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偶聯(lián)到高分子量的聚亞烷基二醇類上的超氧物歧化酶的結(jié)合物的制作方法

文檔序號(hào):541393閱讀:447來源:國知局
專利名稱:偶聯(lián)到高分子量的聚亞烷基二醇類上的超氧物歧化酶的結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明目的在于超氧物歧化酶(SOD)結(jié)合物或加合物,在這些化合物中至少有一部份SOD氨基、羧基、或巰基偶聯(lián)到聚亞烷基二醇(PAG)如聚乙二醇(PEG)或聚亞乙基-聚亞丙基二醇共聚物上,其中PAG的分子量大于20,000,而理想的平均分子量為40,000至1,000,000道爾頓。除了另有說明外,PAG的分子量是用PEG作為標(biāo)準(zhǔn)通過高效篩析液體色譜法(HPLC)確定的。較好的PAG是平均分子量大于40,000至小于200,000,特別好的PAG是平均分子量為50,000-150,000。這些PAG可以是無支鏈的或有支鏈的而且可以是未被取代的或被C1-4烷基或C1-4烷氧基取代的??煞乐惯B接到兩個(gè)SOD分子上的特別有價(jià)值的PAG分子是在其分子中的一個(gè)末端基團(tuán)是C1-4烷基醚基團(tuán)如異丙氧基基團(tuán)。
以前的工作者已經(jīng)利用低分子量(通常約為5,000和5000以下)的PEG或甲氧基-PEG連接到超氧物歧化酶(SOD)和其他蛋白質(zhì)上,以得到表現(xiàn)出不同程度的(a)增加血清耐久性和(b)降低免疫原性的加合物。但是,對(duì)于要求充分的達(dá)到(a)及(b)的兩個(gè)目的的帶有低分子量的PEG或甲氧基-PEG的蛋白質(zhì)基團(tuán)的修飾幅度,常常導(dǎo)致酶活性或生物活性實(shí)質(zhì)上喪失。
超氧物歧化酶是一種承擔(dān)催化超氧化物基轉(zhuǎn)化為氧和過氧化氫的作用的細(xì)胞內(nèi)酶。提供一種較體內(nèi)的天然SOD蛋質(zhì)耐久的產(chǎn)物并延緩由于腎臟所造成的失活是本發(fā)明的一個(gè)目的。特別重要的是產(chǎn)品在顯示低水平免疫原性的同時(shí)能保持酶活性。
正如在用小鼠做通常的導(dǎo)入角叉菜膠的瓜浮腫試驗(yàn)中所證明的此種結(jié)合物還具有一種抗炎活性。
在本發(fā)明中體現(xiàn)的新概念,應(yīng)用了分子量大于20,000的高分子量PAG鏈。用于本發(fā)明的PAG可以是任何水溶性的烯化氧聚合物,例如聚(環(huán)氧乙烷)或環(huán)氧乙烷和1,2-環(huán)氧丙烷的某些共聚物。PAG可以是線型的或有支鏈的并可在一個(gè)或多個(gè)羥基位上被C1-4烷氧基或其他的化學(xué)基團(tuán)所取代。但是,在本發(fā)明中用于制備結(jié)合物的PAG聚合物的分子量大于20,000而較好是在40,000至200,000分子量的范圍。應(yīng)用分子量大于200,000的聚合物也是可能的,但是由于它們?cè)诒磺邢鲿r(shí)易于斷裂和它們有較高的粘度所以它們并不是較好的。
本發(fā)明的PAG-SOD加合物的分子量(相對(duì)于已知分子量的PEG標(biāo)準(zhǔn))范圍約從85,000至約2,000,000道爾頓,而較好是約90,000至1,000,000道爾頓。再者,本發(fā)明的PAG-SOD加合物和其他的PAG-加合物通常保持天然蛋白質(zhì)的大部份酶活性(注在本說明書中分子量是根據(jù)已知分子量的PEG標(biāo)準(zhǔn)決定的,為了校正高效液體色譜法(HPLC),蛋白質(zhì)當(dāng)量,即根據(jù)已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)決定的分子量,可以認(rèn)為是約高5至8倍)。
