本發(fā)明屬于食品加工
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及以乳蛋白為原料生產(chǎn)的生物活性多肽，尤其涉及一種具備腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的保健品及其制備方法。
背景技術(shù)：
：乳蛋白源性生物活性多肽是以乳蛋白為原料，經(jīng)蛋白酶水解以后的產(chǎn)物，乳蛋白源性生物活性肽不僅可以提供人體所需的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)還具有多種生理調(diào)節(jié)功能，因而是多種功能性食品組成成分。腸道微生態(tài)是人體與腸道菌群之間構(gòu)成的微生態(tài)系統(tǒng)，這一系統(tǒng)中，各種微生物保持著種類和數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)人體消化機(jī)能削弱、某些種類微生物受到抑制或某些種類微生物過(guò)度生長(zhǎng)時(shí)，腸道微生態(tài)平衡就被破壞，出現(xiàn)腹瀉、便秘、消化不良等腸道菌群失?，F(xiàn)象。乳源性生物活性肽中與腸道微生態(tài)關(guān)系最密切的是抗菌肽和多肽類雙歧因子?？咕氖且活惏被釟埢鶖?shù)量小于100，且通常帶正電荷的多肽，大部分抗菌肽的分子量在3000Da左右，抗菌肽對(duì)于腸道內(nèi)機(jī)會(huì)型致病菌有抑制作用，但是腸道益生菌對(duì)抗菌肽卻不敏感。多肽類雙歧因子一般為含有二硫鍵的多肽，能夠促進(jìn)雙歧桿菌等益生菌的生長(zhǎng)，但是對(duì)于腸道內(nèi)機(jī)會(huì)型細(xì)菌沒(méi)有作用。然而，由于人體內(nèi)的消化酶系的存在，乳蛋白源性的活性肽在到達(dá)小腸末端前已經(jīng)被大部分降解，喪失了其生理調(diào)節(jié)功能。即使對(duì)于胃腸道消化功能不良的人群而言，乳蛋白源性活性肽雖然可以到達(dá)小腸末端，但由于乳蛋白的水解產(chǎn)物中多肽的組成相當(dāng)復(fù)雜，當(dāng)它們被用作腸道微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，既能促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)，也能促進(jìn)腸道機(jī)會(huì)型細(xì)菌的生長(zhǎng)，這就干擾了乳蛋白源性抗菌肽和多肽類雙歧因子對(duì)腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，通過(guò)多種手段的結(jié)合，提供一種口感好，能夠直接作用于腸道菌群并發(fā)揮腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)功能的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。本發(fā)明的另一目的是提供一種乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案：一種乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：A、制備酶解底物，將乳蛋白與水混合，待乳蛋白吸水溶脹后殺菌，冷卻后使用酸或堿調(diào)節(jié)至適宜pH，得到酶解底物，B、水解，調(diào)節(jié)酶解底物的溫度至酶反應(yīng)的適宜溫度，加入蛋白酶開始反應(yīng)，使用堿液調(diào)節(jié)pH使酶反應(yīng)維持在適宜pH，得到水解液，C、膜分離，降低水解液溫度至常溫，調(diào)節(jié)水解液的總固形物濃度為1-5％，用超濾膜作超濾，得到透過(guò)液和殘留液，透過(guò)液指在超濾中能透過(guò)超濾膜的溶液，殘留液指在超濾中沒(méi)有能透過(guò)超濾膜的蛋白質(zhì)和多肽構(gòu)成的溶液，D、調(diào)配，取步驟B的水解液經(jīng)濃縮或稀釋后調(diào)節(jié)總固形物濃度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纖維，加入適量復(fù)合甜味劑調(diào)節(jié)口味，得調(diào)配液，或者取步驟C的透過(guò)液，經(jīng)濃縮或稀釋后調(diào)節(