專利名稱：酸性脲酶及其生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系一種新的脲酶，它可用于提高酒精性飲料的質(zhì)量或用于臨床實驗室檢驗或食品中的脲的測定。
脲酶(E，C，3，5，1，5)是一種分解脲為氨氣和二氧化碳的酶，廣泛布于自然界的植物，動物和微生物體內(nèi)。除了來自刀豆素A(CananaliaAdans(Jack豆))和鼠疫桿菌(Bacilluspastenri)的脲酶已被商品化生產(chǎn)和提供使用以外，已知還有由某些微生物合成的分子量440，000的脲酶，包括百合棒狀桿菌(Corynebactiriumlilium)，產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacteriumammoniagenes)，石蠟節(jié)桿菌(Arthrobacterparaffineus)，普通變形桿菌(proteusvulgaris)，嗜氨微桿菌(Microbacteriumammoniaphilum)或支氣管敗血桿菌(Bordetellabronchiseptica)(日本專利公布№60-55119)，還有由芽胞桿菌UR-155(BacillusSP，UR-155)合成的分子量440，000的脲酶(日本未審查專利公布(KOKAI)59-17987)以及由綠膿假單孢桿菌(Pseudomonasaeruginosa)和紅色奴卡氏菌(Nocardiaerythrropolis)(日本未審查專利申請(KOKA1)61-257183)合成的分子量280，000的脲酶。
上述全部脲酶最適反應(yīng)PH值均于中性到堿性區(qū)，在酸性區(qū)不但不穩(wěn)定和易于失活，而且難以進行反應(yīng)。特別是當(dāng)反應(yīng)溫度高于室溫或反應(yīng)系統(tǒng)中含有有機溶劑，如酒精時，這些脲酶顯示出大量失活的缺點。
本發(fā)明者作了大量的篩選性研究以發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生最適PH為酸性區(qū)并且高度穩(wěn)定的脲酶的微生物，發(fā)現(xiàn)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streprotoccus)的一個菌株，其細胞內(nèi)積累所需要的脲酶。隨后，發(fā)明者對該酶進行分離和純化，及進一步研究，并完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明目的標(biāo)是提供一種具有下列理化特征和最適PH于酸性區(qū)的新的脲酶(簡稱酸性脲酶)(1)作用它使1摩爾脲和1摩爾水產(chǎn)生2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。
(2)底物特異性它主要是有效地作用于脲。
(3)最適PH和PH穩(wěn)定性它的最適PH是1.5-5.5，在PH6-8.37℃下穩(wěn)定30分鐘。
(4)最適溫度和溫度穩(wěn)定性在最適PH下，它是最適溫度是55-75℃，在PH6，50℃下保持穩(wěn)定30分鐘。
(5)抑制劑它可被氯化汞和乙酰氧肟酸抑制。
(6)分子量經(jīng)凝膠過濾確定其分子量為100，000到250，000。
(7)比活性在最適PH和37℃下，它的比活性不低于20單位/毫克蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提出一種通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)乳菌屬或鏈球菌屬的一種細菌來生產(chǎn)酸性脲酶的方法。在生產(chǎn)本發(fā)明的酸性脲酶中使用的乳桿菌屬或鏈球菌屬產(chǎn)脲酶菌株，包括發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)JCM5867(IFO14511，F(xiàn)ERMP-8990)，發(fā)酵乳桿菌JCM5868(IFO14512，F(xiàn)ERMP-8991)，發(fā)酵乳桿菌JCM5869(IFO14513，F(xiàn)ERMP-8992)，reuteri乳桿菌(Lactobacillusreuteri)UM-12(IFO14629，F(xiàn)ERMP-9456)，reuteri乳桿菌UM-18(IFO14630，F(xiàn)ERMP-9457)，reuteri乳桿菌Rt-5(IFO14631，F(xiàn)ERMP-9458)，ruminis乳桿菌(Lactobacillusruminis)PG-98(IFO14632，F(xiàn)ERMP-9459)，輕型鏈球菌(Streptococcusmitior)PG-154(IFO14633，F(xiàn)ERMP-9460)，牛鏈球菌(Streptococcusbovis)PG-186(IFO14634，F(xiàn)ERMP-9461)和唾液腺鏈球菌(Streptococcussulivarius)PG-186(IFO14746)可以作為例子來說明。上述的IFO編號系日本大阪發(fā)酵研究所保藏菌種編號(地址Juso-honmachi2-Chome，Yodogawa-ku，osaka532，Japan)，F(xiàn)ERMP編號系日本國際貿(mào)易和工業(yè)部，工業(yè)科技分部，發(fā)酵研究所(FRI)的保藏編號(地址1-3，Higashil-Chome，Tsukuba-shi，lbarakiken305，Japan)。