本發(fā)明的結(jié)合物是一種超過以前的產(chǎn)品的改進(jìn)產(chǎn)品,在產(chǎn)品中由于連接的PAG鏈較少,使活性母分子僅有較少的化學(xué)改性,因而保留了較多的母分子原有的特性。因此,正如在本發(fā)明中那樣,應(yīng)用較少鏈的高分子量PAG,加合物保留多數(shù)(如果不是大多數(shù)的話)的母分子的活性,同時(shí)也顯示出增加在血液中的耐久性。本發(fā)明的加合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是,應(yīng)用高分子的PAG,可制成由其他工作者所制成的具有同樣改性程度的較大的加合物。再者,在某些應(yīng)用中,較大的PAG加合物是明顯地有利的。例如,用本發(fā)明的方法應(yīng)用分子量為30,000-130,000范圍的PEG-鏈制備的而且說明了本發(fā)明的原理的本發(fā)明的PEG-SOD加合物,在小鼠體內(nèi)的血清半衰期約為36小時(shí),比以前的工作者所敘述的PEG-SOD加合物較為大而長(zhǎng)。
在PAG-SOD加合中較好是含有每個(gè)蛋白質(zhì)分子上連有1至10個(gè)PAG鏈,而每個(gè)蛋白質(zhì)分子較好是連有2至8個(gè)PAG鏈,而以連有2至6個(gè)PAG鏈最好。
當(dāng)應(yīng)用長(zhǎng)鏈時(shí),則達(dá)到滿意的血清耐久性所需的鏈的數(shù)目可降低。
本發(fā)明的SOD制劑通常是由牛,其他動(dòng)物(如羊、馬、豬、狗、兔、雞)或人類細(xì)胞衍生而來的以哺乳動(dòng)物的含銅和含鋅的超氧物歧化酶形式的酶。含其他金屬離子如鐵或錳的SOD制劑同樣是有效的。從微生物的培養(yǎng)物衍生而來具有異系同基因結(jié)構(gòu)的酶也是有效的(在這樣的培養(yǎng)物中已克隆和表達(dá)了這種結(jié)構(gòu))。因?yàn)?,本發(fā)明的產(chǎn)鏌呀檔土酥旅庖咝?,所译s捎讜謖廡┪⑸錙嘌鎦兇氳牟槐U嫘緣慕峁琒OD還可能是不等同于天然存在的蛋白質(zhì)。
現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn),當(dāng)SOD制劑含有痕量的非SOD蛋白質(zhì)時(shí),在重復(fù)的非腸道施用時(shí),這種蛋白質(zhì)會(huì)以其他方式使這種制劑在免疫學(xué)上不安全,用本發(fā)明的方法偶聯(lián)這種SOD可使這種產(chǎn)品相當(dāng)?shù)赜行В驗(yàn)檫@類污染蛋白質(zhì)會(huì)造成顯著地缺少致免疫性。
在這種偶聯(lián)方法中,可使用許多常規(guī)的反應(yīng)。
應(yīng)用試劑如羰基二咪唑“、氯甲酸對(duì)硝基苯酯或雙-N-琥珀酰亞胺碳酸鹽,通過形成活性的碳酸半酯即PAG-O-CO-X(其中X是一個(gè)好的離去基團(tuán))來進(jìn)行的反應(yīng)的是一種優(yōu)選的反應(yīng)。然后在不會(huì)破壞其酶活性的條件下,將此活化的PAG即PAG-O-CO-X與蛋白質(zhì)反應(yīng),從而導(dǎo)致占優(yōu)勢(shì)的尿烷鍵合PAG-O-CO-NH-蛋白質(zhì)其連接是通過蛋白質(zhì)氨基如賴氨酸的ε-氨基而形成的。
