本技術(shù)涉及飲品，尤其是涉及一種枸杞外泌體復(fù)合飲品及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、衰老是一種普遍的生理現(xiàn)象，表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)能力的漸行性下降、相關(guān)器官功能的響應(yīng)性衰退，在此過(guò)程中可觀測(cè)到衰老標(biāo)志物表達(dá)水平的變化。衰老不僅對(duì)個(gè)人的身心健康造成嚴(yán)重?fù)p害，也會(huì)加大家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)。

2、在人體各器官衰老過(guò)程中，骨骼肌組織往往伴隨著以肌萎縮為主的病理表型發(fā)生，主要表現(xiàn)為肌管直徑減小、衰老標(biāo)志物表達(dá)上升、骨骼肌細(xì)胞氧化性損傷和骨骼肌正常生理功能受損等。衰老性肌萎縮不僅增加運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病風(fēng)險(xiǎn)和糖尿病等慢性代謝性疾病的發(fā)病率，還會(huì)影響老年人的生活質(zhì)量，也進(jìn)一步加重了醫(yī)療系統(tǒng)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。隨著老齡化問(wèn)題日益嚴(yán)峻，探求一種有效、可行的抗骨骼肌衰老方案或輔助手段十分重要。

3、枸杞(lycium?barbarum?berry)作為一種傳統(tǒng)的、具備“藥食同源”特性的中草藥，它富含枸杞多糖、多酚類物質(zhì)、甜菜堿等多種生物活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、促生長(zhǎng)等作用。以往的研究表明，枸杞提取物可以通過(guò)抗氧化損傷等機(jī)制發(fā)揮抗衰老的作用。

4、外泌體(exosomes)是由細(xì)胞膜上剝離或細(xì)胞主動(dòng)分泌的粒徑為30nm-150nm的膜性囊泡，微生物、哺乳動(dòng)物、植物和人類細(xì)胞均可產(chǎn)生，具有促進(jìn)細(xì)胞間通信和調(diào)節(jié)生理及病理過(guò)程等作用。植物來(lái)源的類外泌體主要從新鮮植物中分離提取，與原植物具有相同的生物活性成分(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、植物化學(xué)物、mirna等)，因其有益作用和具有組織特異性，目前已被應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。

5、枸杞外泌體除了含有枸杞多糖、多酚等植物化學(xué)物質(zhì)，還攜帶mirna等生物活性物質(zhì)，且更易于被人體吸收。同時(shí)，1kg新鮮枸杞果實(shí)即可提取1×1012-13顆粒的枸杞外泌體，可保留新鮮果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分，也能在-80℃條件下保存半年。然而，枸杞外泌體雖具有良好的應(yīng)用前景，但由于其顆粒小，負(fù)載生物活性物質(zhì)有限，在常規(guī)存儲(chǔ)條件(4℃或-20℃)下極易降解，因此也較難單獨(dú)作為可短期儲(chǔ)存的產(chǎn)品應(yīng)用于市場(chǎng)，并且枸杞外泌體無(wú)色無(wú)味，感官性狀不及枸杞勻漿。

6、目前，市面上現(xiàn)有的非濃縮還原汁工藝(not?from?concentrate，nfc)提取的枸杞原漿產(chǎn)品，由新鮮枸杞經(jīng)低溫壓榨而成，但是，該產(chǎn)品存在原料標(biāo)準(zhǔn)不一(由于枸杞nfc果汁對(duì)于原料來(lái)源要求不高，通常包含不同品種及容易摻雜發(fā)霉或不新鮮的果實(shí))和工藝程序限制等缺陷，會(huì)導(dǎo)致植物外泌體、mirna等生物活性物質(zhì)流失，影響飲品的整體抗氧化、抗炎和/或抗衰老的能力，目前這些缺陷常被忽視，也尚未有能有效解決這一缺陷的工藝或方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種枸杞外泌體復(fù)合飲品及其制備方法和應(yīng)用。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采取的技術(shù)方案為：

3、本技術(shù)提供了一種枸杞外泌體復(fù)合飲品，所述枸杞外泌體復(fù)合飲品包括枸杞外泌體和枸杞原漿；

4、所述枸杞原漿包括枸杞鮮果、抗氧化劑和水。

5、枸杞作為一種歷史悠久的藥食同源的傳統(tǒng)中藥材，含有多種生物活性物質(zhì)。但枸杞原漿產(chǎn)品存在部分生物活性物質(zhì)流失(特別是枸杞外泌體)的缺陷，影響枸杞的功效發(fā)揮。

