本發(fā)明涉及海參食品加工
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種具有降壓抗凝血功能的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法。
背景技術(shù)：
：隨著人們生活水平的不斷提高，平均壽命不斷延長，社會逐漸步入老齡化，心腦血管疾病患病趨勢呈現(xiàn)逐年增加?！吨袊难軋蟾?015》指出，2014年，中國心血管病死亡率仍居疾病死亡構(gòu)成的首位，高于腫瘤及其他疾病。其中，農(nóng)村心血管病死亡率從2009年起超過并持續(xù)高于城市水平。心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成在農(nóng)村為44.60％，在城市為42.51％。全國每5個死亡人中，就有2個是死于心腦血管病，而腦血管病在中國則成為首位死因。高血壓是一種以動脈收縮壓或舒張壓升高為特征的臨床綜合癥，是引發(fā)心、腦、腎和血管等各種并發(fā)癥和導(dǎo)致中風(fēng)、動脈硬化、冠心病的一個重要危險因子。世界各國平均患病率在10～12％，且人群分布廣。因此，研究心血管藥物，治療和防治心血管疾病是當(dāng)今社會關(guān)注的一個熱門課題。目前降壓藥物有很多種，其中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)是應(yīng)用最普遍的，也是當(dāng)前被認(rèn)為最安全、最適合于老年人抗高血壓藥物之一。但多數(shù)ACEI為化學(xué)合成類藥物，在臨床應(yīng)用時，存在不同程度的副作用。于是，尋找療效高、副作用小的天然來源的ACEI，尤其是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制肽，是全世界關(guān)注的焦點。海參卵是海參生殖腺的一種，是海參加工過程中的副產(chǎn)物。海參卵營養(yǎng)成分豐富，可直接食用，具有改善視力、抗衰老、增強體質(zhì)、預(yù)防癌癥等生理功效。近年來，國內(nèi)學(xué)者對海參卵進(jìn)行系統(tǒng)性研究，通過酶解、發(fā)酵等方式獲得了具有特殊生理功能的活性物質(zhì)，如類胡蘿卜素和抗氧化肽等。納豆菌(Bacillusnatto)屬細(xì)菌科，芽孢桿菌屬，最早分離自傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品——納豆，是制備發(fā)酵產(chǎn)物常用的一種有益菌，可產(chǎn)生多種酶系。1987年，Sumi等人從納豆中提取具有顯著溶栓作用的納豆激酶(nattokinase，NK)，促進(jìn)了國內(nèi)外學(xué)者對納豆芽孢桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的研究。研究顯示，納豆發(fā)酵產(chǎn)物具有纖溶、降膽固醇、降血脂、抗菌和抗氧化等多種營養(yǎng)保健功能。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于拓寬海參原料的應(yīng)用，充分利用海參加工副產(chǎn)物——海參卵資源，開發(fā)一種兼具降壓和抗凝血功能的海參卵發(fā)酵產(chǎn)品提升海參卵食品的功能性及附加值。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種具有降壓抗凝血功能海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟：S1、原料預(yù)處理：取海參卵清洗、去雜質(zhì)，-80℃預(yù)凍4～5h，-50℃凍干40～50h，粉碎，得到海參卵凍干粉，備用；S2、制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基：將步驟S1制得的海參卵凍干粉與水按質(zhì)量體積比1:10～50(g/mL)混合，制得混合液；按比例加入葡萄糖，所述葡萄糖與所述混合液的質(zhì)量體積比為1～7:100(g/mL)，加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)初始pH至6～10，制得海參卵基礎(chǔ)培養(yǎng)基；S3、滅菌：將步驟S2制得的海參卵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，121℃滅菌20min，得到滅菌培養(yǎng)基；S4、接種發(fā)酵：待步驟S3制得的滅菌培養(yǎng)基溫度降低至40～50℃時，加入所述滅菌培養(yǎng)基體積2～9％的納豆菌菌懸液，所得滅菌培養(yǎng)基中納豆菌的終濃度為107CFU/mL，充分混勻后，在31～43℃、通風(fēng)，搖床轉(zhuǎn)速140～300r/min下培養(yǎng)32～40h，獲得海參卵發(fā)酵液；S5、分離產(chǎn)物：將步驟S4制得的海參卵發(fā)酵液在7000r/min下離心20分鐘，收集上清液；將所述上清液濃縮、凍干，得到具有降壓抗凝血功能海參卵發(fā)酵產(chǎn)物凍干粉。