舉例來說,羰基二咪唑可與PAG以末端羥基反應(yīng)。在中性pH的水溶液中抑制反應(yīng)混合物,并通過透析和/或篩析色譜法將活化的PAG(聚亞烷基二醇-羰基-咪唑)分離出來。
SOD與
的反應(yīng)是在有過量的活性PAG的溶液中進(jìn)行的。
在另一種形式的這類反應(yīng)中,SOD和活性的PAG的溶液是干凍的。應(yīng)用篩析色譜法可很方便地將偶聯(lián)的產(chǎn)物分離出來。并可以應(yīng)用的其他純化方法包括離子交換色譜法。
在另外一個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)中,是將聚亞烷基二醇溶于一種惰性有機(jī)溶劑中,使反應(yīng)混合物變?yōu)槿鯄A性并與氰尿酰氯反應(yīng)。
通過用石油醚沉淀PAG而除去末反應(yīng)的氰尿酰氯。蒸發(fā)殘留的溶劑而得到2-PAG-6-氯-1,3,5-三嗪。然后將所得到的活化聚合物在適合的緩沖液如硼酸溶液中與SOD反應(yīng)。將未反應(yīng)的活化PAG除去并用色譜法分離產(chǎn)物。因而獲得4-羥基-1,3,5-三嗪,在其2-位上連有聚亞烷基二醇基團(tuán)-PAG-O-,同時(shí)在其6-位上則連有SOD的活化賴氨酸基的ε-氨基。
PAG-OH的一個(gè)或幾個(gè)羥基也可轉(zhuǎn)化為羰基,例如與琥珀酸酐或與溴乙酸乙酯和堿反應(yīng),或者用堿性高錳酸鹽氧化末端-OCH2CH2OH以形成PAG乙酸酯PAG-O-CH2COOH。然后將羧基活化,所用的方法為通常所知的用于修篩蛋白質(zhì)的方法,例如用碳化二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)而形成N-羥基琥珀酰亞胺酯,或者將乙酰肼亞硝化而形成?;B氮。然后將活化的PAG在不破壞蛋白質(zhì)的酶活性的條件下與蛋白質(zhì)反應(yīng),主要是導(dǎo)致通過蛋白質(zhì)的氨基(如氨基的末端NH2和賴氨酸的ε-氨基)的酰胺鍵合(PAG…C(=O)NH-蛋白質(zhì))。
末端的PAG羥基也可以轉(zhuǎn)化成氨基,如首先與溴化亞硫酰反應(yīng)形成PAG-Br,接著再用過量的氨進(jìn)行氨解而形成PAG-NH2。然后應(yīng)用水溶性碳化二亞胺或伍德瓦德試劑K,通過酰胺鍵而將氨基-PAG直接偶聯(lián)到蛋白質(zhì)的羧基上。另一方面,可將氨基的功能轉(zhuǎn)化成羧酸的功能,例如通過與琥珀酸酐反應(yīng),然后再按前述的方法使之活化并與蛋白質(zhì)反應(yīng)。
也可以將PAG末端的-CH2OH用例如二氧化錳氧化而轉(zhuǎn)化成醛基-CH(=O)。然后,應(yīng)用例如氰基硼氫化物,通過蛋白質(zhì)的自由氨基,可將這個(gè)醛基還原性地烷基化到蛋白質(zhì)上,從而得到主要是通過仲胺基團(tuán)的鍵連而形成PAG-O-CH2CH2-NH-蛋白質(zhì)橋。
除了蛋白質(zhì)氨基外,蛋白質(zhì)羧基和巰基都可用于與PAG偶聯(lián)。
正如上所述,在選擇偶聯(lián)反應(yīng)時(shí),只剩下由碳、氧、硫、氮和氫組成的非芳香基團(tuán)作為PAG與蛋白質(zhì)之間的橋式聯(lián)接的一部份是優(yōu)選的。
被結(jié)合的SOD可從反應(yīng)溶液中分離出來,較好是通過通常使用的冷凍干燥在透析除去外來的離子后進(jìn)行。如有需要或在必需時(shí),這種結(jié)合物可通過離子交換色譜、電泳和/或凝膠過濾來進(jìn)一步純化。