6、外泌體具有已證實(shí)的藥理活性、良好的生物相容性、特異性的組織靶向性和良好的載藥能力，被認(rèn)為是一種很有前途的治療活性物質(zhì)和藥物傳遞載體。與來(lái)源于哺乳動(dòng)物的外泌體相比，植物來(lái)源的外泌體因具有易分離、收率高、來(lái)源廣泛、活性明顯等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。植物外泌體的形態(tài)和組成均與動(dòng)物細(xì)胞外囊泡相似，且具有與來(lái)源植物相似的功能，在非細(xì)胞自主方式甚至物種間信息交換方面都發(fā)揮著重要作用。

7、本技術(shù)發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量研究及試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與枸杞果實(shí)或枸杞原漿相比，來(lái)源于枸杞的外泌體可能含有同枸杞鮮果成分相似的生物活性物質(zhì)(例如枸杞多糖、甜菜堿等)，具有同樣的抗氧化及抗衰老作用。枸杞外泌體攜帶的蛋白質(zhì)、mirna等生物活性成分能直接被胞吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，具有促進(jìn)細(xì)胞間通信和調(diào)控機(jī)體生理功能的作用，有利于充分發(fā)揮抗氧化、抗衰老等生理功能；還具有靶器官藥效濃度高以及生物利用度高的優(yōu)點(diǎn)，可彌補(bǔ)現(xiàn)有枸杞原漿產(chǎn)品活性物質(zhì)流失、生物利用度較低的缺陷。

8、除此之外，本技術(shù)首次嘗試將枸杞外泌體與枸杞原漿混合后，可配制成感官性狀較良好的枸杞外泌體復(fù)合飲品(命名為杞能)，可以充分利用/發(fā)揮枸杞中的有效成分，也極大地延緩了枸杞外泌體的降解速度，在短期內(nèi)穩(wěn)定保存枸杞外泌體，保留了枸杞果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分。因此，本技術(shù)的枸杞外泌體復(fù)合飲品能綜合或疊加發(fā)揮枸杞原漿和枸杞外泌體的優(yōu)勢(shì)，該復(fù)合飲品具有潛在的良好抗氧化損傷的作用并能抑制骨骼肌衰老標(biāo)志物表達(dá)等作用，也優(yōu)于市面上現(xiàn)有的枸杞原漿產(chǎn)品。

9、綜上所述，“杞能”在抗衰老及抗氧化方向具有優(yōu)秀的應(yīng)用前景，可作為抗骨骼肌衰老或運(yùn)動(dòng)疲勞的健康飲品或保健食品，擁有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景和途徑。

10、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，每毫升的枸杞原漿添加囊泡數(shù)量為5×1010～1×1011的枸杞外泌體。

11、本技術(shù)通過(guò)nta檢測(cè)枸杞外泌體懸液確定囊泡數(shù)量。

12、在本技術(shù)的技術(shù)方案中發(fā)現(xiàn)，枸杞外泌體含有與枸杞果實(shí)相似的mirna，枸杞外泌體具有抗骨骼肌衰老的作用，因其來(lái)源于藥食同源物種枸杞，具有開(kāi)發(fā)為復(fù)合飲品的潛力。

13、經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，枸杞外泌體的含量可直接影響枸杞原漿在體內(nèi)的生物功能作用效果。在枸杞原漿中添加囊泡數(shù)量為5×1010～1×1011的枸杞外泌體，具有緩解h2o2導(dǎo)致的細(xì)胞毒性的作用，還可以協(xié)同增效作用，各個(gè)成分，相互作用，互相促進(jìn)，可提高枸杞有效成分的生物利用度，進(jìn)而提升產(chǎn)品的抗氧化及抗衰老效果，解決了口服枸杞原漿活性物質(zhì)流失、生物利用率較低的問(wèn)題。

14、本技術(shù)通過(guò)利用枸杞原漿和枸杞外泌體制作感官性狀良好且具有抗骨骼肌細(xì)胞衰老作用的復(fù)合飲品，為人群的抗衰老研究提供新思路和策略。

15、發(fā)明人探究了枸杞外泌體的用量，若枸杞外泌體的用量過(guò)小，協(xié)同效果不及合適添加量帶來(lái)的效果，若枸杞外泌體的用量過(guò)大，可能產(chǎn)生拮抗作用，進(jìn)而也會(huì)導(dǎo)致提高枸杞有效成分的生物利用度效果下降，產(chǎn)品的抗氧化及抗衰老效果下降，表明，上述原料在本技術(shù)的范圍內(nèi)時(shí)，具有較理想的協(xié)同增效作用。

16、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，每毫升的枸杞原漿添加囊泡數(shù)量為5×1010的枸杞外泌體。