jié)總固形物濃度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纖維，加入適量復(fù)合甜味劑調(diào)節(jié)口味，得調(diào)配液，或者分別取若干步驟B和步驟C的水解液和透過(guò)液混合，經(jīng)濃縮或稀釋后調(diào)節(jié)總固形物濃度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纖維，加入適量復(fù)合甜味劑調(diào)節(jié)口味，得調(diào)配液，E、殺菌，將調(diào)配液高溫殺菌，即得乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品及其制備方法中，步驟C為可選步驟，但是如在步驟A中使用了酪朊酸鈉或在步驟B中得到的水解液在20℃時(shí)的粘度超過(guò)100mPa·s時(shí)，則不可以使用該步驟。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟A中，所述的乳蛋白含量為1-16wt％，pH調(diào)節(jié)至6.0-8.0，在步驟B中，蛋白酶的添加量按1-1000U/g乳蛋白計(jì)，pH維持在7.0-8.0之間，在步驟C中，所述的超濾膜為截留分子量為5000-10000Da的超濾膜。其中U為酶活力的單位，是指在25℃下，在1min內(nèi)能轉(zhuǎn)化底物中1μmol的酰胺鍵的酶量。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟E中，采用UHT殺菌或在121℃下保溫15-20min殺菌。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟E中，將調(diào)配液裝入容器中，密封后在121℃殺菌15-20min；或調(diào)配液直接在121℃殺菌15-20min后，在無(wú)菌條件下灌入經(jīng)高溫消毒處理的西林瓶或安瓿瓶中密封；或調(diào)配液用UHT殺菌器殺菌后在無(wú)菌條件下灌入經(jīng)高溫消毒處理的西林瓶或安瓿瓶中密封。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟A中，所述的乳蛋白包括酪蛋白、酪朊酸鈉和乳清蛋白中的一種或幾種。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟B中，所述的蛋白酶包括堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶中的任意一種或幾種。某些蛋白存在不能完全溶解的情況，不影響產(chǎn)品的生產(chǎn)。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟D中，所述的水溶性膳食纖維包括聚葡萄糖、抗性糊精、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、聚半乳糖醛酸和羧甲基纖維素鈉的任意一種或幾種，所述的復(fù)合甜味劑為天然甜味劑或天然甜味劑與人工合成甜味劑的組合。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，當(dāng)步驟A的乳蛋白本身不含有還原糖時(shí)，復(fù)合甜味劑的組成中必須包含還原糖，所述的還原糖包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和麥芽糖中的一種或幾種組合。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟C中，還包括將殘留液濃縮至干得回收蛋白的步驟，回收蛋白用于下一次制備酶解底物。在上述的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法中，在步驟B中，當(dāng)水解度達(dá)到2-10％時(shí)，用高溫滅酶，終止反應(yīng)。如果使用的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶中的一種或幾種，如需終止酶反應(yīng)，應(yīng)將水解液的pH調(diào)節(jié)到7，并升高反應(yīng)液溫度滅酶；如果使用的蛋白酶不包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶的任意一種或幾種，采用升高反應(yīng)液溫度的方法滅酶以終止反應(yīng)。