專利名稱：無粉塵酶的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型酶顆粒及其制備方法。
許多工業(yè)上有用的酶是用諸如細(xì)菌、酵母和真菌之類的微生物生產(chǎn)的。它們?cè)谇鍧崉⒌矸酆涂椢锛庸ぶ刑貏e有用，它們也應(yīng)用于飼料和食品中。
應(yīng)用于清潔劑中的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂酶和纖維素酶。這些酶是用發(fā)酵方法生產(chǎn)的，然后再進(jìn)行回收、純化和濃縮，使之成為液態(tài)或成為干燥狀態(tài)。適合的回收技術(shù)包括過濾、離心、膜濾、沉淀、結(jié)晶、層析和噴霧干燥等。
由于可能出現(xiàn)與干燥酶特別是干蛋白酶制品有關(guān)的皮膚病學(xué)和其它的健康問題，在這種制品中粉塵的含量應(yīng)當(dāng)盡可能低。為此，這種干酶通常是做成顆粒狀，為達(dá)到此目的已經(jīng)研制成功數(shù)種造粒技術(shù)，請(qǐng)見例如USP Nos.4,009,076；4,016,040；4,078,368；4,242,219等。
為了進(jìn)一步降低酶的粉塵釋放并保護(hù)顆粒，在制成顆粒后將其大部分以成膜的大分子材料包覆。
顆?；旧峡梢苑殖蓛煞N類型，第一類是把所用的化合物混合于顆粒中，第二類是把所用的化合物置于顆粒核芯周圍。很清楚，后一類型與化合物混合于顆粒中的顆粒相比，在核芯表面所用的化合物(例如，酶)的濃度是很高的。結(jié)果，如果涂層不夠充分或者涂層受損時(shí)，化合物將比有均勻分布的化合物的顆粒以較高水平暴露于環(huán)境中。
JP 58-179492A公開了有保護(hù)涂層的酶粒的制備方法。在整個(gè)過程進(jìn)行干燥時(shí)，用流化床干燥器首先將例如液態(tài)酶濃縮物噴于核芯材料，然后再將含纖維素衍生物的涂料噴于顆粒上。
EP-A-0193829敘述了含粒子的無粉塵酶的生產(chǎn)方法，是用酶包覆能水合的核芯粒子，然后再用成膜材料包覆。包覆是將核芯粒子懸浮于流化床干燥器中，在懸浮時(shí)將酶的水漿噴于核芯粒子上，將水分蒸發(fā)后，在粒子上留下了干燥的酶涂層。所得到的有酶包覆的粒子，當(dāng)其仍懸浮于流化床中時(shí)，噴以大分子材料溶液或分散液，然后干燥，除去溶劑，得到大分子材料的涂層。
WO 90/09428公開了一種清潔添加劑顆粒，它包括初級(jí)清潔添加劑(例如一種酶)的核芯，圍繞其外的是由次級(jí)清潔添加劑(例如另一種酶)、粘合劑、成粒劑，還可以有填料構(gòu)成的殼，以及核芯和殼之間的保護(hù)涂層。其中殼包括纖維素或人造纖維，其核芯也可以包括纖維素或人造纖維。據(jù)稱該清潔添加劑顆粒呈現(xiàn)高的物理(力學(xué))強(qiáng)度，初級(jí)和次級(jí)清潔添加劑彼此間是分離的，并/或與有害的環(huán)境因素分離。
WO 93/07263公開了一顆粒狀酶組合物，它包括核芯、酶層和外涂層。酶層含乙烯基聚合物，核芯和外涂層也可以含乙烯基聚合物。顆粒狀酶組合物據(jù)稱有降低形成粉塵和殘留的趨向，并呈現(xiàn)改進(jìn)的穩(wěn)定性和延遲釋放的特性。制備這種含酶的顆粒的方法據(jù)稱可以大大減少工藝時(shí)間。
本發(fā)明提供了具有改進(jìn)性能的新的酶顆粒。與以上引用的現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的顆粒具有的優(yōu)點(diǎn)是所用的化合物不僅只在顆粒的表面。
本發(fā)明的第一方面是提供包括有酶溶液被吸附在多孔核芯材料中的酶顆粒。
含酶的顆粒宜涂以成膜大分子材料。這種顆粒具有改進(jìn)的機(jī)械強(qiáng)度。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了新型酶顆粒的有效制備方法。
本發(fā)明的顆粒是以核芯粒子為基礎(chǔ)的，該核芯粒子具有較好的孔徑和孔徑分布，以便酶溶液能進(jìn)入粒子。因此，核芯材料包括液體形態(tài)的酶，從而避免了加工粉狀酶的缺點(diǎn)。
至今所能得到的核芯材料是不具備所要求的特性的。核芯材料的孔徑不應(yīng)太大，因?yàn)檫@將特別降低粒子的強(qiáng)度；核芯材料孔徑也不應(yīng)太小，因?yàn)檫@將阻礙所用化合物(例如一種酶)進(jìn)入孔隙。