優(yōu)選方式下，步驟S1所述海參卵凍干粉備用期間凍存于-20℃；以防氧化和變質(zhì)。優(yōu)選方式下，步驟S2所述海參卵凍干粉與水的質(zhì)量體積比為1:30(g/mL)。優(yōu)選方式下，步驟S2所述葡萄糖的添加量為2:100(g/mL)。優(yōu)選方式下，步驟S2采用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2。優(yōu)選方式下，步驟S2所述加入鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)初始pH值為設(shè)計值+0.2。在步驟S3滅菌過程中，培養(yǎng)基的pH值會下降0.2，所以在調(diào)初始pH的時候，調(diào)整到設(shè)計值+0.2。優(yōu)選方式下，步驟S4為：待步驟S3制得的滅菌發(fā)酵混合物冷卻到40～50℃后，加入所述滅菌培養(yǎng)基體積5％的納豆菌菌懸液，所得滅菌培養(yǎng)基中納豆菌的終濃度為107CFU/mL；在37℃通風(fēng)條件下，在轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床中培養(yǎng)36h，獲得海參卵發(fā)酵液。優(yōu)選方式下，步驟S5濃縮處理具體為：將所述上清液濃縮至原體積的1/5。濃縮處理可以有效縮短凍干時間。優(yōu)選方式下，步驟S5所述凍干的具體操作為：-20℃預(yù)凍6～8h，-50℃凍干24～40h。采用上述方案后，本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：1、本發(fā)明先將含有海參卵原料的培養(yǎng)基經(jīng)過高壓(121℃，20min)處理，提高海參卵原料對納豆菌發(fā)酵過程中所分泌蛋白酶的敏感度，使海參卵更易被水解，提高發(fā)酵后樣品中的多肽含量，并殺滅致病菌和腐敗菌，保證產(chǎn)物安全性。通過TCA結(jié)合Folin-酚的方法測定樣品中多肽含量發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵0h的樣品中多肽含量為0.25mg/mL，發(fā)酵36h后樣品中多肽含量為4.3mg/mL；通過Folin-酚測定可溶性蛋白的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0h海參卵樣品由于高溫高壓，溶出部分蛋白，蛋白含量為3.5mg/mL，發(fā)酵36h后樣品中的蛋白含量為11mg/mL；從Tricine-SDS-PAGE小分子電泳結(jié)果可知，經(jīng)發(fā)酵后，海參卵中大分子蛋白被充分降解，發(fā)酵產(chǎn)物中富含小分子蛋白和多肽，其分子量均低于26Kd，且大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物接近1Kd，發(fā)酵產(chǎn)物蛋白回收率約為50％。2、海參卵原料未發(fā)酵樣品的凝血酶時間(TT)為21.95s，凝血酶原時間(PT)為13.6s，活化部分凝血活酶時間(APTT)為56.65s；本發(fā)明方法制得的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的APTT為69.5s，PT為15.95s，TT為22.4s；本發(fā)明方法制得的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的凝血時間明顯延長，本發(fā)明方法制得的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物具有較強的抗凝血活性。3、海參卵樣品為開始發(fā)酵時，幾乎無ACE抑制活性，ACE抑制率為7.8％，本發(fā)明方法制得的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的ACE抑制活性顯著提高，ACE抑制率可達(dá)為90％。