專利名稱：細胞生長抑制因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制細胞增生，尤其是抑制人體乳房癌細胞增生的蛋白質(zhì)生長因子。
在不斷探索改進治療癌癥方法方面，防治腫瘤細胞生長而對宿主有機體無嚴重副作用已成為人們長期以來的研究目標。人們早就認為，造成贅生細胞增生的部分原因可能是由于多肽生長因子的畸形表達。從而導致贅生細胞群體的自刺激。因此，能夠抑制生長因子的天然細胞抑制因子的鑒定可能對了解和控制贅生細胞的發(fā)展來說是必不可少的。
由于腫瘤細胞的異質(zhì)性，即腫瘤內(nèi)的所有細胞對所給藥物的反應(yīng)可能不全相同，所以腫瘤對治療藥物的反應(yīng)各有不同。細胞生長調(diào)節(jié)肽往往具有多重生物活性，包括生長刺激活性和生長抑制活性，這兩種活性決定于靶細胞的類型。具體而言，各種生長調(diào)節(jié)多肽，如干擾素、腫瘤壞死因子α、白細胞間素和轉(zhuǎn)移生長因子α和轉(zhuǎn)移生長因子β，均具有抑制某些腫瘤細胞增生的活性。這些多肽可以單獨的、相加的和協(xié)同的作用方式對腫瘤細胞增生產(chǎn)生抑制作用。
在體外具有相加和協(xié)同作用的細胞生長抑制因子的結(jié)合，在體內(nèi)對腫瘤塊中或不同轉(zhuǎn)移部位的腫瘤細胞亞群具有選擇性抑制作用，從而從整體上大大減少腫瘤細胞的數(shù)量，其療效遠遠超過目前治療用的藥物。為此，引起了人們對研究生長調(diào)節(jié)分子結(jié)合的興趣，這些分子結(jié)合使用，可以抑制腫瘤細胞的生長，從而可以降低個別多肽的有效劑量和減少可能同個別多肽的較高濃度有關(guān)而引起的不需要的副作用。
本申請的對比文獻有Hirano等報導的BSF-2的DNA序列(Nature(186)324，73-76;Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84，228-231)。Billiau介紹的IFN-β2的性質(zhì)，尤其是其能促進β細胞的生長和分化的性質(zhì)(ImmunologyToday(1987)8，84-87。May等報導的β2-IFN序列(Proc.Nat1.Acad.Sci.USA(1986)83，8957-8961)。Sehgal等介紹的β-INF和BSF-2的一致性(Scicnce(1987)235，731-732)。
本發(fā)明提供的名為BCIF的細胞生長抑制因子可用作贅生細胞，尤其是人體乳房癌細胞增生的抑制因子。BCIF可單獨使用或者與具有抗贅生活性的其他生長因子結(jié)合使用。BCIF的特征可從人體肺癌細胞得到，其分子量約21000道爾頓，能抑制贅生細胞的生長。生長因子的片段可用于產(chǎn)生抗體，這種抗體具有降低抑制作用或其本身就能用于產(chǎn)生具有生長抑制活性的抗個體基因型抗體。


圖1表示提高BCIF在乳房癌細胞系中的濃度可增加對細胞生長的抑制作用。
圖2表示使用TBFβ和BCIF相結(jié)合與僅用其中的一個多肽進行比較，顯示它們對抑制人體黑素瘤細胞增生的作用。
本發(fā)明提供了包括BCIF及其片段的組合物以及制備和使用這些組合物的方法。細胞生長抑制因子BCIF的特征是由人體肺癌細胞系H-2981產(chǎn)生的。BCIF的進一步特征是經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析測定，其分子量約為21000道爾頓，具有單獨或至少與一個其他能抑制贅生細胞增生的生長因子結(jié)合來抑制贅生細胞的生長。這種結(jié)合對抑制細胞生長的作用可以是相加作用，也可以是協(xié)同作用。
