專利名稱：鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝。
金屬硫蛋白是1957年發(fā)現(xiàn)的，含有鎘及鋅的蛋白質(zhì)是從馬的腎臟中分離出來的，以后實質(zhì)相同的蛋白質(zhì)從兔、牛、羊等動物中分離，馬的金屬硫蛋白的分子量為6000-7000，金屬含量高，它含有61個氨基酸殘基，不含芳香族氨基酸，在61個氨基酸殘基中有20個半胱氨酸，在第一屆金屬硫蛋白國際會議上，確定了具有上述特性并和馬腎的金屬硫蛋白相似的蛋白質(zhì)為金屬硫蛋白(MT)，由于MT具有的結(jié)構特征，決定了它具有極其重要的生理功能，MT在人體中參與微量元素的儲存、運輸和代射，參與激素和發(fā)育過程的調(diào)節(jié)，增強機體對應激的適應，能夠清除自由基及抗電離輻射等，隨著人們對MT的深入研究，其用途日益廣泛，那么對于MT的需求，不再是試驗室的方法，一次提取幾十微克，這遠遠不能滿足社會對MT的需求，因此有必要提供一種批量制取金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明目的是提供一種批量地生產(chǎn)鋅金屬硫蛋白(ZnMT)的工藝，利用本工藝，可使ZnMT的得率高，生產(chǎn)容易操作，效率高。
為達到上述目的，本發(fā)明采用以下幾個步驟(1)誘導將哺乳動物(兔、羊)注射ZnCL2，注射量逐漸上升，注射量在10-80mg/kg體重，誘導期大約8天;(2)粗提將經(jīng)誘導的動物屠宰取肝，用生理鹽水清洗，稱重，加入予冷的含乙醇的混合液，勻漿、超聲波粉碎，離心分離去沉淀，上清液內(nèi)滴加予冷的無水乙醇，乙醇最終濃度約75%(體積比)，靜置并離心分離，得沉淀，將沉淀以緩沖液溶解，分離去沉渣，得到棕黃色上清液為乙醇粗提物;(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，上樣量為柱床體積的20-30%，經(jīng)洗脫分離，收集第二個無色峰即為含鹽的總金屬硫蛋白(MT);(4)濃縮脫鹽將(3)得到的總MT于超過濾下濃縮脫鹽;(5)分裝、凍干得產(chǎn)品。
濃縮脫鹽步驟中，除了采用超過濾進行濃縮脫鹽外，還可以通過真空冷凍濃縮，經(jīng)層析脫鹽。除了上述獲得總MT外，還可以將步驟(3)得到的總MT經(jīng)真空冷凍濃縮或超濾濃縮后，再按柱床體積的10-20%上層析柱，經(jīng)緩沖液直線梯度洗脫，收集MT-1，MT-2，然后分別濃縮脫鹽、分裝、凍干，獲得分型的MT產(chǎn)品。
本發(fā)明的優(yōu)點是本工藝中，采用ZnCl2作為誘導劑，由于ZnCl2無毒性，所用劑量大于CdCl2、ZnSO4等，使得哺乳動物的肝臟產(chǎn)生更多的MT;在破碎上采用組織搗碎和超聲波破碎相結(jié)合，有利于MT的提取，可提高MT的得率;為實現(xiàn)批量生產(chǎn)，采用先濃縮后層析分離工藝;利用超過濾濃縮除鹽，減少液態(tài)停留時間，降低MT二聚體的聚合率;在成品上采用分裝凍干，以達到批量生產(chǎn)的目的。
實施例1(1)誘導取家兔一只，重3kg，于第一、二、四、七天分四次皮下注射ZnCl2懸浮液，每次注射量第一次60mg，第二、三次分別為105mg，第四次150mg，每次體積不大于2ml，于第九天屠宰動物，取肝臟。
(2)粗提肝臟用生理鹽水洗滌后，稱重約100g，加入予冷的混合液55ml，混合液組成是0.01MTris-Hcl，PH8.6無水乙醇氯仿＝1∶00∶1.03∶0.08(體積比)，勻漿5分鐘后，在超聲波下處理5分鐘，4℃，15000g離心30分鐘，除去沉淀。上清液在磁力攪拌下滴加-20℃予冷的無水乙醇，使乙醇最終濃度達75%(體積比)，置20℃冰柜內(nèi)過夜(12-20小時)，靜置下吸去上清液約70%，余下液體離心分離，沉淀用20ml0.01MTris-HclPH8.6緩沖液溶解，再用4℃12000g離心分離去沉渣，棕黃色上清液即為乙醇粗提物(約35ml)。