4、本發(fā)明方法制得的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物中富含具有降壓抗凝血功能的多肽，對高血壓癥、高血粘癥及血栓性疾病具有潛在的輔助治療作用；同時，本發(fā)明制得的發(fā)酵產(chǎn)物中含有多種蛋白酶，對于消化酶分泌不足的人群能促進(jìn)其胃腸道食物的充分消化吸收；本發(fā)明方法制得的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物可應(yīng)用于飲品、保健品、營養(yǎng)添加劑及醫(yī)藥開發(fā)等方面。綜上，與直接食用海參卵相比，本發(fā)明將海參卵經(jīng)納豆菌發(fā)酵，不但可產(chǎn)生具有溶解血栓作用的溶纖酶，還產(chǎn)生利于消化吸收、具有抗凝血及降壓功能的多肽。海參卵發(fā)酵產(chǎn)物，不但可以作為食品直接使用，還可進(jìn)一步經(jīng)過濃縮、分離等開發(fā)成為保健功能產(chǎn)品。因此，本發(fā)明豐富了海參卵的應(yīng)用方式并增強了其生物活性及開發(fā)價值。附圖說明圖1是海參卵發(fā)酵過程TCA可溶性寡肽含量的變化；圖2是海參卵發(fā)酵過程可溶性蛋白含量的變化；圖3是海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的明膠酶譜譜圖；圖4是豆粉和海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE譜圖；圖5是豆粉和海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的抗凝血活性。具體實施方式本發(fā)明提供了一種具有降壓抗凝血功能的海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的制備方法，以海參卵為原料，通過納豆菌發(fā)酵，根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物的ACE抑制活性和抗凝血活性優(yōu)化發(fā)酵條件，得到最優(yōu)發(fā)酵產(chǎn)物。終止發(fā)酵，對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行離心、過濾、濃縮、凍干，制備降壓抗凝血海參卵發(fā)酵產(chǎn)物。以下實施例中采用的海參卵凍干粉通過下述方法制得：將海參卵洗凈、去除表面粘連的雜質(zhì)，瀝干，在-80℃進(jìn)行預(yù)凍，根據(jù)預(yù)凍的海參卵的質(zhì)量和體積設(shè)定預(yù)凍時間4～5h，然后采用真空冷凍濃縮設(shè)備(凍干機)進(jìn)行冷凍濃縮，先對凍干機進(jìn)行預(yù)冷，約30分鐘后，凍干機溫度穩(wěn)定在-50℃后，放入處理好的海參卵樣品，打開真空泵，壓力迅速下降到10pa之下，凍干機穩(wěn)定運行40～50h，將海參卵樣品全部凍干。將凍干后的海參卵打粉，放入-20℃冰箱備用。本發(fā)明實施例及對比例采用下述方法進(jìn)行表征：測試1：TCA可溶性寡肽含量的測定方法如下：發(fā)酵樣品100μL加入100μL濃度為20％三氯乙酸(TCA)，震蕩混勻，靜置20min，16500g/min下離心15min，取上清進(jìn)行稀釋，取稀釋后的待測樣品100μL，利用Folin-酚的方法測定TCA可溶性寡肽含量，加入Folin-酚甲液500μL，室溫反應(yīng)10min，加入Folin-酚乙液100μL，30℃反應(yīng)30min，500nm測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定可溶性寡肽含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如下：用結(jié)晶牛血清蛋白，根據(jù)其純度配制成0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL，依次加入500μlFolin-酚甲液，混勻。室溫下放置10min，再加入50μlFolin-酚乙液，立即振蕩均勻，室溫下放置30min。然后，在500nm波長下，用酶標(biāo)儀測定光密度值。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值(500nm)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測試2：可溶性蛋白含量的測定方法如下：取稀釋后的待測樣品100μL，加入Folin－酚甲液500μL，室溫反應(yīng)10min，加入Folin-酚乙液100μL，30℃反應(yīng)30min，500nm測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定可溶性蛋白含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制同測試1。