發(fā)酵乳桿菌JCM5867(IFO14511)，JCM5868(IFO14512)和JCM5869(IFO14513)株列于IFO發(fā)行的研究通訊(№13，Page94，1987)上。
按下表的日期保藏于FRI的這些微生物現(xiàn)已轉(zhuǎn)到布達佩斯條約貯存，并如下表所示以FERMBP編號貯存于FRI。
微生素IFO貯存日期布達佩斯條約登記號CCTCC發(fā)酵乳桿菌JCM58671986年10月4日FERMBP-1454M87078JCM58681986年10月4日FERMBP-1445M87079JCM58691986年10月4日FERMBP-1446M87080reuteri乳桿菌UM-121987年7月7日FERMBP-1904UM-181987年7月7日FERMBP-1905Rt-51987年7月7日FERNBP-1447M87081ruminis乳桿菌PG-981987年7月7日FERMBP-1906輕型鏈球菌PD-1541987年7月7日FERMBP-1448M87083
牛鏈球菌PG-1861987年7月7日FERMBP-1449M87084菌株P(guān)G-303W于1988年4月14日貯存于FRI編號為FERMBP-1856rellteri乳桿菌UM-12，UM-18，Rt-5和ruminis乳桿菌PG-98細菌學(xué)特性介紹于下
乳桿菌PG-98的細菌學(xué)特性如下列來源豬盲腸細胞形態(tài)短桿狀(0.6-0.8x1.0-1.5)活動力-孢子形成-革蘭氏染色+氧需要微需氧有氧發(fā)酵試驗酵解酵解類型同質(zhì)L-乳酸過氧化氫酶-氧化酶-硝酸鹽還原-
明膠液化-淀粉水解(微弱)+七葉苷分解+MR試驗(微弱)+VP試驗-吲哚產(chǎn)生-硫化氫產(chǎn)生-精氨酸產(chǎn)氨-石芯指示無變化葡萄糖產(chǎn)氣-最適生長溫度30-37℃45℃下生長-15℃下生長-PH4.0下生長-PH9.6下生長-含3%NaCl-培基中生長含6.5%NaCl-培基中生長α-溶血-β-溶血-酸性產(chǎn)物核糖醇-阿拉伯糖-
阿拉伯醇-熊果苷-纖維二糖+半乳糖醇-果糖+半乳糖+(Gluconate)-葡萄糖酸鹽葡萄糖+甘油-肌醇-菊粉-乳糖-麥芽糖+甘露醇-甘露糖+松三糖-蜜二糖-α-甲基葡萄糖苷-棉子糖+鼠李糖-核糖-唾液酸+山梨醇-
>
上表中姆臠ys，Asp，Glu，Orn，Ser，和m-DAP分別代表賴氨酸，天冬氨酸，丙氨酸，谷氨酸，鳥氨酸，絲氨酸和對二氨基庚二酸?！癗D”表示該項試驗未進行。為按上述細菌學(xué)特性對各菌株于以歸類，查閱Bergey鑒定細菌學(xué)手冊第2卷(1986)提示，UM-12，UM-18，和Rt-5株足以歸類于reuteri乳桿菌，雖然它們與文獻所述特性稍有不同UM-18和Rt-5株對分解阿拉伯糖，果糖，核糖產(chǎn)酸反應(yīng)陰性(Rt-5核糖產(chǎn)酸微弱陽性)。由于UM-12和Rt-5在生長溫度和營養(yǎng)缺陷型方面有所差異，故認為它們是突變菌株。PG-98株的特性與rumines乳桿菌特性相當(dāng)一致。PG-154株，雖然α-溶血陰性，但屬輕型乳桿菌;PG-186株雖然對七葉苷的水解陰性，也屬牛鏈球菌，PG-303株為唾液鏈球菌。
為積累酸性脲酶而培養(yǎng)這些菌株可以通過常規(guī)操作的靜置培養(yǎng)，振蕩培養(yǎng)，浸沒的需氧培養(yǎng)或固體培養(yǎng)，或持續(xù)性或在間歇性基礎(chǔ)培養(yǎng)基上來進行。特別理想的是靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)基可以是一種常用的微生物生長培養(yǎng)基。作為碳源，菌株生長時可被同化的一種以上的底物能從各種碳水化合物，油，脂肪，脂肪酸，有機酸，乙醇及其它物質(zhì)中選擇。作為碳源，可被應(yīng)用為有機氮源物質(zhì)有胨，大豆粉，棉籽粉，玉米浸液，酵母提取物，肉提取物，麥芽提取物，乳清，等，以及無機氮化合物如硫酸銨，氯化銨，亞硝酸銨，磷酸銨等。這些原料可按需要單獨使用或結(jié)合應(yīng)用。除了這些碳源和氮源外，培養(yǎng)基最好還含有一些必需的因子和促生長劑，如無機離子，氨基酸，維生素等，以利生長和酶的產(chǎn)生。此外，在某些情況下加入脲和硫脲來誘生酸性脲酶。培養(yǎng)期間為控制PH和泡沫，加入苛性鹼溶液，碳酸鈉溶液或一種鈣鹽被證明是有利的。
作為溫育溫度，適于所用菌株生長的溫度能被選擇。通常，培養(yǎng)在15-55℃成功地進行，最好是在25-45℃。溫育時間應(yīng)足夠該菌生長和酸性脲酶的產(chǎn)生，一般維持5-120小時。
于上述條件下培養(yǎng)后，一般可見該酸性脲酶出現(xiàn)于微生物細胞之中。因此，用離心收集，沉降，結(jié)絮或在多孔的聚合材料或陶瓷材料濾膜上過濾的活細胞先經(jīng)以下處理，即冷凍干燥，勻漿器處理，超聲波破碎，滲透壓處理，細胞壁膜溶解，表面活性劑處理等。由此而溶解出的酶再經(jīng)過適當(dāng)?shù)某Ｓ妹讣兓椒ㄌ幚?，如精蛋白處理，分級沉淀，有機溶劑處理，等電聚焦，電泳，離子交換層析，凝膠過濾，親和層析，結(jié)晶等，得到一種同質(zhì)蛋白質(zhì)的酶制品。
檢測酶活性的方法已講過的該脲酶活性值在PH4.0，37℃下經(jīng)下列步驟測定。2ml適度稀釋的酶溶液在37℃下溫育5分鐘。向該酶溶液中加入預(yù)溫于37℃的底物溶液2ml。振蕩后，37℃下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)后立即向混合液中加入10%三氯乙酸4ml，并離心(8，000轉(zhuǎn)/分，5分鐘)。上清液2ml并加水至20ml，向4ml一份的該溶液中加入呈色試劑A2ml，輕柔地混合。再加呈色試劑B2ml，再輕柔混合，37℃下反應(yīng)進行30分鐘。然后，以水為對照測定波長640nm下的吸光值。