用通常的方法通過一種微孔過濾器濾入一無菌小瓶中,任意選擇地在用例如氯化鈉和/或磷酸頻鶻誒胱優(yōu)ǘ瘸晌壬娜芤褐?,而提供谅栆曋k⑸涫┮┑奈蘧芤骸 本發(fā)明的藥物組合物包括本發(fā)明的PAG-SOD結(jié)合物和可在藥物上應(yīng)用的載體。
較好的藥物組合物是無菌注射制劑的形式例如無菌注射水溶液。應(yīng)用可在藥物上應(yīng)用的上述載體,根據(jù)已知的技術(shù)可配制成這種水溶液。這種無菌的注射制劑也可以是用無毒性的可于非腸道使用的稀釋劑或溶劑配制成的溶液或懸浮液。
當(dāng)通過適于具體的藥物載體的途徑施用單位劑量的組合物時(shí),本發(fā)明的組合物與有效單位劑量的SOD結(jié)合物以有效于引起所需的反應(yīng)的濃度相結(jié)合。例如液體組合物通常含有約每0.25至10ml含有約0.5至40mg結(jié)合蛋白,較好是約0.5至5ml(除了靜脈內(nèi)滴注溶液之外),這些溶液還可以是更稀的,如每50-1,000ml較好是每100-500ml滴注溶液含有0.5至200mgSOD結(jié)合蛋白質(zhì)。片劑、膠囊和栓劑通常每劑量單位含有0.1至25mg,較好是1至10mg結(jié)合蛋白質(zhì)。
正如已確定的產(chǎn)品銅鋅協(xié)同物質(zhì),本發(fā)明的SOD結(jié)合物在治療多種炎癥病情時(shí)是有效的,包括那些其中的合成的抗炎劑例如由于在長(zhǎng)期應(yīng)用時(shí)的毒性付作用而具有有限實(shí)用性的SOD結(jié)合物。
更具體地說,SOD結(jié)合物在各種哺乳動(dòng)物中改善氧氣毒性、再灌注損傷,和炎癥病情以及減輕它們的影響(例如包括泌尿道和關(guān)節(jié)的)是非常有效的。這類結(jié)合物對(duì)于減輕與外傷后的關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕病例如滑囊炎、腱炎和骨關(guān)節(jié)炎的癥狀和與其有關(guān)的結(jié)構(gòu)變形是有效的。
用下面的實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)例1將50g PEG(以Polyox
為商標(biāo)的聯(lián)合碳化公司產(chǎn)品或聚環(huán)氧乙烷100,000分子量,由根據(jù)特性粘度測(cè)量確定的、標(biāo)明分子量為100,000的異丙氧基化的PEG組成,由高效液體色譜法得到的平均值約為50,000)溶于1升無水吡啶中,加入22g琥珀酸酐。將此混合物在60℃攪拌38小時(shí)。在低于60℃于真空下除去溶劑并將殘留物再溶于500ml水中。用己烷洗滌溶液然后用1000ml氯仿萃取產(chǎn)物。在40℃于真空下除去氯仿并將產(chǎn)品溶于苯中。用石油醚從苯中再沉淀琥珀?;腜EG兩次。
將此琥珀?;颬EG的水溶液進(jìn)行篩析分離,應(yīng)用裝備有300,000(蛋白質(zhì)基準(zhǔn))分子量截膜的Millipore
Minitan
裝置以超濾作用除去低分子量的PEG。將篩析分離產(chǎn)物在真空中干燥。用水相篩析高效液體色譜分析顯示,用超濾作用的結(jié)果琥珀?;腜EG的平均分子量由50,000增加至約80,000。
然后將由此得到的經(jīng)篩析分離的琥珀?;腜EG用N-羥基琥珀酰亞胺活化。將12g琥珀?;疨EG(分子量80,000,0.15mmol)溶于120ml無水二甲基甲酰胺中,再加入300mg(2.6mmol)N-羥基琥珀酰亞胺,同時(shí)攪拌,溶解后,再加入2.4毫摩爾二環(huán)己基碳化二亞胺并將此溶液在40℃攪拌30分鐘然后在24℃靜置5天。再將此混合物通過一玻璃纖維過濾器過濾并在40℃于真空下將濾液蒸發(fā)至干。將殘留物在溫?zé)嵯氯苡?00ml無水甲苯中。加入400ml石油醚使N-羥基琥珀酰亞胺基PEG固體沉淀。在真空中在一玻璃纖維過濾器上收集此產(chǎn)物,然后用石油醚將產(chǎn)物從甲苯中再沉淀,隨后在真空中干燥。用篩析高效液體色譜法分析顯示活化的結(jié)果并沒有改變產(chǎn)物的分子量。