17、本技術(shù)枸杞外泌體的用量為上述范圍時(shí)，可以更好地緩解h2o2導(dǎo)致的細(xì)胞毒性的作用，協(xié)同效果更加明顯，更好地提高枸杞有效成分的生物利用度，減少口服枸杞原漿活性物質(zhì)流失，進(jìn)而更好地提升產(chǎn)品的抗氧化及抗衰老效果。

18、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述枸杞外泌體復(fù)合飲品中枸杞外泌體的粒徑范圍為50nm～110nm。

19、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的ph值為4.0～4.5，所述枸杞外泌體的ph值為7.2～7.7，所述枸杞原漿的ph值為3.9～4.4。

20、在本技術(shù)中，枸杞外泌體為無(wú)色透明溶液，無(wú)明顯氣味，ph范圍為7.2～7.7；枸杞原漿為橙色透明溶液，無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)異物且氣味與枸杞果實(shí)類似，ph范圍為3.9～4.4。

21、本技術(shù)配制的枸杞外泌體復(fù)合飲品為橙色透明溶液，同樣無(wú)明顯肉眼可見(jiàn)異物且氣味與枸杞原漿相似，ph范圍4.0～4.5。

22、在一些具體的實(shí)施中，所述抗氧化劑包括維生素c和檸檬酸。

23、采用上述種類的抗氧化劑，以抑制枸杞外泌體復(fù)合飲品中的細(xì)菌，還具有護(hù)色和改善風(fēng)味的作用。

24、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述枸杞外泌體的制備方法，包括以下步驟：

25、1)將新鮮枸杞洗凈破碎，先置于低速離心條件下去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，取上清液，然后將上清液置于超高速離心條件下離心，取沉淀；

26、2)將沉淀重懸后加至密度梯度蔗糖溶液中離心，取密度分層在30％分層與45％分層之間的溶液，將溶液重懸離心，取沉淀，再次重懸過(guò)濾，得到枸杞外泌體。

27、在一些具體方式中，密度梯度蔗糖溶液的配置方法包括以下步驟：

28、密度梯度蔗糖溶液由蔗糖和雙蒸水按比例(蔗糖/溶液總體積＝80g/l，300g/l，450g/l，600g/l)配制成8％，30％，45％，60％濃度的蔗糖溶液。經(jīng)高壓滅菌(121℃，30min)后以密度分層(由上至下為8％，30％，45％，60％)加至離心管中。

29、經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，本技術(shù)提取了可見(jiàn)的兩個(gè)分層(密度分層分別為8％分層與30％分層之間、30％分層與45％分層之間)之間的液體，通過(guò)nta檢測(cè)后均有囊泡，密度分層為8％～30％的分層溶液中囊泡濃度低于密度分層為30％～45％的分層溶液的囊泡濃度。

30、本技術(shù)通過(guò)蔗糖梯度-超速離心法從新鮮枸杞中提取枸杞外泌體，可以獲得質(zhì)量更佳的枸杞外泌體，將獲得的枸杞外泌體和枸杞原漿混勻，可彌補(bǔ)枸杞原漿生物利用度較低的缺陷，形成的枸杞外泌體復(fù)合飲品具有更佳的抗衰老及抗氧化性能，可作為抗骨骼肌衰老或運(yùn)動(dòng)疲勞的健康飲品或保健食品，擁有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景和途徑。

31、在一些具體實(shí)施例中，新鮮枸杞為新鮮寧杞7號(hào)枸杞，還可以為其他型號(hào)的枸杞，不僅局限于上述種類。

32、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟1)中，低速離心條件為：先采用1000×g～3000×g離心10～20min，再采用9000×g～11000×g離心40～60min；

33、超高速離心條件為：采用150000×g～170000×g離心80～100min；

34、所述步驟2)中離心的條件為采用150000×g～170000×g離心80～100min。

35、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟2)中密度分層為30％～45％的分層溶液對(duì)應(yīng)的蔗糖濃度范圍為25～50％。

36、在一些具體的實(shí)施方式中，密度分層為30％的分層溶液對(duì)應(yīng)的蔗糖濃度范圍為25～30％，密度分層為45％的分層溶液對(duì)應(yīng)的蔗糖濃度范圍為45～50％。

37、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述枸杞外泌體置于溫度為2～5℃條件下保存。

38、本技術(shù)在比較了枸杞外泌體在不同儲(chǔ)存條件下的降解情況，發(fā)現(xiàn)在上述溫度條件下，將枸杞外泌體與現(xiàn)有的原漿產(chǎn)品混合后，可配制成感官性狀較良好的枸杞外泌體復(fù)合飲品，也極大地延緩了枸杞外泌體的降解速度，枸杞外泌體中的囊泡下降不明顯，保留了枸杞果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分。