另一方面，上述酶稀釋液2ml與作為底物替代物的檸檬酸鹽緩沖液0.2M2ml混合，37℃下反應(yīng)30分鐘。所獲反應(yīng)混合液作為酶的本底，(空白)試驗按上述方法同樣步驟處理。
此外，為取得標(biāo)準(zhǔn)液可取標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(50μg/ml)2ml，10%三氯乙酸1ml和0.2M的檸檬酸鹽緩沖液0.5ml混合并用水稀釋至20ml，所得溶液按上述步驟同樣呈色反應(yīng)進行。另一方面，取10%三氯乙酸1ml和0.2M檸檬酸鹽緩沖液0.5ml混合并用水稀釋至20ml，稀釋液按上述同樣呈色反應(yīng)處理以作為標(biāo)準(zhǔn)品的本底試驗。
酶反應(yīng)活性按下列公式計算。
酶活性(單位/毫克)＝
(OD值(酶溶液)-OD值(酶本底))/(OD值(標(biāo)準(zhǔn)品液)-OD值(標(biāo)準(zhǔn)品本底)) (稀釋系數(shù))/(酶數(shù)量(mg)) ×1/30每分鐘作用于1μMNH3的酶量推定為1個單位(1μ)。上述測定過程所用試劑和稀釋液的制備如下。底物液系將脲1.0g溶于0.2M檸檬酸鹽緩沖液中制成100ml。10g三氯乙酸溶于水900ml中制成10%三氯乙酸液。呈色試劑A(苯酚-硝普鈉溶液)系用酚5g和硝普鈉25mg溶于水成500ml而制成。呈色試劑B液(鹼性次氯酸鈉液)用氫氧化鈉5.0g和次氯酸鈉液(有效氯濃度5%)7.5ml溶于水至500ml制成。0.2M檸檬酸鹽緩沖液用檸檬酸(含1分子水)25.18g和檸檬酸鈉(2分子水)23.59g加水至1000ml(PH4.0)制成。標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液(50μ/ml)用精確稱量硫酸銨250.0mg溶于水中至250ml，取該液5ml再用水稀釋至100ml而成。
與既往的脲酶不同，該新脲酶活性最適PH在酸性區(qū)間。而且，在PH穩(wěn)定性方面優(yōu)于以往的脲酶。因此，本發(fā)明的脲酶更適于商品化使用。特別是本脲酶有超過20單位/毫克蛋白質(zhì)的比活性，因此，在一個低劑量下，它足以有效地從強酒精飲料中降解和排除脲(日本專利申請N.179738/1987)，從而可用以提高這些產(chǎn)品的質(zhì)量。另一方面，在血和尿標(biāo)本的臨床試驗室檢驗和測定酒精飲料中的脲實驗，該酶是一種很有效的試劑(日本專利申請N.171751/1987)。例如，日本米酒中脲的測定可用該酶分解脲為氨氣和應(yīng)用吲哚酚的方法而高精度地完成。
圖注

圖1，2，3，4顯示例1脲酶活性與PH和溫度間的關(guān)系。
在圖1可顯示37℃下的PH-活性曲線，0，和X分別表示0.1M檸檬酸鹽緩沖液，0.1M醋酸鹽緩沖液，和0.1M佛羅納-醋酸-鹽酸緩沖液中測定的結(jié)果。
圖2顯示該酶的PH穩(wěn)定性，說明37℃下放置30分鐘后的殘留酶活性。
圖3顯示在PH4，0.1M檸檬酸鹽緩沖液中的溫度-酶活性曲線。
圖4顯示該酶的溫度穩(wěn)定性，指出在各種溫度下作用30分鐘后的殘留酶活性;0表示PH4，為PH6(0.1M檸檬酸緩沖液)。
圖5到8，9到12，13到16，17到20，21到24，25到29，29到32分別顯示按例2，3，4，5，6，7和8中脲酶活性與PH和溫度間的關(guān)系。圖5-32的試驗，除PH穩(wěn)定性試驗以外均使用0.1M檸檬酸鹽緩沖液進行。
下列例子希望能更詳細地說明本發(fā)明，但決不應(yīng)視為是對本發(fā)明范圍的限制。
例1將生長于一種商品GAM半液體培養(yǎng)基(NissuiSeyyaku公司出品，日本)的reuteri乳桿菌Rt-5(IFO14631，F(xiàn)ERMBP-1447，M87081)接種于10個錐形瓶(容量200ml)內(nèi)，每瓶內(nèi)含50ml無菌種子培養(yǎng)基，其成分為3%葡萄糖，1.5%胨，1%肉浸膏，0.8%酵母浸膏0.5%氧化鈉，0.2%無水醋酸鈉，0.005%硫酸鎂(約含4分子水)和0.001%硫酸鎳(6HO)(用30%NaOH調(diào)PH至7.0)。34℃下靜置培養(yǎng)24小時。由此制備的種子培養(yǎng)物再轉(zhuǎn)移至10個錐形瓶內(nèi)(容量2升)。每瓶內(nèi)含上述同樣成分的無菌培養(yǎng)基11，32℃下靜置培養(yǎng)2天，上述步驟得到顯示21.6單位/ml酸性脲酶活性的培養(yǎng)物101。