歐洲專利申請(qǐng)EP-A-0542351(1993年5月19日公開，即在本專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)日之后)公開了一種制備鹽顆粒的方法。用此方法得到的產(chǎn)品在酶的應(yīng)用中非常適合于用作核芯材料。從方法的經(jīng)濟(jì)學(xué)觀點(diǎn)看，孔隙度水平是很重要的。
本發(fā)明的又一方面是提供一種有效地制備新的酶顆粒的方法，該方法包括下列各步驟(a)制備非水酶溶液；(b)將所說酶溶液施于多孔核芯材料，使酶溶液被多孔核芯材料吸收；(c)將得到的酶顆粒進(jìn)行干燥；還可以(d)用大分子成膜材料包覆酶顆粒。
酶溶液的制備可以用各種方法，主要決定于所用酶的物理特性。用于本發(fā)明目的的適合溶劑包括乙二醇、丙二醇、如PEG 200和PEG 400之類的液態(tài)聚乙二醇和甘油。在某些情況下，先制備酶的水溶液并加入非水溶劑可能是適用的。然后例如用蒸發(fā)方法除去部分或全部的水。非水酶溶液可含一定量的水，例如10-20％，但不應(yīng)對(duì)顆粒的各組分特別是多孔核芯材料有不利影響。在某些例子中也可以用酶漿液代替酶溶液。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，這是十分清楚的。
使酶吸收到粒子中可用各種方法來完成，可自含酶的水液或水漿(例如濃縮的發(fā)酵湯)或自含酶的非水液或水漿(例如非離子劑、醇類等)，或者二者的結(jié)合。
適合的多孔核芯材料包括蘇打、NaCl和硅石并有商品供應(yīng)。多孔核芯材料的制備最好是用EP-A-0542351中所述的方法。
將酶溶液施于多孔核芯材料上可使用各種方法，它們均為現(xiàn)有技術(shù)中所知，例如使用混合裝置或流化床或混合器-流化床干燥器聯(lián)用裝置。步驟(b)和(c)可以適宜地結(jié)合起來。
需要時(shí)，可將一個(gè)或多個(gè)保護(hù)涂層施于核芯上以得到無粉塵的含酶粒子。適合的涂覆材料常見于文獻(xiàn)中，例如JP 58-179492A和EP-A-0193829。它們包括纖維素涂料或含羥丙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和/或羥乙基纖維素的纖維素基涂料。也可以使用如EUDRAGIT(R)(Rhm Pharma)的丙烯酸類聚合物。涂料的施用量可在相當(dāng)大的范圍內(nèi)變化，但通常在0.1和25wt％之間。纖維素基涂料最好在5和25wt％之間。
可利用涂層將其它有用的化合物加于顆粒上，甚至可以制備各涂層有不同功能(例如穩(wěn)定存在的化合物、著色等)的多涂層顆粒。
在本領(lǐng)域技術(shù)人員比較了解的某些應(yīng)用中是適宜地使用能緩慢溶解或緩慢釋放被吸收的酶的多孔核芯材料。此技術(shù)與涂覆技術(shù)相結(jié)合可使顆粒組合物能按需要依次釋放幾種化合物。例如將蛋白酶吸收于多孔核芯中、將脂酶涂覆在核芯上、最后將涂料層施于顆粒上的顆粒。
按本發(fā)明制備酶顆粒的整個(gè)過程(吸收、涂料和其它化合物的涂覆)可在同一設(shè)備中適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，例如在混合器或流化床中進(jìn)行。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是，當(dāng)方法的完成不只一個(gè)步驟時(shí)，在設(shè)備之間運(yùn)送顆粒時(shí)降低了(酶)粉塵的形成。此外，酶溶液或水漿在多孔顆粒中的吸收較之例如在流化床中將酶溶液或水漿噴在核芯上或?qū)⒚概c多孔載體混合要快得多。
以本發(fā)明的多孔材料也可以用其它技術(shù)得到依次的或受控的化合物釋放，而不需調(diào)節(jié)涂層的組成或位置。
下面的實(shí)施例的提出只是為了進(jìn)行說明，而非對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
實(shí)驗(yàn)方法在實(shí)施例中所用的蛋白酶是高堿性蛋白酶PB92。(見USPNo.Re 30,602)，可從Gist-brocades N.V.購(gòu)得，商標(biāo)為MAXACAL。
