu Lys Asp Ile Ile Pro Asn 150Asp Lys Tyr Ile Glu Ala Ala Ash Lys Gly Ser Leu Ser Cys Val 165Lys Glu His Thr Tyr Lys Ile Glu Met Cys Tyr Asn Gln Ala Leu 180Gly Lys Val Asn Val Leu Ser Pro Aan Arg Asn Val His Glu Trp 195Leu Tyr Ser Phe Lys Pro Asn Phe Asn Gln Val Glu Ser Asn Asn 210Arg Thr Val Asn Ser Leu Ala Val Lys Ser Leu Leu Met Ser Ala 225Glu Asn Asn Ile Men Pro Asn Ser Gln Ala Ser Thr Asp Ser His 240Phe Lys Leu Ser Leu Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Leu Lys Gln 255Val Ser Ile Gln Lys Leu Phe Lys Val Ala Gly Asp Glu Thr Asn 270Lys Thr Phe Tyr Leu Ser Ile Ala Cys Ile Pro Asn His Asn Ser 285Val Glu Thr Ala Leu Asn Ile Thr Val Ile Cys Lys His Gln Leu 300Pro Ile Arg Lys Cys Lys Ala Pro Phe Glu Leu Ser Met Met Phe 315Ser Asp Leu Lys Glu Pro Tyr Asn Ile Val His Asp Pro Ser Tyr 330Pro Lys Gly Ser Val Pro Met Leu Trp Leu Glu Thr His Thr Ser 345Leu His Lys Phe Phe Ala Thr Asn Leu Gln Glu Asp Val Ile Ile 360Tyr Thr Leu Asn Asn Leu Glu Leu Thr Pro Gly Lys Leu Asp Leu 375Gly Glu Arg Thr Leu Asn Tyr Ser Glu Asp Ala Tyr Lys Arg Lys 390Tyr Phe Leu Ser Lys Thr Leu Glu Cys Leu Pro Ser Asn Thr Gln 405Thr Met Ser Tyr Leu Asp Ser Ile Gln Ile Pro Ser Trp Lys Ile 420Asp Phe Ala Arg Gly Glu Ile Lys Ile Ser Pro Gln Ser Ile Ser 435Val Ala Lys Ser Leu Leu Lys Leu Asp Leu Ser Gly Ile Lys Lys 450Lys Glu Ser Lys Val Lys Glu Ala Tyr Ala Ser Gly Ser Lys 46權(quán)利要求
1.一種能直接或間接編碼反義RNA分子的DNA結(jié)構(gòu)物，它所編碼的反義RNA分子具有與入侵植物病毒所編碼的依賴于RNA的RNA多聚酶相互作用的能力，在病毒入侵植物時反義RNA分子與所說的侵染病毒編碼的依賴于RNA的RNA多聚酶相互作用結(jié)果、生成至少一種引發(fā)(elicitmg)因子，前述這種結(jié)構(gòu)的表達受能夠在植物起作用的啟動子和終止子所控制。
2.一種能夠編碼正義RNA分子的重組DNA結(jié)構(gòu)物，所編碼的正義RNA分子能夠與病毒侵染植物的病毒所編碼的依賴于RNA的RNA多聚酶相互作用，這種相互作用的結(jié)果是正義RNA分子能夠編碼至少一種引發(fā)(eliciting)因子
3.一種依據(jù)權(quán)利要求1包含序列(Seq.)Id.No.1的結(jié)構(gòu)。
4.一種依據(jù)權(quán)利要求1包含序列(Seq.)Id.No.4的結(jié)構(gòu)。
5.一種依據(jù)權(quán)利要求1包含序列(Seq.)Id.No.6的結(jié)構(gòu)。
6.一種依據(jù)權(quán)利要求1包含序列(Seq.)Id.No.8的結(jié)構(gòu)。
7.依據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的重組DNA結(jié)構(gòu)，其中引發(fā)(eliciting)因子從蛋白、多肽、肽類群中選擇。
8.一種依據(jù)權(quán)利要求7的結(jié)構(gòu)，其中引發(fā)(eliciting)因子能夠引出植物過敏反應(yīng)或者釋放細胞抑制蛋白。
9.一種依據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的結(jié)構(gòu)，其中引發(fā)體(elicitor)的蛋白來源于植物病毒、細菌、真菌、或線蟲。
10.一種依據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的結(jié)構(gòu)，其中細胞抑制蛋白是從核糖核酸酶、蛋白酶、核糖體抑制蛋白、以及細胞壁降解蛋白類群中選擇。
11.一種依據(jù)權(quán)利要求1至10的任一權(quán)利要求的結(jié)構(gòu)，其中結(jié)構(gòu)含組成型的啟動子，從病毒、真菌、細菌及植物衍生的啟動子類群中選擇。
12.一種依據(jù)權(quán)利要求11的結(jié)構(gòu)，其中啟動子從CaMV195、nopaline合成酶、章魚堿合成酶、熱休克80啟動子類群中選擇。
13.其基因組包含依據(jù)權(quán)利要求1至12任一權(quán)利要求的結(jié)構(gòu)的植物。
14.一個依據(jù)權(quán)利要求13的制備植物的方法包含A)在植物細胞基因組中插入依據(jù)權(quán)利要求1的DNA結(jié)構(gòu)；B)獲得轉(zhuǎn)化細胞；C)從轉(zhuǎn)化細胞中再生在遺傳上經(jīng)過轉(zhuǎn)化植物。
全文摘要
能夠編碼一種與病毒侵染植物時病毒所編碼的依賴于RNA的RNA聚合酶相互作用的RNA分子的DNA結(jié)構(gòu)，作為同所說的侵染病毒所編碼的依賴于RNA的RNA聚合酶相互作用的結(jié)果，產(chǎn)生了引發(fā)eliciting因子或正義RNA分子，借此，任何一個產(chǎn)生的正義RNA分子能夠編碼引發(fā)(eliciting)因子，含有這種結(jié)構(gòu)的植物以及獲得這種植物的方法。
文檔編號C12N15/83GK1128048SQ94192894
公開日1996年7月31日 申請日期1994年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月4日
發(fā)明者P·T·德哈安 申請人:山道士有限公司