測試3：ACE抑制活性的測定方法如下：ACE抑制活性空白組：于1.5mL離心管中，取25μL超純水，加入25μL的ACE(酶活力為0.047U/mL)，漩渦震蕩2min，37℃孵育5min。加入50μL，5mmol/L底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)，37℃，反應(yīng)1h。然后加入20μL，0.2MHCl終止反應(yīng)。反應(yīng)液過孔徑為0.45μm的膜后，用HPLC(Waters)檢測馬尿酸(HA)生成量。ACE抑制活性樣品組：于1.5mL離心管中，取25μL上述發(fā)酵液(蛋白含量20mg/mL)，加入25μL的ACE(酶活力為0.047U/mL)，漩渦震蕩2min，37℃5min。加入50μL，5mmol/L底物HHL，37℃反應(yīng)1h。然后加入20μL，0.2MHCl終止反應(yīng)。反應(yīng)液過孔徑為0.45μm的膜后，用HPLC(Waters)檢測HA生成量。ACE抑制率＝(A-B)/A*100％；(其中A:加入發(fā)酵樣品組中HA的峰面積；B:空白組中HA的峰面積)。測試4：抗凝血活性測定方法如下：抗凝血活性測定：將30份來自健康人體檢的血液，加入3.8％枸櫞酸鈉作為抗凝劑，混合均勻，以3000r/min離心15min，收集血漿。將待測血漿加入試管，每管0.9mL，加入發(fā)酵產(chǎn)物0.1mL。按試劑盒說明書操作，測定TT、PT及APTT。TT、PT、APTT是檢測凝血功能的常見指標(biāo)：TT是反應(yīng)凝血酶活性和纖維蛋白原含量的指標(biāo)，正常范圍14.0～21.0s；PT主要反應(yīng)外源性凝血途徑的功能，正常范圍9.5～15.5s；APTT主要反應(yīng)內(nèi)源性凝血途徑有關(guān)因子的活性，正常范圍23.0～43.0s。實施例1取海參卵凍干粉1.49g，加入30mL去離子水，加入0.6g葡萄糖，用NaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH到7.2(設(shè)計值為7)，將培養(yǎng)基封口，置于121℃滅菌20分鐘，待滅菌結(jié)束后，取出滅菌培養(yǎng)基。待滅菌培養(yǎng)基溫度在40～50℃時，加入0.9mL納豆菌菌懸液，使培養(yǎng)基菌濃度最終達(dá)到107CFU/mL，將納豆菌菌懸液與滅菌培養(yǎng)基充分混合后，置于37℃，180r/min的搖床中，通風(fēng)培養(yǎng)0～72h。每隔12h取發(fā)酵液一次，采用TCA可溶性寡肽含量的測定方法測定本實施例發(fā)酵過程中，發(fā)酵產(chǎn)物中TCA可溶寡肽的含量，結(jié)果如圖1所示。0h時，TCA可溶性寡肽含量很低，說明在0h時高溫高壓溶出的海參卵大分子蛋白和海參卵未溶出的大蛋白并未被納豆菌分解；隨著發(fā)酵時間的延長，TCA可溶性寡肽含量增加，說明納豆菌在海參卵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，將培養(yǎng)基中的大分子蛋白降解為小分子蛋白或者肽，使發(fā)酵產(chǎn)物中TCA可溶性寡肽含量顯著增加。在0～72h，每隔12h取一次發(fā)酵液，用Folin-酚方法測定樣品中蛋白含量，結(jié)果如圖2。在0h海參卵樣品由于高溫高壓，溶出部分可溶性蛋白，其含量為3.5mg/mL，發(fā)酵36h后樣品中的可溶性蛋白含量達(dá)到11mg/mL，之后變化不大。分別取上述發(fā)酵0h和36h的產(chǎn)物樣品，經(jīng)過7000r/min離心20min后，取上清液100μL，進(jìn)行抗凝血活性測定，結(jié)果如表1。發(fā)酵36h后，TT、PT、APTT都有顯著的延長，說明發(fā)酵過程可以促進(jìn)某些抗凝血因子的形成，使得凝血時間延長，起到一定的抗凝血作用。表1海參卵發(fā)酵0h和36h抗凝血活性海參卵發(fā)酵0h樣品海參卵發(fā)酵36h樣品TT/s21.9522.4PT/s13.615.95APTT/s56.6569.5實施例2取海參卵凍干粉1.1g，加水30mL，加入葡萄糖0.4g，調(diào)整pH為7.2(設(shè)計值為7)，在121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至40～50℃后，接入1.5mL納豆菌菌懸液，終濃度為107CFU/mL，在37℃，180r/min條件下，通風(fēng)培養(yǎng)36h。發(fā)酵液經(jīng)過7000r/min離心20min，上清液體積約為30mL，經(jīng)福林酚方法測定上清液蛋白含量約為20mg/mL，上清液經(jīng)過濃縮、凍干制得海參卵發(fā)酵凍干粉約為0.6g。