將含有80mg的牛的Cu、ZnSOD(2.46微摩爾,4400單位/mg,DDIPharmaceuticalsInc.產(chǎn)品)的39ml0.1摩爾磷酸鉀緩沖液(pH8.0)溶液加到4g無水N-羥基琥珀酰亞胺基PEG衍生物(50微摩爾)中并在24℃溶解該混合物。篩析高效液體色譜分析顯示偶聯(lián)反應(yīng)可在1.5小時(shí)內(nèi)基本完成。這一點(diǎn)可由未反應(yīng)的SOD的消失和具有分子量約200,000的高分子量紫外光吸收的加合物峰的出現(xiàn)而明顯地看出。
未偶聯(lián)到SOD上的自由PEG可從PEG-SOD加合物上用離子交換色譜分離出來。含有PEG-SOD的液份可用NaCl通過增加洗脫緩沖液(pH9)的離子濃度來收集。在水中透析PEG-SOD液份以除去緩沖組份緩笥美潿掣稍锘蛘嬋照舴⒗磁ㄋ酢 作為一個(gè)實(shí)例,已敘述了用50毫摩爾NaCl洗脫的典型產(chǎn)物的性質(zhì)。該加合物含有24mgSOD蛋白質(zhì)和165mg蛋白結(jié)合PEG。應(yīng)用蛋白質(zhì)成份的折射率檢測(cè)(RI)和折射率的校正,通過二縮脲分析來測(cè)定蛋白質(zhì)含量,通過高效液體色譜法測(cè)定PEG含量。測(cè)定出蛋白結(jié)合PEG的平均分子量是72,000。通過蛋白水解作用由加合物分離出來的PEG的這個(gè)分子量與表示在加合物中SOD蛋白質(zhì)(分子量32,000)與PEG的比例是24mg比165mg的這一數(shù)據(jù)相結(jié)合,得出每一個(gè)SOD分子上結(jié)合3條PEG鏈的結(jié)合比例。用這種方法得到的每一個(gè)SOD分子的PEG鏈的數(shù)目得出計(jì)算出的加合物分子量是220,000(72,000×3+32,000/8),這一結(jié)果與用高效液體色譜法得出的分子量是一致的。
應(yīng)用McCord和Fridovich的細(xì)胞色素C分析法(J.Biol.Chem.2446049-6055(1969))測(cè)定出上述加合物的SOD活性。PEG-SOD加合物的比活性(約4317單位/mg蛋白質(zhì))是天然酶起始物料(4400單位/mg)的98%。因此該產(chǎn)物仍然保留幾乎所有的天然酶的或生物學(xué)的活性,同時(shí)達(dá)到了本發(fā)明的其他要求。
用成年的雌性瑞士Webster小鼠進(jìn)行致敏作用/激發(fā)試驗(yàn),以將得自如本實(shí)例所敘述的PEG-SOD衍生物與高度純化的、末改良的SOD原始物料在免疫學(xué)的致敏作用潛能(引起過敏反應(yīng)的活性)方面進(jìn)行比較。在兩周的期間用每劑量0.075mg蛋白質(zhì)對(duì)10只小鼠進(jìn)行4次皮下注射使之免疫,然后在間隔21天后用同一化合物以每劑量0.04mg蛋白質(zhì)進(jìn)行靜脈注射使之激發(fā)。盡管在第5次靜脈激發(fā)期間,在接受未改進(jìn)的SOD試驗(yàn)組中有5只死亡而留下的5只中有3只顯示過敏癥的病征,但接受同一劑量的PEG-SOD的10支小鼠中沒有一只顯示過敏癥的任何病征。