上述培養(yǎng)物離心獲得細胞，以0.05MPH7.2磷酸鹽緩沖液沖洗兩次，以含0.05M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)，1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇的溶液41懸浮細胞。加入直徑0.1-0.2mm的玻璃球2升后，細胞懸液在4，500轉(zhuǎn)/分下機械破碎20分鐘。破碎細胞懸液被離心，再向上清液中加入終濃度達80%的乙醇。經(jīng)離心收集沉積團塊，復(fù)溶于PH7.0是0.05MTris-HCl緩沖液(含1mMEDTA和2-ME(二巰基乙醇)中，溶液過葡萄聚糖(Sephodex)G-100柱(直徑7.5cm，長度90cm)為吸附和洗脫使用同一緩沖液。收集酶活性部分，再過以同一緩沖液平衡后的SephadexG-200柱(4.5cm×150cm)，使用同一緩沖液進行吸附和洗脫。收集酶活性部分，再過DEAE-SepharoseCL-6B柱，使用含0-0.7M氯化鈉的上述同一緩沖液經(jīng)梯度提取法進行吸附和洗脫。收集酶活性部分。在帶有一個Amicon8200UK-50薄膜的超濾器中(排除分子量界限50，000)對該溶液于以濃縮，緩沖液改用含1mM2ME的0.005M磷酸鹽緩沖液(PH7.0)。然后，溶液再過親和層析柱(4cm×50cm)該柱以Bio-Rad公司出品的Affiprep10和羥基脲為吸附劑，用0.005M-0.044M磷酸緩沖液為梯度洗脫液進行。收集酶活性部分，使用上述同樣超濾器進行濃縮，隨后分級沉淀和凍干而獲得純酶制品104mg。該制品比活性為336.5u/mg蛋白，在聚丙烯酰胺凝膠電泳上顯示單一的蛋白區(qū)帶。純化過程見表1。
表1純化步驟總蛋白總活性比活性產(chǎn)率(X10U)(U/mg蛋白)(%)無細胞提取物14.1183.313.0100.0乙醇5.2157.630.386.0SephadexG-1003.0140.146.776.4SephadexG-2001.078.778.742.9DEAE-Sepharose0.3760.7164.033.1CL-6B親和層析凝膠0.1035.4354.019.3凍干0.1035.0336.519.1上述過程所獲凍干酸性脲酶的酶化學(xué)和理化特性如下。
酸性脲酶A(1)活性該酶使1分子脲和1分子水產(chǎn)生2分子氨氣和1分子二氧化碳。
(2)底物特異性該酶最有效地作用于脲，并在一定程度上作用于乙脲，二脲，甲脲，尿囊酸和尿囊素(表2)表2底物比活性(%)脲100.0尿囊素1.2尿囊酸8.8聯(lián)二脲64.1甲脲4.9乙脲41.1(3)最適PH和PH穩(wěn)定值如圖1所示，該酶最適PH為2-4.5。圖2顯示了該酶在37℃和各種PH下靜置30分鐘后的殘留活性。圖2可見該酶在PH6-8下很穩(wěn)定，在2-10區(qū)間尚穩(wěn)定。
(4)最適溫度和溫度穩(wěn)定性如圖3所示，該酶最適溫度為60-70℃。圖4顯示了該酶在PH4和6下和變溫條件下靜置30分鐘后的殘留酶活性，從圖4可見該酶在PH660℃下穩(wěn)定，PH4，60℃下尚穩(wěn)定。
(5)抑制劑如表3所示，該酶被氯化汞，硝酸銀，碘乙酸和乙酰氧肟酸抑制。
表3抑制劑濃度比活性(%)無100.0AgNO30.05mM 0.7HgCl20.05mM 0.6碘乙酸1mM15.4乙酰氧肟酸10mM10.0(6)分子量經(jīng)SephadexG-200凝膠過濾測定為220，000。
(7)等電點經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠上的等電聚焦測定，該酶的等電點為4.7。
(8)晶體結(jié)構(gòu)該酶不易結(jié)晶(9)元素分析由于難以結(jié)晶而未能測定。
(10)米氏常數(shù)(km)該酶km值為1.7mM(PH4，0.1M檸檬酸緩沖液)。
例2以例1同樣的方式得到發(fā)酵乳桿菌JCM5867(lFO是14511，F(xiàn)ERMBP-1454，M87078)的種子培養(yǎng)物。將其接種到含1升無菌培養(yǎng)基的錐形瓶(2升容積)中。培養(yǎng)基含4%葡萄糖，1.5%胨，1%肉提取物，0.8%酵母膏，0.5%氯化鈉，0.2%無水醋酸鈉，0.5%尿素，0.05%硫酸錳(約含4分子水)，0.002%硫酸鎳(帶6個水)，0.002%硫酸鈷(帶7個水)，0.005%硫酸錫和0.001%硫酸鍶(用氫氧化鈉將PH調(diào)至7.0。在32℃靜置培養(yǎng)2天。得到10升的培養(yǎng)液，顯示出5.6單位/毫升的酸性脲酶活性。
離心上述培養(yǎng)液，收集細胞，用0.05M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)洗兩次，再懸浮在含0.05M磷酸緩沖液(PH7.2)，1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇的4升溶液中。加入2升直徑為0.1到0.2毫米的玻璃珠，然后以4.500轉(zhuǎn)/分機械破碎細胞20分鐘，再離心該破碎細胞懸液，向上清液中加乙醇使乙醇終濃度為80%。離心收集沉淀，復(fù)溶在含1mMEDTA和2-巰基乙醇的0.05MTris-HCl緩沖液(PH7.0)中。將所得溶液進SephadexG-100柱(直徑7.5cm，長90cm)，用與吸附同樣的緩沖液洗脫。將有活性組分合在一起再進SephadexG-200柱(直徑4.5cm，150cm)，用同樣緩沖液洗脫。將所得活性級分再匯集，進DEAT-SephadexA-50柱，用同樣緩沖液平衡及用含0-0.7M氯化鈉的同樣緩沖液梯度洗脫。匯集活性級分。該溶液的比活性為35.2單位/毫克，活性收率為43.7%。這個產(chǎn)物的酶化學(xué)性質(zhì)如下
酸性脲酶B(1)作用該酶使1摩爾的脲和1摩爾的水產(chǎn)生2摩爾的氨氣和1摩爾的二氧化碳。
(2)底物特異性該酶對脲作用最有效，也在一定程度上作用于乙脲，聯(lián)二脲，甲脲和尿囊酸(見表4)表4底物相對活性(%)脲100.0脲囊素0.0尿囊酸3.7聯(lián)二脲72.0甲脲14.0乙脲46.0(3)最優(yōu)PH和PH穩(wěn)定性如圖5所示一最優(yōu)PH約為3。圖6表示該酶置于37℃不同PH下30分鐘后殘留的活性。從圖6似乎看出酶PH6-8時是穩(wěn)定的。