本實施例產(chǎn)物蛋白回收率大約54.5％，通過TCA可溶性寡肽含量測定方法測量得到的寡肽含量18mg/mL。明膠酶譜(活性電泳)顯示，如圖3所示，在發(fā)酵產(chǎn)物中，還存在多種蛋白酶，這些蛋白酶不但可以促進(jìn)海參卵蛋白分解形成活性多肽，還可以補充部分消費者消化酶分泌不足，促進(jìn)胃腸道食物的充分消化吸收。實施例3取海參卵凍干粉3.8g，加水40mL，加入葡萄糖1.2g，調(diào)整pH為7.2(設(shè)計值為7)，在121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后，接入2mL納豆菌菌懸液，終濃度為107CFU/mL，在37℃，180r/min條件下，通風(fēng)培養(yǎng)36h。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過7000r/min離心20min，取上清，上清液體積約為32mL，經(jīng)測定蛋白含量約為23mg/mL，上清液經(jīng)過濃縮、凍干制得海參卵發(fā)酵凍干粉約為0.736g。本實施例產(chǎn)物蛋白回收率為31％，通過TCA可溶性寡肽含量測定方法測量得到的寡肽含量20mg/mL。蛋白回收率＝發(fā)酵后蛋白含量/總蛋白*100％利用豆粉作為海參卵發(fā)酵產(chǎn)物抗凝血活性測的的對比例。經(jīng)凱氏定氮測定豆粉中總蛋白含量約為39％(干基)，海參卵中總蛋白含量約為62％(干基)，結(jié)果顯示，海參卵屬于高蛋白、低脂肪的蛋白源，是制備生物活性蛋白和多肽的優(yōu)良原料。對比例1取相同條件下凍干的豆粉1.8g，保證與實施例2添加到培養(yǎng)基中的總蛋白含量(0.68g)一致，在與實施例2相同的條件下發(fā)酵36h，發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過7000r/min離心20min，取上清，上清液體積約為20mL，經(jīng)測定蛋白含量約為33mg/mL，上清液經(jīng)過濃縮、凍干制得大豆發(fā)酵凍干粉約為0.66g。本對比例產(chǎn)物蛋白回收率為28％。取實施例2及對比例1的發(fā)酵上清液分別進(jìn)行ACE抑制活性的測定，結(jié)果顯示，豆粉發(fā)酵產(chǎn)物的ACE抑制率為86.07％，海參卵發(fā)酵產(chǎn)物的抑制率為90.06％，說明海參卵是適宜生產(chǎn)ACE抑制多肽的原料，ACE抑制活性略高于豆粉。取實施例2及對比例1中海參卵和豆粉發(fā)酵36h后的上清液分別進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE小分子電泳，結(jié)果顯示如圖4，其中M代表超低分子量marker、第1條帶代表豆粉發(fā)酵0h、第2條帶代表豆粉發(fā)酵36h、第3條帶代表海參卵發(fā)酵0h、第4條帶代表海參卵發(fā)酵36h。發(fā)現(xiàn)在0h，豆粉和海參卵都以大分子蛋白存在，發(fā)酵36h后，海參卵的大分子蛋白均被降解，在26.6KD上方無大分子蛋白條帶，在1～26KD之間有蛋白條帶，說明發(fā)酵過程中大分子蛋白被降解成小分子蛋白和多肽，且海參卵與豆粉發(fā)酵樣品產(chǎn)生了不同分子量分布的小分子蛋白，這種差異可能導(dǎo)致二者發(fā)酵產(chǎn)物生物活性不同的主要原因。對比例2采用添加到培養(yǎng)基中的總蛋白含量一致的方法，取相同條件下凍干的豆粉6g(總蛋白含量為2.36g)加水40mL，加入葡萄糖1.2g，調(diào)整pH為7.2(設(shè)計值為7)，在121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后，接入2mL納豆菌菌懸液，終濃度為107CFU/mL，在37℃，180r/min條件下，通風(fēng)培養(yǎng)36h。發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)過7000r/min離心20min，取上清，上清液體積約為27mL，經(jīng)測定蛋白含量約為31mg/mL，上清液經(jīng)過濃縮、凍干制得大豆發(fā)酵凍干粉約為0.837g。本對比例產(chǎn)物蛋白回收率為35％。取實施例3及對比例2的發(fā)酵上清液100μL，分別測定其抗凝血活性。結(jié)果如圖5所示，海參卵發(fā)酵產(chǎn)物比豆粉發(fā)酵產(chǎn)物具有更強的抗凝血活性，可對心腦血管疾病具有潛在的輔助治療作用。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3