當(dāng)應(yīng)用相同的實(shí)驗(yàn)原始方案對(duì)每分子SOD約含有6條5000分子量的PEG鏈的PEG-SOD加合物進(jìn)行試驗(yàn),在第5次激發(fā)試驗(yàn)期間10只小鼠中有2只死亡而余下的小鼠中有4只顯現(xiàn)出過敏癥的病征。因此在由本發(fā)明制備的PEG-SOD中,每個(gè)SOD含有3條分子量為72,000的PEG其致免疫性要比含有6條分子量為5,000的PEG的PEG-SOD加合物為弱。
實(shí)例2按照實(shí)例1的方法,將高分子量的PEGs偶聯(lián)到牛的Cu、ZnSOD上。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)具有5條分子量為100,000的PEG和3條分子量為120,000的PEG的產(chǎn)物其致免疫性要比天然的SOD或具有4條分子量為35,000PEG的產(chǎn)物致免疫性要弱。
實(shí)例3應(yīng)用成熟雌性瑞士Webster小鼠,將天然SOD的血清耐久性與按實(shí)例1的方法制備的PEG-SODs相比較。將100微克SOD進(jìn)行靜脈注射。按常規(guī)的間歇收集血液并用從小鼠SOD中分離PEG-SOD的電泳法來分析血漿的比PEG-SOD活性。一種試驗(yàn)的PEG-SOD加合物含有分子量約為65,000的2條PEG鏈和另一種含有分子量約為40,000的4條PEG鏈。在小鼠中天然SOD消失的半衰期為5-10分鐘,然而上兩者PEG-SOD消失的半衰期大于36小時(shí),而在這些動(dòng)物血液中的PEG-SOD活性至少9天都可以探測(cè)到。
具有分子量約為45,000含有平均25條PEG鏈的制劑也可表現(xiàn)出半衰期大于36小時(shí)。
實(shí)例4一種被標(biāo)明為100,000分子量(由特性粘度測(cè)定的平均分子量)的PEG(聯(lián)合碳化公司)的水溶液,(但是用高效液體色譜法測(cè)得平均分子量約為50,000),用裝備有300,000(蛋白質(zhì)基準(zhǔn))分子量阻截膜的MilliporeMinitan裝置通過超濾作用來篩析分離。在真空下干燥篩析的產(chǎn)物。用高效液體色譜分析表明,樣品經(jīng)超濾作用后的平均分子量由50,000增加到100,000。在含有3.77g上述篩析分離的PEG的100ml無水乙腈溶液中加入含有1.39g氰尿酰氯的2.8ml無水乙腈溶液。在24℃靜置3天后,用等量的乙腈烯釋然后過濾使之變清。在30℃于真空中蒸發(fā)以除去溶劑并將殘留物再溶于120ml無水甲苯中。加入360ml無水己烷使產(chǎn)物沉淀。用石油醚使產(chǎn)物從甲苯中再沉淀一次,并在真空中干燥,而得到活化的氰尿酰氯PEG。經(jīng)篩析高效液體色譜法顯示,活化的結(jié)果并沒有改變PEG的分子量。
將不同量的得自上述的活化PEG進(jìn)行試驗(yàn)以便得知偶聯(lián)到處于1mg/ml的恒定水平的牛的Cu、ZnSOD上的效率。PEG終濃度范圍從5至100mg/ml。在24℃反應(yīng)24小時(shí)后,用高效液體色譜分析該混合物,用紫外光檢測(cè)PEG-SOD的形成和殘余的SOD的量。
表1PEG∶SODSOD轉(zhuǎn)化為加加合物峰值(W∶W)(M∶M)合物的百分?jǐn)?shù)分子量*5225%-10429%90K20862%140K502090%150K753095%200K10040100%200K*在TSKPW柱上用高效液體色譜測(cè)定,用商業(yè)的PEG基準(zhǔn)校準(zhǔn)。
