專(zhuān)利名稱(chēng)：聚合酶鏈反應(yīng)查結(jié)核菌標(biāo)本前處理新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從臨床標(biāo)本中純化提取結(jié)核菌DNA(核糖核酸)的方法，特別是一種聚合酶鏈反應(yīng)查結(jié)核菌標(biāo)本前處理新方法。
目前，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(簡(jiǎn)稱(chēng)PCR)檢出結(jié)核菌的操作較為復(fù)雜。該方法是用耐高溫的聚合酶把結(jié)核菌DNA片斷擴(kuò)增105-107倍后，標(biāo)記熒光素電泳得出結(jié)果。其在擴(kuò)增前的標(biāo)本前處理階段非常重要，它將直接影響檢測(cè)結(jié)果的正確與否?，F(xiàn)行標(biāo)本前處理的方法少，不統(tǒng)一，試劑多，難掌握，影響PCR工作推廣應(yīng)用。如痰標(biāo)本中粘蛋白液化不好很難清除，造成結(jié)核菌DNA提取不完全;又如結(jié)核菌擴(kuò)增前需把堅(jiān)硬的類(lèi)脂質(zhì)細(xì)胞壁破壞掉，使DNA釋放出來(lái)，但傳統(tǒng)的破壁方法采用溶菌酶，該方法步驟多，難于成功，且需時(shí)間長(zhǎng)。另外藥物被污染、空氣清潔度影響等因素易引起假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果，缺少對(duì)PCR全過(guò)程的質(zhì)量控制。上述諸多原因致使PCR查結(jié)核菌的結(jié)果可靠性差，易造成誤診或延誤治療時(shí)間，因此，改進(jìn)標(biāo)本前處理方法已勢(shì)在必行。
本發(fā)明的目的是提供一種聚合酶鏈反應(yīng)查結(jié)核菌標(biāo)本前處理新方法，它操作簡(jiǎn)便，節(jié)約試劑，可使標(biāo)本中結(jié)核菌DNA提取快速、完全，明顯提高標(biāo)本前處理質(zhì)量和降低成本，確保PCR全程結(jié)果穩(wěn)定可靠。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的采用臨床標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理和前處理，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物和陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物作相應(yīng)前處理，具體步驟是a、預(yù)處理將臨床標(biāo)本離心分離后，取上清液或沉淀物備用;
b、前處理取同體積的預(yù)處理標(biāo)本、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物、陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物分裝各試管中，在各試管中分別加入十二烷基磺酸鈉液、氫氧化鈉液，其體積比均為20∶1∶1，于95-100℃下水溶15-20分鐘，然后在各試管中分別加入與其總體積量相同的酚/氯仿液，反復(fù)顛倒混合均勻，在4℃下高速離心10分鐘后靜止;靜止分離后取各上層水相分移新試管中，在各試管中分別加入與水相體積相同的酚/氯仿液，再反復(fù)顛倒混合均勻，于4℃下高速離心10分鐘后靜止;靜止分離后取各上層水相分移新試管中，在各試管中分別加入與水相體積相同的氯仿/異戊醇液，反復(fù)顛倒混合均勻，4℃下高速離心10分鐘后靜止;靜止分離后取各上層水相分移新試管中，在各試管中先分別加入水相體積1/10的醋酸鈉，再分別加入其總體2-2.5倍的無(wú)水乙醇，混勻置入-20℃下冷凍12小時(shí)以上，最后在4℃下高速離心30分鐘后，棄上清液，將各沉淀物分別加入三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉液20-50μl，混溶沉淀待擴(kuò)增。
由于本發(fā)明直接采用配制好的置于試劑盒中的試劑，分別對(duì)各種臨床進(jìn)行預(yù)處理和前處理，所以既統(tǒng)一了試劑，簡(jiǎn)化了檢定結(jié)核菌DNA分離純化工藝，操作穩(wěn)定，使DNA提取快速完全，無(wú)須專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)即可很容易掌握，又因直接采用統(tǒng)一試劑，操作方便，節(jié)約試劑，故可減少試劑配制過(guò)程中的危險(xiǎn)性，降低成本。本發(fā)明的方法同用溶菌酶的方法相比，具有步驟簡(jiǎn)單，明顯縮短破壞結(jié)核菌堅(jiān)硬的類(lèi)脂質(zhì)厚壁的時(shí)間，充分釋放出DNA，溶菌酶方法需3-4小時(shí)，而本方法只需15-20分鐘，進(jìn)一步節(jié)省了試劑。特別指出的是本發(fā)明的方法采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制辦法檢定前處理的質(zhì)量好壞，明顯提高標(biāo)本前處理質(zhì)量，從而確保PCR全程獲得最理想的結(jié)果。本發(fā)明的方法非常適于基層防癆和醫(yī)療單位廣泛應(yīng)用。它以處理痰標(biāo)本為主，同時(shí)還可以處理胸水、腦脊液、尿、膿汁等臨床標(biāo)本。利用該方法配合擴(kuò)增儀就可以進(jìn)行PCR檢定工作，并使該項(xiàng)工作所用時(shí)間較原培養(yǎng)方法所用8-49天，平均14天，縮短為2天，它為結(jié)核病人的診斷和鑒別診斷及治療贏得了寶貴的時(shí)間。
以下結(jié)合實(shí)施方法對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
