本發(fā)明涉及一種動物微生態(tài)制劑及其制備方法和用途，特別涉及一種能夠治療及預防動物腸道疾病、調節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡、增強動物免疫力和抗應激能力的動物微生態(tài)制劑及其制備方法和用途。本發(fā)明屬于飼料研究技術領域。
背景技術：
合生元(synbiotics)又稱為合生素，是指益生菌和益生元的組合制劑，或再加入維生素、微量元素等。它既可發(fā)揮益生菌的生理效應，又可快速增加該菌的數(shù)量，使益生菌作用更顯著持久。合生元作為新一代微生態(tài)調節(jié)劑對動物腸道疾病的防治和維護機體的微生態(tài)平衡起著至關重要的作用。
隨著人們環(huán)保意識的增強，社會文明程度和生活水平的提高，安全"優(yōu)質"無公害"無污染的綠色畜禽產(chǎn)品已成為消費主流，抗生素的長期使用會使細菌產(chǎn)生耐藥性，引起畜禽體內菌群失調和二重感染，使畜禽免疫力下降，并在動物產(chǎn)品及環(huán)境中殘留，同時濫用抗生素加大了飼料成本，降低了經(jīng)濟效益。針對長期使用抗生素添加劑所造成的諸多弊端我們經(jīng)多年的研究開發(fā)出具有生物活性的合生元—治療和預防畜禽消化道疾病的微生態(tài)制劑(幼齡康)，其是一種高效的動物腸道微生態(tài)平衡調節(jié)劑，作為動物腸道疾病治療和預防的微生態(tài)合生元制劑對綠色養(yǎng)殖具有重要意義。
微生態(tài)制劑的發(fā)展歷程：
微生態(tài)制劑應用最早見于日本，上世紀50年代就有“表飛鳴”、“乳酶生”，其成分是糞鏈球菌。用于治療人的腸道疾病，隨后相繼應用于畜禽養(yǎng)殖。美國上世紀70年代開始使用飼用微生物。80年代中期，世界各國，尤其歐洲各國和日本等發(fā)達國家紛紛采取有力措施，對飼用抗生素的種類、使用方法、劑量和配伍等方面加以限制，同時大力開展研究藥物飼料添加劑代用品，積極鼓勵和倡導綠色安全飼料添加劑的研究和推廣。這給獸用微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)帶來了一次難得的發(fā)展機遇。全球獸用微生態(tài)產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，近十幾年來發(fā)展更為迅速，每年銷售額達到10億美元。
我國微生態(tài)制劑的研究現(xiàn)狀：
我國微生態(tài)制劑的研究始于上世紀80年代。1998年，國內市場上能找到的微生態(tài)制劑產(chǎn)品寥寥幾種，2000年產(chǎn)品數(shù)量達到1998年的5倍以上，近十幾年微生態(tài)產(chǎn)品迅速猛增，這在很大程度上反映出微生態(tài)制劑市場前景的廣闊。目前國內有許多生產(chǎn)廠家研究生產(chǎn)出飼用微生態(tài)制劑產(chǎn)品，表現(xiàn)出一定的作用與效果，但畢竟我國的微生態(tài)制劑市場起步較晚，研究和開發(fā)尚待深入，許多問題尚未完全弄清楚，加之微生態(tài)制劑本身的不穩(wěn)定性，國內從上到下還沒有對其形成一個完善的管理機制，尤其是尚沒有一個統(tǒng)一的質量標準，因此大多數(shù)還處于試驗研究階段。
國外微生態(tài)產(chǎn)業(yè)發(fā)展情況：
最早研究和應用畜禽微生態(tài)制劑的歷史可以追溯到1947年，蒙哈德首先發(fā)現(xiàn)使用乳酸桿菌飼喂仔豬可有效的增加仔豬的體重并改善仔豬的身體健康。20世紀70年代，美國率先使用微生態(tài)制劑，使用效果非常明顯，顯現(xiàn)出抗生素無法比擬的優(yōu)點。80年代，微生態(tài)制劑開始在世界范圍內普及，并逐漸被世人所認可。特別是近十年來，微生態(tài)制劑的發(fā)展尤其迅速。美國FDA規(guī)定：允許用作益生素的微生物有42種。我國農(nóng)業(yè)部(2003)公布的可直接飼喂動物的飼料級微生物添加劑菌種有枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、乳酸球菌和酵母菌等15種。
近年來，在養(yǎng)殖業(yè)中，由于各地長期、大劑量使用抗生素，不但增加了生產(chǎn)成本，而且其毒副作用和藥物殘留嚴重影響到人類健康。美國及西歐一些國家相繼禁用或限用抗生素作為飼料添加劑。微生態(tài)制劑則可以通過改善動物胃腸微生態(tài)環(huán)境來促進健康養(yǎng)殖，填補抗生素留下的空白。一些發(fā)達國家相繼開發(fā)研制出一些微生態(tài)制劑替代抗生素，在理論及應用方面進行了深人細致的研究，使微生態(tài)制劑得到了較快發(fā)展。飼用微生態(tài)制劑已經(jīng)廣泛應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，形成了微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)。