BCIF的部分氨基酸順序如下V-P-P-G-E-D-S-K-D-V10A-A-P-H-R-Q-P-L-T-S20S-E-R-I-D-K-Q-I-R-Y30L-L-D-G34上述順序系使用各個氨基酸的一個字母的氨基酸縮寫符號。BCIF的這個氨基酸順序與Hirano等報導的BSF-2成熟蛋白質(zhì)因子的氨基末端的氨基酸殘基2-35相同(Nature(1986)324，73-76)，其與May等報導的氨基酸30-63的IFN-β2順序相同(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83，8957-8961)。
BCIF可通過各種途徑得到。它從天然發(fā)生源可以獲得，例如從癌細胞系可以得到。這種細胞系的一個實例是H-2981，這是一個人體肺癌細胞系，大量出版物已有介紹，例如Hellstrom等在Proc.Natl.Acad.SciUSA(1986)83，7059-7063中所作的介紹。癌細胞在已知支承它們增生的生長培養(yǎng)基中生長，從培養(yǎng)基中分離得到BCIF。
BCIF可采用各種純化技術(shù)純化成基本游離的細胞組分。這些純化技術(shù)可以包括溶劑提取、凝膠滲透色譜、反相HPLC、電泳技術(shù)等。特別可用的技術(shù)是采用不同于BSF-2和INF-β2的BCIF-2區(qū)的抗體特異性的親和色譜法。這類抗體可采用人工合成具有特征區(qū)的免疫原(肽類)進行制備。其他特殊技術(shù)在下述實施例中介紹?？梢圆捎酶鞣N合成技術(shù)合成具有抑制活性的活性片段，其中有在固體載體上合成多肽，或通過切割整個BCIF分子或其片段進行制備。有許多現(xiàn)成的商業(yè)性的合成物，而且使用頗為有利，例如可從SmithKlineBeckman;AppledBiosystems等可得到。
BCIF及其片段也可采用重組技術(shù)制備，氨基酸順序可用于設(shè)計探查物，由刺激H-2981癌細胞得到的cDNA庫或基因庫可用來鑒別雜交順序。為了提高鑒定正確順序的可能性，可以用由肺癌細胞或不產(chǎn)生BCIF的其他有關(guān)細胞系中得到的cDNA庫進行雜交。將由H-2981細胞得到的這些順序集中為所需順序，但這些H-2981細胞不能雜交成非BCIF產(chǎn)生者的順序。雜交得到探查物并且不與不產(chǎn)生BCIF的細胞中的cDNA雜交的順序，可用卵母細胞蟾蜍(Xenopus oocytes)鑒別測定它們是否含有BCIF基因。可采用將限制片段插入原核表達載體如
gt-11和接著用BCIF的抗體進行篩選來檢測雜交反應(yīng)的肽片段方式，進行BCIF表達的測定。
一當鑒別出含有編碼BCIF順序的片段，就可采用切除、引物修復(fù)、體外誘變、核酸內(nèi)切限制酶消化等方法操作該片段，以提供5′轉(zhuǎn)錄區(qū)，如適宜可提供轉(zhuǎn)錄啟始區(qū)(假如必須或需要)，并且可提供與之不同的3′轉(zhuǎn)錄區(qū)，如適宜可提供轉(zhuǎn)錄末端區(qū)?？梢圆迦肟瘴蛔g讀編碼BCIF中的各種表達載體均可通過商業(yè)途徑得到或按文獻所述制備。載體可轉(zhuǎn)移到適宜的表達宿主。原核表達宿主包括大腸桿菌(E.coli)和枯草桿菌(B.subtilis);真核宿主包括啤酒酵母(S.cerevisiae)、CHO細胞、猴腎細胞和鏈霉菌等。
本發(fā)明組合物可以通過在N端或C端的平截，除去多至約10個氨基酸來改性。生物活性按如后所述及保留的活性分子進行測定。此外，可得到多至大約5mole%非保守誘變和多至大約10mole%的保守誘變。對保守置換而言，可將氨基酸破碎成為非極性脂族氨基酸(G，A，P，V，I，L)，極性脂族氨基酸(C，S，T，M，N，Q)、芳族氨基酸(F，H，W，Y)、堿性氨基酸(K，R)和酸性氨基酸(D，F(xiàn))。保守誘變發(fā)生在這些氨基酸組內(nèi)，而非保守誘變則發(fā)生在這些氨基酸的組間。