(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性如圖7所示，該酶最優(yōu)溫度為60-70℃，圖8表示該酶置于PH4和6下30分鐘后殘留的活性。從圖8看出似乎該酶在PH6時達80℃仍是穩(wěn)定的，在PH4時，到60℃仍是穩(wěn)定的。
(5)抑制劑如表5所示，該酶被氯化汞，硝酸銀，硫酸銅，碘乙酸和乙酰氧肟酸抑制表5抑制劑濃度相對活性(%)無100.0AgNO30.05mM 0.4CuSO4.5H2O 0.4mM 0.8HgCl20.005mM 0.8碘乙酸1mM14.9乙酰氧肟酸10mM16.0(6)分子量根據(jù)SephadexG-200凝膠過濾測定，該酶分子量為210，000到220，000。
(7)等電點用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦測定，該酶等電點為4.8。
(8)晶體結(jié)構(gòu)該酶不易結(jié)晶(9)元素分析由于不易結(jié)晶，沒有測定(10)米氏常數(shù)(km)該酶米氏常數(shù)為1.0mM(在PH2，0.1M檸檬酸緩沖液中)。
例3將生長在商品GAM半液體培養(yǎng)基(Nissui seiyaku公司產(chǎn)品，日本)上的牛鏈球菌PG-186(IFO14634，F(xiàn)ERM BP-1449，M87084)接種到10個錐形瓶(200ml容量)中，每瓶內(nèi)裝50ml無菌的種子培養(yǎng)基，內(nèi)含4%葡萄糖，1.5%胨，1%肉浸膏，0.8%酵母浸膏，0.5%氯化鈉，0.2%無水醋酸鈉，0.5%脲(尿素)，0.005%硫酸錳(約含4H2O，和0.001%硫酸鎳(6分子H2O)(用30%氫氧化鈉調(diào)PH至7.0)。將其在34℃下靜置溫育24小時。將如此制備的種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入10入錐形瓶中(容積2升)，每瓶含1升上述同樣成分的無菌培養(yǎng)基，在32℃靜置溫育2天。得到10升培養(yǎng)液，顯示7.6U/ml的酸性脲酶活性。
離心上述培養(yǎng)液回收細胞，用0.05M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)洗兩次，將其懸浮于4升含0.05M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇的溶液中。加入2升直徑為0.1-0.2毫米的玻璃球，以4，500轉(zhuǎn)/分機械破碎細胞20分鐘。離心破碎細胞懸液，向上清液加乙醇，使乙醇終濃度為80%。再離心收集沉淀，將其復(fù)溶于含1mMEDTA和2-巰基乙醇的0.05MTris-HCI緩沖液(PH7.0)中。然后將該液過SephadexG-100柱(直徑7.5cm，長90cm)吸附，用同樣緩沖液洗脫。匯集活性級分，再將其過SephadexG-200柱(直徑4.5cm，長150cm)用同樣緩沖液平衡和洗脫。將匯集的活性級分再進入DEAE-SephadexCL-6B柱，用含0-0.7M氯化鈉的同樣緩沖液梯度洗脫。匯集活性級分后，將其在帶Amicon8200UK-50膜(排除分子量為50，000的分子)的超濾器中濃縮。緩沖液改為含1mM2-巰基乙醇的0.005M磷酸鹽緩沖液(PH7.0)。然后將溶液進親和凝膠層析柱(直徑4cm，長50cm)，該柱是用Affiprep10(BroRad產(chǎn)品)和羥基脲作吸附材料制備的，然后用0.005M-0.044M磷酸鹽緩沖液梯度洗脫。匯集活性級分，用上述超濾法濃縮，再分級沉淀，冷凍干燥，得到104毫克純酶粉。該酶比活暈 24u/mg蛋白。
上述所得凍干酸性酶的酶化學(xué)及物理化學(xué)性質(zhì)如下酸性脲酶C(1)作用該酶將1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。
(2)底物特異性該酶有效地作用于脲(見表6)
表6底物相對活性(%)脲100.0尿囊酸0.0聯(lián)二脲0.0乙脲0.0(3)最適PH和PH穩(wěn)定性如圖9所示，該酶最優(yōu)PH為5。圖10表示該酶在37℃和不同PH水平靜置30分鐘殘留活性。從圖10看出該酶象在PH6-10間都是穩(wěn)定的。
(4)最適溫度和溫度穩(wěn)定性如圖11所示，該酶最優(yōu)溫度為60-70℃，圖12表示在PH6及不同溫度下放置30分鐘該酶的殘留活性。從圖12看在PH6時，達50℃時該酶還是穩(wěn)定的。
(5)抑制劑如表7所示，氯化汞和乙酰氧肟酸抑制該酶。
表7抑制劑濃度相對活性(%)無100.0HgCl21mM 0.0碘乙酸10mM89.8乙酰氧肟酸10mM9.8(6)分子量經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳測定(見H，Eng等人;Can，J，Microbial，32，487(1986)，該酶分子量約為190，000。
SephadexG-200凝膠過濾測定其分子量約為170，000。
(7)等電點根據(jù)聚丙烯酰胺上的等電聚焦測定，該酶等電點約為4.7。
(8)結(jié)晶結(jié)構(gòu)該酶難以結(jié)晶。
(9)元素分析由于難結(jié)晶，沒有測定(10)米氏常數(shù)(km)該酶米氏常數(shù)為0.2mM(PH5.0，0.1M檸檬酸緩沖液中)。
例4以例3同樣方式培養(yǎng)輕型鏈球菌PG-154(IFO14633，F(xiàn)ERMBP-1448，M87083)。所得10升培養(yǎng)液顯示5.4單位/毫升蛋白質(zhì)。
