本發(fā)明涉及一種雞胚egf分離提取制備動(dòng)物腸黏膜營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動(dòng)物腸道不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場(chǎng)所，也是重要的免疫器官，維護(hù)正常的腸道機(jī)能對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。動(dòng)物在營(yíng)養(yǎng)素缺乏、感染、應(yīng)激及病理等情況下，均可導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)和功能損傷、細(xì)菌和內(nèi)毒素移位以及腸道黏膜屏障功能障礙等，嚴(yán)重影響動(dòng)物健康和生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失。表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor，egf)屬于促生長(zhǎng)因子家族成員，具有廣泛的生物活性，具有促進(jìn)胃腸組織生長(zhǎng)和發(fā)育、修復(fù)受損的黏膜組織、調(diào)節(jié)腸道各種酶活性、提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收等重要作用。外源供給egf是改善動(dòng)物腸道結(jié)構(gòu)和功能、修復(fù)損傷腸道、促進(jìn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)的重要途徑，egf作為新型動(dòng)物腸黏膜營(yíng)養(yǎng)調(diào)控劑在畜牧業(yè)生產(chǎn)上有十分廣闊的應(yīng)用前景。
egf是一條由53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)為致密的球狀結(jié)構(gòu)，特殊空間結(jié)構(gòu)使egf具有較高穩(wěn)定性，對(duì)酸、熱具有耐受性，能抵抗胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶的消化。egf具有許多生物學(xué)作用，可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)dna、rna和蛋白質(zhì)合成；刺激多種組織細(xì)胞分裂、增殖和分化；抑制胃酸分泌，促進(jìn)潰瘍愈合及上皮組織再生；增加體內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)以及機(jī)體一些物質(zhì)(果酸、前列腺素)合成，具有調(diào)節(jié)精子、卵巢發(fā)育和生殖功能的作用，egf是促進(jìn)新生動(dòng)物胃、腸道發(fā)育的重要生長(zhǎng)因子，但是egf有限的來(lái)源、昂貴的價(jià)格制約著其在畜牧領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種雞胚egf分離提取制備動(dòng)物腸黏膜營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑的方法，其特征在于其步驟如下：
1)取15-20日齡孵化雞胚，去殼，添加0.05mol/l乙酸溶液高速勻漿10-30分鐘，1500轉(zhuǎn)/分鐘，其中去殼雞胚與乙酸溶液質(zhì)量比為1：5-10，離心20-30分鐘，取上清液；
2)沉淀繼續(xù)加0.05mol/l乙酸溶液勻漿，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心，其中沉淀與乙酸溶液質(zhì)量比為1：5-10，離心20-30分鐘，合并兩次上清液，去除上清液表面脂肪，
3)上清液加苯甲酸鈉，充分?jǐn)嚢瑁蛊淙咳芙?，?mol/l的nh4oh溶液調(diào)ph至5.5-6.5，攪拌半小時(shí)，靜置，經(jīng)減壓過(guò)濾，取出沉淀；
4)待沉淀干燥后，加預(yù)冷丙酮，攪拌形成懸濁液，4℃下靜置4-12h，則有蛋白樣絮狀沉淀，減壓過(guò)濾；將沉淀再用丙酮洗滌，加入沸石粉，洗滌后沉淀與沸石粉的質(zhì)量比為1：5-10，攪拌混合10-20分鐘，50℃干燥粉碎即制成動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑。
優(yōu)選的，所述的雞胚是指15-20日齡的健康發(fā)育的白羽aa雞或三黃雞雞胚。
本發(fā)明所述的egf為一條由53個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)為致密的球狀結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選的，所述的步驟1)和步驟2)中的乙酸溶液的濃度為0.05mol/l，溫度為4℃。
優(yōu)選的，所述的苯甲酸鈉加入量為每升上清液加入20-30g。
優(yōu)選的，所述步驟4)中加入預(yù)冷丙酮后，沉淀在預(yù)冷丙酮溶液中的質(zhì)量濃度為0.04-0.1g/ml，預(yù)冷丙酮溫度為4℃。
優(yōu)選的，所述的沸石粉ph在7-7.5之間，含水量3.0-8.0％，吸氨量為120-140毫摩爾/100g，目數(shù)為30-60目。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種所述方法制備的動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑在畜禽全價(jià)飼料中的應(yīng)用，具體為：每噸畜禽全價(jià)飼料中添加0.05-0.3公斤所述動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑。