具有抑制活性的BCIF及其它片段可用作抗贅生組合物。能夠得到的BCIF的相對特異活性約0.1單位/ng，通常至少約20單位/ng，最好至少約100單位/ng，甚至高到完全純化。單位是指細胞生長和靶細胞系(例如ZR-70-30)分裂速率降低一半所需的活性數(shù)量。此外，抗贅生組合物可以包括至少一種具有抗贅生性質(zhì)的其他生長因子，生長因子結(jié)合的量應(yīng)足以抑制贅生細胞的增生。其他生長因子可以是一種與BCIF結(jié)合對抑制細胞生長可起相加作用的生長因子，例如OncostatinM，或者可以是一種與BCIF結(jié)合起協(xié)同作用的生長因子，例如，TGF-β。生長因子結(jié)合使用的優(yōu)點是降低了必須用于得到生長抑制所需任何一種肽的用量。
如上所述的體內(nèi)用肽，即單獨使用或與其他生長因子結(jié)合使用，其給藥方式可多種多樣，例如注射、灌注、局部給藥和非經(jīng)腸胃道給藥等?？梢耘c生理上可接受的載體結(jié)合給藥，例如無菌水、磷酸鹽緩沖鹽水、鹽水、含水乙醇等。設(shè)計的用藥濃度為1單位/mlGIA的細胞量，以至少10單位/ml為佳，至少100單位/ml則更佳，給藥方式的設(shè)計可按照其他生物活性蛋白已建立的標準，例如按胰島素或生長激素釋放抑制因子標準設(shè)計給藥方式。
除了用于抑制生長之外，BCIF及其片段也可用于診斷。因此，BCIF及其片段可與標記物結(jié)合使用，例如放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)、酶片段、顆粒等。大量的診斷測定已為公眾所知，例見美國專利USP3791932，3817837，4134792，3996345。本發(fā)明化合物也可用于產(chǎn)生多克隆抗體或單克隆抗體，這些抗體可用于檢測診斷測定中的BCIF，研究BCIF對培養(yǎng)細胞的作用，檢測BCIF在條件培養(yǎng)基中的存在，等等。再者，其他蛋白質(zhì)如胰島素已建立的標準提供指導產(chǎn)生對BCIF及其片段的抗體，以及這些抗體在測定中選擇和使用。另外，抗BCIF抗體可用于產(chǎn)生抗個體基因型抗體，這種抗體可以模擬原始BCIF分子的活性。BCIF分子的單個片段可用于制備含有10-20個肽長度的片段并重疊復(fù)蓋BCIF分子全長的混合物。這類混合物可用于產(chǎn)生抗肽片段的抗體，尤其是單克隆抗體，由此產(chǎn)生的抗體可篩選到抗BCIF本身的抗體，從而選擇具有適度結(jié)合親和力的抗體。該技術(shù)也可以用于其他具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。
至此只是對本發(fā)明作了一般性的介紹，而通過下述實施例則可更好地理解本發(fā)明，這些實施例旨在說明本發(fā)明，除了另有說明外，無意限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例1生物活性的測定1.生長抑制的測定將ZR-70-30人體乳房癌細胞(ATCCCRL1504，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland)用作敏感指示細胞系。測定是在96井平底組織培養(yǎng)平板(Costor 3596)上進行。在0.05ml的IMDM/DMEM(50∶50V/V)溶液中加入7.5%胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素(P/S)(生長培養(yǎng)基)，含有約3.5×103細胞，按此量加入每個井中(外層井不加)，再將0.1ml無菌PBS加入每個外層井中。3小時后，將溶于生長培養(yǎng)基的0.05ml試樣加到每個井中。培養(yǎng)平板在37℃和濕潤的5%CO2與95%空氣氣氛下保溫3天，然后用0.05ml的5-[125I]碘代-2′-脫氧尿嘧啶核苷(Idu)(0.05 μCi/井，Amersham IM.355V)沖洗細胞18小時。1單位的生長抑制活性(GIA)定義為抑制50%[125I]Idu摻入量所需的生長因子量。