離心上述培養(yǎng)液，回收細胞，用0.05M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)洗兩次，再懸入4升含0.05M磷酸鹽緩沖液(PH7.2)，1mMEDTA和1mM二硫蘇糖醇的溶液中。加2升直徑為0.1-0.2毫米的玻璃球后，以4，500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速機械破碎細胞20分鐘。離心破碎的細胞懸液，向上清液加乙醇，使其終濃度為80%。離心收集沉?，将其复溶诱?mMEDTA和2-巰基乙醇的0.05MTris-HCl緩沖液(PH7.0)。將所得溶液過SephadexG-100柱(直徑7.5cm，長90cm)，用同樣緩沖液洗脫。匯集活性級分，將其過SephadexG-200柱(直徑4.5cm，長150cm)用與吸附一樣的緩沖液平衡和洗脫。再匯集所得活性級分，進DEAE-SephadexCL-6B柱，用含0.7M氯化鈉的同樣緩沖液梯度洗脫。匯集活性級分，該溶液比活性為76.3單位/毫克蛋白，活性收率為38.7%，該產(chǎn)物酶化學(xué)性質(zhì)如下酶性脲酶D(1)作用該酶使1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。
(2)底物特異性該酶有地作用于脲，也一定程度上作用于聯(lián)二脲和乙脲(見表8)。
表8底物相對活性(%)脲100.0尿囊酸0.0聯(lián)二脲22.0乙脲18.0(3)最優(yōu)PH和PH穩(wěn)定性如圖13所示，該酶最優(yōu)PH為4-5，圖14表示將該酶放置37℃不同PH水平30分鐘后殘留的活性。從圖14看出似乎該酶在PH4-8時仍然穩(wěn)定。
(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性如圖15所示，該酶最優(yōu)溫度給為60℃，圖16表示將該酶放置PH6下30分鐘后殘留的活性。從圖16看出似乎該酶在PH6高達60℃時仍是穩(wěn)定的。
(5)抑制劑如表9所示，氯化汞，碘乙酸和乙酰氧肟酸是該酶抑制劑。
表9抑制劑濃度相對活性(%)無100.0HgCl1mM0.0碘乙酸10mM0.6乙酰氧肟酸10mM19.2(6)分子量用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其分子量約為160，000，而用SephadexG-200凝膠過濾測定，該酶分子量約為170，000。
(7)等電點在聚丙烯酰胺凝膠上等電聚焦測定該酶等電點約4.6。
(8)結(jié)晶結(jié)構(gòu)本酶不易結(jié)晶。
(9)元素分析由于難于結(jié)晶，故未測定。
(10)米氏常數(shù);
該酶米氏常數(shù)為0.3mM(PH4.0，0.1M檸檬酸緩沖液中)。
例5以例3同樣方式培養(yǎng)唾液鏈球菌PG-303W(IFO14746，F(xiàn)ERMBP-1856)。所得10升培養(yǎng)液顯示活性為4.3單位/毫＝門嘌焊堇 步驟純化，得到酶溶液比活性為68.2單位/毫克蛋白。活性收率為41.2%，本產(chǎn)品酶化學(xué)性質(zhì)如下酸性脲酶E(1)作用該酶使1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。
(2)底物特異性該酶主要有效作用于脲，一定程度上也作用于聯(lián)二脲和尿囊酸(見表10)表10底物相對活性(%)脲100.0尿囊酸12.0聯(lián)二脲60.0乙脲50.0(3)最優(yōu)PH和PH穩(wěn)定性如圖17所示，該酶最優(yōu)PH是4。圖18表示將該酶放置37℃，不同PH水平30分鐘后殘留的活性。從圖18看出似乎在PH6-11時該酶仍是穩(wěn)定的。
(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性如圖19所示，該酶最優(yōu)溫度為60-70℃。圖20表示該酶被放置PH為6和不同溫度下30分鐘殘留的活性。從圖20看出好象在PH6高達60℃時該酶仍是穩(wěn)定的。
(5)抑制劑從表11看出，氯化汞和乙酰氧肟酸抑制該酶。
表11抑制劑濃度相對活性(%)無100.0HgCl20.05mM 2.0碘乙酸10mM100.0乙酰氧肟酸10mM15.2(6)分子量用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定酶分子量約為110，000。用SephadexG-200凝膠過濾測定，該酶分子量約為140，000。
(7)等電點在聚丙烯酰胺凝膠上等電聚焦測定，該酶等電點約為4.7(8)結(jié)晶結(jié)構(gòu)該酶難以結(jié)晶
(9)元素分析由于難結(jié)晶，未測定。
(10)米氏常數(shù)該酶的米氏常數(shù)為0.2mM(PH4，0.1M檸檬酸緩沖液)。
例6用例1同樣方式培養(yǎng)ruminis乳桿菌PG-98(IFO14632，F(xiàn)ERMBP-1906)。所得10升培養(yǎng)液顯示5.2單位/毫升的酸性脲酶活性。如例2所述將該培養(yǎng)液純化，所得酶比活性為36.7單位/毫克蛋白，活性收率為42.8%。該產(chǎn)品酶化學(xué)性質(zhì)如下酸性脲酶F(1)作用該酶將1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。
(2)底物特異性該酶主要是有效地作用于脲，一定程度上也作用于乙脲和聯(lián)二脲(見表12)。