水解度的定義為：根據(jù)上述的制備方法制得的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、充分保留了乳蛋白的營(yíng)養(yǎng)功能和利用了乳源性生物活性肽的功能特性，原料利用率高，適宜乳糖不耐的人群食用。2、通過(guò)控制水解程度提高了抗菌肽和多肽類雙歧因子在乳蛋白水解產(chǎn)物中的比例，避免了過(guò)度水解造成的功能性多肽降解的情況。3、利用抗菌肽和多肽類雙歧因子集中分布于1000-5000Da這一分子量區(qū)間的特性，通過(guò)膜分離的手段篩選掉分子量較大的蛋白質(zhì)和多肽，小分子的多肽在食用后可以借助人體正常消化與吸收功能在小腸內(nèi)被吸收掉，使得最終到達(dá)小腸末端的抗菌肽和多肽類雙歧因子的比例大幅提高。4、通過(guò)加入水溶性的膳食纖維以保護(hù)抗菌肽和多肽類雙歧因子不被人體自身的消化酶系降解，同時(shí)水溶性膳食纖維對(duì)于雙歧桿菌的生長(zhǎng)也有一定促進(jìn)作用。5、在還原糖存在下，在中性或弱堿性條件下對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行高溫殺菌，除了殺滅產(chǎn)品中的微生物之外，還可以促使美拉德反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致包括賴氨酸殘基在內(nèi)的一些氨基酸殘基產(chǎn)生化學(xué)變化，抑制抗菌肽和多肽類雙歧因子在腸道內(nèi)的降解。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法，包括以下步驟：濃縮乳清蛋白粉與水混合，使混合液的總固形物濃度為15％，待濃縮乳清蛋白溶解并吸水溶脹后，加熱到62～65℃，保持30min，冷卻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，獲得酶解底物。調(diào)節(jié)酶解底物的溫度至50℃，按照20U/g底物的量加入中性蛋白酶開始反應(yīng)，反應(yīng)中使用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使其pH保持在7.0，當(dāng)水解度達(dá)到6％時(shí)，升高反應(yīng)液溫度至99℃以終止反應(yīng)，得到水解液。降低水解液溫度至常溫，加水調(diào)節(jié)水解液的總固形物濃度為5％，使用截留分子量為5000Da的超濾膜作切向流超濾，收集透過(guò)液，當(dāng)殘留液總固形物濃度上升為10％時(shí)，終止超濾操作。取透過(guò)液，經(jīng)蒸發(fā)濃縮，使其總固形物濃度達(dá)到6％，加入6％的低聚果糖，再加入1％的葡萄糖和4％的蔗糖，得調(diào)配液。將調(diào)配液在121℃殺菌15min，在無(wú)菌條件下灌入西林瓶中，密封后，即得乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。所得的產(chǎn)品為甜味的液體，總固形物濃度約17％，其中多肽含量約6％，成年人每天服用40mL，可以顯著起到改善腸道微生態(tài)的作用。實(shí)施例2一種乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法，包括以下步驟：將低粘度酪朊酸鈉與熱水混合，混合液中酪朊酸鈉的濃度為4％，攪拌使酪朊酸鈉充分吸水溶脹成為膠狀溶液，迅速加熱到75～90℃，保溫15～16s，冷卻后用乳酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，獲得酶解底物。調(diào)節(jié)酶解底物的溫度至65℃，按照10U/g底物的量加入木瓜蛋白酶開始反應(yīng)，反應(yīng)中使用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使其pH保持在6.0，當(dāng)水解度達(dá)到5％時(shí)，進(jìn)一步調(diào)高pH至7.0以上，加熱反應(yīng)液至沸騰，得到水解液。趁熱向反應(yīng)液中加入5％的低聚木糖，1％的聚葡萄糖，1％的果糖，0.05％的甜蜜素和0.01％的安賽蜜，得調(diào)配液。趁熱將調(diào)配液分裝到玻璃瓶中，旋上鐵蓋密封，在121℃殺菌20min，即得乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。