動物微生態(tài)制劑原理和功效：
動物微生態(tài)制劑的分類：廣義地說，微生態(tài)制劑包括動物微生態(tài)制劑和植物微生態(tài)制劑。動物微生態(tài)制劑既包括正常微生物成員，尤其是優(yōu)勢種群的活菌制劑，還包括一些能促進正常微生物群生長繁殖的物質所制備的制劑，其能產(chǎn)生一定的生物效應或生長態(tài)效應如益生元。動物微生態(tài)制劑分類方法較多，但常用的分類有以下幾種方式：
根據(jù)微生態(tài)制劑使用的菌種類型，主要分為單一菌類和復合微生態(tài)制劑兩大類，其中單一菌類微生態(tài)制劑又包括以下四種類型：乳酸菌類微生態(tài)制劑：主要有嗜酸乳桿菌、雙歧乳桿菌和糞鏈球菌等，是一種可分解糖類產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌，厭氧或兼性厭氧生長。乳酸菌在維持消化道的正常微生物群系的穩(wěn)定性方面起著決定性的作用，缺點是大部分乳酸菌的耐熱能力比較差，易導致產(chǎn)品質量不穩(wěn)定，進而影響飼喂效果。據(jù)報道，乳酸菌不耐高溫，經(jīng)80℃處理5min，將損失70％～80％，但耐酸在pH 3.0～4.5時仍可生長，對胃中的酸性環(huán)境有一定耐受性。在動物體內通過生物拮抗降低pH，阻止和抑制致病菌的侵入和定植；降解氨、吲哚及糞臭素等有害物質，維持腸道中正常的生態(tài)平衡；活菌體和其代謝產(chǎn)物中含有較高的超氧化物歧化酶(SOD)，能消除氧自由基的不利作用，增強體液免疫和細胞免疫。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在魚體腸道定植，可抵抗革蘭氏陰性致病菌，增強抗感染能力，增加腸黏膜的免疫調節(jié)活性，促進生長。乳酸菌可用于哺乳和斷乳期動物的飼料中。
芽孢桿菌類微生態(tài)制劑：主要有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等，是一類好氧菌。在一定條件下產(chǎn)生芽孢，由于芽孢的特殊結構使芽孢桿菌對干燥、高溫高壓、氧化、強酸強堿、擠壓等不良環(huán)境的抵抗力很強，產(chǎn)品穩(wěn)定性高，并且具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，在腸道發(fā)芽生長具有多種有效的酶促效應。
酵母類微生態(tài)制劑：主要有啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、紅色酵母等，酵母細胞富含蛋白質、核酸、維生素和多種酶，具有增強動物免疫力，增加飼料適口性，促進動物對飼料的消化吸收能力等功能，可提高動物對磷的利用率，可以用來發(fā)酵生產(chǎn)飼用單細胞蛋白。
光合細菌類微生態(tài)制劑：是一類有光合作用能力的異養(yǎng)微生物，主要利用小分子有機物合成自身生長繁殖所需要的各種養(yǎng)分，富含蛋白質、B族維生素、輔酶Q、抗活性病毒因子等多種生物活性物質及類胡蘿卜素、番茄紅素等天然色素。光合細菌菌體蛋白中多種必需氨基酸的含量高于酵母菌。光合細菌在改善水體環(huán)境，促進水產(chǎn)動物生長，改善色澤等方面有良好的作用
復合微生態(tài)制劑：相比較前四種由單一菌種組成的微生態(tài)制劑，復合微生態(tài)制劑是由多種菌按照一定比例復合配制而成，能適應多種條件和宿主，具有防病治病、促生長、提高飼料轉化率等多種功能。
按動物微生態(tài)制劑的用途分類，主要分為以下三類：
微生態(tài)治療劑：主要由乳酸菌、雙歧桿菌等種、屬菌株組成，具有很強地調整消化道內環(huán)境和微生物區(qū)系平衡的作用，主要用于預防和治療消化機能紊亂和消化道感染。
微生態(tài)促生長劑：主要由真菌、酵母、芽孢桿菌等具有很強消化能力的菌株組成，在消化道中能產(chǎn)生多種消化酶、豐富的B族維生素、維生素K、未知生長因子和菌體蛋白等，可起到輔助消化、促進生長的作用。
微生態(tài)多功能劑：由多種、屬菌株配合而成，具有一定整腸保健、防治疾病作用，又有較好的輔助消化、促進生長等作用。
根據(jù)微生態(tài)制劑的物質組成，可分為益生素、益生元及合生元；