實(shí)施例中所用的脂酶，可由類產(chǎn)堿假單胞菌(Pesudomonas pseudoalcaligenes)M-1(CBS 473.85)菌株得到(見例如EP-B-0218272；USP Nos.4,933,287和5,153,135)。
實(shí)施例中所用的凝乳酶是用用乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Lactis)的轉(zhuǎn)化酵母菌株生產(chǎn)的，并可自Gits-brocades N.V.購(gòu)得，商標(biāo)為MAXIREN(R)(見例如EP-B-0096430和EP-B-0301669，以及USP No.4,859,596)。
實(shí)施例1從AKZO N.V.分別得到孔隙率為6(Soda ash Denes(R))、16(Soda ash Compact(R))和38％(Soda ash Sorbent(R))的蘇打(Soda)核芯，將其過篩后得到粒徑為315-710μm的粒子。
分別將乙二醇和丙二醇加入濃的蛋白酶水溶液中以生產(chǎn)酶液，然后蒸發(fā)酶液中的水使含水量降至約10％。液體中蛋白酶濃度為3.7MADU/g(＝3.7×106ADU/g)。將此液體噴在蘇打粒子上。根據(jù)粒子的孔隙率水平使粒子完全以液體充填。
噴霧和吸收是在一旋轉(zhuǎn)容器中進(jìn)行的(酶液的進(jìn)口溫度為30-50℃)。然后將此材料基本上按JP-58-179492A或EP-A-0193829所述的方法在流化床干燥器中進(jìn)行包覆，并制得無粉塵的酶顆粒。
生產(chǎn)出的乙二醇、丙二醇、PEG 400和甘油的非水蛋白酶溶液的蛋白酶活性在3.4至3.7MADU/g之間。液體的吸收過程得到的酶產(chǎn)率是基于酶活性的61％至98％，決定于非水溶液中的含水量。試驗(yàn)分別用6％、16％和38％孔隙率的蘇打(見上述)進(jìn)行。
在加入含蛋白酶的液體后，在一流化床涂覆器中(入口空氣溫度為65℃，出口溫度為40℃)包覆離子。大量生產(chǎn)的得率很好，并保持高的酶活性滯留。
實(shí)施例2按實(shí)施例1的相同方法制備蛋白酶顆粒，但用多孔的NaCl核芯以代替蘇打核芯。NaCl核芯的制備基本上按EP-A-0542351中所述的方法，其孔隙率為15％，并將其充填以含活性為3.4MADU/g的含蛋白酶非水液體，得到活性為440,000ADU/g(酶產(chǎn)率＞97％)的顆粒。經(jīng)在與上述相同的條件在流化床中以纖維素基涂料(20％w/w)包覆后，得到活性為397.500ADU/g的包覆顆粒，大量生產(chǎn)的得率很好(＞92％)。
實(shí)施例3從凝乳酶進(jìn)行相似實(shí)驗(yàn)。將凝乳酶溶于丙二醇，液體能很好地被多孔NaCl吸收，可達(dá)NaCl重量的15％，有同樣好的酶產(chǎn)率和多孔材料負(fù)荷。
實(shí)施例4將粒徑為300-710μm的多孔核芯材料(Soda ashCompact(R)，600g)導(dǎo)入流化床干燥器并于38℃將含脂酶和非離子劑(Triton X114(R))的乙二醇溶液導(dǎo)入并噴在多孔粒子上。蒸發(fā)掉水分，非離子劑和脂酶被粒子吸收，再將涂料噴在粒子上，得到無粉塵的顆粒。
實(shí)施例5按與實(shí)施例4相似的方法制備了蛋白酶顆粒。將含蛋白酶的乙二醇和丙二醇溶液分別直接噴入流化床中流化的多孔材料(粒徑在400-600μm之間)之頂部。當(dāng)?shù)鞍酌溉苡谝叶己捅己?，液體均能被材料很好地吸收。
在流化床涂覆器中施以附加的纖維素基涂料(Seppic的SEPIFILM(R)后，并過300和600μm篩，粉塵水平進(jìn)一步降低。
按上述相似方法制備的并包覆纖維素基涂料(20％w/w)的四個(gè)蛋白酶顆粒樣品在Heubach磨耗試驗(yàn)儀中進(jìn)行粉塵形成試驗(yàn)(見WO 93/07263)。在此試驗(yàn)中，酶的粉塵水平低于0.5mg/20g為極低；總粉塵數(shù)值低于10mg/20g也為極低。結(jié)果給于表1。
表1四種涂覆的蛋白酶成顆粒狀的樣品的Heubach磨耗水平
<p>可以看出，在試驗(yàn)條件下未包覆的顆粒是被擦污涂抹的。與之相對(duì)照，包覆的粒子除了其低的粉塵水平外足以經(jīng)受Heubach磨耗試驗(yàn)中鋼球的粉碎力。
實(shí)施例6以非水蛋白酶溶液充填不同的多孔核芯材料(蘇打、NaCl和硅石)；用乙二醇、丙二醇作為溶劑。