所得產(chǎn)品為甜味的液體，總固形物濃度約11％，其中多肽含量約4％，成年人每天食用60mL，可以顯著起到改善腸道微生態(tài)的作用，糖尿病人也可以適量食用，實(shí)施例3一種乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法，包括以下步驟：將干酪素與濃縮乳清蛋白粉按照3:7(W/W)的比例混合，而后加入10倍質(zhì)量的熱水，攪拌使蛋白吸水溶脹，混合液的總固形物濃度為15％，待蛋白質(zhì)吸水溶脹后，加熱到62-65℃，保持30min，冷卻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，獲得酶解底物。調(diào)節(jié)酶解底物的溫度至55℃，按照40U/g底物的量加入復(fù)合酶(胰蛋白酶：堿性蛋白酶的酶活比為1:1)開始反應(yīng)，反應(yīng)中使用0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使其pH保持在8.0，當(dāng)水解度達(dá)到5％時(shí)，升高反應(yīng)液溫度至95℃以終止反應(yīng)，得到水解液。降低水解液溫度至常溫，加水調(diào)節(jié)水解液的總固形物濃度為3％，使用截留分子量為10000Da的超濾膜作切向流超濾，收集透過(guò)液，當(dāng)殘留液總固形物濃度上升為8％時(shí)，終止超濾操作。取透過(guò)液，經(jīng)蒸發(fā)濃縮，使其固形物濃度達(dá)到3％，加入4％的抗性糊精，再加入4％的復(fù)配甜味劑(葡萄糖：木糖醇的質(zhì)量比1:1)，得調(diào)配液。調(diào)配液裝入蒸煮袋中，密封后在121℃殺菌15min，即得乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。所得產(chǎn)品為口味微甜的飲料，總固形物濃度約11％，成年人每天食用200mL，可以起到補(bǔ)充蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和改善腸道微生態(tài)的作用。實(shí)施例4一種乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的制備方法，包括以下步驟：A、制備酶解底物，將酪蛋白、酪朊酸鈉和乳清蛋白按重量比1:1:1稱重復(fù)配后與水混合得到混合液，使混合液中固形物含量為1％，待乳蛋白吸水溶脹后用巴斯德殺菌，殺菌后冷卻，使用酸或堿調(diào)節(jié)至適宜pH6.5，得到酶解底物，B、水解，調(diào)節(jié)酶解底物的溫度至酶反應(yīng)的適宜溫度50-65℃，加入由相等重量的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和無(wú)花果蛋白酶組成的復(fù)合酶開始反應(yīng)，其中復(fù)合酶的添加量按1U/g乳蛋白計(jì)，乳蛋白由上述酪蛋白、酪朊酸鈉和乳清蛋白組成，使用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在7.0-8.0之間，得到水解液，C、膜分離，降低水解液溫度至常溫，這里所述的常溫是指室溫，通常為10-35℃，調(diào)節(jié)水解液的總固形物濃度為1-5％，也即如水解液的總固形物小于1％，則使用加熱濃縮的方法使總固形物濃度為1-5％，如水解液的總固形物大于5％，則使用往水解液中添加水稀釋使總固形物濃度為1-5％，取上述部分調(diào)整好濃度的水解液，用截留分子量為7000Da的超濾膜作超濾，得到透過(guò)液和殘留液，殘留液濃縮或烘干，得到回收蛋白，透過(guò)液與剩余的水解液混合得到預(yù)調(diào)配液，D、調(diào)配，取步驟C的預(yù)調(diào)配液經(jīng)濃縮或稀釋后調(diào)節(jié)總固形物濃度2-6％，加入1-8wt％的水溶性膳食纖維，加入適量果糖、麥芽糖和/或阿巴斯甜調(diào)節(jié)口味，得調(diào)配液，E、殺菌，將調(diào)配液用UHT在135℃高溫殺菌10-30S，殺菌后直接灌入到包裝容器中，密封，即得乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。在該步驟中，也可將調(diào)配液在121℃下保溫15-20min殺菌。