首先制作臨床標(biāo)本前處理試劑盒，即在試劑盒內(nèi)將試劑按操作順序裝入相應(yīng)瓶?jī)?nèi)待用。其中有T·E·N液(三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉，其體積比5∶2∶5)、DTT液(二-硫基蘇糖醇)、SDS液(十二烷基磺酸鈉)、NaOH液、酚/氯仿液(其體積比1∶1)、氯仿/異戊醇液(其體積比24∶1)、T·E液(三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉，其體積比5∶1)、NaAc液(醋酸鈉)、無(wú)水乙醇。上述各試劑按量配制裝入專(zhuān)用試劑盒內(nèi)，操作時(shí)可直接使用。另外在試劑盒內(nèi)還裝有陰性、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物。其中陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物選用T·E·N液，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物是將純培養(yǎng)的人型結(jié)核菌以0.5%吐溫80生理鹽水稀釋?zhuān)瑑?yōu)選出與標(biāo)準(zhǔn)模板濃度含量相一致的物品，經(jīng)100℃滅菌30分鐘后，冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行臨床標(biāo)本前處理的過(guò)程中，陰性、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物與標(biāo)本同時(shí)處理，并一同進(jìn)行擴(kuò)增，再以標(biāo)準(zhǔn)模板對(duì)比，就可以以其結(jié)果分析評(píng)價(jià)每次標(biāo)本前處理的質(zhì)量。
1、痰標(biāo)本的前處理
a、預(yù)處理將痰標(biāo)本與T·E·N液、DTT液以體積比5∶5∶1的量置入試管中，室溫下充分液化約30分鐘;在80℃下水浴30分鐘后，離心(3000rpm)后，10分鐘取上清液備用。上清液的用量根據(jù)需要確定。
b、前處理取同體積的預(yù)處理后的上清液、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物、陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物分別裝入試管中，在各試管中分別加入SDS液、NaOH液，其體積比均為20∶1∶1。于95-100℃下水浴15-20分鐘，然后在各試管中分別加入與其總體積量相同的酚/氯仿液，反復(fù)顛倒混合均勻，在4℃下高速離心(8000-10000rpm)10分鐘后靜止，靜止分離后取各上層水相分別移至新試管，于各試管中分別加入與水相體積相同的酚/氯仿液，再反復(fù)顛倒混合均勻，同樣在4℃下高速離心10分鐘后靜止;靜止分離后取各上層水相分別移至新試管，于各試管中分別加入水相體積相同的氯仿/異戊醇液，反復(fù)顛倒混合均勻，4℃下高速離心(8000-10000rpm)10分鐘后靜止，靜止分離后取各上層水相分別移至新試管，于各試管中分別加入水相體積1/10的NaAc液，再分別加入其總體積的2-2.5倍的無(wú)水乙醇，混勻置入-20℃冷凍12小時(shí)以上，最后在4℃下高速離心30分鐘，棄上清液，將沉淀物加入T·E液20-50μl(視沉淀物量多少而定)，混溶沉淀待擴(kuò)增，即完成前處理全過(guò)程。
2、腦脊液、尿標(biāo)本的前處理a、預(yù)處理將腦脊液、尿標(biāo)本適量離心(1000rpm)1分鐘，取上清液高速離心(7000-8000rpm)10分鐘靜止，倒掉靜止后的上清液，將沉淀物懸浮于600μlT·E液中備用。T·E液的用量可視沉淀物的多少增減。
b、前處理取同體積懸浮于T·E液中的沉淀物、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物、陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物分裝各試管中，在各試管中分別加入SDS液、NaOH液，其體積比均為20∶1∶1，于95-100℃下水浴15-20分鐘。其余操作步驟同上例痰標(biāo)本的前處理的相應(yīng)步驟。
3、胸膚水、膿汁的前處理a、預(yù)處理將胸膚水、膿汁標(biāo)本作倍量稀釋?zhuān)x心(1500rpm)1分鐘，取上清液備用。
b、前處理取同體積預(yù)處理后的上清液、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物、陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物分裝各試管中，在各試管中分別加入SDS液、NaOH液，其體積比均為20∶1∶1，于95-100℃下水浴15-20分鐘。其余操作步驟同上例痰標(biāo)本的前處理的相應(yīng)步驟。
本發(fā)明首次提出在聚合酶鏈反應(yīng)(即PCR)查結(jié)核菌全過(guò)程中，采用陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物與臨床標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行前處理，并配以擴(kuò)增儀同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，再以標(biāo)準(zhǔn)模板(市售)對(duì)比，就可以監(jiān)測(cè)臨床標(biāo)本前處理的質(zhì)量，使PCR全程獲滿(mǎn)意之結(jié)果。下表即可從標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物擴(kuò)增情況進(jìn)行分析對(duì)比。