Soda ash Sorbent(R)(見實(shí)施例1)吸收液體可達(dá)3.7wt％(基于蘇打重量計(jì)算)；所用的NaCl可吸收其重量的15％；硅石可吸收100％。
表2所示是各種含酶液體被各種核芯材料吸收后的殘酶活性。
表2不同的多孔材料部分和完全負(fù)載后測(cè)定的蛋白酶產(chǎn)率
實(shí)施例7用各種非水液體得到的材料在7℃(和環(huán)境相對(duì)濕度)下對(duì)其蛋白酶穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)。表3所示為蘇打吸收蛋白酶的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。
表3吸收的蛋白酶在表列時(shí)間的穩(wěn)定性
*EG＝乙二醇，PG＝丙二醇，PEG＝聚乙二醇400
本申請(qǐng)說明書中所述的所有出版物(包括專利和專利申請(qǐng))對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平是指示性的。文中所有的出版物在此均可用作參考，正如具體指出的個(gè)別出版物在此作為參考一樣。
雖然本發(fā)明為了能被清楚地理解而以說明及實(shí)施例進(jìn)行了一定程度的詳細(xì)敘述。但很明顯，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不脫離所附權(quán)利要求書的精神和范圍情況下可對(duì)其做出的許多改變或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種顆粒，其中核芯由多孔材料組成，存在于顆粒中的(部分)酶被核芯所吸收。
2.權(quán)利要求1的顆粒，該顆粒包覆了一層保護(hù)外層。
3.一種顆粒，其中核芯由多孔材料組成，存在于顆粒中的(部分)酶被核芯所吸收，該顆粒包覆了數(shù)層涂層，這些涂層含有例如(其它的)酶、穩(wěn)定劑著色劑和控制化合物釋放的層。
4.一種生產(chǎn)無粉塵酶顆粒的方法，該顆粒由多孔材料組成，并使之與酶和水溶液或非水溶液或水漿接觸，因而使酶被顆粒吸收；需要時(shí)將顆粒用保護(hù)外層或數(shù)層涂層包覆以便得到權(quán)利要求2和3中所述的產(chǎn)品。
5.權(quán)利要求4的方法，其中的顆粒由多孔材料組成并使之與酶的水溶液或非水溶液或水漿接觸，使酶在混合器中被顆粒所吸收。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的設(shè)備是流化床干燥器。
7.權(quán)利要求4的方法，其中的顆粒以一保護(hù)外層或數(shù)層涂層包覆以便得到在混合器中進(jìn)行包覆的權(quán)利要求2和3中所述的產(chǎn)品。
8.權(quán)利要求7的方法，其中包覆是在流化床干燥器中進(jìn)行的。
9.權(quán)利要求4的方法，其中整個(gè)過程是在同一設(shè)備中完成的。
10.權(quán)利要求9的方法，其中整個(gè)過程是在流化床干燥器中完成的。
11.一種包含了多孔載體的涂層，該涂層由變性纖維素(混合物)和添加劑組成，其中加入了一種或多種化合物以防止包覆過程中顆粒產(chǎn)生附聚和粘結(jié)。
12.權(quán)利要求11的涂層，其中所加入的化合物是滑石。
13.在載有含酶的水或非水液體的多孔材料上涂覆涂層，其粒子的強(qiáng)度顯著增加。
全文摘要
提供了有改良性能的酶顆粒，它基于有好的孔徑和孔徑分布的核芯粒子，以使酶溶液進(jìn)入粒子。核芯材料包括液態(tài)形狀的酶，因而無加工粉狀酶的缺點(diǎn)。它仍可得到好的流動(dòng)性和計(jì)量性，含酶顆粒最好以成膜大分子材料包覆。顆粒具有低粉塵度和改進(jìn)的機(jī)械強(qiáng)度。本發(fā)明也提供制備酶顆粒的方法。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1110059SQ94190299
公開日1995年10月11日 申請(qǐng)日期1994年5月18日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月18日
發(fā)明者C·S·M·安德拉, J·費(fèi)杰, M·迪利塞恩 申請(qǐng)人:吉斯特—布羅卡迪斯有限公司