實(shí)施例5取實(shí)施例4中的回收蛋白，與酪蛋白按重量比1:2混合形成復(fù)配乳蛋白，取若干復(fù)配乳蛋白與水混合，控制乳蛋白含量為16wt％，待乳蛋白吸水溶脹后用巴斯德殺菌，殺菌后冷卻，使用酸或堿調(diào)節(jié)至適宜pH6.0-8.0之間，得到酶解底物，這里所述的酸可以是鹽酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液或檸檬酸溶液等，堿可以是NaOH溶液、KOH溶液等。將酶解底物升溫至62℃，加入1U/g復(fù)配的蛋白酶，蛋白酶包括重量比1:2:2的中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5，檢測(cè)當(dāng)水解度達(dá)到2-10％時(shí)，用95℃高溫滅酶，終止反應(yīng)，得水解液。冷卻水解液至室溫，檢測(cè)水解液的總固形物含量，并調(diào)節(jié)水解液的總固形物濃度為1-5％，調(diào)節(jié)方法同實(shí)施例4，用截留分子量為5000-6000Da的超濾膜作超濾，得到透過(guò)液和殘留液，殘留液的處理同實(shí)施例4。取透過(guò)液，經(jīng)濃縮或稀釋后調(diào)節(jié)總固形物濃度4％，加入2wt％的水溶性膳食纖維，加入適量復(fù)合甜味劑調(diào)節(jié)口味，得調(diào)配液，調(diào)配液高溫消毒后灌裝得到乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品。其中，水溶性膳食纖維包括聚葡萄糖、抗性糊精、低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、聚半乳糖醛酸和羧甲基纖維素鈉的任意一種或幾種，可以單獨(dú)添加到透過(guò)液中，也可以復(fù)配后添加到透過(guò)液中，復(fù)合甜味劑包括葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖和麥芽糖中的一種或幾種組合，添加量按調(diào)配液的0.1-5％wt計(jì)，按甜味酌情添加。應(yīng)用例一、乳清蛋白水解肽對(duì)雙歧桿菌和乳酸菌生長(zhǎng)的影響將一定量分離乳清蛋白(WPI)粉溶于水配制成濃度為5％的溶液作為生化反應(yīng)底物，將底物裝入生化反應(yīng)器中，使用超級(jí)恒溫水浴往反應(yīng)器夾層中通入98-99℃循環(huán)水并開通攪拌槳攪拌，當(dāng)反應(yīng)器溫度升高到98℃后保持15min，隨后往反應(yīng)器夾層中通入45℃的恒溫循環(huán)水，使底物降溫到45℃。用0.1mol/LNaOH調(diào)pH至8.0，依照乳清蛋白粉加入量的5％(W/W)的比例加入云南龐博生物工程有限公司生產(chǎn)的堿性蛋白酶，并開始反應(yīng)計(jì)時(shí)。使用pH探頭在線測(cè)定反應(yīng)液的pH，在反應(yīng)過(guò)程中隨時(shí)滴加0.1mol/LNaOH以維持pH穩(wěn)定，并控制溫度誤差不超過(guò)1℃，pH誤差不超過(guò)0.1。反應(yīng)40min后，調(diào)高循環(huán)水浴溫度，使夾層反應(yīng)器中反應(yīng)液的溫度迅速上升到90℃以上，維持15min以鈍化酶，隨后將反應(yīng)液冷卻。將冷卻后的反應(yīng)液于70℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至有大量固體析出，而后冷凍干燥得乳清蛋白水解多肽。將大豆去皮并干燥后粉碎得大豆干粉，以5.3％大豆干粉，4％的高果玉米糖漿和0.5％的乳清蛋白水解多肽作為(以總固形物計(jì))發(fā)酵底物，將發(fā)酵底物裝入發(fā)酵罐中用0.1MPa的高壓蒸汽滅菌15min，隨后冷卻至38℃，按照0.03％的接種量(以菌種干粉/發(fā)酵底物中總固形物)加入丹尼斯克生產(chǎn)的YO-MIXTMVegetal乳酸菌系，按照0.15％的接種量(以菌種干粉/發(fā)酵底物中總固形物)加入丹尼斯克公司提供的乳雙歧桿菌，在38℃厭氧發(fā)酵6h，在線監(jiān)測(cè)pH，發(fā)酵完成后，使用GB/T4789.35-2010的方法，檢測(cè)最終產(chǎn)品中的乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量。對(duì)照組的培養(yǎng)基中不加入乳清蛋白水解多肽，其余操作同上。