(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，由(2)得到的乙醇粗提物直接上用0.01MPH8.6的Tris-Hcl緩沖液平衡好的SephadexG-50柱(4.5×130cm)，上樣量為柱床體積的20-30%，并用同一緩沖液進行洗脫分離，在波長254nm的監(jiān)測下收集第二個無色的峰，此峰即為含鹽的總金屬硫蛋白(MT)約200ml。
(4)濃縮脫鹽，將(3)得到的總MT于超濾下濃縮脫鹽，使體積達到100ml的濃縮液。
(5)濃縮液經(jīng)分裝、凍干得到成品重為140mg。
實施例2(1)誘導取家兔一只，重4kg，于第一、二、四、七次皮下注射ZnCl2懸浮液，其注射量是第一次100mg，第二、三次160mg，第四次240mg，注射體積不大于2ml。
(2)粗提其操作條件與實施例1相同。
(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，其操作條件與實施例1相同。
(4)濃縮脫鹽采用真空冷凍干燥后，加20ml(NH4)2CO3溶解成溶液或真空冷凍濃縮成約20ml溶液，再用0.01M(NH4)2CO3溶液平衡好的SephadexG-50(35×120cm)并以此溶液進行層析脫鹽。
(5)分裝、凍干制得成品重為150mg。
實施例3(1)、(2)、(3)的操作條件與實施例2相同。
由(3)得到的總金屬硫蛋白(MT)以超濾濃縮30分鐘后，上用0.01M、PH8.6的Tris-Hcl緩沖液平衡好的DEAESepharoseA50柱(或DEAESepharoseFastFlow柱)進行直線洗脫(洗脫液濃度可在0.01M-0.35M之間)，在波長為254nm的監(jiān)測儀監(jiān)測下逐一收集MT-1，MT-2峰，然后以實施例1、2方法濃縮脫鹽、分別分裝、凍干即為成品。
權利要求
1.一種鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于它包括以下幾個步驟(1)誘導將哺乳動物(兔、羊)注射ZnCl2，誘導期約8天，注射量控制在10mg/kg體重-80mg/kg體重之間，并逐次增大；(2)粗提將經(jīng)誘導的動物屠宰取肝，用生理鹽水清洗、稱重，加入予冷的含乙醇的混合液，勻漿、超聲波粉碎處理，離心分離去沉淀，上清液內(nèi)滴加予冷的無水乙醇，控制乙醇的最終濃度約達75%(體積比)，靜置并離心分離，得沉淀，將沉淀以緩沖液溶解，分離去沉渣，得棕黃色上清液為乙醇粗提物；(3)柱層析分離上述金屬硫蛋白(MT)，上樣量為柱床體積的20-30%，經(jīng)洗脫分離，收集第二個無色峰即為含鹽的總金屬硫蛋白(MT)；(4)濃縮脫鹽將(3)得到的總MT于超過濾下濃縮脫鹽；(5)分裝、凍干得產(chǎn)品。
2.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的予冷的含乙醇的混合液為0.01MTris-Hcl，PH8.6∶無水乙醇∶氯仿＝1.00∶1.03∶0.08(體積比)，其用量為100g肝臟加入50-200ml混合液。
3.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的勻漿后用超聲波粉碎3-10分鐘，粉碎的漿液的離心分離采用4℃，10000-20000g離心30分鐘;加無水乙醇后的離心分離采用4℃，10000-20000g離心分離。
4.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的濃縮脫鹽采用真空冷凍濃縮后，經(jīng)層析柱層析脫鹽。
5.按權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的由(3)得到的總MT用真空冷凍濃縮或超濾方法濃縮后，按柱床體積的10-20%上層析柱，經(jīng)緩沖液直線梯度洗脫，收集MT-1、MT-2，然后分別濃縮脫鹽，分裝、凍干即為分型的產(chǎn)品。
全文摘要
一種鋅金屬硫蛋白的生產(chǎn)工藝，它包括以下幾個步驟(1)誘導將哺乳動物注射ZnCl
文檔編號A23J1/00GK1085045SQ92111198
公開日1994年4月13日 申請日期1992年9月30日 優(yōu)先權日1992年9月30日
發(fā)明者王金琪, 陸靜玫, 薛小平, 王祖榮, 任道生, 李旭, 唐心利 申請人:北京市科學技術研究院