益生素：是指改善宿主微生態(tài)平衡而發(fā)揮有益作用，達到提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的活菌制劑及其代謝產(chǎn)物。益生素在動物腸道內通過自身生長繁殖抑制有害細菌的生長，增強非特異性免疫功能，達到防治疾病、促進生長和提高飼料報酬的目的。
益生元又叫化學益生素：是一種不能被宿主消化吸收，也不能被腸道有害菌利用，只能被有益微生物選擇性吸收利用或能促進有益菌的活性(或繁殖)的一類化學物質，它能選擇性促進腸內有益菌群的活性或生長繁殖，起到增進宿主健康和促進生長的作用。
合生元：是益生菌和益生元按一定比例結合的生物制劑，能同時發(fā)揮二者的共同作用，合生元結構合理，效果更加優(yōu)越，成為微生態(tài)制劑開發(fā)的主要方向。
動物微生態(tài)制劑存在的問題：
微生態(tài)制劑應用廣泛，兼有養(yǎng)生和保護功能，能起到“已病輔治、未病防病、無病保健”的重要作用。目前，對微生態(tài)制劑的開發(fā)和研究，國外已進入高潮，并且形成強大的產(chǎn)業(yè)，每年的收入相當可觀。而我國的微生態(tài)制劑發(fā)展相對緩慢，較國外有很大差距。導致如此情況有以下幾個原因：
我國微生態(tài)制劑起步較晚；許多微生態(tài)制劑尚處在開發(fā)和試驗當中，沒有投入到批量生產(chǎn)和實際應用當中去，所以市場上成熟的產(chǎn)品種類較少。目前已確定在我國適宜作微生態(tài)制劑的菌種種類太少，尚需開發(fā)新的菌種，或利用現(xiàn)有分子生物學等方法改良現(xiàn)有菌種，使之具有新的特性。關于微生態(tài)制劑作用機制的研究進展緩慢，對于各種畜禽腸道正常菌群的組成和相互關系研究不夠清楚，這都將減緩微生態(tài)制劑的開發(fā)和應用。
微生態(tài)制劑的制作和加工工藝手段落后單一：對微生態(tài)制劑生產(chǎn)的后處理階段手段匱乏，很難保證微生態(tài)制劑在與飼料混合過程中不被其他有害菌污染，無法保證微生態(tài)制劑的安全穩(wěn)定性，其活性也易受外界環(huán)境因素的影響。飼料中添加的抗生素對微生態(tài)飼料添加劑的殺滅和抑制作用。
缺少配套的應用推廣措施：因為微生態(tài)制劑的使用有很嚴格的要求，使用不當會導致微生態(tài)制劑的效果減弱或消失。沒有專業(yè)措施相配套，給微生態(tài)制劑在我國的推廣帶來很大的困難。
如果嚴格限制在飼料中添加抗生素，將大大加強人們對微生態(tài)制劑的研發(fā)力度，加快我國微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展速度。就目前國際大環(huán)境的影響來看，要想保證我國肉、蛋及奶產(chǎn)品的出口，勢必要改善藥物殘留過高的現(xiàn)狀，禁止飼料中添加抗生素勢在必行。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是提出一種用于治療和預防畜禽消化道疾病的微生態(tài)制劑及其制備方法，本發(fā)明的微生物制劑可通過直接飼喂、飲水或添加到飼料中的方式達到治療和預防動物腸道細菌性腹瀉和消化不良性腹瀉，提高動物機體免疫力和抗應激能力，增強動物消功能，促進動物生長的目的，綠色安全，可代替動物腸道疾病抗生素等藥物的使用，免除了應用抗生素的弊端，同時提高了動物的成活率，降低了生產(chǎn)成本，提高了動物福利。
本發(fā)明的一種用于治療和預防畜禽消化道疾病的微生態(tài)制劑，是由雙歧桿菌、乳桿菌、芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵，離心，低溫冷凍干燥后復配低聚異麥芽糖和益生菌后得到的干燥粉劑。該產(chǎn)品富含大量的生物活性物質和多種活菌，本產(chǎn)品直接飼喂、飲水或添加到飼料中可治療和預防動物細菌性腹瀉和消化不良性腹瀉，調節(jié)消化機能，提高動物機體免疫力和抗應激能力，促進動物生長，可替代抗生素藥物治療動物腸道疾病，提高動物的成活率，降低生產(chǎn)成本。
具體的，本發(fā)明的一種用于治療和預防畜禽消化道疾病的微生態(tài)制劑，是通過以下方法制備得到的：
(1)將動物雙歧桿菌菌種接種于雙歧桿菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36-60小時，挑取雙歧桿菌接種于100ml雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)15-25小時，再將100ml培養(yǎng)液接種于1000ml雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-14小時；