進(jìn)一步的，21-28日齡斷奶仔豬每噸全價(jià)飼料中添加0.1-0.3公斤所述動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑，母豬每噸全價(jià)飼料中添加0.05-0.2公斤所述動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑，肉雞每噸全價(jià)飼料中添加0.05-0.1公斤所述動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑。
本發(fā)明之動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑制備方法，由于采用了通過(guò)調(diào)節(jié)溶液ph值使雞胚勻漿egf帶陽(yáng)電荷，利用不溶于水的苯甲酸吸附egf，使其從上清夜中分離出來(lái)，再利用丙酮不溶解egf的性質(zhì)，將egf從苯甲酸上解析出來(lái)的原理，可使雞胚egf分離提取得產(chǎn)率大于85％，egf粗粉得率為0.1-0.2mg/g雞胚，它有效地解決了現(xiàn)有飼料工業(yè)中egf來(lái)源有限、價(jià)格昂貴的問(wèn)題。
本發(fā)明的動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑，可使仔豬平均日增重提高30％-40％，料重比降低10％-20％，腹瀉率下降80％-85％，空腸絨毛高度提高70％-90％，隱窩深度下降20％-30％，十二指腸腸激酶活性提高50％-55％，空腸黏膜乳糖酶的活性提高35％-40％，蔗糖酶活性提高40％-60％；使試驗(yàn)組肉雞日增重提高8-12％，采食量提高6-10％，十二指腸絨毛長(zhǎng)度提高10-20％，十二指腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度提高20-30％；回腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度提高10-18％，十二指腸胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和總蛋白水解酶活性分別提高了40-55％、80-100％、30-45％和25-35％。本發(fā)明的動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑，具有保護(hù)和促進(jìn)黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，提高畜禽采食量和生長(zhǎng)性能，顯著降低仔豬斷奶后腹瀉率的作用。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合以下實(shí)例作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1
取100個(gè)15日齡孵化健康雞胚，去殼，稱(chēng)重，按1：6(g/g)的比例加入0.05mol/l乙酸(4℃)，高速勻漿30分鐘，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液；沉淀繼續(xù)加0.05mol/l的乙酸(4℃)勻漿15分鐘，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取上清液，合并兩次上清液，去除上清液表面脂肪，上清液中加入苯甲酸鈉(25g/l)，充分?jǐn)嚢?，使其全部溶解，?mol/l的nh4oh調(diào)ph至6.0，攪拌半小時(shí)，靜置，減壓過(guò)濾，取出沉淀，沉淀干燥后，加預(yù)冷丙酮(0.05g/ml丙酮4℃)，攪拌形成懸濁液，4℃下靜置12h，出現(xiàn)蛋白樣絮狀沉淀，減壓過(guò)濾，將沉淀再用丙酮洗滌3次，留下的沉淀以1：5的比例加入沸石粉(30目)，攪拌混合10分鐘，50℃干燥粉碎制成動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑。
實(shí)施例2
25日齡仔豬斷奶開(kāi)始，對(duì)照組飼喂對(duì)照日糧(配方見(jiàn)表1)。試驗(yàn)組全價(jià)飼料在每噸對(duì)照組日糧基礎(chǔ)上添加動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑200克，飼喂上述飼料至46日齡，測(cè)定仔豬生長(zhǎng)性能。
表1試驗(yàn)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)
試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組仔豬平均日增重提高31％(p<0.05)，料重比降低12％(p<0.05)，腹瀉率下降85％(p<0.05)，空腸絨毛高度提高72％(p<0.05)，隱窩深度下降21％(p<0.05)，十二指腸腸激酶活性提高58％(p<0.05)，空腸粘膜乳糖酶的活性提高39％(p<0.05)，蔗糖酶活性提高42％(p<0.05)。
實(shí)施例3
21日齡健康aa肉雞，對(duì)照組飼喂對(duì)照日糧(配方見(jiàn)表2)，試驗(yàn)組全價(jià)飼料在每噸對(duì)照組日糧基礎(chǔ)上添加動(dòng)物腸黏膜egf營(yíng)養(yǎng)修復(fù)劑100克，飼喂上述飼料至35日齡，測(cè)定肉雞生長(zhǎng)性能。
表2試驗(yàn)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)
試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組肉雞日增重和采食量分別提高了9.17％(p<0.05)和7.74％(p<0.05)，十二指腸絨毛長(zhǎng)度提高14.20％(p<0.05)，十二指腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度提高25.53％(p<0.01)；回腸絨毛長(zhǎng)度/隱窩深度提高13.63％(p<0.05)，十二指腸胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和總蛋白水解酶活性分別提高了44.61％(p<0.05)、98.34％(p<0.01)、36.47％(p<0.05)和28.36％(p<0.05)。