表12底物相對活性(%)脲100.0尿囊酸0.0聯(lián)二脲26.0乙脲5.0
(3)最優(yōu)PH和PH穩(wěn)定性如圖21所示，該酶最優(yōu)PH為5。圖22表示將該酶置于37℃，不同PH下30分鐘殘留的酶活性。從圖22可看出該酶在PH4-8時是穩(wěn)定的。
(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性如圖23所示，該酶的最優(yōu)溫度為55-60℃，圖24表示將該酶放置PH6下30分鐘后殘留的活性，從圖24看出該酶在PH6，溫度高達55℃及PH4，溫度達30℃時都是穩(wěn)定的。
(5)抑制劑如表3所示，氯化汞，碘乙酸和乙酰氧肟酸抑制該酶。
表13抑制劑濃度相對活性(%)無100.0HgCl20.05mM 0.0碘乙酸10mM50.0乙酰氧肟酸10mM0.0(6)分子量用SephadexG-200凝膠過濾測定，該酶分子量約為150，000。
(7)等電點在聚丙烯酰胺凝膠上等電聚焦測定該酶等電點約為4.7。
(8)結(jié)晶結(jié)構(gòu)本酶難于結(jié)晶(9)元素分析由于其難于結(jié)晶，故未測定。
(10)米氏常數(shù)該酶米氏常數(shù)為1.2mM(PH5，0.1M檸檬酸緩沖液)例7如例1同樣方式培養(yǎng)reuteri乳桿菌M-12(IFO14629，F(xiàn)ERMBP-1904)。得到10升顯示3.6單位/毫升的酸性脲酶活性的培養(yǎng)液。用例2步驟將上述培養(yǎng)液純化，使酶的比活性達33.4單位/毫升蛋白?；钚允章蕿?5.3%，該產(chǎn)品的酶化學(xué)性質(zhì)如下酸性脲酶G(1)作用該酶使1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。
(2)底物特異性本酶主要是有效地作用于脲，一定程度上也作用于乙脲和聯(lián)二脲(見表14)。
表14底物相對活性(%)脲100.0尿囊酸0.0聯(lián)二脲7.9乙脲25.5(3)最優(yōu)PH和PH穩(wěn)定性如圖25所示，該酶的最優(yōu)PH是4。圖26表示將酶置于37℃和不同PH下30分鐘后殘留的活性。從圖26可看出該酶在PH4-8時是穩(wěn)定的。
(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性如圖27所示，該酶最優(yōu)溫度為70-75℃。圖28表示將酶放置PH4和PH6下30分鐘后的殘留活性。從圖28可看出該酶在PH6溫度達75℃及PH為6溫度為65℃時都是穩(wěn)定的。
(5)抑制劑如表15所示，氯化汞和乙酰氧肟酸抑制該酶。
表15抑制劑濃度相對活性(%)無100.0HgCl0.05mM0.0碘乙酸10mM100.0乙酰氧肟酸10mM17.1(6)分子量用SephadexG-200凝膠過濾測得該酶分子量約為210，000。
(7)等電點在聚丙烯酰胺凝膠上的等電聚焦測定其等電點約為4.8。
(8)結(jié)晶結(jié)構(gòu)該酶難于結(jié)晶。
(9)元素分析由于難以結(jié)晶，而未測定。
(10)米氏常數(shù)該酶米氏常數(shù)為1.3mM(PH4，0.1M檸檬酸緩沖液中)。
例8用例1同樣方式培養(yǎng)reuteri乳桿菌M-18(IFO14630，F(xiàn)ERMBP-1905)。得到10升顯示4.5單位/毫升的酸性脲酶活性的培養(yǎng)液。將上述培養(yǎng)液用例2步驟純化至酶比活性為39.8單位/毫克蛋白，活性收率41.7%。該產(chǎn)品酶化學(xué)性質(zhì)如下酸性脲酶H(1)作用該酶可使1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。
(2)底物特異性該酶主要是有效地作用于脲，一定程度上也作用于乙脲，聯(lián)二脲和尿囊酸(見表16)。
表16底物相對活性(%)脲100.0尿囊酸12.3聯(lián)二脲82.4乙脲66.2(3)最優(yōu)PH和PH穩(wěn)定性如圖29所示，本酶最優(yōu)PH為3。圖30表示該酶置于37℃和不同PH下30分鐘后殘留的活性。從圖30可看出該酶在PH5-8時是穩(wěn)定的。
(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性如圖31所示，本酶最優(yōu)溫度為70-75℃，圖3所示將該酶放置PH4和PH6下30分鐘后的殘留活性。從圖32可以看出，該酶在PH6，溫度達70℃及PH4溫度達65℃都是穩(wěn)定的。
(5)抑制劑如表17所示，該酶被氯化汞和乙酰氧肟酸抑制。
表17抑制劑濃度相對活性(%)無100.0HgCl0.05mM0.0碘乙酸10mM99.0乙酰氧肟酸10mM7.9(6)分子量用SephadexG-200凝膠過濾測定本酶分子量約為230，000。
(7)等電點在聚丙烯酰胺凝膠上進行等電聚焦測定其等電點為約4.5。
(8)結(jié)晶結(jié)構(gòu)本酶很難結(jié)晶。
(9)元素分析由于難于結(jié)晶，故未測定。
(10)米氏常數(shù)該酶米氏常數(shù)為4.8mM(PH3，0.1M檸檬酸緩沖液中)。
試驗例1用含不同乙醇濃度的反應(yīng)液測定，例3-5所得酸性脲酶C、D和E的酶活性。如表18所示，這些脲酶既使在20或50%乙醇濃度下都能對脲作用。
表18酸性脲酶乙醇濃度(%)02050酸性脲酶C10084.251.6酸性脲酶D10085.050.4酸性脲酶E10082.647.6(相對活性%)試驗例2將例1、2、6、7和8所得酸性脲酶A、B、F、G和H及Jack豆脲酶調(diào)至濃度為10單位/毫升，然后在20℃有20%乙醇存在時測定這些酶活性。結(jié)果見表19。