(2)分別將嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌以及干酪乳桿菌菌種接種于乳酸桿菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36-60小時，分別挑取各菌種接種于100ml乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)15-25小時，再將各菌的100ml培養(yǎng)液分別接種于1000ml乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10-14小時；
(3)將步驟(1)和步驟(2)得到的全部培養(yǎng)液混合后，按照1％(v/v)的接種量接種于含有增菌培養(yǎng)基的1000升厭氧發(fā)酵罐中，37℃增菌培養(yǎng)10-14小時，1000轉/分離心5-10分鐘，獲得雙歧桿菌與乳桿菌混合發(fā)酵的上清液和菌泥，收集菌泥，加入凍干保護劑，-60℃速凍3-5小時，放入冷凍干燥機中凍干，收集得到雙歧桿菌與乳桿菌的混合凍干菌粉；
(4)將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌菌種分別接種于芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)15-25小時，分別挑取各菌種接種于100ml芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，放入搖床中，210轉/分，37℃培養(yǎng)15-25小時，將各菌的100ml培養(yǎng)液接種于1000ml芽孢桿菌液體培養(yǎng)基，放入中搖床中，210轉/分，37℃培養(yǎng)10-14小時；
(5)將步驟(4)得到的全部培養(yǎng)液混合后，按照1％(v/v)的接種量接種于1000升含有芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中37℃增菌培養(yǎng)15-25小時，1000轉/分離心5-10分鐘，獲得芽孢桿菌發(fā)酵上清液和菌泥，收集菌泥，加入凍干保護劑，-60℃速凍3-5小時，放入冷凍干燥機中凍干，收集得到芽孢桿菌的凍干菌粉；
(6)收集步驟(3)和步驟(5)離心后的發(fā)酵上清液，分別進行超濾濃縮，濃縮后按照雙歧桿菌與乳桿菌混合發(fā)酵的上清液與芽孢桿菌發(fā)酵上清液體積比為3-5：1配比混合，再加入低聚異麥芽糖攪拌均勻后，噴霧干燥；
(7)將步驟(3)獲得的雙歧桿菌和乳酸菌的混合凍干菌粉與步驟(5)獲得的芽孢桿菌的凍干菌粉按重量比50-150：1的比例混合，再與步驟(6)所獲得的噴霧干燥粉按照重量比1：50-150混合，即為所述的微生態(tài)制劑。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的動物雙歧桿菌的保藏編號為CICC 21711，所述的嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸乳球菌、干酪乳桿菌的保藏編號分別為CICC 22150、CICC 22703、CICC 23609以及CICC 23488，所述的枯草芽孢桿菌的保藏編號分別為CICC 20532，所述的地衣芽孢桿菌包括兩種保藏編號不同的菌株，其保藏編號分別為CICC 20083以及CICC 20446，以上菌種均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的雙歧桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫80 1.0g，K2HPO42.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，蒸餾水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌，雙歧桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂；所述的乳酸桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO3 20.