39、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的優(yōu)選實(shí)施方式，所述枸杞原漿包括質(zhì)量百分比為95.0～99.9％的枸杞鮮果、質(zhì)量百分比為0.03～0.15％的維生素c和質(zhì)量百分比為0.05～0.1％的檸檬酸，余量為水。

40、需要說(shuō)明的是，在本技術(shù)中，所述的枸杞原漿的制備方法不限，將各原料混合均勻，即可制得枸杞原漿。

41、其中，具有代表性的枸杞原漿為“可益康”的枸杞原漿，其包括質(zhì)量百分比為99％的枸杞鮮果、質(zhì)量百分比為0.05％的維生素c和質(zhì)量百分比為0.05％的檸檬酸，余量為水。

42、本技術(shù)還提供了上述枸杞外泌體復(fù)合飲品的制備方法，將枸杞原漿經(jīng)過(guò)低速離心和過(guò)濾后，與枸杞外泌體混勻制得；

43、每毫升的枸杞原漿添加囊泡數(shù)量為5×1010～1×1011的枸杞外泌體。

44、優(yōu)選地，每毫升的枸杞原漿添加囊泡數(shù)量為5×1010的枸杞外泌體。

45、作為本技術(shù)所述枸杞外泌體復(fù)合飲品的制備方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述低速離心為：采用2000×g離心20min。

46、本技術(shù)還提供了上述枸杞外泌體復(fù)合飲品在制備保健品中的應(yīng)用。

47、作為本技術(shù)所述應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)施方式，所述保健品包括抗骨骼肌衰老或抗疲勞的保健品。

48、本技術(shù)首次將枸杞外泌體與枸杞原漿配制成枸杞外泌體復(fù)合飲品“杞能”，“杞能”綜合了枸杞勻漿及枸杞外泌體二者優(yōu)勢(shì)，在延緩了枸杞外泌體降解速度的同時(shí)，具有良好的抗氧化和抗衰老(骨骼肌萎縮)作用。

49、通過(guò)tem和nta檢測(cè)證實(shí)了枸杞原漿中外泌體因長(zhǎng)期保存或工藝損耗含量低，而通過(guò)分類保存后現(xiàn)配置的“杞能”中含有更多的枸杞外泌體，且在4℃保存條件下，7天后“杞能”中枸杞外泌體仍能保存約2/3。

50、通過(guò)mirna測(cè)序和qpcr實(shí)驗(yàn)初步推斷，枸杞外泌體雖然體積小，但仍保留有相當(dāng)含量的mirna；同時(shí)，枸杞勻漿中保留的mirna與枸杞外泌體中mirna的種類分布及含量均存在差異，“杞能”中mirna種類及分布結(jié)合了枸杞勻漿與提取的枸杞外泌體的特征。

51、通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)“杞能”具有良好的抗氧化效果且相較于枸杞原漿具有更優(yōu)良的提高細(xì)胞活性、抑制衰老標(biāo)志物表達(dá)、緩解肌管直徑減小以及提高atp水平及抑制細(xì)胞凋亡的功能。同時(shí)，與枸杞勻漿相比“杞能”中的mirna更容易被細(xì)胞吸收。由此可初步推斷“杞能”可改善枸杞原漿產(chǎn)品的性能，發(fā)揮更佳的抗骨骼肌細(xì)胞衰老的作用。

52、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

53、本技術(shù)提供了一種枸杞外泌體復(fù)合飲品及其制備方法和應(yīng)用，本技術(shù)利用枸杞外泌體對(duì)枸杞原漿產(chǎn)品進(jìn)行改進(jìn)，配制感官性狀良好且抗骨骼肌細(xì)胞衰老功效更佳的枸杞外泌體復(fù)合飲品。同時(shí)經(jīng)nta分析驗(yàn)證了枸杞外泌體復(fù)合飲品中枸杞外泌體降解速度延緩，進(jìn)一步結(jié)合mirna測(cè)序技術(shù)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了枸杞外泌體復(fù)合飲品具有更豐富的信息物質(zhì)種類/相對(duì)含量和良好的抗氧化作用，相較于市面上現(xiàn)有的枸杞原漿產(chǎn)品，更能發(fā)揮抑制骨骼肌細(xì)胞衰老標(biāo)志物表達(dá)、緩解肌細(xì)胞衰老的生物活性效應(yīng)。與傳統(tǒng)的抗衰老技術(shù)或方案相比，本技術(shù)利用枸杞外泌體與枸杞原漿配制的枸杞外泌體復(fù)合飲品“杞能”，具有安全性較高、原材料容易獲取、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠以及便攜易操作等優(yōu)點(diǎn)，為人群的抗衰老研究和/或?qū)嶋H應(yīng)用提供了一種有效、可行的新思路。