如表1所示,在PEG對(duì)SOD之比(20∶1摩爾比)為50∶1(W/W)時(shí),有90%的SOD轉(zhuǎn)化成具有150,000平均分子量的PEG-SOD。在PEG對(duì)SOD有較大比率的情況下,SOD轉(zhuǎn)化為PEG-SOD的量和加合物的分子量?jī)烧叨加性黾?。由所得到的加合物的大小表明,在上述這樣的條件下應(yīng)用氰尿酸為偶合劑,有多至兩條100,000分子量的PEG可被連接到SOD上。
表1中列出了測(cè)定在小鼠體內(nèi)用PEG-SOD產(chǎn)物(PEG對(duì)SOD的比例為10∶1(W∶W)和75∶1(W∶W)的反應(yīng)的血清耐久性。應(yīng)用了在上述實(shí)例3中所應(yīng)用的同一方法。得到了兩種試驗(yàn)產(chǎn)物的半衰期至少為36小時(shí)。
實(shí)例5將10g100千道爾頓聚乙二醇(100KPEG,聯(lián)合碳化物公司)冷凍干燥24小時(shí),以除去在樣品中存在的任何濕氣。將干的100KPEG溶于約45ml的無水乙腈中。然后加入5.12g1,1-碳酰二咪唑并將反應(yīng)混合物在室溫下孵育1.5小時(shí),然后在去離子水中驟冷以破壞過量的碳酰二咪唑。將pH保持在7以防止活性PEG的水解。然后將該混合物在4℃在4升蒸餾水中透析1天,應(yīng)用至少10次更換以除去乙腈和咪唑。經(jīng)透析后,在去離子水中活化的PEG用在SephacrylS-400柱上進(jìn)行色譜法分離,以從低分子量片段中分離出活化的100K-PEG。
在所得到的活化的PEG中加入足夠的SOD以產(chǎn)生每摩爾SOD為3摩爾PEG的摩爾比,將92.8mgSOD加到沉淀池(體積=108ml)中。將此混合物冷凍干燥4次以產(chǎn)生所需要的PEG-O-CO-SOD產(chǎn)物。
實(shí)例6在35℃于氮?dú)夥罩胁⒂跀嚢柘?,?0g氫化鈉緩慢地加到含有30g聚乙二醇的1100ml無水二噁烷熔液中。在25℃再攪拌一小時(shí)后,加入15ml溴乙酸乙酯。將此溶液在25℃攪拌30分鐘,然后在45℃再攪拌2小時(shí)再加入200ml水以終止反應(yīng)。然后在不斷攪拌下再加入400ml石油醚將有機(jī)相棄去并用石油醚洗滌粘性的水相。將含有PEG乙基酯的水相稀釋至約1升并將溫度升至60-70℃進(jìn)行皂化5小時(shí)。最后,進(jìn)行酸化至pH2使PEG羧基轉(zhuǎn)化成游離酸。用透析法或凝膠過濾法以除去余下的溴乙酸??蓪⑺苽涞腜EG醚取代以制成用于實(shí)例1的琥珀酰化的PEG。
因此,應(yīng)用9.4g活化的聚乙二醇(分子量為40,000)和7.9mg牛的SOD,就可得到含有平均每分子SOD有3.3條PEG鏈的加合物。用高效液體色譜測(cè)定,產(chǎn)物的分子量約為140,000。在小鼠體內(nèi),此加合物的致免疫性大大降低。
應(yīng)用6.5g分子量為120,000的聚乙二醇和87mg牛SOD,就可得到由高效液體色譜法測(cè)定出其分子量約為245,000的加合物。
實(shí)例7已經(jīng)制定了應(yīng)用人類SOD的應(yīng)用方法。將20mg活化的樣品即琥珀?;腜EG放入玻璃試管中。含有3mg/ml人類SOD的0.2摩爾pH8的磷酸-硼酸緩沖液的溶液100mcl。經(jīng)混合后,在一支250mcl的微試管中在58mcl的0.01M1∶1醋酸鈉∶醋酸的緩沖液中將每一反應(yīng)混合物中的樣品除去并使之驟停。為了監(jiān)測(cè)反應(yīng)的進(jìn)行,將樣品在pH8.5用250伏電壓電泳15分鐘,然后用氮藍(lán)四唑進(jìn)行染色。