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH6.8，121℃20分鐘高壓滅菌，乳酸桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂；所述的芽孢桿菌固體培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0，121℃20分鐘高壓滅菌。芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的配制同固體培養(yǎng)基，但不加瓊脂。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的增菌培養(yǎng)基按照以下配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫80 500ml，K2HPO4 2.0g，乙酸鈉5.0g，蒸餾水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的凍干保護劑為含有18％(w/w)脫脂奶粉、1％乳糖(w/w/)的0.5％(v/v)甘油溶液，所述的凍干保護劑按照體積比為1:1的比例加入到菌泥中。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的超濾濃縮為采用0.22pm的濾膜進行超濾濃縮。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(6)中低聚異麥芽糖的終濃度為10％(w/w)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(6)中雙歧桿菌與乳桿菌混合發(fā)酵的上清液與芽孢桿菌發(fā)酵上清液按照體積比4：1配比混合，步驟(7)中將步驟(3)獲得的雙歧桿菌和乳酸菌的混合凍干菌粉與步驟(5)獲得的芽孢桿菌的凍干菌粉按重量比100：1的比例混合，再與步驟(6)所獲得的噴霧干燥粉按照重量比1：100混合。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的微生態(tài)制劑中動物雙歧桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌的總菌數(shù)≥1010CFU/g，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的總菌數(shù)≥107CFU/g。
本發(fā)明采用了科學的冷凍干燥技術和發(fā)酵代謝生物活性物質的分離噴霧干燥技術，根據(jù)動物腸道的生理特點合理配比使用各種益生菌及益生素，使得得到的產(chǎn)品富含大量的生物活性物質(免疫因子、多肽抗菌素、細菌素、促生長物質、多種消化酶類及多種益生菌)，研究表明本發(fā)明的微生物制劑能夠有效治療和預防動物細菌性腹瀉和消化不良性腹瀉，調節(jié)消化機能，提高動物機體免疫力和抗應激能力，促進動物生長。
因此，更進一步的，本發(fā)明還提出了以上任一項所述的微生態(tài)制劑在制備預防或治療動物腸道細菌性腹瀉和消化不良性腹瀉、提高動物機體免疫力和抗應激能力、增強動物消功能以及促進動物生長的飼料添加劑中的用途。
本發(fā)明的微生態(tài)制劑的推廣應用，將規(guī)避動物腸道疾病對抗生素的依賴性，推動動物微生態(tài)應用技術進步，同時產(chǎn)生巨大社會效益和經(jīng)濟效益。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
實施例1用于治療和預防畜禽消化道疾病的微生態(tài)制劑的制備
1、生產(chǎn)菌種和培養(yǎng)基：
1.1動物雙歧桿菌(CICC 21711)
雙歧桿菌固體培養(yǎng)基配制：蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖10.0g，吐溫80 1.0g，K2HPO4 2.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，ZnSO4·7H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，瓊脂15g，蒸餾水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌。若配制雙歧桿菌液體培養(yǎng)基則不加瓊脂。
1.2植物乳桿菌(CICC 22703)、干酪乳桿菌(CICC 23488)、乳酸乳球菌(CICC 23609)、嗜酸乳桿菌(CICC 22150)