加入乳清蛋白水解多肽后的發(fā)酵底物，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸的速率明顯上升，最終所能達(dá)到的pH也比不添加乳清蛋白水解多肽的對(duì)照組更低。將乳清蛋白的水解肽，加入到發(fā)酵底物中，使用乳酸菌和雙歧桿菌進(jìn)行混合發(fā)酵，培養(yǎng)6h后乳酸菌的量為未添加乳清蛋白水解肽的對(duì)照組的4倍，雙歧桿菌的量為未添加乳清蛋白水解肽的對(duì)照組的1.46倍，說(shuō)明為乳清蛋白水解肽對(duì)于乳酸菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，并可以提高發(fā)酵過(guò)程中酸的產(chǎn)量。見(jiàn)表1。表16h后發(fā)酵液中的乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量二、乳酪蛋白水解多肽對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的影響在酶反應(yīng)器中，以質(zhì)量比32:1000的比例加入酪蛋白和水作為反應(yīng)底物，并用超級(jí)恒溫水浴往酶反應(yīng)器夾層中通入恒溫循環(huán)水，使底物的溫度達(dá)到44℃，隨后滴加1mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)底物的pH達(dá)11左右，開通磁力攪拌，使酪蛋白的溶解，隨后用1mol/L的磷酸，將反應(yīng)底物的pH調(diào)至7.4。按照酶底比2.5％的比例加入混合酶制劑，混合酶制劑由胰蛋白酶和中性蛋白酶以質(zhì)量比1：1的比例復(fù)配而成，開始酶解反應(yīng)。反應(yīng)過(guò)程中用pH計(jì)監(jiān)控pH值的變化，并隨時(shí)滴加0.1mol/L的NaOH使pH的變動(dòng)范圍為7.4±0.1。反應(yīng)進(jìn)行60min后，將反應(yīng)物從酶反應(yīng)器中移出，并迅速加熱至沸騰，保持沸騰狀態(tài)5min滅酶。滅酶后的反應(yīng)液，即為乳酪蛋白水解多肽溶液，將該溶液裝入冰箱內(nèi)備用。經(jīng)測(cè)定，此溶液中乳酪蛋白的水解度約為15％。取裝有8mLPYG培養(yǎng)基(蛋白胨1％、牛肉浸膏0.3％、NaCl0.5％)的大試管40支，分為四組，每組10支，分別標(biāo)記為大腸桿菌實(shí)驗(yàn)組、大腸桿菌對(duì)照組、金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)組、金黃色葡萄球菌對(duì)照組。在各實(shí)驗(yàn)組中加入1mL乳酪蛋白水解多肽溶液，各對(duì)照組加入生理鹽水1mL，用紫外線殺菌20min，隨后在大腸桿菌實(shí)驗(yàn)組和大腸桿菌對(duì)照組大試管中各加入大腸桿菌的菌懸液1mL，菌懸液中大腸桿菌量為106-107CFU/mL，在金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)組和金黃色葡萄球菌對(duì)照組大試管中各加入金黃色葡萄球菌的菌懸液1mL，菌懸液中金黃色葡萄球菌的量為106-107CFU/mL。將上述試管用無(wú)菌橡膠塞密封后移入空氣浴搖床，在37℃下培養(yǎng)8h，而用分光光度計(jì)在560nm下的測(cè)吸光度并計(jì)算抑制率。結(jié)果表明，乳酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶和中性蛋白酶組成的混合酶水解，當(dāng)水解度達(dá)到15％時(shí)，產(chǎn)生的酪蛋白水解多肽，加入到PYG培養(yǎng)基中，可以抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的增殖，37℃下培養(yǎng)8h后抑制率分別為31％和76％。三、乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品對(duì)腸道乳酸菌和雙歧桿菌的影響SPF級(jí)C57小鼠30只，5周齡，雄性，體重18±2g，購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按照下表2的流程進(jìn)行飼養(yǎng)和灌胃操作。表2A：純凈水灌胃，一天兩次，每次0.4mLB：雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊加水稀釋至105CFU/mL，作為小鼠的飲用水，早晚各更換一次。