2.協(xié)同生長抑制的測定將A375黑素瘤細胞(ATCC CRL1619，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland)用作敏感指示細胞系。測定是在96井平底組織培養(yǎng)平板(Costor 3596)＊進行。在0.05ml的DMEM中加入10%胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素(P/S)(生長培養(yǎng)基)，含有約3.5×103細胞，按此量加入每井中(外層井不加)，再將0.1ml無菌PBS加入每個外層井中。3小時后，將溶于生長培養(yǎng)基的0.025ml試樣加到每個井中。培養(yǎng)平板在37℃和濕潤的5%CO2與95%空氣氣氛下保溫3天，然后用0.05ml的5-[125I]碘代-2′-脫氧尿嘧啶核苷(Idu)(0.05 μCi/井，Amersham IM.355V)沖洗細胞18小時，測定細胞增生的抑制率。
實施例2從人體肺癌細胞系H-2981分離純化BCIF(a)分離將H-2981細胞在裝有IMDM并附加15%胎牛血清(FBS)和青霉素/鏈霉素(P/S)的20個圓底燒瓶(850cm)(CorningC2540)中培養(yǎng)生長至會合狀態(tài)。當細胞達到會合狀態(tài)時，立即用無血清的DMEM(100亮升)洗滌，并在無血清的DMEM(50ml)中培養(yǎng)15天，每隔3天收集和補充培養(yǎng)基。將條件培養(yǎng)基離心除去細胞碎片，在-20℃下將所收集的培養(yǎng)基冰凍至5升。用Amicon過濾法濃縮條件培養(yǎng)基，分子量為10000。在4℃下，用pH8.0的4升10mMTris滲析殘留液(600ml)2天，用滲析緩沖液替換3次。離心殘留液(3000g，30分鐘)，收集上清液，得到條件培養(yǎng)基粗品。
(b)純化(ⅰ)陰離子交換層析將含有大約600mg蛋白質(zhì)的條件培養(yǎng)基粗品裝在流速為3毫升/分的DEAE-Sephacel(5×2.5cm)的層析柱(Pharmacia)上。然后用40倍層析柱體積的10mMTris(pH8.0)(原始緩沖液)洗滌層析柱，并在10mMTris緩沖液(pH8.0)中平衡。被吸附的蛋白質(zhì)用線性梯度為0-0.5MNaCl的10mMTris緩沖液(pH8.0)洗脫，每5ml餾份進行收集。在280nm上測定其吸光率，并按如上所述測定各等餾分的生長抑制活性(GIA)。匯集含有GIA(第24-28餾分)的這些餾分。從DEAE層析柱上洗脫得到的大部分GIA在NaCl濃度為0.15M處呈現(xiàn)一個峰值。
(ⅱ)C-18A反相高性能液相色譜法將匯集含有GIA的DEAE-Sephacel餾分調(diào)整到0.2%TFA，用μ-BondapackC-18層析柱進一步純化。將大約31.25mg的DEAE庫裝到C-18層析柱(7.8×300mm)上進行同溶劑層析洗脫，在室溫條件下，于0.1%TFA中平衡，流速為1.0ml/分，記錄紙速為0.1厘米/分。用線性梯度為0-45%、45-52%和52-100%乙腈的0.1%TFA溶液進行洗脫，洗脫條件為0-45%，10分鐘，流速1毫升/分;45-52%，420分鐘，流速0.2毫升/分;52-100%，20分鐘，流速1毫升/分。在45-52%乙腈范圍內(nèi)收集餾分(每份1ml)，進行GIA測定。在48%乙腈上洗脫得到大部分GIA。
(ⅲ)C-18B將上述C-18A步驟中得到的含有大部分GIA-的各個餾分(45-59)匯集后，用0.1%TFA稀釋3倍，并用上述同一個μ-BondapackC-18層析柱進行再層析。這一步驟進一步將BCIF與大量紫外吸收物質(zhì)分離。
將大約0.18mg蛋白質(zhì)裝在第1步的C-18層析柱上，并在0.1%TFA中平衡。在室溫條件下，將上述匯集的各個餾分裝在層析柱上，流速為1毫升/分，記錄紙速為0.1cm/分。用線形梯度為0-25%和25-35%正丙醇的0.1%TFA溶液進行洗脫。梯度條件為0-25%，10分鐘，流速0.8毫升/分;25-35%，300分鐘，流速0.4毫升/分。在25-35%正丙醇范圍內(nèi)收集餾分，每份1ml，進行GIA測定。