乳酸桿菌固體培養(yǎng)基制作：酪蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO3 20.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH6.8，121℃20分鐘高壓滅菌。若配制乳酸桿菌液體培養(yǎng)基則不加瓊脂。
1.3枯草芽孢桿菌(CICC 20532)、地衣芽孢桿菌(CICC 20083)、地衣芽孢桿菌(CICC 20446)
芽孢桿菌培養(yǎng)固體基制作：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0，121℃20分鐘高壓滅菌。若配制芽孢桿菌液體培養(yǎng)基則不加瓊脂。
2、成品生產(chǎn)流程
(1)將動物雙歧桿菌(CICC 21711)菌種接種于雙歧桿菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時，挑取2環(huán)接種于100ml雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20小時，再將100ml培養(yǎng)液接種于1000ml雙歧桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12小時。
(2)將嗜酸乳桿菌(CICC 22150)、植物乳桿菌(CICC 22703)、乳酸乳球菌(CICC 23609)、干酪乳桿菌(CICC 23488)菌種分別接種于乳酸桿菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時，各菌種挑取2環(huán)分別接種于100ml乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)20小時，再將各菌液100ml培養(yǎng)液分別接種于1000ml乳酸桿菌液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12小時。
(3)將步驟(1)和步驟(2)得到的全部培養(yǎng)液混合后，按照1％(v/v)的接種量接種于含有增菌培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分：蛋白胨5g，牛肉膏5g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖10g，吐溫80 500ml，K2HPO4 2g，乙酸鈉5g，蒸餾水定容至1L，pH 6.2～6.4，121℃20分鐘高壓滅菌)的1000升厭氧發(fā)酵罐中，37℃增菌培養(yǎng)12小時，1000轉/分離心5分鐘，獲得雙歧桿菌與乳桿菌混合發(fā)酵的上清液和菌泥，收集菌泥，按照保護劑與菌泥體積比為1:1的比例加入凍干保護劑(含有18％(w/w)脫脂奶粉、1％乳糖(w/w/)的0.5％(v/v)甘油溶液)，-60℃速凍4小時，放入冷凍干燥機中凍干32小時收集得到雙歧桿菌與乳桿菌的混合凍干菌粉。
(4)將枯草芽孢桿菌(CICC 20532)、地衣芽孢桿菌(CICC 20083)、地衣芽孢桿菌(CICC 20446)菌種分別接種于芽孢桿菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)20小時，各菌種挑取2環(huán)分別接種于100ml芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，放入搖床中，210轉/分，37℃培養(yǎng)12小時，分別取100ml培養(yǎng)液接種于1000ml芽孢桿菌液體培養(yǎng)基，放入中搖床中，210轉/分，37℃培養(yǎng)12小時。
(5)將步驟(4)得到的全部培養(yǎng)液混合后，按照1％(v/v)的接種量接種于1000升含有芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中37℃增菌培養(yǎng)12小時，1000轉/分離心5分鐘，獲得芽孢桿菌發(fā)酵上清液和菌泥，收集菌泥，按照凍干保護劑與菌泥體積比為1:1的比例加入凍干保護劑(含有18％(w/w)脫脂奶粉、1％乳糖(w/w/)的0.5％(v/v)甘油溶液)，-60℃速凍4小時，放入冷凍干燥機中凍干32小時收集得到芽孢桿菌的凍干菌粉。
(6)收集步驟(3)和步驟(5)離心后的發(fā)酵上清液，分別采用0.22pm的濾膜超濾濃縮，濃縮后按照雙歧桿菌與乳桿菌發(fā)酵上清液與芽孢桿菌發(fā)酵上清液體積比4：1配比混合，再加入10％(w/w)的低聚異麥芽糖攪拌均勻后，噴霧干燥。