C：6％乳清蛋白、6％的低聚果糖、1％的葡萄糖和4％的蔗糖配制成溶液，一天2次，每次0.4mLD:實(shí)施例2中制備的乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品，一天兩次，每次0.4mLE:頭孢曲松鈉400mg/mL,一天2次，每次0.4mL適應(yīng)性灌胃時(shí)間設(shè)定為7天，各組均灌胃純凈水，主要目的是防止小鼠因運(yùn)輸、不適應(yīng)環(huán)境、灌胃緊張等造成的腸功能紊亂對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成干擾。適應(yīng)期結(jié)束后稱重并分組，隨機(jī)分為5組，每組6只，隨后開始第一階段(7天)喂養(yǎng)。第一階段喂養(yǎng)結(jié)束后，稱重并收集糞便進(jìn)行檢測(cè)，每只小鼠收集約0.5g糞便。待糞便收集完成后，使用頭孢曲松鈉灌胃2天造成腸道菌群失調(diào)模型，隨后進(jìn)行為期3天的第二階段喂養(yǎng)，第二階段喂養(yǎng)結(jié)束后，稱重并收集糞便進(jìn)行檢測(cè)，每只小鼠收集約0.5g糞便。待糞便收集完成后，拉頸處死并解剖，測(cè)定盲腸指數(shù)。將糞便樣本小心切開，盡可能從中心挖取0.2g，裝入無(wú)菌試管中，加入無(wú)菌生理鹽水4.8mL，渦旋振蕩使之勻質(zhì)化，再按比例稀釋后依照GB/T4789.35-2010的方法進(jìn)行雙歧桿菌和乳酸菌計(jì)數(shù)。表3第一階段喂養(yǎng)結(jié)束后的情況經(jīng)過(guò)7天的第一階段喂養(yǎng)后，喂飼乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的干預(yù)組小鼠的體重平均增長(zhǎng)率為10.82％，明顯高于空白組8.27％，說(shuō)明該保健品具有改善小鼠營(yíng)養(yǎng)狀況并促進(jìn)生長(zhǎng)的功能，但是干預(yù)組小鼠的平均體重增長(zhǎng)率要低于喂飼乳清蛋白及碳水化合物的對(duì)照組2，這是由于經(jīng)過(guò)高溫處理后的多肽，不容易被小鼠自身的消化酶系降解，故不如未處理的乳清蛋白那么容易吸收。經(jīng)過(guò)7天的第一階段喂養(yǎng)后，干預(yù)組小鼠糞便中的雙歧桿菌數(shù)量明顯高于空白組和各對(duì)照組，達(dá)到5.0×109CFU/g，說(shuō)明乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品有促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖的作用。此外，干預(yù)組糞便中的乳酸菌數(shù)量達(dá)到對(duì)照組2的2.6倍，說(shuō)明乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品比乳清蛋白與碳水化合物的簡(jiǎn)單組合，更有利于乳酸菌的增殖。表4第二階段喂養(yǎng)后各組糞便雙歧桿菌數(shù)量組別空白組模型組對(duì)照組1對(duì)照組2干預(yù)組雙歧桿菌數(shù)量CFU/g2.0×102未檢出3.7×1043.6×1071.4×109使用亞致死劑量的頭孢曲松鈉造成小鼠重度腸功能紊亂，造模成功三天后，喂飼乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品的干預(yù)組，雙歧桿菌數(shù)量恢復(fù)到109CFU/g以上，而同期對(duì)照組1的雙歧桿菌數(shù)量?jī)H為3.7×104，說(shuō)明乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品與雙歧桿菌三聯(lián)活菌的組合使用，對(duì)于腸道微生態(tài)的恢復(fù)作用，要優(yōu)于單純使用雙歧桿菌三聯(lián)活菌制劑。從第二階段喂養(yǎng)后盲腸指數(shù)的情況看，使用頭孢曲松鈉造成小鼠腸功能紊亂后，喂飼雙歧桿菌三聯(lián)活菌或雙歧桿菌三聯(lián)活菌與乳蛋白的組合，均有利于盲腸指數(shù)的下降，但是在飲用水中加入雙歧桿菌三聯(lián)活菌并使用乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品灌胃，其效果要優(yōu)于單純使用雙歧桿菌三聯(lián)活菌或乳蛋白與碳水化合物的組合。