(ⅳ)凝膠滲透色譜法用串聯(lián)形式的2個Bio-silTSK-250層析柱(300×7.5mm)進行BCIF純化的最后一步步驟。先將等體積的含有0.1%TFA乙腈溶液加到快速VAC濃縮器(Savant)中，再用其將由C-18B得到的匯集餾分(51-54)濃縮至0.1ml。將經(jīng)C-18(B)純化的蛋白質(zhì)約0.015mg裝到串聯(lián)的層析柱上，然后用含0.1%TFA的50%乙腈溶液洗脫，流速0.4毫升/分，記錄紙速0.25厘米/分。在214nm處測定吸光率。分段收集各餾分，每份0.4ml，進行GIA測定。經(jīng)洗脫的GIA呈現(xiàn)單峰值為Mr26000的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標記物為卵清蛋白(Mr45000)、胰凝乳蛋白酶原(Mr25000)、核糖核酸酶(Mr13700)、胰島素(Mr6000)。BCIF的純化約為5800倍，總回收率7.4%(參見表1)。純化BCIF的半最大劑量為9pg蛋白質(zhì)。
(ⅴ)聚丙烯酰胺凝膠電泳按Laemmli所述方法(Nature(1970)227，680-685)在有NaDodSO存在下制備聚丙烯酰胺平板凝膠。由丙烯酰胺(30%V/V)和二(丙烯酰胺)甲烷(N，N′-methylenebisacrylamide)(0.8W/V))的儲備溶液制備堆積凝膠(4%)和分辨凝膠(15%)。用Bio-Rad垂直微平板凝膠裝置灌注凝膠。經(jīng)銀染色目測蛋白質(zhì)，觀測到Mr21000的一條單譜帶。
表1BCIF純化的總結(jié)純化步驟蛋白質(zhì)(mg) GIA單位×10－6特異活性單得率(％)Crude600.000 12.50 0.0002100.0DEAE 31.25021.00 0.0067168.0C-18(A)0.180 3.220.179024.0C-18(B)0.015 1.270.850010.1TSK-2500.008 0.931.16007.4實施例3BCIF的特征(a)純BCIF的氨基末端氨基酸順序?qū)?個BCIF制劑(分別為25和30pmol)純化并用470A型蛋白質(zhì)順序儀(AppliedBiosystems，Inc.)進行自動埃德曼降解。BCIF氨基末端氨基酸順序如下V-P-P-G-E-D-S-K-D-V10A-A-P-H-R-Q-P-L-T-S20S-E-R-I-D-K-Q-I-R-Y30L-L-D-G34
(b)純生長抑制活性的劑量反應(yīng)用人體乳房癌細胞系ZR-75-30作為指示細胞系，在多次稀釋條件下對由Bio-silTSK-250層析柱得到的純BCIF制劑進行測定。抑制活性用細胞生長和分裂的減慢(%抑制率提高)表示，圖1給出其與BCIF濃度增加的關(guān)系曲線。
(c)BCIF和其他生長因子的協(xié)同作用和相加作用對高度純化的BCIF、TGF-β和OncostatinM的生長抑制活性以及BCIF、TGF-β和BCIF、OncostatinM之間在抑制A-375黑素瘤細胞方面可能的協(xié)同作用進行測定。如圖2所示，分別將BCIF和TGF-β加到培養(yǎng)皿中，分別用0.2-25ng/ml和0.04-5ng/ml抑制A-375細胞增生。在有少量TGF-β(0.2ng/ml)存在下，BCIF的效價約增加10倍，BCIF的最大抑制率由55%增至85%(圖2)。將BCIF和TGF-β結(jié)合使用可以獲得協(xié)同作用。增加量約為期望相加反應(yīng)的2倍。例如，1ng/mlBCIF和0.2ng/mlTGF-β抑制細胞增生率分別為16%和13%，兩者結(jié)合則抑制率達58%，即為29%期望相加作用的2倍。此外，在僅有BCIF(1.0ng/ml)時，觀測到的抑制率為16%，而有低濃度TGF-β(0.04ng/ml)參加時，抑制率增至27%，而后者本身測不到有作用。