類(lèi)別結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物+--+-+陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物---++-標(biāo)準(zhǔn)模板+-++--情況分析處理擴(kuò)增前處理假陽(yáng)性擴(kuò)增不良標(biāo)準(zhǔn)模良好不良不良存在與污染板不好根據(jù)上述分析對(duì)比，就可以以其結(jié)果分析評(píng)價(jià)每次標(biāo)本前處理的質(zhì)量，從而確定PCR全程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，使檢出陽(yáng)性率有了質(zhì)理保證。
權(quán)利要求
1.一種聚合酶鏈反應(yīng)查結(jié)核菌標(biāo)本前處理新方法，其特征是采用臨床標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理和前處理，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物和陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物作相應(yīng)前處理，具體步驟是a、預(yù)處理將臨床標(biāo)本離心分離后，取上清液或沉淀物備用；b、前處理取同體積的預(yù)處理標(biāo)本、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物、陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物分裝各試管中，在各試管中分別加入十二烷基磺酸鈉液、氫氧化鈉液，其體積比均為20∶1∶1，于95-100℃下水溶15-20分鐘，然后在各試管中分別加入與其總體積量相同的酚/氯仿液，反復(fù)顛倒混合均勻，在4℃下高速離心10分鐘后靜止；靜止分離后取各上層水相分移新試管中，在各試管中分別加入與水相體積相同的酚/氯仿液，再反復(fù)顛倒混合均勻，于4℃下高速離心10分鐘后靜止；靜止分離后取各上層水相分移新試管中，在各試管中分別加入與水相體積相同的氯仿/異戊醇液，反復(fù)顛倒混合均勻，4℃下高速離心10分鐘后靜止；靜止分離后取各上層水相分移新試管中，在各試管中先分別加入水相體積1/10的醋酸鈉，再分別加入其總體2-2.5倍的無(wú)水乙醇，混勻置入-20℃下冷凍12小時(shí)以上，最后在4℃下高速離心30分鐘后，棄上清液，將各沉淀物分別加入三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉液20-50μl，混溶沉淀待擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用酚/氯仿液中的酚與氯仿體積比1∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用氯仿/異戊醇液中的氯仿與異戊醇體積比24∶1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述三羥甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸二鈉液中的三羥甲基氨基甲烷與乙二胺四乙酸二鈉體積比5∶1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物是將純培養(yǎng)的人型結(jié)核菌以0.5%吐溫80生理鹽水稀釋?zhuān)瑑?yōu)選出與標(biāo)準(zhǔn)模板濃度含量相一致的物品，經(jīng)100℃滅菌30分鐘后，冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用陰性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物選用三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉液中的三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉與氯化鈉體積比5∶2∶5。
全文摘要
本發(fā)明提供一種聚合酶鏈反應(yīng)查結(jié)核菌標(biāo)本前處理新方法。該方法采用臨床標(biāo)本前處理試劑盒中的試劑，對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理和前處理，使結(jié)核菌DNA提取完全，將結(jié)核菌擴(kuò)增前堅(jiān)硬的類(lèi)脂質(zhì)細(xì)胞壁破壞掉，使DNA快速釋放出來(lái)，與此同時(shí)對(duì)陽(yáng)性、阻性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控物與臨床標(biāo)本也一同作相應(yīng)前處理，并同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，再以標(biāo)準(zhǔn)模板對(duì)比，來(lái)分析評(píng)價(jià)每次標(biāo)本前處理的質(zhì)量。它操作簡(jiǎn)便，節(jié)約試劑，明顯提高標(biāo)本前處理質(zhì)量和降低成本，可使PCR全程結(jié)果穩(wěn)定可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1071954SQ9211188
公開(kāi)日1993年5月12日 申請(qǐng)日期1992年11月20日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月20日
發(fā)明者張欣然, 鄂曉軒, 李明蘭, 趙華云 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)市胸科醫(yī)院