于室溫3-3.5小時(shí),用45微升每毫克PEG0.03摩爾1∶1乙酸鹽緩沖液使溶液驟停。加入0.1mlpH8的反應(yīng)緩沖液和0.9ml30毫摩爾乙酸鹽使pH最后成為6.4。此pH值的降低和1∶10稀釋作用停止了進(jìn)一步的PEG-SOD偶聯(lián)和水解。30-45分鐘后發(fā)現(xiàn)沒有可以觀察到的進(jìn)一步反應(yīng)。
雖然注射后的一天在小鼠血清中不再檢測(cè)到上述具有類似自由SOD的、帶有分子量為19,000道爾頓PEG鏈的PEG-SOD,但是帶有分子量為30,000道爾頓的PEG鏈的制劑卻提供了一延長(zhǎng)的耐久時(shí)間。
權(quán)利要求
1.制備一種用偶聯(lián)劑將超氧物歧化酶偶聯(lián)到聚亞烷基二醇上的、基本上溶于水的非致免疫結(jié)合物的方法,該聚亞烷基二醇是聚乙二醇或聚亞乙基-聚亞丙基二醇共聚物殘基,其中所說的二醇具有應(yīng)用約30,000-1,000,000分子量的PEG為標(biāo)準(zhǔn),通過高效液體色譜法(HPLC)確定的平均分子量,而且在二醇的末端是未被取代的或由C1-4烷基或C1-4烷氧基取代的,該方法包括將1摩爾超氧物歧化酶與1-8摩爾一個(gè)末端基團(tuán)用蛋白質(zhì)的氨基酸活化的聚亞烷基二醇進(jìn)行反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1制備結(jié)合物的方法,其中聚亞烷基二醇是具有用高效液體色譜法確定其平均分子量約為40,000-200,000的聚乙二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2制備結(jié)合物的方法,其中的聚乙二醇是具有平均分子量約為50,000-150,000的聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求2制備結(jié)合物的方法,其中將2至8個(gè)聚乙二醇基團(tuán)偶聯(lián)到每一個(gè)含銅和鋅的超氧物歧化酶分子上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4制備結(jié)合物的方法,其中將2至6個(gè)二醇基團(tuán)偶聯(lián)到每一個(gè)超氧物歧化酶分子上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法其中聚亞烷基二醇是異丙氧基聚乙二醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求1制備結(jié)合物的方法,其中聚乙二醇的末端基團(tuán)是通過一個(gè)CO連接到超氧物歧化酶賴氨酸的末端氨基上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其中的聚亞烷基二醇的末端基團(tuán)是由羥基制備的,該羥基被酯化或改變成羧基、氨基、羧酰氨基或醛基。
全文摘要
基本上是水溶的超氧物歧化酶的非致免疫的結(jié)合物是由將該酶偶合到聚亞烷基二醇上而制備成的,該聚亞烷基二醇是聚乙二醇或聚乙基-聚亞丙基二醇共聚物,其中所說的二醇具有30,000-1,000,000的平均分子量并且是末端未被取代或被C
文檔編號(hào)C12N9/96GK1031088SQ8810485
公開日1989年2月15日 申請(qǐng)日期1988年8月2日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月3日
發(fā)明者馬克·賽發(fā), 羅爾夫·松馬克, L·戴維·威廉斯 申請(qǐng)人:Ddi制藥有限公司
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