與此相反，BCIF(1ng/ml)和OncostatinM(1ng/ml)抑制A-375細胞增生分別為16%和32%，而兩者結(jié)合使用時則為46%，接近預(yù)期的相加作用。
本發(fā)明的組合物及其使用方法提供了抑制贅生細胞生長的手段。BCIF單獨使用或與具有抗贅生活性的其他生長因子結(jié)合使用，均可抑制離體腫瘤細胞的增生，并可用于體內(nèi)，尤其是對體內(nèi)的腫瘤，包括對常規(guī)抗贅生藥劑敏感性差的細胞。
本文所提及的全部出版物和專利申請文件反映了本發(fā)明與之有關(guān)的這個領(lǐng)域中專業(yè)人員所了解的專業(yè)水平，它們都包括在本文的參考文獻內(nèi)，如同具體逐一指明每個出版物或?qū)＠暾埼募粯樱袨楸疚牡膮⒖嘉墨I。
對本發(fā)明業(yè)已作了完整的介紹，顯然本領(lǐng)域的普通專業(yè)人員在不脫離本文所附權(quán)利要求書的精神和范圍的情況下對此都能作出許多改變和改進。
權(quán)利要求
1.抑制贅生細胞增生的方法，包括將所述細胞與至少包含一種以能抑制贅生細胞增生為特征的多肽的組合物接觸，其中所述多肽之一是第一多肽，具有與含有下列順序的至少8個連續(xù)氨基酸基本相似的氨基酸順序V-P-P-G-E-D-S-K-D-V 10A-A-P-H-R-Q-P-L-T-S 20S-E-R-I-D-K-Q-I-R-Y 30I-L-D-G 34。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一多肽是人體細胞生長抑制因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一多肽包括約8-20個氨基酸并能抑制ZR-75-30癌細胞或A-375細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述組合物還包括第二多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述第二多肽與所述第一多肽具有抑制所述贅生細胞增生的協(xié)同作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述第二多肽是轉(zhuǎn)移生長因子β。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述第二多肽與所述第一多肽具有抑制所述贅生細胞增生的相加作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述第二多肽是Oncostatin M。
9.用于抑制贅生細胞增生的組合物，其至少包括一種以具有抗增生活性為特征的多肽，其中所述多肽之一是包含細胞生長抑制因子的第一多肽。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中所述組合物還包括第二多肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其中所述第二多肽包括轉(zhuǎn)移生長因子β或Oncostatin M。
全文摘要
本發(fā)明提供了名為BCIF的生長因子及其使用方法。BCIF能抑制細胞增生，尤其是抑制人體乳房癌細胞和人體黑素瘤細胞的增生。BCIF可單獨使用，也可與其他生長因子，如轉(zhuǎn)移生長因子β或Oncostatin M結(jié)合使用，這些生長因子與BCIF結(jié)合，對抑制細胞增生可以產(chǎn)生相加作用或協(xié)同作用。本發(fā)明還提供了獲得BCIF的方法。
文檔編號C12N5/06GK1040926SQ88107690
公開日1990年4月4日 申請日期1988年11月5日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月6日
發(fā)明者約翰·M·羅, 謨罕默德·索雅布 申請人:翁科根公司