表19酸性脲酶相對活性(%)酸性脲酶A100.0酸性脲酶B95.0酸性脲酶F107.0酸性脲酶G119.7酸性脲酶H121.6Jack豆脲酶＊0.5注Jack豆脲酶是從Jack豆得到的脲酶，其最優(yōu)PH為7.0，它是來自P、L.BiochenicalsInc;USA公司。
權(quán)利要求
1.具有下列物理化學(xué)性質(zhì)的酸性脲酶(1)作用它使1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。(2)底物特異性它主要是有效地作用于脲。(3)最適PH值和PH穩(wěn)定性它最適PH是1.5到5.5；它在PH6-8，37℃下活性保持30分鐘穩(wěn)定性。(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性它在最優(yōu)PH下的最優(yōu)溫度是55到75℃，在PH6時溫度達50℃時它能保持穩(wěn)定性30分鐘。(5)抑制劑它被氯化汞和乙酰氧肟酸抑制。(6)分子量用凝膠過濾測定分子量為100，000至250，000。(7)比活性它在最優(yōu)PH和37℃時，比活性不低于20單位/毫升蛋白質(zhì)。
2.生產(chǎn)具有下列物理化學(xué)特性的酸性脲酶的方法(1)作用它使1摩爾脲和1摩爾水生成2摩爾氨氣和1摩爾二氧化碳。(2)底物特異性它主要是有效地作用于脲。(3)最優(yōu)PH和PH穩(wěn)定性它最優(yōu)PH為1.5到5.5;它在37℃，PH6-8時放置30分鐘仍是穩(wěn)定的。(4)最優(yōu)溫度和溫度穩(wěn)定性它在最優(yōu)PH下的最優(yōu)溫度為55-75℃，在PH6時溫度達50℃能保持穩(wěn)定性30分鐘。(5)抑制劑它被氯化汞和乙酰氧肟酸抑制。(6)分子量用凝膠過濾測定分子量為100，000到250，000。(7)比活性它在最優(yōu)PH和37℃時比活性不小于20單位/毫升蛋白質(zhì)。該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)或鏈球菌屬(Streptococcus)能產(chǎn)生具有上述性質(zhì)脲酶的微生物，從而在細菌培養(yǎng)液中產(chǎn)生和積累酸性脲酶，再從培養(yǎng)液收集該酸性脲酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2方法，其中的微生物屬于發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus Fermentum)，reueri乳桿菌(Lactobacillus reuteri)或ruminis乳桿菌(Lactobacillus ruminis)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2方法，其中的微生物屬于牛鏈球菌(Srteptococcus bovis)，輕型鏈球菌(Streptococcus mitior)，或唾液鏈球菌(Streptococcus Salivarius)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3方法，其中的微生物是發(fā)酵乳桿菌JCM5867(IFO14511，F(xiàn)ERM BP-1454，M87078)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3方法，其中的微生物是reuteri乳桿菌Rt-5(IFO14631，F(xiàn)ERM BP-1447，M87081)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3方法，其中的微生物是ruminis乳桿菌PG-98(IFO14632，F(xiàn)ERM BP-1906)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3方法，其中的微生物是reuteri乳桿菌UM-12(IFO14629，F(xiàn)ERM BP-1904)。
9.根據(jù)權(quán)利要求3方法，其中的微生物是reuteri乳桿菌UM-18(IFO14630，F(xiàn)ERM BP-1905)。
10.根據(jù)權(quán)利要求4方法，其中的微生物是牛鏈球菌PG-186(IFO14634，F(xiàn)ERM BP-1449，M87084)。
11.根據(jù)權(quán)利要求4方法，其中的微生物是輕型鏈球菌PG-154(IFO14633，F(xiàn)ERM BP-1448，M87083)。
12.根據(jù)權(quán)利要求4方法，其中的微生物是唾液鏈球菌PG-303W(IFO14746，F(xiàn)ERM BP-1856)。
全文摘要
用屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)微生物生產(chǎn)活性最優(yōu)pH在酸性區(qū)的新的脲酶。該脲酶在pH，溫度和對乙醇穩(wěn)定性均優(yōu)于通常的脲酶。
文檔編號C12N9/80GK1036405SQ8810423
公開日1989年10月18日 申請日期1988年7月9日 優(yōu)先權(quán)日1987年7月9日
發(fā)明者柿本茂八, 隅野靖弘, 鈴木節(jié)工 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社