四、乳蛋白源性腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)肽保健品對(duì)脾虛腹瀉小鼠的恢復(fù)作用在生化反應(yīng)器中將干酪素與熱水依照3:100(W/W)的比例混合，通過(guò)攪拌使蛋白吸水溶脹，而后用0.1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，往生化反應(yīng)器夾層中通入恒溫循環(huán)水，使反應(yīng)器溫度保持在55℃，而后按照干酪素：木瓜蛋白酶100:1(W/W)的比例加入木瓜蛋白酶開始反應(yīng)。用pH計(jì)監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程中的pH變化，并滴加0.1mol/L的NaOH溶液使反應(yīng)液pH維持在6.0±0.1。3h后加入1mol/L的NaOH溶液，使pH升高到7.0以上，并升高循環(huán)水溫，使生化反應(yīng)器溫度達(dá)到95℃以上，維持該溫度半小時(shí)滅酶以終止反應(yīng)。待反應(yīng)液冷卻后用紗布過(guò)濾除去不溶物，而后將反應(yīng)液裝入切向流超濾系統(tǒng)中，用密理博公司生產(chǎn)的截留分子量為10000Da的超濾膜作超濾處理，收集透過(guò)液，并不斷向殘留液中補(bǔ)充純凈水，待透過(guò)液在280nm下的紫外吸收與純凈水的紫外吸收之差小于0.01時(shí)，終止超濾操作，將透過(guò)液在75℃下真空濃縮至有少量沉淀析出，而后進(jìn)行冷凍干燥，得到中低分子量酪蛋白水解多肽。將厚樸15g、枳實(shí)12g裝入砂鍋，加水1000mL，煎至約500mL,去滓后加入大黃12g，再煎至約250mL，去滓后加入芒硝9g，再煎約5min，得大承氣湯。SPF級(jí)昆明種小鼠20只，雄性，5周齡，隨機(jī)分為兩組，分別為模型組和干預(yù)組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)4周，每天灌胃2次，每次0.5mL生理鹽水。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，兩組均灌胃大承氣湯，每次0.5mL，每天2次。待發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀后，間隔1h再灌胃一次大承氣湯，視為造模成功。造模成功后的模型組小鼠，每天灌胃2次，每次0.5mL生理鹽水。干預(yù)組小鼠，每天灌胃2次，每次0.5mL濃度為16％的中低分子量酪蛋白水解多肽溶液。當(dāng)小鼠能穩(wěn)定排出干便后，視為已經(jīng)恢復(fù)，記錄恢復(fù)的時(shí)間。表5小鼠腹瀉恢復(fù)時(shí)間對(duì)于使用大承氣湯制造的脾虛腹瀉小鼠而言，腹瀉癥狀消失時(shí)間縮短，在造模成功第三天時(shí)，灌胃中低分子量酪蛋白水解多肽溶液的小鼠，已均為干便，而同期模型組仍有30％為稀便，表明中低分子量酪蛋白水解多肽溶液有利于促進(jìn)腹瀉的恢復(fù)。綜上所述，以乳清蛋白為原料的水解肽，體外實(shí)驗(yàn)?zāi)艽龠M(jìn)雙歧桿菌和乳酸菌的生長(zhǎng)，培養(yǎng)6h后比未添加組菌落數(shù)多40％。以乳酪蛋白為原料的水解肽，體外實(shí)驗(yàn)可抑制大腸桿菌，金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，抑制率分別為31％和76％。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用實(shí)施例1中的產(chǎn)品對(duì)C57小鼠喂養(yǎng)一周后，小鼠糞便中雙歧桿菌數(shù)量明顯高于未喂養(yǎng)的組別，乳酸菌的菌落計(jì)數(shù)增加了2.6倍。對(duì)于使用頭孢曲松鈉建立的腸功能紊亂模型而言，建模三天后雙歧桿菌數(shù)量恢復(fù)到5.0×109個(gè)/克(糞便中)。解剖后盲腸指數(shù)比非干預(yù)組降低。對(duì)于使用大承氣湯制造的脾虛腹瀉小鼠而言，腹瀉癥狀消失時(shí)間縮短，表明促進(jìn)了腹瀉恢復(fù)。本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3