(7)將步驟(3)獲得的雙歧桿菌和乳酸菌的混合凍干菌粉與步驟(5)獲得的芽孢桿菌的凍干菌粉按重量比100：1的比例混合，再與步驟(6)所獲得的噴霧干燥粉按照重量比1：100混合，即為本發(fā)明所述的微生態(tài)制劑。
本發(fā)明得到的微生態(tài)制劑中動物雙歧桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌的總菌數(shù)≥1010CFU/g，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的總菌數(shù)≥107CFU/g。
實施例2本發(fā)明的微生態(tài)制劑對保育豬生長的影響
1、試驗材料
微生態(tài)制劑干燥粉劑，按照實施例1方法制備。
2、實驗方法：
選擇同一批斷奶的仔豬，分成三組，各自將病仔豬挑出。分別是對照組，微生態(tài)制劑組，抗生素組(使用的抗生素藥物是：康泰欣)。三組日糧成分相同，飼喂方法：三組均常規(guī)飼喂，微生態(tài)制劑組將微生態(tài)制劑5g，用水稀釋200ml，在每日的6點、17點，兩個時間定量加入飼料中，每天10點清理糞便，記錄相應的采食量，糞便情況，疾病情況)。
3、試驗結果
微生態(tài)制劑對保育豬生長性能的影響如下表1所示，保育豬增重耗料成本預算如下表2所示：
表1微生態(tài)制劑對保育豬生長性能的影響
表2保育豬增重耗料成本預算
從表1結果可以看出，微生態(tài)制劑組與對照組和抗生素組相比，腹瀉率明顯降低，在初始重量較低的情況每日增重水平均高于對照組，并且料肉比下降顯著，證明該微生態(tài)制劑的使用提高了飼料轉化率，糞便成型，豬舍臭味明顯降低，飼養(yǎng)環(huán)境得到良好改善。
從表2結果可以看出，保育豬飼喂微生態(tài)制劑31天，節(jié)省飼料成本比對照組少56.48元，比抗生素組少47.36元，給養(yǎng)殖戶帶來明顯經(jīng)濟效益。
實施列3母豬飼喂微生態(tài)制劑的效果及對仔豬生長的影響
1、試驗材料
微生態(tài)制劑干燥粉劑，按照實施例1方法制備。
2、試驗方法及結果
選擇8頭母豬，隨機分成2組，分別是對照組，微生態(tài)制劑組，2組日糧成相同，飼喂方法：2組均常規(guī)飼喂，微生態(tài)制劑組將微生態(tài)制劑4g，用水稀釋200ml，在每日的6點、17點，兩個時間定量加入飼料中，每天10點清理糞便，記錄仔豬糞便、疾病等情況)，結果如下表3所示。
表3母豬飼喂微生態(tài)制劑對仔豬生長的影響
從表3結果可以看出，使用微生態(tài)制劑飼喂母豬，對仔豬生長影響明顯，無論在降低腹瀉還是增重上都有顯著效果。
實施列4飼喂微生態(tài)制劑菌制劑對雞生長的影響
1、試驗材料
微生態(tài)制劑干燥粉劑，按照實施例1方法制備。
2、試驗方法及結果
2.1肉雞飼喂微生態(tài)制劑菌制劑的效果
選擇9005只肉雞土隨機分成2組，分別是對照組，微生態(tài)制劑組，2組日糧成相同，飲水方法：1000只雞每日用量1克，將微生態(tài)制劑干燥粉劑加入葡萄糖鹽水(糖1％,鹽0.2％，)中稍微攪拌均勻后加入飲水容器中供雞飲用(加水量在3小時內飲用完)，連續(xù)飲水14天即可。14天后每天各2天飲用一次。觀察雞生長情況。結果如下表4所示。
表4肉雞土飼喂微生態(tài)制劑20天后的結果
從表4可以看出每1000羽節(jié)省飼料34斤，死亡率降低1.6％，出欄單只母雞增重195g，公雞單只增重125g。
2.2麻雞飼喂微生態(tài)制劑菌制劑的效果
選擇8000只麻雞隨機分成2組，分別是對照組，微生態(tài)制劑組，2組日糧成相同，飲水方法：1000只雞每日用量1克，將微生態(tài)制劑干燥粉劑加入葡萄糖鹽水(糖1％,鹽0.2％，)中稍微攪拌均勻后加入飲水容器中供雞飲用(加水量在3小時內飲用完)，連續(xù)飲水14天即可。14天后每天各2天飲用一次。觀察雞生長情況。結果如下表5所示。
表5麻雞飼喂微生態(tài)制劑結果
從表5可以看出每1000羽節(jié)省飼料5kg，死亡率降低1.8％，出欄單只增重100g，死亡率也明顯下降，出欄重量比對照組顯著提高，雞糞便降氨方面有所明顯改善。
綜上所述，本發(fā)明提供了一種能夠有效地治療及預防動物腸道疾病、調節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡、增強動物免疫力和抗應激能力的微生態(tài)制劑，本發(fā)明的微生態(tài)制劑通過直接飼喂、飲水或添加到飼料中可治療和預防動物細菌性腹瀉和消化不良性腹瀉，調節(jié)消化機能，提高動物機體免疫力和抗應激能力，促進動物生長，成本低見效快，可替代抗生素藥物治療動物腸道疾病，提高動物的成活率，降低生產(chǎn)成本。